Składanie i kwantyfikacja kokultur łączących drożdże heterotroficzne z fototroficznymi cyjanobakteriami wydzielającymi cukier

Nasze badania mają na celu zrozumienie sieci mikrobiologicznych w syntetycznych konsorcjach z udziałem cyjanobakterii wydzielających sacharozę i grzybów heterotroficznych. W przeszłości mikrobiolodzy zwykle badali czyste kultury pojedynczych mikroorganizmów. Jednak w naturze drobnoustroje zwykle występują w konsorcjach, dlatego ważne jest, aby zrozumieć również sieci mikrobiologiczne w kulturach mieszanych.

Jednym z głównych wyzwań jest znalezienie odpowiednich warunków wzrostu, w tym podłoża umożliwiającego wzrost wszystkich członków konsorcjów. Tutaj skupiamy się głównie na optymalizacji pod kątem najwyższej produkcji i wydzielania sacharozy przez element fototroficzny, który stanowi podstawę do wzrostu członków heterotroficznych. Do śledzenia wzrostu w kulturach aksenicznych można zastosować popularne techniki, takie jak pomiary gęstości optycznej lub rozproszenia wstecznego.

Techniki te nie mają jednak zastosowania do kokultur, w których potrzebujemy liczby komórek poszczególnych gatunków. W naszym protokole stosujemy kombinację znakowania fluorescencyjnego i zliczania komórek, aby rozróżnić różnych partnerów do wspólnej hodowli. Ponadto mogliśmy pokazać, że podobne wyniki można osiągnąć różnymi metodami, od prostych, tanich po drogie, o dużej przepustowości.

Na początek osadź komórki cyjanobakterii po trzech dniach hodowli. Zawiesić osad w 25 mililitrach sterylnego podłoża CoYBG-11. Odwirować próbkę o masie 4 000 g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie odrzucić supernatant przez dekantację. Po określeniu gęstości optycznej dodać obliczoną ilość CoYBG-11 do 250-mililitrowej kolby z przegrodą w sterylnych warunkach. Następnie dodaj obliczone objętości zawiesin komórek cyjanobakteryjnych i heterotroficznych, aby uzyskać końcową objętość kultury 50 mililitrów.

Użyj 50 mikrolitrów z jednomolowego materiału IPTG do 50-mililitrowej hodowli. Następnie umieść kolbę w fotoinkubatorze przy około 200 mikromolach fotonów na metr kwadratowy na sekundę. Uzupełnij środowisko 2% dwutlenkiem węgla o temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsami orbitalnymi przy 150 obr./min i wilgotnością 75%.

W celu pobrania próbek należy wyjąć kolbę z inkubatora i pobrać jednomililitrową próbkę z kultury w sterylnych warunkach. Aby przygotować się do mikroskopijnej oceny ilościowej, upewnij się, że komora liczenia i szkło nakrywkowe są wolne od kurzu i komórek. Ustaw szkiełko nakrywkowe prawidłowo, wsuwając je na dwie pręty nośne z niewielkim naciskiem, unikając pęknięcia.

Po prawidłowym umieszczeniu szkła nakrywkowego obserwuj pierścienie Newtona między dwiema powierzchniami szkła, upewniając się, że szkło nakrywkowe się nie ślizga. Teraz dokładnie wymieszaj zawiesinę komórek i nałóż kilka mikrolitrów na krawędź komory. Pozwól, aby komora całkowicie się napełniła za pomocą siły kapilarnej.

Następnie użyj odpowiedniego obiektywu mikroskopu świetlnego i skup się na liniach siatki komory liczącej. Policz komórki w kwadratach odpowiednich dla danego rozmiaru komórki. W celu określenia ilościowego przez zliczanie cząstek, należy dostosować gęstość optyczną próbki do 0,1.

Następnie dodać 10 mikrolitrów próbki do 10 mililitrów izotonicznego buforu pomiarowego. Zabezpiecz pokrywkę kubka na próbkę i delikatnie wymieszaj próbkę, lekko przechylając kubek. Po umieszczeniu kubka na próbkę w liczniku cząstek, włóż do kubka na próbkę kapilarę o odpowiedniej wielkości porów dla wykorzystanych komórek i zamknij drzwi maszyny.

Rozpocznij pomiar i zapisz w odpowiednim zakresie. Na tym etapie można rozróżnić komórki o różnych rozmiarach. W celu oznaczania ilościowego za pomocą jednokomórkowej cytometrii przepływowej należy dostosować gęstość optyczną próbek, aby ułożyć je odpowiednio do pomiaru cytometrycznego.

Zastosuj podany wzór, aby upewnić się, że liczba komórek pozostaje w zakresie od 1 000 do 10 000 komórek na sekundę przy natężeniu przepływu 10 mikrolitrów na minutę. Przenieś 300 mikrolitrów zawiesiny każdej próbki do indywidualnego dołka w 96-dołkowej płytce. Następnie przenieś 96-dołkową płytkę do automatycznej próbki cytometru.

Otwarte wykresy punktowe i histogramy dla kanałów fluorescencji i rozproszenia istotnych dla próbek. Aby określić stężenie w komórkach, należy zarejestrować zdefiniowaną objętość próbki za pomocą funkcji rejestrowania. Oddziel sygnały dla organizmów foto- i heterotroficznych na podstawie czerwonej autofluorescencji organizmu fototroficznego za pomocą histogramu kanału APC-H.

Następnie użyj histogramu kanału FITC-H wyświetlającego tylko populację heterotroficzną, aby zidentyfikować komórki heterotroficzne zawierające zielone białko fluorescencyjne. Użyj histogramu kanału PC5.5-H, aby odróżnić komórki heterotroficzne zawierające białko czerwonej fluorescencji od tych bez niego.