Name: Składanie i kwantyfikacja kokultur łączących drożdże heterotroficzne z fototroficznymi cyjanobakteriami wydzielającymi cukier (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Poznaj metody składania i kwantyfikacji kokultur łączących cyjanobakterie wydzielające cukier z drożdżami heterotroficznymi. Protokół obejmuje etykietowanie fluorescencyjne, cytometrię przepływową i pomiar gęstości optycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) - SFB1535 - Project ID 458090666 (projekt B03 do KS, AM i IA), oraz Major Research Instrumentation INST 208/808-1. DCD przebywa obecnie w HHU Düsseldorf jako Mercator Fellow w SFB1535. Dodatkowego wsparcia dla EJK udzieliły nagrody National Science Foundation Awards #1845463 i #2334680.

Protocol for Co-Culturing Sucrose-Secreting Cyanobacteria with Fungal Partners

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Postępowanie z mikroorganizmami w kulturach jednoaksenicznych w kontekście laboratoryjnym jest znane od dziesięcioleci dla wielu modeli mikrobiologicznych. Mimo że dominującą formą życia w przyrodzie są zbiorowiska mikrobiologiczne, połączenie dwóch lub więcej partnerów w jednym naczyniu uprawowym jest mniej ugruntowane, a wyzwania wynikają z luk w istniejącej wiedzy i metodologii. Trudniej jest również przewidzieć zachowanie komórek w społeczności, ponieważ między komórkami zachodzą emergentne interakcje i wymiana metabolitów, co silnie wpływa na los kokultury34,35. W związku z tym ustanowienie wspólnej kultury nie jest trywialne, w tym na poziomie definicji pożywki wzrostowej, identyfikacji wspólnych warunków wzrostu, międzygatunkowej wymiany śladowych metabolitów/sygnałów i wynikającego z tego składu kokultury w czasie. Postęp, jaki dokonał się w ostatnich latach w łączeniu fototroficznych, wydzielających cukier sinic z heterotroficznymi partnerami, pozwala teraz wydedukować pierwsze zasady i metodologię, które mogą stanowić pomocną wskazówkę przy projektowaniu nowych par kohodowlanych. W oparciu o tę wiedzę, w pierwszej części niniejszego protokołu przedstawiono wytyczne krok po kroku dotyczące łączenia kokultur zawierających sinicę cyjanobakterię wydzielającą sacharozę i jedne lub więcej drożdży.
Jedną z kluczowych kwestii przy pierwszej próbie ustanowienia wspólnej kultury między niespokrewnionymi mikroorganizmami jest skład wspólnej pożywki, która spełnia wszystkie wymagania dotyczące składników odżywczych dla dwóch lub więcej gatunków. Ze względu na ograniczenia przestrzenne nie jest możliwe przedstawienie tutaj w pełni szczegółowego protokołu dla tego procesu, który w niektórych przypadkach może również wymagać wysokiego stopnia dostosowania, ale zamiast tego poniżej przedstawiono ważne kwestie, o których należy pamiętać. Jedno z prostych początkowych podejść polega na porównaniu typowej pożywki wzrostowej sinic (np. BG11; patrz Tabela 1) z dowolnymi ustalonymi minimalnymi pożywkami złożonymi dla interesujących gatunków heterotroficznych. Uzupełnienie wzorcowej pożywki sinicowej wszelkimi brakującymi składnikami, które są zawarte w pożywce heterotroficznej minimalnej, jest dobrym punktem wyjścia do wstępnych badań 8,36. Należy pamiętać, że ponieważ minimalne pożywki są często uzupełniane znaczącym źródłem węgla organicznego dla wzrostu heterotroficznego (np. 1%-4% glukozy), często są one zaprojektowane tak, aby wspierać wyższą gęstość komórek heterotrofalnych, niż jest to prawdopodobne w początkowych eksperymentach z kokulturą. Podobnie, niektóre popularne składniki pożywki mogą również działać jako źródło węgla organicznego niezależnie od fotosyntezy dostarczanej przez partnera cyjanobakteryjnego (np. cytrynian), co może komplikować późniejszą analizę kokultur sinic/heterotrofów. W związku z tym może nie być konieczne uzupełnianie minimalnej pożywki sinicowej o pełną koncentrację brakujących elementów podczas projektowania pożywki do kohodowli. Na przykład wiele organizmów różni się efektywnością wykorzystania różnych form azotu środowiskowego (np. N2, azotan, azotyny, mocznik) i może być całkowicie niezdolnych do wykorzystania niektórych bardziej utlenionych źródeł azotu. Podobnie wiele drobnoustrojów może wymagać suplementacji niezbędnych witamin (np. witaminy B12), kofaktorów lub aminokwasów egzogennych, ponieważ brakuje im kompletnych szlaków biosyntezy do bezpośredniej syntezy tych związków. Z tych powodów najbardziej praktyczne może być rozpoczęcie od prostego "połączenia" ustalonej minimalnej pożywki partnera sinicowego (np. BG11) z dobrze zdefiniowaną minimalną pożywką heterotrofu (np. syntetyczną zdefiniowaną [SD]). Późniejsze cykle wielokrotnego usuwania/redukowania zbędnych składników mogą być wykorzystane do optymalizacji pożywki i zmniejszenia obfitości wszelkich związków, które mogą hamować wzrost jednego z partnerów. Użytecznym punktem wyjścia jest buforowanie pożywki o neutralnym lub lekko zasadowym pH, ponieważ są to warunki preferowane przez większość modelowych gatunków sinic.
W tym momencie często pomocne jest przeprowadzenie wstępnych testów wzrostu wspieranego heterotrofu w nowej pożywce do kohodowli, gdy dostarczany jest nadmiar sacharozy. Oczywiście, wybierając potencjalny heterotrof, ważne jest, aby wybrać taki, który jest zdolny do katabolizowania głównego źródła (źródeł) węgla organicznego, który będzie dostarczany przez partnera sinicowego. Warto w tym miejscu zauważyć, że sacharoza, jako dominujący węglowodan dostarczany w wielu zmodyfikowanych kulturach sinicowych/heterotroficznych4, nie jest węglowodanem tak powszechnie wykorzystywanym przez drobnoustroje heterotroficzne jak glukoza: dedykowane transportery sacharozy muszą być kodowane przez gatunki heterotroficzne lub inwertazy zewnątrzkomórkowe mogą być niezbędne do przekształcenia sacharozy we fruktozę i glukozę, które są często rozpoznawane przez transportery o wyższym powinowactwie8. Ważną obserwacją często zgłaszaną przez wiele laboratoriów badających mieszane społeczności drobnoustrojów jest to, że między partnerami fototroficznymi i heterotroficznymi pojawiają się synergie i antagonizmy wyższego rzędu 4,8,13. Na przykład inne naturalnie wydzielane metabolity (np. kwasy organiczne, zredukowane formy azotu) lub kofaktory (np. siderofory) mogą umożliwiać wyższe tempo wzrostu jednego lub obu partnerów, gdy są hodowane w tym samym podłożu w porównaniu z kontrolami aksenicznymi. I odwrotnie, donoszono, że potencjalnie szkodliwe metaboliczne produkty uboczne, takie jak hiperoksygenacja pożywki przez fotosyntetyczne rozszczepianie wody, powodują międzygatunkowe hamowanie wzrostu u jednego lub obu partnerów8. W związku z tym kontrole akseniczne mogą stanowić użyteczny punkt odniesienia, ale wydajność kokultury może różnić się od oczekiwań ze względu na te wyłaniające się właściwości.
W zależności od partnera heterotroficznego i zdolności S. elongatus do wydalania sacharozy (w zależności od poziomu indukcji, zastosowanego stężenia IPTG), należy zbadać różne proporcje obu organizmów. Sukces kultur zależy przede wszystkim od zdolności S. elongatus do utrzymania wzrostu heterotroficznego partnera (tj. czy może on wyprodukować wystarczającą ilość źródła węgla). Podczas gdy przerost szczepu heterotroficznego jest zwykle ograniczony przez brak węgla organicznego w pożywce do kohodowli, cyjanobakterie mogą wyprzedzić heterotrof, co może prowadzić do nagłych interakcji hamujących (np. warunki hiperoksyczne 8,13). Przy próbie wstępnego określenia odpowiednich proporcji gęstości komórek dla drożdży cyjanobakterii, dobrą przybliżoną zasadą jest to, że partner cyjanobakteryjny może wspierać równą komórkę objętość towarzyszących komórek heterotroficznych. Ponieważ drożdże eukariotyczne mają zwykle znacznie większą objętość komórek niż modelowe cyjanobakterie wydzielające sacharozę, może to prawdopodobnie oznaczać, że gęstość komórek sinic będzie znacznie wyższa (np. 50-100 razy w przypadku S. cerevisiae) w stanie ustalonym. Dlatego dobrym punktem wyjścia do tworzenia nowej kokultury w warunkach laboratoryjnych i gatunkowych specyficznych dla badacza byłoby obliczenie średniej objętości komórek zarówno dla cyjanobakterii, jak i drożdży (na podstawie opublikowanych wartości; np. patrz B10NUMB3R537) w celu oszacowania stosunku objętościowego. Początkowe kolby mogą być wysiewane z takim stosunkiem komórek. Aby zbadać przestrzeń roztworu, badacz może chcieć utrzymać stężenie cyjanobakterii na stałym poziomie (np. OD750 = 0,3), jednocześnie zmieniając stężenie komórek drożdży w górę lub w dół o około rząd wielkości w krokach w oparciu o przepustowość dostępną dla badacza przestrzeń do uprawy fototroficznej. Oczywiście, ta wolumetryczna "reguła kciuka" zależy od szybkości, z jaką partner fototroficzny jest zdolny do wydzielania organicznych fotosyntez (np. sacharozy), które mogą być wykorzystane przez heterotroficznego partnera. Po ustaleniu warunków wspólnej uprawy, dokładne monitorowanie wydajności wzrostu obu partnerów w czasie dostarczy cennych danych dotyczących idealnych proporcji gatunków, zwłaszcza jeśli wczesne kokultury mogą być utrzymywane przez dni lub tygodnie, co pozwoli badaczowi określić stosunek stanu ustalonego osiągnięty pod koniec kokultury. Informacje te mogą być wykorzystane przy wyborze początkowej gęstości inokulacji dla każdego gatunku partnerskiego w kolejnych eksperymentach, aby pomóc kulturze szybciej osiągnąć samodzielnie ustalony idealny stosunek gatunków.
W drugiej części protokołu znajdują się szczegółowe instrukcje dotyczące analizy współkultur. Wiarygodna kwantyfikacja kokultur jest kluczem do ich pomyślnego wdrożenia: wzrost (lub przynajmniej aktywność metaboliczna) fototropowego partnera wydzielającego węgiel jest niezbędny do utrzymania heterotrofów. Podczas gdy stosunek cyjanobakterii do heterotrofu użytego do zaszczepienia kultury może nie zawsze być krytyczny do optymalizacji, ponieważ długoterminowe kokultury mają tendencję do zbliżania się do stabilnych proporcji, ważne może być zintegrowanie metod kontroli nieograniczonego wzrostu któregokolwiek z partnerów poprzez rozcieńczenie kultury lub enkapsulację jednego lub więcej gatunków 36,38,39,40. Jak wspomniano powyżej, produkty uboczne partnera sinicowego mogą hamować heterotrof w wysokich stężeniach (np.O2), a niektóre produkty metabolizmu heterotroficznego mogą być również szkodliwe dla zdrowia sinic. Większość opublikowanych kokultur wykorzystuje heterotrofy, które mają szybsze tempo wzrostu niż większość modelowych gatunków sinic; W związku z tym tempo wzrostu heterotroficznego jest zwykle ograniczane przez dostarczanie węgla organicznego wytwarzanego przez Sinicę. Niemniej jednak określenie dynamiki liczebności gatunków w czasie jest krytyczną wartością dla wyjaśnienia błędów w stabilności i optymalizacji pod kątem solidnych kokultur w uprawie długoterminowej.
Dostępne są protokoły oznaczania ilościowego przy użyciu komór zliczających, liczników cząstek i jednokomórkowej cytometrii przepływowej. Wszystkie techniki są cennymi narzędziami do charakteryzowania współkultur, jednak z różnymi warunkami wstępnymi, zaletami i ograniczeniami. Komory liczące mają bardzo szerokie zastosowanie do kwantyfikacji współkultur, pod warunkiem, że wszyscy partnerzy w kulturze mogą być wizualnie odróżnieni na podstawie kształtów komórek lub innych właściwości. Ogromną zaletą jest niska cena tego urządzenia, dzięki czemu jest ono w zasadzie osiągalne dla każdego laboratorium. Oprócz informacji na temat składu i proporcji różnych partnerów w kokulturze, można uzyskać wrażenie morfologii i dopasowania komórki oraz wykryć potencjalne zanieczyszczenia. Jednak zastosowanie komory liczącej jest również bardzo czasochłonne, wiąże się z dużym obciążeniem pracą i może obsługiwać tylko niską przepustowość.
Zarówno liczniki cząstek, jak i jednokomórkowa cytometria przepływowa zapewniają ogromne korzyści w postaci wysokiej przepustowości i wygodnej, oszczędzającej czas obsługi. Podczas gdy licznik komórek opiera się na wyraźnych różnicach w rozmiarach komórek partnerów we wspólnej hodowli, cytometria jednokomórkowa może również rozróżniać znaczniki fluorescencyjne, co daje możliwość ilościowego określenia kokultur z więcej niż dwoma członkami tego samego rozmiaru lub nawet dwoma różnymi mutantami tego samego organizmu na podstawie różnych markerów fluorescencyjnych. W podanym przykładzie sztucznego złożenia Synechocystis z S. cerevisiae i U. maydis, do rozróżnienia dwóch drożdży użyto wewnątrzkomórkowych reporterów fluorescencji mKate2 i eGFP. Te same reportery fluorescencyjne mogą być również wykorzystane do rozróżnienia dwóch genetycznie zmodyfikowanych szczepów tego samego organizmu (np . S. cerevisiae), których nie można było rozdzielić na podstawie samych ich właściwości rozpraszania światła. Podobne strategie zostały wdrożone w celu śledzenia konsorcjów bakterii syntetycznych41. W zależności od typu komórki, liczby partnerów w konsorcjum i ich potencjalnego zakresu autofluorescencji, wybór markerów fluorescencyjnych wymaga dodatkowej uwagi, aby uniknąć nakładania się jakości widmowych, szczególnie biorąc pod uwagę właściwości autofluorescencyjne cyjanobakterii. 42 Rozdział 42
Opowiadamy się tutaj za przestrzeganiem zasad przewodnich FAIR w zakresie przechowywania, zarządzania i udostępniania danych naukowych. FAIR to akronim oznaczający Findable, Accessible, Interoperable i Reusable43. W miarę jak zasady te zyskują coraz szerszą akceptację, obiecują przekształcić krajobraz badań biologicznych, promując bardziej otwarte, oparte na współpracy i efektywne podejście do zarządzania danymi i ich wykorzystania. Chociaż kluczowe elementy dostępności można zapewnić poprzez deponowanie danych w anotowanym kontekście badawczym (ARC)44, ważne jest, aby umożliwić odtworzenie etapów przetwarzania danych za pomocą oprogramowania o otwartym dostępie. Surowe pliki FCS przechowują zarówno dane, jak i metadane (informacje o laserach i detektorach, w tym długości fal, filtry itp.) dotyczące eksperymentów z cytometrią przepływową45. Mogą być ładowane i odczytywane poza zastrzeżonym oprogramowaniem, które pozwala na zaawansowaną analizę danych, np. dostępnych jest wiele pakietów do pracy z surowymi danymi w środowisku Pythona. Opracowany pakiet pokazuje, jak ładować, odczytywać i wizualizować surowe pliki .fcs zawierające dane cytometryczne poza zastrzeżonym oprogramowaniem przy użyciu jednego z wielu dostępnych pakietów w Pythonie23. Korzystanie z otwartego oprogramowania, takiego jak opisane powyżej, eliminuje konieczność ponoszenia kosztownych opłat licencyjnych związanych z oprogramowaniem własnym, zapewnia pełną kontrolę nad przetwarzaniem danych (np. transformacja, kompensacja, bramkowanie) oraz dodatkowo umożliwia integrację wielu narzędzi w jednym miejscu.
Cenną dodatkową korzyścią płynącą z zastosowania cytometrii jednokomórkowej w połączeniu z sortownikiem komórek jest możliwość zbierania komórek innego typu za pomocą FACS. Może to być niezwykle cenne dla zastosowania wszelkich technologii -omicznych w celu uzyskania szczegółowego wglądu w interakcje gatunków w obrębie kokultury, takich jak RNASeq lub metabolomika. Wyraźnym minusem tych urządzeń są ich wysokie ceny, więc przystępność cenowa i dostępność takich maszyn może być pozornym ograniczeniem w niektórych laboratoriach.
Co ciekawe, bezpośrednie porównanie przedstawionych metod kwantyfikacji trzech partnerów w konsorcjum wykazało bardzo dobrą zgodność między różnymi technikami, co wskazuje, że mieszanina, która została zebrana na podstawie pomiarów OD, jest wiarygodnie określana ilościowo wszystkimi opisanymi metodami. Co ciekawe, całkowita liczba cyjanobakterii była około 3-4 razy wyższa niż liczba dwóch gatunków drożdży, co prawdopodobnie wynika z ich mniejszego rozmiaru komórek. Spostrzeżenie to jest w pełni zgodne z powszechną wiedzą, że OD nie dostarczają informacji o rzeczywistej liczbie komórek bez kalibracji46. Drożdże wykazały jednak liczebność na porównywalnym poziomie (tab. 2 i tabela 3). Ponadto porównanie z oznaczaniem ilościowym pojedynczych kultur pokazuje, że wszystkie trzy metody są wiarygodnymi narzędziami do rozróżniania typów komórek, z wyjątkiem licznika cząstek, który nie oddzielił dwóch gatunków drożdży.
Zasadniczo zastosowania cytometrii jednokomórkowej są zdecydowanie najpotężniejszym narzędziem do monitorowania składu kokultur, pozwalającym na liczenie 1000-10 000 komórek na sekundę. Jest to szczególnie ważne, jeśli liczba partnerów wzrasta do więcej niż dwóch lub jeśli partnerzy są podobni pod względem kształtu i/lub średnicy. Warto zauważyć, że istnieje wiele alternatyw, które umożliwiają monitorowanie kokultur. Wzrost drobnoustrojów znakowanych fluorescencyjnie w kokulturach można na przykład śledzić w sposób ciągły za pomocą fluorymetrii lub mikrobioreaktorów47. Są one jednak często ograniczone do wspólnej hodowli dwóch partnerów i wymagają starannego zaprojektowania eksperymentalnego, na przykład przy wyborze markerów fluorescencyjnych. Sekwencjonowanie amplikonów (sekwencjonowanie 16S rRNA) i inne techniki sekwencjonowania nowej generacji w połączeniu z zaawansowaną bioinformatyką to kolejna opcja charakterystyki społeczności syntetycznych 48,49,50. Techniki te są odpowiednie dla podejść o wysokiej przepustowości i mogą zajmować się ustalonymi interakcjami w długoterminowych uprawach, pytaniach ewolucyjnych lub śledzeniu mutacji z wieloma partnerami mikrobiologicznymi.
Podsumowując, uproszczone współkultury mikrobiologiczne, które są racjonalnie zaprojektowane, zapewniają potężne "oddolne" podejście do badania dynamiki międzygatunkowej, która może być trudniejsza do podejścia w społecznościach wielogatunkowych, które dominują w świecie przyrody 51,52,53. W niniejszym dokumencie przedstawiono uproszczony protokół, który może być łatwo zaadaptowany przez społeczność naukową do tworzenia i analizy nowych par cyjanobakterii i partnerów heterotroficznych. Oczywiste jest, że potrzeba wielu badań, zarówno aby wykorzystać potencjalne fundamentalne spostrzeżenia, które można uzyskać ze sztucznych współkultur mikroorganizmów, jak i określić, czy syntetycznie zaprojektowane konsorcja mikrobiologiczne mogą dorównać potencjałowi często przypisywanemu im w literaturze do zastosowań biotechnologicznych.

Dzięki szybkiemu rozwojowi narzędzi genomicznych i technologii DNA w ostatnich latach, wysiłki bioinżynieryjne są coraz częściej w stanie uznać mieszane społeczności mikrobów za opłacalne dla strategii bioprodukcji, zamiast skupiać się wyłącznie na kulturach aksonicznych. Konsorcja mikrobiologiczne mają wiele potencjalnych zalet w stosunku do kultur jednogatunkowych, w tym specjalizację i podział pracy, zdolność adaptacji i wytrzymałość oraz efektywność wykorzystania substratów1. Jednak przewidywalna inżynieria konsorcjów wielogatunkowych jest skomplikowana przez niepewności spowodowane zachowaniami wyższego rzędu, które wyłaniają się z interakcji międzygatunkowych2. Sygnalizacja międzygatunkowa i wymiana metabolitów leżą u podstaw zasady podziału pracy, ale prowadzą również do nieoczekiwanych synergii i antagonizmów między uczestnikami konsorcjów3. Znaczny postęp w tej dziedzinie jest konieczny, jeśli można w pełni wykorzystać potencjał mieszanych konsorcjów mikrobiologicznych, w tym wykorzystanie elastycznych platform kohodowli z 2 i 3 partnerami, które można wykorzystać do lepszego scharakteryzowania i zrozumienia interaktywności drobnoustrojów od "dołu do góry".
Obecnie w tej dziedzinie używa się kilku dominujących typów platform kokulturowych, w tym uzupełniających partnerów auksotroficznych i mikrobów, które wydzielają metabolity, które są ogólnie korzystne dla szerokiego zakresu gatunków drobnoustrojów. W tej drugiej kategorii cyjanobakterie zostały zmodyfikowane tak, aby stały się ulepszonymi producentami pierwotnymi poprzez wprowadzenie szlaków, które prowadzą do wydzielania łatwo metabolizowanych węglowodanów, a obecnie są badane w różnych racjonalnie zaprojektowanych konsorcjach. Krótko mówiąc, w tak zmodyfikowanych zbiorowiskach mikrobiologicznych partner cyjanobakteryjny jest w stanie wykorzystywać światło i CO2 jako główne wejściówki, a dzięki procesowi fotosyntezy tlenowej szczepy te mogą wydzielać centralne cukry węglowe jako dobro publiczne. Jedną z klas takich zmodyfikowanych szczepów sinic są te, które zostały zaprojektowane do wydzielania disacharydu sacharozy4. Takie szczepy prawdopodobnie odniosły sukces, ponieważ sacharoza jest metabolitem, który jest bliski centralnemu metabolizmowi węgla u wielu gatunków, a także często jest nadmiernie akumulowany jako tak zwana "kompatybilna substancja rozpuszczona", aby przystosować się do różnych środowiskowych stresów abiotycznych5. Minimalna liczba interwencji genetycznych może prowadzić do efektywnego wydzielania sacharozy w szeregu organizmów modelowych sinicowatych4.
Sinice wydzielające sacharozę są użyteczną platformą do badania racjonalnie zaprojektowanych konsorcjów mikrobiologicznych, ponieważ szeroki zakres gatunków heterotroficznych może metabolizować sacharozę jako dominujące źródło węgla i energii. Rzeczywiście, wykorzystując kilka modelowych cyjanobakterii o zdolnościach wydzielania sacharozy, wiele laboratoriów racjonalnie zaprojektowało mieszane gatunki kokultur i konsorcja, które zawierają jeden lub więcej heterotroficznych mikroorganizmów i które są ostatecznie wspierane przez podstawowe dane wejściowe światła i CO2 bez suplementacji organicznych surowców węglowych4. Szczepy heterotroficzne mogą po prostu przetrwać na węglowodanach pochodzących z sinic lub mogą być wykorzystane do przekształcenia sacharozy w bioprodukty o wyższej wartości (np. paliwa, polimery, pigmenty itp.). Takie uproszczone współkultury mogą być nie tylko potencjalną strategią na rzecz zrównoważonej bioprodukcji, ale także jako platforma do badania pojawiających się interakcji między niespokrewnionymi gatunkami drobnoustrojów.
Ten artykuł wideo skupia się na metodologiach i wymaganiach wstępnych dotyczących wykorzystania cyjanobakterii produkujących cukier jako elastycznej platformy do projektowania prostych konsorcjów mikrobiologicznych, które mogą być stabilne poprzez uzupełnianie tylko lekkiego i nieorganicznego węgla wejściowego. Podczas gdy konfiguracja i monitorowanie kultur zawierających pojedyncze mikroorganizmy jest w większości proste i można je łatwo osiągnąć przy użyciu metodologii gęstości optycznej (OD) lub rozpraszania wstecznego, nie jest to wykonalne, gdy dwa lub więcej organizmów zostanie połączonych w jednym naczyniu. Głównym powodem jest to, że metody te nie rozróżniają różnych mikroorganizmów, a zatem zapewniają jedynie ogólny obraz kultury i nie rozwiązują problemu wzrostu poszczególnych organizmów. Co więcej, cyjanobakterie mają szerokie spektrum absorpcji w zakresie 400-750 nm, więc pomiar OD600 heterotrofu doprowadziłby do fałszywych wyników z powodu fikocyjaniny (która absorbuje się w 620 nm). W związku z tym zapewniono szczegółowe protokoły tworzenia mieszanych zbiorowisk sinic i heterotrofów w laboratorium, a także przydatne protokoły ogólne do analizy wydajności tych konsorcjów w czasie. Podczas gdy protokoły koncentrują się na konkretnym parowaniu modelowych, wydzielających sacharozę gatunków sinic z jednym lub kilkoma modelowymi mikroorganizmami heterotroficznymi, celem tej pracy jest zapewnienie zasobów dla badaczy, którzy mogą chcieć zaprojektować nowe pary gatunków i przyspieszyć fazę optymalizacji w celu ustanowienia takich kultur. W związku z tym, oprócz protokołów specyficznych dla gatunku, zawarte są informacje i strategie, które można wykorzystać do adaptacji i uogólnienia tych protokołów dla niestandardowych społeczności, zgodnie z potrzebami czytelnika.
Ze względu na elastyczność opisanej tutaj platformy do współhodowli, opisano protokoły dla wielu różnych gatunków heterotroficznych, które wcześniej były zgłaszane w ko-hodowli z cyjanobakteriami wydzielającymi cukier. Na przykład przedstawiono protokół krok po kroku dla kohodowli Synechococcus elongatus PCC 7942 z powszechnymi drożdżami laboratoryjnymi Saccharomyces cerevisiae. Jednak artykuł zawiera również protokoły, które są odpowiednie do oznaczania wydajności kokultur zawierających inne gatunki modelowe, w tym formę drożdży Ustilago maydis.
Artykuł skupia się na podstawowym zestawie protokołów niezbędnych do ustanowienia kokultury cyjanobakterii/heterotroficznej i przeprowadzenia podstawowej charakterystyki wydajności tych mieszanych konsorcjów w czasie. W szczególności położono nacisk na cytometrię przepływową pojedynczej komórki i metody liczenia cząstek odpowiednie do przeprowadzenia dokładnego spisu różnych gatunków, a także podejścia mikroskopowe do oceny morfologii komórek. Protokoły te mają służyć jako podstawa do dostosowania do potrzeb i dostępnego sprzętu. Co ważne, dostarczane są uwagi techniczne i inne kwestie, które są ważne dla ustanawiania i monitorowania kokultur w laboratorium. Na koniec zamieszczono przykłady niezastrzeżonych alternatyw dla analiz danych surowych plików FCS6 przy użyciu pakietów Pythona. Podsumowując, celem jest uczynienie technik współhodowli opartych na sinicach bardziej dostępnymi dla szerszego grona naukowców.

<table><tbody><tr><td>10x obiektyw Ph1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>46 04 01-9904</td><td></td></tr><tr><td>525/40 nm Filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0051</td><td>Filtr FITC (w laserze 488 nm)</td></tr> <tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy 660/10 nm</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0055</td><td>Kanał APC (w laserze 638 nm)</td></tr> <tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy 710/50 nm</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B71092</td><td>PC5.5 kanałowy (w laserze 561 nm)</td></tr><tr><td>Akcesoria do Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A35473</td><td>Kubki na próbki z pokrywkami</td></tr><tr><td>Rurka z otworem 30 &mu; M jak Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C92760</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>kapilarny Lab Associates</td><td>EQM-ARBP</td><td>do sterylizacji materiału</td></tr><tr><td>Kolby z przegrodami ROTILABO&reg;, Prosta szyjka, 250 ml</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>LY95.1</td><td></td></tr><tr><td>BG11 / CoYBG11 komponenty</td><td>różni dostawcy</td><td></td><td>patrz tabela 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Sterylny filtr butelkowy</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z222593</td><td>do sterylnych pożyw, jeśli nie chcesz używać autoklawu</td></tr><tr><td>Kapila 45 i mikro; m</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651738</td><td></td></tr><tr><td>CASY Licznik komórek Model TTC</td><td>Schaerfe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kubki CASY</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651794</td><td></td></tr><tr><td>CASYclean</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651786</td><td>Roztwór czyszczący</td></tr><tr><td>CASYton Omni</td><td>Life Science</td><td>OLS 5651808</td><td>Roztwór izotoniczny&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe (50 ml)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>BOC</td><td>270182-L</td><td>do dostarczania kultur aksenowych i kokultur sinic</td></tr><tr><td>CONTRAD&reg; 70</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>81911</td><td>Roztwór do głębokiego czyszczenia</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe 20 i razy; 26 x 0,4 mm</td><td>VWR International GmbH</td><td>631-1190</td><td>Szkło nakrywkowe do komory liczenia</td></tr><tr><td>Kuwety</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanobakterie BG-11 Roztwór słodkowodny</td><td>Merck KGaA</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>CytExpert Software v. 2.6</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Oprogramowanie aplikacyjne cytometru</td></tr><tr><td>CytoFLEX Sheath Fluid</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B51503</td> Cytometr <td>płynu Sheat</td></tr><tr><td>CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>BE51180</tr><tr><td>Środek czyszczący DxH do Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>628022</td><td>Roztwór czyszczący</td></tr><tr><td>Wirówka probówkowa Eppendorf (mała)</td><td>Labstac</td><td>CEN16-15</td><td>do odwirowania mniej niż 2 ml kultury</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K928.1</td><td></td></tr><tr><td>Probówki FACS</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>2523749</td><td>tubki do półautomatycznego</td></tr><tr><td>środka czyszczącego FlowClean, 500ml</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C48093</td><td>Codzienny czysty roztwór</td></tr><tr><td>Cylindry miarowe</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z131121</td><td>do przygotowania pożywek</td></tr><tr><td>HEPPSO</td><td>Merck KGaA</td><td>R426725</td><td></td></tr><tr><td>Infors MultiTron fotoinkubator</td><td>Infors AG</td><td></td><td>białe światło LED</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Merck KGaA</td><td>I6758</td><td>Przygotować porcje, przechowywać w temperaturze -20&deg; C, rozmrozić i trzymać na lodzie&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoton II do Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>8448011</td><td>Roztwór izotoniczny&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaluza v. 2.2</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B16406</td><td>Oprogramowanie do analizy danych cytometrycznych</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR International GmbH</td><td>115-2221</td><td>Niestrzępiące się chusteczki</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>KPO3</td><td>Noah Chemicals</td><td>7790-53-6</td><td></td></tr><tr><td>Zlewki miarowe</td><td>VWR</td><td>213-3747</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka testowa, 96-dołkowa, wsuwana pokrywa, płaska podstawa, PS, przezroczysta</td><td>SARSTEDT AG & Co. KG</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa mikroskopu</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 09 18-9902/16</td><td></td></tr><tr><td>Głowica mikroskopowa</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 30 14</td><td></td></tr><tr><td>System oczyszczania wody Milli-Q</td><td>Merck Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Licznik cząstek Mulitisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B23005</td><td>Alternatywa dla licznika komórek CASY</td></tr><tr><td>Neubauer ulepszony, głębokość 0,02 mm</td><td>Assistent Niemcy</td><td></td><td>Komora licząca</td></tr><tr><td>Neubauer ulepszona, głębokość 0,1 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>640010</td><td>Komora licząca</td></tr><tr><td>gotowa do użycia Codzienna kontrola jakości fluorosfer</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C65719</td><td>Odniesienie do</td></tr><tr><td>butelek QC SCHOTT</td><td>Dutscher</td><td>90347</td><td>do przechowywania</td></tr><tr><td>Specord&reg; Spektrofotometr 200 Plus</td><td>Analytic Jena GmbH</td><td></td><td>OD600/750</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Merck KGaA</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa (duża)</td><td>Labstac</td><td>CEN18-06R</td><td>zbiera biomasę kulturową</td></tr><tr><td>Drożdże Azot Zasada, bez aminokwasów, bez siarczanu amonu</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>11743014</tr></tbody></table>

składanie i kwantyfikacja kokultur łączących drożdże heterotroficzne z fototroficznymi cyjanobakteriami wydzielającymi cukier

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

Wraz z rosnącym zapotrzebowaniem na zrównoważone biotechnologie, mieszane konsorcja zawierające fototroficzne mikroby i heterotroficzne gatunki partnerskie są badane jako metoda bioprodukcji napędzanej energią słoneczną. Jedno z podejść polega na wykorzystaniu cyjanobakterii wiążących CO2 , które wydzielają węgiel organiczny w celu wsparcia metabolizmu współhodowanego heterotrofu, który z kolei przekształca węgiel w towary lub usługi o wyższej wartości. W niniejszym protokole przedstawiono opis techniczny, który ma pomóc eksperymentatorowi w ustanowieniu wspólnej kultury łączącej szczep sinic wydzielający sacharozę z partnerem (partnerami) grzyba, reprezentowanym przez modelowe gatunki drożdży. Protokół opisuje kluczowe warunki wstępne dla ustanowienia wspólnej kultury: określenie składu pożywki, monitorowanie cech wzrostu poszczególnych partnerów oraz analiza mieszanych kultur z wieloma gatunkami połączonymi w tym samym naczyniu wzrostowym. Podsumowano podstawowe techniki laboratoryjne do monitorowania kohodowli, w tym mikroskopię, licznik komórek i jednokomórkową cytometrię przepływową, a także przedstawiono przykłady niezastrzeżonego oprogramowania do analizy danych z plików standardowej cytometrii przepływowej surowej (FCS) zgodnie z zasadami FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable). Na koniec zamieszczono komentarz na temat wąskich gardeł i pułapek często napotykanych podczas prób ustanowienia wspólnej kultury z cyjanobakteriami wydzielającymi cukier i nowym heterotroficznym partnerem. Protokół ten stanowi zasób dla naukowców próbujących ustalić nową parę współhodowanych drobnoustrojów, która obejmuje cyjanobakterię i drobnoustroję heterotroficzną.

Ustanowienie kokultur fototroficznego S. elongatus i heterotroficznych drożdży 
Wcześniej przedstawiliśmy szczegółowe wyniki kokultywacji Synechococcus elongatus PCC 7942 z różnymi podszczepami S. cerevisiae. Kompleksowy opis wyników kokultur dla tej pary sinic i drożdży znajduje się w8. Ze względu na zwięzłość i dokładność wyniki te nie zostały tutaj powtórzone. W skrócie, wcześniejsze wyniki wskazują na szereg kwestii istotnych dla ustanowienia długoterminowych kokultur sinic i drożdży. Kluczową kwestią jest zdolność drożdży do przeżycia w warunkach, w których sinice stanowią jedyne źródło węgla organicznego, co w dużym stopniu zależy od wydajności, z jaką szczep drożdży potrafi wykorzystać sacharozę. Szczepy S. cerevisiae, które ewoluowały lub zostały zmodyfikowane genetycznie w celu bardziej wydajnego metabolizowania sacharozy27,28, wykazywały większą szansę na przeżycie przejścia do trybu wzrostu w kokulturze, osiągały wyższe gęstości komórkowe i wykazywały większą odporność w długoterminowych (od kilku dni do kilku tygodni) eksperymentach z kokulturami sinic8. Początkowa faza szczepienia kokultury była szczególnie istotna dla żywotności drożdży, prawdopodobnie ze względu na stresy wynikające z rozcieńczenia hodowli, zmiany składu pożywki i/lub wycofania bardziej skoncentrowanego źródła węgla. Dlatego działania mające na celu ułatwienie przejścia z bogatego pożywki do warunków minimalnej dostępności węgla podczas inicjacji kokultury mogą poprawić wydajność i powtarzalność eksperymentów (patrz krok 1.2.1.1). Dodatkowo S. cerevisiae wykazywały odpowiedzi stresowe charakterystyczne dla hiperoksji po zaszczepieniu do gęstych kultur S. elongatus, co jest zgodne z powstawaniem O2 jako głównego produktu ubocznego tlenowej fotosyntezy. W związku z tym działania mające na celu zapobieganie nadmiernemu rozrostowi partnera sinicowego i/lub stosowanie naprzemiennych cykli świetlnych „dzień/noc” mogłyby znacznie wydłużyć żywotność S. cerevisiae w długoterminowych kokulturach. Dodatkowe podsumowanie zjawisk powszechnych w kokulturach w odniesieniu do aksenicznych próbek kontrolnych znajduje się w sekcji Dyskusja.
Monitorowanie wzrostu kokultur przy użyciu różnych metodologii 
W następnej sekcji opisano przykładową kwantyfikację sztucznie zmieszanego, trójskładnikowego konsorcjum Synechocystis oraz dwóch drożdżowych gatunków S. cerevisiae i U. maydis przy użyciu trzech różnych metod. Dla mieszaniny wyznaczono i dostosowano do OD 0,1 wartości OD750 (dla cyjanobakterii) oraz OD600 (dla heterotrofów) kultur pojedynczych. Kultury pojedyncze zmieszano w stosunku 1:1:1, opierając się na gęstości optycznej (co różni się od liczenia komórek, patrz wyżej). Aby ułatwić rozróżnienie drożdży w cytometrze, zastosowano szczepy reporterowe genetycznie zmodyfikowanych S. cerevisiae FY1679-O1B29 konstytutywnie produkujących cytoplazmatyczne mKate2 (genotyp: URA3Δ/pTDH3::mKate2; szczep: S. cerevisiae mKate230) oraz szczep U. maydis AB3331 konstytutywnie produkujący eGFP (genotyp: pep4Δ/pRpl40::egfp; szczep: U. maydis eGFP32). Należy zaznaczyć, że szczep cyjanobakterii posiadał plazmid replikacyjny promujący konstytutywną, silną ekspresję wersji żółtego białka fluorescencyjnego mVenus (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus, szczep Synechocystis mVenus, podobnie jak w33), a ponadto wykazuje typową silną autofluorescencję ze względu na obecność aparatu fotosyntetycznego.
Ilościowe oznaczanie mikroskopowe z użyciem komór licznikowych: Wszystkie typy komórek w zastosowanej sztucznej mieszaninie trzech mikroorganizmów można łatwo rozróżnić pod mikroskopem (Rycina 2A): Synechocystis i S. cerevisiae reprezentowane są przez komórki sferyczne, które różnią się jednak znacząco pod względem średnicy (Synechocystisśrednica ok. 1,5-3 µm, S. cerevisiae: przybliżona średnica 3-6 µm), podczas gdy U. maydis komórki mają wydłużoną morfologię w kształcie cygara i długość co najmniej 10 µm (Rysunek 2A). Te wyraźne cechy morfologiczne pozwalają na dokładną kwantyfikację każdego partnera w mieszaninie. Jako przykład ilustracyjny, 37, 18, 36 i 21 S. cerevisiae komórki są zliczane odpowiednio w czterech dużych kwadratach (Rysunek 2B). Wartość średnia wynosi 28 komórek. Ponieważ duży kwadrat użytego komory licznikowej ma powierzchnię 1 mm2 a głębokość komory wynosiła 0,02 mm, co przekłada się na 28 komórek na 0.02 µLOdpowiada to 1400 komórkom/µL, co odpowiada wartości 1,4 x 106 komórek/ml. Policzono pozostałe typy komórek i odpowiednio określono ich stężenia (Rysunek 2C, Tabela 2).
<img alt="Identyfikacja drobnoustrojów przy użyciu obrazowania SEM, tabeli danych, analizy wykresu kwadrantowego cytometrii przepływowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Mikroskopowa kwantyfikacja konsorcjum trójdzielnego składającego się z Synechocystis oraz drożdży S. cerevisiae i U. maydis. (A) Obraz mikroskopowy w kontraście różnicowym (DIC) sztucznie połączonej mieszaniny wskazanych mikroorganizmów. Wszystkie gatunki można łatwo rozróżnić na podstawie ich morfologii. Pasek skali: 10 µm. (B) Przykładowe wyniki zliczeń dla sztucznie przygotowanej mieszaniny wskazanych szczepów na podstawie kultur aksenicznych o OD wynoszącej 0.1. Przeanalizowano cztery duże kwadraty na krawędziach siatki (czerwki znacznik na Rysunku 1D). (C) Średnią wartość różnych komórek policzonych w czterech kwadratach wykorzystano do obliczenia stężenia komórek w zawiesinie za pomocą następującego równania: Wartość średnia/(głębokość komory [0.02 mm] x rozmiar liczonego kwadratu [1 mm2] x 1,000). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Ilościowe oznaczenie za pomocą liczników cząstek: Liczniki cząstek określają liczbę cząstek w zawiesinie w zależności od ich rozmiaru. W przykładowym zestawie danych wykorzystano licznik cząstek z kapilarą o średnicy 45 µm. Ponieważ komórki S. cerevisiae i U. maydis wykazują podobne wymiary, nie można ich rozróżnić w liczniku cząstek, natomiast mniejsze komórki Synechocystis mogą zostać wyraźnie odseparowane. Analiza monokultur wykazuje zatem piki w tych samych pozycjach, odpowiadające przedziałowi od 3 do 6 µm dla obu drożdży (Rysunek 3A). Podczas pomiaru przyłożone jest podciśnienie, które powoduje wniknięcie komórek do kapilary. Powoduje to krótkotrwałą zmianę oporności elektrycznej, dzięki czemu urządzenie może określić rozmiar cząstki na podstawie tej zmiany. W kulturze mieszanej można wykryć dwa wyraźne piki: jeden związany z mniejszymi komórkami sinic, a drugi reprezentujący wspólną frakcję obu gatunków drożdży (Rysunek 3B). Co istotne, oprócz pików odzwierciedlających żywe komórki, wykryto dodatkowe piki przy około 1 µm (Rysunek 3), odpowiadające szczątkom komórkowym i mniejszym cząstkom. Sygnały pojawiające się przy średnicach większych niż oczekiwano mogą być spowodowane agregacją komórek. Należy zauważyć, że kształt pików odzwierciedla homogeniczność komórek: ostry pik wskazuje na bardzo homogeniczne komórki, co jest mało prawdopodobne w przypadku kokultury. W kokulturze oczekuje się zobaczenia bardzo szerokiego piku lub nawet dwóch pików, jeśli partnerzy kokultury wyraźnie różnią się rozmiarem. Dla kultur aksenicznych grzybów heterotroficznych pik może być średnio szeroki.
<img alt="Wykresy rozkładu średnicy komórek dla Synechocystis, Ustilago i Saccharomyces w analizie kokultury." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ilościowe oznaczenie konsorcjum trzech gatunków składającego się z Synechocystis mVenus oraz drożdży S. cerevisiae mKate2 i U. maydis eGFP przy użyciu licznika cząsteczek. (A) Wynik wizualny analiz kultur aksenicznych trzech szczepów przedstawionych na wykresach (licznik komórek z kapilarą 45 µm). (B) Przykładowy plik z wynikiem wizualnym dla analizy sztucznego konsorcjum trzech gatunków w identycznych warunkach. Licznik cząsteczek nie pozwala na rozróżnienie dwóch gatunków drożdży, które oba są reprezentowane przez drugi piki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Ilościowe oznaczenie za pomocą cytometrii pojedynczych komórek: Wykorzystując cytometr przepływowy do analizy pojedynczych komórek, można łatwo rozróżnić poszczególne populacje komórek na podstawie ich właściwości (auto-)fluorescencji oraz rozpraszania światła. Komórki fototroficzne (Synechocystis) można odróżnić od komórek heterotroficznych (U. maydis oraz S. cerevisiae) na podstawie czerwonej autofluorescencji pigmentów fotosyntetycznych, która jest mierzona w kanale APC-H (Rysunek 4A). W oparciu o tę wstępną separację komórek fototroficznych i heterotroficznych, dwie populacje heterotroficzne można rozróżnić na podstawie ich markerów fluorescencyjnych: eGFP w kanale FITC-H oraz mKate2 w kanale PC5.5 (Rysunek 4B,C). Na wykresie kropkowym przedstawiającym właściwości rozpraszania wszystkich trzech populacji (FSC-H i FSC-Width) populacje te można również odróżnić, przy jedynie niewielkich nakładaniach między nimi (Rysunek 4D).
Przy zastosowaniu tej metody analizowano 10 µL rozcieńczonych próbek przy szybkości przepływu 10 µL/min, co pozwoliło na kwantyfikację około 70 000 komórek w ciągu 1 min. Około 60% tych komórek można było przypisać do Synechocystis (4,23 x 106 komórek/mL), podczas gdy pozostałe 40% rozłożyło się równomiernie pomiędzy U. maydis (1,35 x 106 komórek/mL) i S. cerevisiae (1,36 x 106 komórek/mL, Rycina 4E, Tabela 2).
<img alt="Wyniki cytometrii przepływowej; wykresy populacji komórek w kulturze mieszanej: heterotroficznych, eGFP, mKate2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Ilościowe oznaczenie konsorcjum trójdzielnego składającego się z cyjanobakterii Synechocystis mVenus oraz drożdży U. maydis eGFP i S. cerevisiae mKate2 przy użyciu cytometrii przepływowej pojedynczych komórek. Przykładowe wykresy uzyskane po pomiarze kultury mieszanej Synechocystis mVenus (ciemnozielony), U. maydis eGFP (jasnozielony) i S. cerevisiae mKate2 (czerwony) w stosunku ⅓ OD750 / ⅓ OD600 / ⅓ OD600 na cytometrze (A) przedstawiający histogram liczby zdarzeń i fluorescencji w kanale APC-H (ex.: 638 nm, em.: 660/10 nm) wszystkich komórek, służący do rozróżnienia komórek fototroficznych i heterotroficznych na podstawie ich autofluorescencji. (B) Histogram liczby zdarzeń i fluorescencji w kanale FITC-H (ex.: 488 nm, em.: 525/40 nm) wszystkich komórek heterotroficznych, służący do rozróżnienia komórek U. maydis eGFP i S. cerevisiae mKate2 na podstawie właściwości ich zielonej fluorescencji. (C) Histogram liczby zdarzeń i fluorescencji w kanale PC5.5-H (ex.: 561 nm, em.: 710/50 nm) wszystkich komórek heterotroficznych, służący do rozróżnienia komórek U. maydis eGFP i S. cerevisiae mKate2 na podstawie właściwości ich czerwonej fluorescencji. (D) Wykres kropkowy sygnałów rozproszenia w kanale FSC-Width względem FSC-H, służący do identyfikacji populacji komórek bez właściwości fluorescencyjnych. (E) Statystyki populacji, w tym liczba zdarzeń, wartości procentowe, średnie arytmetyczne i odchylenia standardowe (SD) odpowiednich kanałów fluorescencji. Całkowita liczba komórek wraz z ich rozmiarem i fluorescencją została określona w objętości 10 µL przy szybkości przepływu 10 µL/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
W celu porównawczej wizualizacji wyników różnych metod ilościowych, wyznaczone liczby komórek przedstawiono w poniższych dwóch tabelach (Tabela 2 i Tabela 3). Końcowe stężenia komórek określone przy użyciu trzech opisanych wcześniej metod mieszczą się w podobnym zakresie dla wszystkich metod. Cytometr wskazuje największą liczbę próbek, następnie licznik cząstek i analiza mikroskopowa, przy czym między metodami występuje spadek o około jeden rząd wielkości.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Współhodowla 1:1:1</td>
			<td>Fotometr</td>
			<td colspan="2">Cytometr</td>
			<td colspan="2">Licznik cząstek</td>
			<td colspan="2">Komora licznikowa do mikroskopii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Organizm</td>
			<td>OD750/600</td>
			<td>liczenie komórek</td>
			<td>komórek/ml</td>
			<td>liczba komórek</td>
			<td>komórek/ml</td>
			<td>liczenie komórek</td>
			<td>komórek/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,618</td>
			<td>1,36 x 106</td>
			<td rowspan="2">1,546*</td>
			<td rowspan="2">2,58 x 106*</td>
			<td>112</td>
			<td>1,40 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,541</td>
			<td>1,35 x 106</td>
			<td>89</td>
			<td>1,11 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>42,330</td>
			<td>4,23 x 106</td>
			<td>3,094</td>
			<td>5,16 x 106</td>
			<td>271</td>
			<td>3,39 x 106</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Porównanie różnych metod ilościowych: sztuczna kultura mieszana.Należy zauważyć, że U. maydis oraz S. cerevisiae nie można rozróżnić przy użyciu licznika cząstek (*).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Kultura jednorodna</td>
			<td>Fotometr</td>
			<td colspan="2">Cytometr</td>
			<td colspan="2">Licznik cząstek</td>
			<td colspan="2">Komora licznikowa do mikroskopii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Organizm</td>
			<td>OD (gęstość optyczna)750/600</td>
			<td>liczenie komórek</td>
			<td>komórek/ml</td>
			<td>liczenie komórek</td>
			<td>komórek/ml</td>
			<td>liczba komórek</td>
			<td>komórek/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.1</td>
			<td>38,936</td>
			<td>3,89 x 106</td>
			<td>1,928</td>
			<td>3,21 x 106</td>
			<td>403</td>
			<td>4,03 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.1</td>
			<td>36,927</td>
			<td>3,69 x 106</td>
			<td>2,465</td>
			<td>4,11 x 106</td>
			<td>307</td>
			<td>3,07 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus</td>
			<td>0.1</td>
			<td>127,864</td>
			<td>1,28 x 107</td>
			<td>8,186</td>
			<td>1,36 x 107</td>
			<td>428</td>
			<td>1,07 x 107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Porównanie różnych metod ilościowych: Kalibracja z kulturami pojedynczymi/aksenicznymi.

Ten protokół dostarcza wyczerpujących wytycznych dotyczących konfiguracji i ilościowego monitorowania kokultur, w tym fotoautotroficznych cyjanobakterii wydzielających cukier i drożdży heterotroficznych.

Składanie i kwantyfikacja kokultur łączących drożdże heterotroficzne z fototroficznymi cyjanobakteriami wydzielającymi cukier

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

Nasze badania mają na celu zrozumienie sieci mikrobiologicznych w syntetycznych konsorcjach z udziałem cyjanobakterii wydzielających sacharozę i grzybów heterotroficznych. W przeszłości mikrobiolodzy zwykle badali czyste kultury pojedynczych mikroorganizmów. Jednak w naturze drobnoustroje zwykle występują w konsorcjach, dlatego ważne jest, aby zrozumieć również sieci mikrobiologiczne w kulturach mieszanych.Jednym z głównych wyzwań jest znalezienie odpowiednich warunków wzrostu, w tym podłoża umożliwiającego wzrost wszystkich członków konsorcjów. Tutaj skupiamy się głównie na optymalizacji pod kątem najwyższej produkcji i wydzielania sacharozy przez element fototroficzny, który stanowi podstawę do wzrostu członków heterotroficznych. Do śledzenia wzrostu w kulturach aksenicznych można zastosować popularne techniki, takie jak pomiary gęstości optycznej lub rozproszenia wstecznego.Techniki te nie mają jednak zastosowania do kokultur, w których potrzebujemy liczby komórek poszczególnych gatunków. W naszym protokole stosujemy kombinację znakowania fluorescencyjnego i zliczania komórek, aby rozróżnić różnych partnerów do wspólnej hodowli. Ponadto mogliśmy pokazać, że podobne wyniki można osiągnąć różnymi metodami, od prostych, tanich po drogie, o dużej przepustowości.Na początek osadź komórki cyjanobakterii po trzech dniach hodowli. Zawiesić osad w 25 mililitrach sterylnego podłoża CoYBG-11. Odwirować próbkę o masie 4 000 g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Następnie odrzucić supernatant przez dekantację. Po określeniu gęstości optycznej dodać obliczoną ilość CoYBG-11 do 250-mililitrowej kolby z przegrodą w sterylnych warunkach. Następnie dodaj obliczone objętości zawiesin komórek cyjanobakteryjnych i heterotroficznych, aby uzyskać końcową objętość kultury 50 mililitrów.Użyj 50 mikrolitrów z jednomolowego materiału IPTG do 50-mililitrowej hodowli. Następnie umieść kolbę w fotoinkubatorze przy około 200 mikromolach fotonów na metr kwadratowy na sekundę. Uzupełnij środowisko 2% dwutlenkiem węgla o temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsami orbitalnymi przy 150 obr./min i wilgotnością 75%.W celu pobrania próbek należy wyjąć kolbę z inkubatora i pobrać jednomililitrową próbkę z kultury w sterylnych warunkach. Aby przygotować się do mikroskopijnej oceny ilościowej, upewnij się, że komora liczenia i szkło nakrywkowe są wolne od kurzu i komórek. Ustaw szkiełko nakrywkowe prawidłowo, wsuwając je na dwie pręty nośne z niewielkim naciskiem, unikając pęknięcia.Po prawidłowym umieszczeniu szkła nakrywkowego obserwuj pierścienie Newtona między dwiema powierzchniami szkła, upewniając się, że szkło nakrywkowe się nie ślizga. Teraz dokładnie wymieszaj zawiesinę komórek i nałóż kilka mikrolitrów na krawędź komory. Pozwól, aby komora całkowicie się napełniła za pomocą siły kapilarnej.Następnie użyj odpowiedniego obiektywu mikroskopu świetlnego i skup się na liniach siatki komory liczącej. Policz komórki w kwadratach odpowiednich dla danego rozmiaru komórki. W celu określenia ilościowego przez zliczanie cząstek, należy dostosować gęstość optyczną próbki do 0,1.Następnie dodać 10 mikrolitrów próbki do 10 mililitrów izotonicznego buforu pomiarowego. Zabezpiecz pokrywkę kubka na próbkę i delikatnie wymieszaj próbkę, lekko przechylając kubek. Po umieszczeniu kubka na próbkę w liczniku cząstek, włóż do kubka na próbkę kapilarę o odpowiedniej wielkości porów dla wykorzystanych komórek i zamknij drzwi maszyny.Rozpocznij pomiar i zapisz w odpowiednim zakresie. Na tym etapie można rozróżnić komórki o różnych rozmiarach. W celu oznaczania ilościowego za pomocą jednokomórkowej cytometrii przepływowej należy dostosować gęstość optyczną próbek, aby ułożyć je odpowiednio do pomiaru cytometrycznego.Zastosuj podany wzór, aby upewnić się, że liczba komórek pozostaje w zakresie od 1 000 do 10 000 komórek na sekundę przy natężeniu przepływu 10 mikrolitrów na minutę. Przenieś 300 mikrolitrów zawiesiny każdej próbki do indywidualnego dołka w 96-dołkowej płytce. Następnie przenieś 96-dołkową płytkę do automatycznej próbki cytometru.Otwarte wykresy punktowe i histogramy dla kanałów fluorescencji i rozproszenia istotnych dla próbek. Aby określić stężenie w komórkach, należy zarejestrować zdefiniowaną objętość próbki za pomocą funkcji rejestrowania. Oddziel sygnały dla organizmów foto- i heterotroficznych na podstawie czerwonej autofluorescencji organizmu fototroficznego za pomocą histogramu kanału APC-H.Następnie użyj histogramu kanału FITC-H wyświetlającego tylko populację heterotroficzną, aby zidentyfikować komórki heterotroficzne zawierające zielone białko fluorescencyjne. Użyj histogramu kanału PC5.5-H, aby odróżnić komórki heterotroficzne zawierające białko czerwonej fluorescencji od tych bez niego.

assembly-quantification-co-cultures-combining-heterotrophic-yeast

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Jiang, H., Ho, M. Izolacja i charakterystyka nienaruszonego fikobilisomu w cyjanobakteriach. J. Vis. Exp.(2021).Ten film przedstawia procedurę hodowli sinic w celu uzyskania biomasy poprzez hodowlę komórek w ciągłym oświetleniu z dopływem dwutlenku węgla i warunkami bogatymi w składniki odżywcze, a następnie zbieranie przez wirowanie.

Przygotowanie kultury sinic do produkcji biomasy

Zaprojektowaliśmy aparat do ciągłej hodowli do użytku z systemami optogenetycznymi do oświetlania kultur mikrobów i regularnego obrazowania komórek w ściekach za pomocą mikroskopu odwróconego. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje na oświetlenie mogą być mierzone przez kilka dni.

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak i) złożyć samoreplikujący się wektor za pomocą modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate, ii) wprowadzić wektor do sinicowego gospodarza przez koniugację, oraz iii) scharakteryzować transgeniczne szczepy sinic za pomocą czytnika płytek lub cytometrii przepływowej.

Modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Obecny protokół szczegółowo opisuje izolację fikobilisomów z cyjanobakterii poprzez wirowanie przez nieciągły gradient gęstości sacharozy. Frakcje nienaruszonych fikobilisomów potwierdza widmo emisji fluorescencji 77K i analiza SDS-PAGE. Otrzymane frakcje fikobilisomów nadają się do barwienia ujemnego TEM i analizy spektrometrii mas.

Izolacja i charakterystyka nienaruszonego fikobilisomu u cyjanobakterii

W tym badaniu, głównym celem było monitorowanie wychwytu komórkowego i ewentualnej egzocytozy nanorurek węglowych (CNT). Z tej perspektywy zaproponowaliśmy tutaj unikalną metodę wykorzystującą obrazowanie wielospektralne cytometrii przepływowej, pozwalającą na kwantyfikację i lokalizację CNT w statystycznie istotnej liczbie komórek.

Lokalizacja i względna kwantyfikacja nanorurek węglowych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Opisano metodę otrzymywania nanowłókien i złożonych nanostruktur z pojedynczych lub wielu białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje interakcje białko-powierzchnia do tworzenia wolnostojących materiałów na bazie białek o przestrajalnym składzie i architekturze do wykorzystania w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej i biotechnologii.

Nanowłókna i nanostruktury białkowe ECM zaprojektowane przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Poznaj metody składania i kwantyfikacji kokultur łączących cyjanobakterie wydzielające cukier z drożdżami heterotroficznymi. Protokół obejmuje etykietowanie fluorescencyjne, cytometrię przepływową i pomiar gęstości optycznej.

Składanie i kwantyfikacja kokultur łączących drożdże heterotroficzne z fototroficznymi cyjanobakteriami wydzielającymi cukier

Przeglądaj więcej filmów