Tanie projekty mikrofluidyki laminacji politereftalanu etylenu do multipleksowanego obrazowania danio pręgowanego

Nasze laboratorium interesuje się mechanizmami regulującymi migrację i aktywację neutrofili w uszkodzeniach tkanek, infekcjach i nowotworach, ze szczególnym uwzględnieniem cech i biologicznego znaczenia wewnątrzkomórkowej sygnalizacji wapnia w gojeniu się ran.

Konwencjonalne metody projektowania mikroprzepływowego są kosztowne i złożone, co spowalnia postęp w dziedzinach takich jak biologia rozwojowa, które wymagają zróżnicowanych środowisk. Zauważyliśmy szybsze i wydajniejsze podejście do opracowywania i testowania indywidualnych projektów. Tak więc ta metoda budowy zapewnia większą elastyczność projektowania i rozdzielczość przestrzenną niż podobnie proste protokoły, umożliwiając jednocześnie szybszą i łatwiejszą iterację niż standardowe urządzenia PDMS. Korzystając z niego, opracowaliśmy RZODKIEWKĘ do jednoczesnego obrazowania wielu zarodków danio pręgowanego w jednym polu widzenia.

Dzięki temu urządzeniu do uwięzienia, które obsługuje obrazowanie życia w wysokiej rozdzielczości, jesteśmy w stanie zrozumieć, w jaki sposób różne sygnały, w tym bodźce chemiczne i mechaniczne, integrują się w celu koordynowania stanu zapalnego i gojenia się ran.

[Instruktor] Aby rozpocząć, zaprojektuj wzór dla urządzenia za pomocą wybranego oprogramowania. W zależności od wieku i wielkości zarodka dostosuj szerokość kanału i rozmiar centralnej komory obrazowania, aby uzyskać najlepsze dopasowanie. Zapisz każdą warstwę jako osobny plik obrazu o identycznych wymiarach. Teraz zainicjuj maszynę do cięcia zgodnie z instrukcjami producenta. W przestrzeni roboczej projektu wybierz nowo przesłane projekty. Grupuj wzory przeznaczone dla arkusza PET o tej samej grubości w tym samym kroju. Potwierdź liczbę i typ wzorów w wycięciu, a następnie wybierz cięty materiał. Następnie przymocuj arkusz PET do maty do cięcia na żądaną grubość, mocno dociskając, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i załaduj matę do maszyny do cięcia. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby poinstruować maszynę do cięcia o rozpoczęcie cięcia. Następnie usuń gotowe kawałki z maty do cięcia. Teraz wyrównaj warstwy na szkle nakrywkowym, samodzielnie lub z wstępnie wyciętymi znacznikami rejestracyjnymi. Zabezpiecz warstwy taśmą biurową, aby uniknąć przesuwania się podczas laminowania. W zależności od wielkości urządzenia i pojemności laminatora, małe konstrukcje należy montować na większym podłożu z większą ilością taśmy, aby uniknąć zakleszczenia lub zatkania zasilania laminatora. Następnie włącz laminator i laminuj zgodnie z instrukcjami producenta. Usuń taśmę biurową przed wyrównaniem następnej warstwy. Za pomocą kleju cyjanoakrylowego przymocuj urządzenie do 35-milimetrowej naczynia wywierconej z otworem o średnicy trzech czwartych cala. Następnie należy zaimpregnować laminat, dokładnie pokrywając zewnętrzne krawędzie urządzenia klejem cyjanoakrylowym. Użyj wystarczającej ilości kleju, aby całkowicie pokryć zewnętrzne krawędzie bez szczelin. Na początek należy wyhodować zarodki danio pręgowanego co najmniej dwa dni po zapłodnieniu w E3 lub innym odpowiednim podłożu do hodowli zarodków. Następnie znieczulij zarodki za pomocą 164 miligramów na litr MS-222. Następnie napełnij naczynie zawierające zamontowane urządzenie pięcioma mililitrami E3 lub inną pożywką dla zarodków zawierającą 164 miligramy na litr MS-222. Za pomocą pipety transferowej umieść jeden znieczulony zarodek w każdej komorze podtrzymującej urządzenie. Następnie, za pomocą pętli włosowej, ustaw zarodki tak, aby ogon każdego zarodka wystawał do centralnej komory obrazowania, a żółtko unieruchomione w kanale w kształcie klina. W razie potrzeby zabezpiecz głowę zarodka, dodając 1,5% niskotopliwej agarozy do komory trzymania za pomocą mikropipety. Na koniec przenieś urządzenie z zarodkami do wybranego systemu obrazowania, aby rozpocząć obrazowanie, wybierz odpowiedni system obrazowania i cel eksperymentu. Dostosuj ostrość próbki i parametry obrazowania, aby uzyskać optymalny stosunek sygnału do szumu i szybkość akwizycji. Aby zranić zarodek poprzez ręczną transcięcję, należy przyłożyć ostrze skalpela do tkanki płetwy ogonowej na końcu struny grzbietowej pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie przywróć urządzenie na scenę. Aby zranić zarodek za pomocą stymulacji laserowej, zdefiniuj obszar zainteresowania w pobliżu krawędzi fałdu płetwy ogonowej i stymuluj zgodnie z dostępną mocą lasera. Zobrazuj zarodek w temperaturze pokojowej za pomocą kanału GFP i RFP z odstępem jednej minuty, co daje łącznie jedną godzinę. W razie potrzeby uwolnij zarodki po obrazowaniu, delikatnie odsysając je w pobliżu głowy za pomocą pipety transferowej lub obracając naczynie.