Model kohodowli z wykorzystaniem dwóch typów przylegających linii komórkowych
8 listopada 2024
Protokół pokazuje nowatorski model eksperymentalny in vitro, który może podsumować biologię dwóch rodzajów przylegających linii komórkowych za pomocą trójwymiarowego (3D) wydrukowanego rusztowania. Opisano budowę tego modelu i procedury operacyjne, od przygotowania komórek i hodowli komórek po analizę i ocenę.
Jak sugeruje nazwa naszej placówki, Instytut Medycyny Matczyno-Płodowej, nasze badania koncentrują się głównie na biologii rozrodu kobiet. Naszym celem jest zrozumienie mechanizmu zaburzeń rozrodu i zidentyfikowanie potencjalnych celów ich leczenia. Jedną z kluczowych zalet tego podejścia jest znaczne skrócenie czasu i zmniejszenie wydatków w porównaniu z dostępnymi na rynku systemami współhodowli.
Domowe rusztowanie jest zbudowane z łatwo dostępnych materiałów, co znacznie obniża koszt montażu. Te wielokomórkowe modele in vitro lepiej reprezentują złożoną anatomię in vivo regionu implantacji. W przyszłości nasze laboratorium wprowadzi inne typy komórek do tego wielokomórkowego modelu in vitro z mieszanym wysiewem i zbada więcej zarówno badań nad implantacją, jak i funkcją macicy w patogenezie chorób, takich jak uszkodzenie endometrium i przyleganie wewnątrzmaciczne.
Aby rozpocząć, zdobądź rusztowanie wydrukowane w 3D do budowy modelu. W przypadku hodowli komórkowej umieść czyste i sterylne kwadratowe szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 milimetrów na dnie 12-dołkowej płytki. Pokryj szkiełko nakrywkowe 200 mikrolitrami macierzy zewnątrzkomórkowej o stężeniu od 200 do 300 mikrogramów na mililitr.
Trzymaj talerz w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie usuń macierz zewnątrzkomórkową z płytki. Następnie należy sprawdzić wcześniej wyhodowane ludzkie embrionalne komórki macierzyste i komórki Ishikawy pod mikroskopem, aby potwierdzić odpowiednią konfluencję.
Następnie usuń zużyte podłoże z dołków i umyj komórki dwukrotnie trzema mililitrami PBS. Teraz inkubuj komórki z dwoma mililitrami enzymu dysocjacyjnego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty, aby je odłączyć. Zneutralizować reakcję za pomocą kompletnej pożywki hodowlanej.
Następnie utwórz zawiesinę jednokomórkową, pipetując w górę i w dół. Teraz wymieszaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek z błękitem trypanowym, utrzymując współczynnik rozcieńczenia równy dwa. Następnie nasuń szkiełko nakrywkowe na komorę hemocytometru.
Wypełnić obie boczne komory zawiesiną komórek zmieszaną z błękitem trypanowym. Policz liczbę komórek w kwadratach po obu stronach pod mikroskopem 20X i oblicz gęstość komórek na podstawie zliczeń. Teraz wysiej ludzkie embrionalne komórki macierzyste w stężeniu 10 do mocy pięciu komórek na mililitr na przygotowanej płytce zawierającej świeżą pożywkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.
W przypadku linii komórkowej Ishikawy należy następnego dnia wysiać komórki do studzienki bez szkiełka nakrywkowego. Dokładnie namocz rusztowania w alkoholu etylowym i podwójnie destylowanej wodzie przez dwa dni. Po namoczeniu usuń podwójnie destylowaną wodę i zamknij metalową puszkę.
Następnie wysterylizuj rusztowania za pomocą autoklawu w temperaturze 121 stopni Celsjusza. Następnie pozwól im wyschnąć. Dodaj około dwóch mililitrów pożywki komplementarnej do studzienki z komórkami Ishikawy.
Przenieś szkiełko nakrywkowe z dołączonymi ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi na rusztowanie, ustawiając komórką do dołu. Podłącz rusztowanie do studzienki zawierającej komórki Ishikawy. W przypadku drugiego ustawienia umieść szkiełko nakrywkowe z komórkami Ishikawy na rusztowaniu i podłącz je do studzienki zawierającej embrionalne komórki macierzyste.
Inkubuj systemy kokultur w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Ostrożnie wyjmij pożywkę hodowlaną z dołków i delikatnie przepłucz komórki sterylnym PBS. Za pomocą cienkich kleszczyków lub pęsety usuń szkiełka nakrywkowe z przyczepionymi komórkami z szalek hodowlanych.
Opcjonalnie umieść szkiełka nakrywkowe w nowym naczyniu z PBS, aby utrzymać je nawodnione podczas procesu przenoszenia. Dodaj kroplę PBS na czysty szkiełko mikroskopowe i delikatnie przenieś szkiełko nakrywkowe zawierające komórki na kroplę, upewniając się, że komórki są skierowane w dół na szkiełku. Umieść przygotowane szkiełko na stoliku odwróconego mikroskopu.
Wybierz odpowiednią soczewkę obiektywu i użyj pokręteł zgrubnej i precyzyjnej ostrości, aby wyregulować ostrość. Ustaw parametry mikroskopu, w tym intensywność oświetlenia i ustawienia kamery. Użyj oprogramowania mikroskopu, aby rejestrować obrazy w żądanych powiększeniach i polach widzenia.
Gęstość obu typów komórek pozostała niska w warunkach jednoczesnej hodowli po 72 godzinach, podczas gdy gęstość komórek hodowanych niezależnie znacznie wzrosła. Długość współhodowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych była krótsza niż tych hodowanych niezależnie.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowatorski model in vitro do badania biologii rozrodu kobiet z wykorzystaniem ekonomicznego, wydrukowanego w technologii 3D rusztowania do podtrzymywania hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych oraz linii komórkowych Ishikawa. Wielokomórkowy model in vitro pozwala na dokładniejszą reprezentację obszaru implantacji i podkreśla korzyści wynikające z ograniczenia czasu i kosztów w porównaniu z tradycyjnymi systemami kokultury.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia rozrodu samic
- Zaburzenia rozrodu
- Techniki hodowli komórkowej
Wstęp
- Koncentracja na mechanizmach leżących u podłoża zaburzeń rozrodu
- Zidentyfikowanie potencjalnych celów terapeutycznych
- Kosztoefektywne alternatywy dla systemów dostępnych komercyjnie
Zastosowane metody
- Wydrukowane w technologii 3D rusztowania do hodowli komórkowej
- Ludzkie embrionalne komórki macierzyste oraz komórki Ishikawa jako system biologiczny
- Mikroskopia do oceny gęstości i morfologii komórek
Główne wyniki
- System kokultury utrzymywał niższą gęstość komórek niż w przypadku kultur niezależnych, dostarczając istotnych informacji na temat oddziaływań międzykomórkowych
- Zaobserwowano krótsze długości kokultywowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych
- Uzyskane wyniki stanowią podstawowe dane dla przyszłych badań nad implantacją i funkcją macicy
Wnioski
- Niniejsze badanie wykazuje możliwość zastosowania rusztowania wydrukowanego w technologii 3D w badaniach z zakresu biologii rozrodu in vitro
- Model ten może przyczynić się do zrozumienia patogenezy zaburzeń związanych z implantacją
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modelowanie oddziaływań międzykomórkowych na granicy macierzyńsko-płodowej ma kluczowe znaczenie dla ograniczania ryzyka w badaniach nad wczesnymi celami biologicznymi w zakresie rozrodu oraz wyjaśniania mechanizmów leżących u podstaw implantacji. Ten system kokultury z wykorzystaniem rusztowań wydrukowanych w technologii 3D umożliwia efektywne kosztowo i skalowalne badania in vitro oddziaływań między komórkami błony śluzowej endometrium a trofoblastem, co zwiększa wiarygodność prognostyczną w walidacji celów i badaniu szlaków sygnałowych. Podejście to ułatwia ciągłość translacyjną, od etapu odkryć po badania przedkliniczne w ramach portfeli projektów dotyczących zdrowia reprodukcyjnego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia mechaniczną analizę oddziaływań między nabłonkiem a podścieliskiem endometrium oraz między trofoblastem a endometrium.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie bezpośredniej i pośredniej komunikacji komórkowej istotnej dla implantacji.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów w badaniach nad zaburzeniami rozrodu.
- Zapewnia platformę do wyjaśniania szlaków sygnałowych w biologii matki i płodu w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewanie i opracowywanie analiz
- Przygotowuje zwalidowane systemy kokultury do dalszego przesiewania związków lub badań nad perturbacjami.
- Standaryzuje warunki analizy przy użyciu powtarzalnych rusztowań wydrukowanych w technologii 3D i zdefiniowanych linii komórkowych.
- Umożliwia ilościową ocenę gęstości i morfologii komórek za pomocą mikroskopii.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy dla wielu warunków eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki uzyskano in vitro z mechanizmami chorobowymi istotnymi dla implantacji i funkcji macicy.
- Zapewnia ciągłość w procesie przenoszenia kandydatów z etapu odkryć do walidacji przedklinicznej w obszarze zdrowia reprodukcyjnego.
- Umożliwia podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka poprzez modelowanie patogenezy uszkodzeń błony śluzowej endometrium oraz zrostów wewnątrzmacicznych.
- Oferuje predykcyjną minimalizację ryzyka w badaniach nad translacyjnymi biomarkerami.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Ten model kokultury integruje się z continuum od odkryć po badania przedkliniczne w biologii rozrodu, wspierając zarówno wczesne badania mechanistyczne, jak i badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych dla celów związanych z interfejsem macica-płód.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne systemy kokultury do oceny odpowiedzi komórkowych.
- Analityka: Dostarcza ilościowych wyników dotyczących gęstości i morfologii komórek do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z modelami przedklinicznymi istotnymi dla chorób w obszarze zdrowia reprodukcyjnego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje niskokosztową, skalowalną platformę, którą można dostosować do dodatkowych typów komórek i schematów doświadczalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy i zwiększa odtwarzalność dzięki zastosowaniu kosztowo efektywnych rusztowań drukowanych w technologii 3D.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez umożliwienie solidnego modelowania na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów w obszarze zdrowia reprodukcyjnego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli komórkowych i mikroskopii w celu przygotowania modelu i przeprowadzenia analizy.
- Wymagany jest dostęp do infrastruktury druku 3D oraz standardowego instrumentarium do hodowli komórkowych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przygotowania rusztowania i wysiewania komórek pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowalna do różnych linii komórek adherentnych w celu szerszego modelowania chorób.
- Ograniczenia obejmują obecne skupienie się na dwóch typach komórek oraz kontekst wyłącznie in vitro.
