Izolacja i zapis całokomórkowy mikrogleju hipokampa od dorosłych myszy

Nasze badania koncentrują się na dokładnym wyizolowaniu mikrogleju do zapisów całych komórek, w tym prądów potasowych, aby zrozumieć aktywność kanałów jonowych. Protokół można również dostosować do izolowania mikrogleju dla różnych regionów mózgu, zapewniając wgląd w zero w różnych stanach neurologicznych.

Najnowsze osiągnięcia w naszej dziedzinie badawczej obejmują zastosowanie tradycyjnego trawienia enzymatycznego zapalenia trzustki w połączeniu z oczyszczaniem mikrogleju poprzez fluorescencyjne sortowanie aktywnych komórek. Postępy te zwiększyły dokładność i skuteczność izolowania określonych populacji mikrogleju w celu przeprowadzenia dalszych badań.

Nasz protokół bada właściwości elektrofizjologiczne mikrogleju bezpośrednio z hipokampa dorosłej myszy, zamiast polegać na pierwotnej hodowli CS. Takie podejście pozwala na dokładniejszą analizę funkcji mikrogleju w ich rodzimym środowisku.

Nasze wyniki utorowały drogę nowym pytaniom naukowym dotyczącym biochemicznych i funkcjonalnych właściwości mikrogleju zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i chorobowych, oferując naukowcom cenne wskazówki do dalszego badania tych aspektów.

[Prezenter] Na początek połóż znieczulone zwierzę na wznak na stole sekcyjnym i przypnij mu kończyny. Odsłoń klatkę piersiową i przeprowadź perfuzję serca lodowatym, sterylnym PBS, aby usunąć wewnątrznaczyniowe krążące krwinki krwi. Następnie przytrzymaj głowę i przetnij nożyczkami skórę wzdłuż linii środkowej mózgu, aby odsłonić czaszkę. Następnie przetnij tylną część czaszki obustronnie i między oczodołami małymi nożyczkami. Przetnij czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego i usuń czaszkę pęsetą. Następnie szybko wyodrębnij tkankę mózgową. Teraz umieść tkankę mózgową w 10-centymetrowych naczyniach hodowlanych zawierających lodowaty PBS. Wypreparuj korę mózgową obustronnie za pomocą pęsety. Odizoluj tkankę hipokampa i pokrój ją na mniejsze kawałki. Przenieś kawałki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie ponownie zawieś małe kawałki tkanki hipokampa w dwóch mililitrach lodowatego roztworu soli Hanksa lub HBSS. I wirować przy 300 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu dodać 1,950 mikrolitrów mieszaniny enzymów jeden do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej kawałki tkanki hipokampa. Potrząsaj probówką wirówkową w sposób ciągły w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj 30 mikrolitrów świeżo przygotowanej mieszaniny enzymów dwa do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Odpipetować fragmenty tkanki w górę i w dół 20 razy za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety i inkubować w łaźni wodnej przez pięć minut, ciągle wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po wyjęciu probówki wirówkowej należy kilkakrotnie pipetować zawiesinę w górę i w dół za pomocą jednomililitrowej pipety, aż nie pozostaną żadne duże kawałki tkanki. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez 70-mikrometrowy filtr przesiewowy komórek i zbierz filtrat do czystej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Przenieść filtrat do nowej 15-mililitrowej probówki wirówkowej i odwirować przy 300 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wyrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Teraz odpipetuj zawiesinę komórek 20 razy w górę iw dół za pomocą 15 mililitrów HBSS, aby ją umyć i odwirować w 300 G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze aktywowanego magnetycznie bufora do sortowania komórek. Na początek przenieś jeden mililitr przygotowanej zawiesiny jednokomórkowej do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej i wiruj przy 300 G przez trzy minuty w czterech stopniach Celsjusza. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad jednokomórkowy w 90 mikrolitrach sortowania komórek aktywowanych magnetycznie lub maksymalnego buforu. Dodać 10 mikrolitrów mikrogranulek CD11b lub c i inkubować zawiesinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut na wytrząsarce poziomej. Następnie dodaj jeden mililitr maksymalnego buforu bezpośrednio do probówki, aby przepłukać zawiesinę jednokomórkową. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach maksymalnego buforu. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra przenieś ponownie zawieszoną zawiesinę komórek do kolumny sortującej w polu magnetycznym. Dopóki pozostaje w polu magnetycznym, przemyj kolumnę trzykrotnie 500 mikrolitrami maksymalnego buforu. Następnie usuń kolumnę sortującą z pola magnetycznego. Dodaj jeden mililitr maksymalnego buforu do kolumny i powoli przepchnij go tłokiem. Zbierz przepływ. Teraz zasiaj wybrane komórki na 24-dołkowej płytce zawierającej szkiełko nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną. Dodaj 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej i inkubuj przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 95% tlenu, 5% dwutlenkiem węgla i wilgotnością od 60 do 80%. Na początek weź hodowany mikroglej wyizolowany z tkanki mózgowej myszy. Zlokalizuj sferyczny mikroglej pod mikroskopem wodnym za pomocą obiektywu 40x. Następnie napełnij elektrodę roztworem wewnątrzkomórkowym i przymocuj ją do stopnia głowicy wzmacniacza zestawu elektrofizjologicznego. Zastosuj nadciśnienie. Przełącz się na obiektyw 4x i zlokalizuj elektrodę. Następnie zanurz elektrodę w roztworze kąpieli. Ustaw amplifier na voltage clamp tryb, aby wykonać test membrany w trybie kąpieli. Następnie przełącz się z powrotem na obiektyw 40x i przesuń końcówkę elektrody bliżej mikrogleju. Następnie zastosuj niewielkie podciśnienie, aby utrzymać komórkę. Gdy rezystancja osiągnie 100 megaomów, przełącz się z trybu kąpieli na tryb łatowy w teście membranowym. Gdy rezystancja osiągnie 300 megaomów, zwolnij podciśnienie. Gdy rezystancja wskazuje na tworzenie się gigaomowego uszczelnienia między elektrodą a membraną mikrogleju. Przełącz się z trybu łatki na tryb komórkowy w teście membranowym. Następnie zastosuj niewielką ilość ssania i zainicjuj porażenie prądem, aby rozerwać membranę. Następnie przełącz się w tryb cęgów napięciowych, otwórz program nagrywający i rejestruj prądy potasu przez 200 milisekund.