Identyfikacja i kwantyfikacja metabolitów zaburzonych u pacjentów w stanie krytycznym przy użyciu metabolomiki opartej na NMR

Nasze badania wykorzystują metabolomikę opartą na NMR do identyfikacji rozregulowanych metabolitów i szlaków biochemicznych, które ulegają zmianie u krytycznie chorych pacjentów OIT, a także uwzględniliśmy pacjentów z ARDS, która jest ciężką chorobą płuc. Poprzez profilowanie i porównywanie sygnatur metabolicznych dążymy do odkrycia zaburzeń biochemicznych, które są związane z postępem choroby i dostosowania leczenia w celu poprawy wyników. W rzeczywistości staramy się wypełnić lukę w zrozumieniu dysregulacji metabolicznej we wszystkich kategoriach pacjentów z ARDS, w tym u pacjentów z łagodnym, umiarkowanym i ciężkim ARDS.

Poprawa naszych spostrzeżeń, lepsze zrozumienie choroby, jej postępu, z ogólnym celem, jakim jest poprawa wyników leczenia pacjentów poprzez zapewnienie precyzyjnej i spersonalizowanej medycyny. NMR umożliwia łatwe przygotowanie próbki, zachowując integralność surowicy do ponownej analizy i wykrywając znane i nieznane metabolity bez derywatyzacji chemicznej. Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych, zapewniając wiarygodny pomiar metabolitów.

W przeciwieństwie do podejść celowanych, NMR umożliwia czułą, bezstronną eksplorację zmian metabolicznych, dzięki czemu idealnie nadaje się do odkrywania sygnatur i ścieżek progresji choroby. Nasze odkrycie wzbogaci badania nad ARDS, odkrywając zmiany metaboliczne na różnych etapach, które są niedostatecznie zbadane. Korzystając z metabolomiki opartej na NMR, dążymy do zidentyfikowania rozregulowanych metabolitów i szlaków, co prowadzi do potencjalnych sygnatur dla wczesnej diagnozy, rokowania, szybszego przewidywania i leczenia.

Takie podejście rozwija spersonalizowane zarządzanie i pogłębia wiedzę w zakresie wielostanowego profilowania metabolicznego. Nasze wyniki utorowały drogę nowym pytaniom naukowym, takim jak: W jaki sposób określone metabolity zidentyfikowane w różnych stadiach ARDS wpływają na postęp choroby? Czy te rozregulowane szlaki mogą być celem wczesnych interwencji terapeutycznych?

Dodatkowo, jak te zmiany metaboliczne różnią się w innych stanach układu oddechowego lub zapalnych? Na początek, za pomocą sterylnej igły, zbierz dwa mililitry krwi z tętnic pacjenta, u którego zdiagnozowano łagodny lub umiarkowany zespół ostrej niewydolności oddechowej lub ARDS. Przenieść krew do sterylnej fiolki i pozostawić ją do krzepnięcia przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Odwirować zakrzepłą krew o stężeniu 3,100 G przez 15 minut, aby oddzielić surowicę. Przenieść surowicę do sterylnych probówek do mikrowirówek, uzyskując porcje od 400 do 500 mikrolitrów. Oznacz probówki danymi pacjenta i przechowuj je w temperaturze 80 stopni Celsjusza.

W przypadku eksperymentów NMR należy zmieszać 250 mikrolitrów podwielokrotności surowicy z 250 mikrolitrami buforu fosforanowego soli fizjologicznej, aby zminimalizować zmiany pH. Mieszaj mieszaninę przez około 15 sekund, aby zapewnić jednorodne mieszanie. Przygotować próbkę przenieść do czystej probówki NMR ze współosiową wkładką zawierającą TSP o stężeniu 0,05 milimola.

Następnie umieść rurkę NMR w magnesie. Wpisz WRPA i wybierz odpowiedni numer eksperymentu, aby skonfigurować eksperyment protonowy z programem impulsowym CPMG. Kliknij opcję Tytuł, aby wprowadzić imię i nazwisko pacjenta oraz inne niezbędne szczegóły.

Wpisz lock i naciśnij Enter, aby zablokować pole magnetyczne. Następnie wybierz opcje 90% wody i 10% tlenku deuteru. Następnie wpisz ATMM i naciśnij Enter, aby przeprowadzić dostrajanie i dopasowywanie sondy.

Następnie z opcji Parametry akwizycji wybierz parametry jako 64 000 punktów w 128 skanach, aby zebrać dane optymalizacyjne. Ustaw opóźnienie relaksacji na pięć sekund, szerokość widmową przemiatania 12 PPM i czas echa na 200 mikrosekund, powtórzone 300 razy. Zastosuj poszerzenie linii o 0,3 Hz za pomocą funkcji okna wykładniczego.

Następnie, korzystając z narzędzi do przetwarzania i analizy NMR, uzyskaj widma NMR. Po uzyskaniu ostatecznych widm wpisz APK i ABSN, aby wykonać odpowiednio korekcję fazy i korekcję linii podstawowej. Następnie kliknij opcję Kalibruj oś w górnym panelu i skalibruj szczyt TSP do 0 PPM, automatycznie lub ręcznie.

Na koniec należy przesłać pozyskane dane z systemu NMR do stacji roboczej w celu dalszej analizy. Po uzyskaniu widm NMR u pacjentów, u których zdiagnozowano łagodny lub umiarkowany ARDS, otwórz oprogramowanie do kwantyfikacji metabolitów NMR w celu przetworzenia danych. Aby wykonać ręczną korekcję linii bazowej przy użyciu metody Whitakera, otwórz plik spektralny w module procesora oprogramowania do kwantyfikacji metabolitów NMR.

Wybierz opcję Korekcja linii bazowej, a następnie wybierz metodę Whitakera. Umieść kropki u podstawy pików w całym widmie. Po zakończeniu zapisz pliki spektralne z korekcją linii bazowej w jednym folderze.

Następnie, aby wykonać kategoryzację spektralną za pomocą modułu Profiler, wybierz Narzędzia, następnie Proces wsadowy, a następnie Binning spektralny. Aby wygenerować końcowy arkusz kategoryzacji do analizy statystycznej, wybierz folder ze wszystkimi plikami spektralnymi z korekcją linii bazowej. Podziel widma na pojemniki o równej wielkości o określonej szerokości widmowej w zakresie od 0,01 do 0,04 części na milion.

Określ rozmiar zasobnika oraz początkową i końcową wartość PPM. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać wyjściowe arkusze kategoryzacji. Wykluczyć obszary przesunięcia chemicznego odpowiadające wodzie i rozpuszczalnikowi TSP, aby zapobiec interferencji spektralnej.

Końcowy arkusz kalkulacyjny będzie wyświetlał nazwy próbek w jednym wierszu i wartości pojemników wraz z odpowiadającymi im PPM w innych wierszach. Przed wykonaniem analizy statystycznej znormalizuj dane przy użyciu normalizacji, transformacji dziennika i skalowania Pareto. W przypadku analizy wielowymiarowej należy przeprowadzić analizę głównych składowych, częściową analizę dyskryminacyjną metodą najmniejszych kwadratów i ortogonalną częściową analizę dyskryminacyjną metodą najmniejszych kwadratów, aby zaobserwować dyskryminację między grupami, uzyskując zmienne znaczenie wyników projekcji dla każdego metabolitu odpowiedzialnego za różnicę w profilu metabolicznym.

Wykonaj test t-Studenta, aby zidentyfikować znaczące metabolity o wartości p mniejszej niż 0,05. W testach T powstają wykresy wąsów pudełkowych wykazujące różnice w stężeniach metabolitów. Następnie przeprowadź analizę biomarkerów, aby wygenerować obszar pod wykresem charakterystyki pracy odbiornika.

Należy wybrać ostateczną listę istotnych metabolitów na podstawie zmiennej ważność wyniku projekcji większej niż jeden, wartości p skorygowanej przez Bonferroniego mniejszej niż 0,05 i pola pod krzywą większego niż 0,8. Korzystając z bazy danych metabolomu ludzkiego, zidentyfikuj metabolity odpowiadające określonym wartościom PPM. Przed rozpoczęciem oznaczania ilościowego, za pomocą modułu procesora, należy skalibrować związek referencyjny wybrany do badania.

Kliknij opcję Kalibruj wskaźnik przesunięcia chemicznego i wprowadź stężenie związku referencyjnego. Przeciągnij pik oprogramowania na pik odniesienia widmowego i dostosuj jego wysokość i szerokość. Gdy piki odniesienia spektralnego zrównają się ze szczytem oprogramowania, kliknij przycisk Akceptuj.

Następnie otwórz żądane widma w module Profiler i wybierz odpowiednią bibliotekę związków do badania. U dołu ekranu zostanie wyświetlona lista metabolitów. Wybierz z listy metabolit, który Cię interesuje.

Kliknij wartość PPM w górnym rogu ekranu. Powiększ widma do określonej skali PPM metabolitu. W tym momencie na ekranie pojawiają się dwa szczyty, jeden reprezentujący zarejestrowane dane, a drugi, pokazany jako przerywana linia, reprezentująca pik oprogramowania.

Przeciągnij szczyt oprogramowania, aby wyrównać go z zarejestrowanym szczytem, dostosowując wysokość i pozycję do dopasowania. Po prawidłowym ustawieniu pików należy odczytać stężenie metabolitu z wartości wyświetlanej pod nagłówkiem Stężenie w milimolach. Aby wygenerować plik wyjściowy, w menu Narzędzia kliknij opcję Operacje wsadowe i określ żądany folder do zapisania pliku wyjściowego.

Analiza głównych składowych wykazała wyraźne grupowanie między łagodnymi i umiarkowanymi grupami pacjentów z ARDS. Ortogonalna częściowa analiza dyskryminacyjna metodą najmniejszych kwadratów ujawniła wyraźny podział między łagodnymi i umiarkowanymi grupami ARDS, podkreślając różnice metaboliczne. Test t i analiza biomarkerów ujawniły kluczowe rozregulowane metabolity między łagodnymi i umiarkowanymi ARDS.

Mleczan i izoleucyna zostały zidentyfikowane jako istotnie rozregulowane metabolity korelujące z nasileniem ARDS.