Name: Odsłonięcie proteoform histonów przy użyciu elektroforezy żelowej 2D-TAU (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Poznaj elektroforezę żelową 2D-TAU do charakteryzacji proteoform histonów w badaniach epigenetycznych. Ta metoda umożliwia identyfikację nowych celów terapeutycznych w leczeniu nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez PRIN2022, DS, CF i AC były wspierane przez PRIN2022, a MLC było wspierane przez program doktorancki z Onkologii Molekularnej, szkołę doktorancką UMG. Prace wsparł również projekt PNRR INSIDE CUP: B83C22003920001

1. Ekstrakcja histonów
<ol>
	<li>Wykonaj ekstrakcję histonów z co najmniej 1 x 106 komórek, które w 80% się zlewają. W tym eksperymencie użyliśmy linii komórkowych MCF-10A z ATCC. Po posianiu przemyć komórki trzykrotnie 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 1x. Wykonaj wszystkie kroki na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj bufor do lizy komórek zawierający 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM KCl i 1,5 mM MgCl2. Dodać 1 mM ditioerytrytolu oraz inhibitory proteazy i fosfatazy tuż przed użyciem.</li>
	<li>Dodać 800 μl buforu do lizy komórek na płytkę Petriego zawierającą komórki, zeskrobać i zebrać komórki do probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie inkubować na rotatorze przy 300 obr./min, 4 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 10 000 x g, 4 °C, przez 10 minut we wstępnie schłodzonej mikrowirówce z rotatorem do probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przepłukać osad 400 μl buforu do lizy komórek i odwirować w temperaturze 10 000 x g, 4 °C, przez 10 minut. Wyrzucić supernatant. Powtórz krok prania 3x. 
	UWAGA: Do wszystkich etapów należy użyć wstępnie schłodzonej mikrowirówki (4 °C) z rotatorem do probówek o pojemności 1.5 ml. Z granulatem należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć utraty materiału.</li>
	<li>Zawiesić osad w 640 μl 0,2 M H2SO4 i inkubować na rotatorze przy 300 obr./min, w temperaturze 4 °C, przez 16 h. 
	UWAGA: Kwas siarkowy jest niebezpieczną substancją chemiczną; Proszę używać go pod wyciągiem chemicznym.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 16 000 x g, 4 °C, przez 10 minut. Przenieść supernatant do świeżej probówki i przechowywać go do następnych kroków. Wyrzuć szczątki nuklearne.</li>
	<li>Wytrącić histony, dodając 212 μl kwasu trichlorooctowego, kropla po kropli (końcowe stężenie TCA wynosi 33%). Wymieszaj roztwór, odwracając probówkę 10 razy. Inkubować na lodzie, w ciemności, przez 16 godz. 
	UWAGA: TCA jest niebezpieczną substancją chemiczną; Stosować pod wyciągiem chemicznym.</li>
	<li>Osady histonów należy rozdrabniać przez wirowanie we wstępnie schłodzonej wirówce o stężeniu 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant i przemyć osad 3x 200 μl zimnego acetonu.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad zimnym acetonem, a następnie 2x sonikować o dużej mocy w 3 cyklach po 30 s włączania/wyłączania, na przemian z 10-minutową przerwą na lodzie. 
	UWAGA: Zabieg został wykonany przy użyciu ultradźwięków. Ten krok jest niezbędny do wyeliminowania DNA owiniętego histonami.</li>
	<li>Wirować przy 16 000 x g przez 10 minut, wyrzucić aceton i ponownie zawiesić próbkę w 100 μl podwójnie destylowanej wody. Oznaczyć stężenie białka za pomocą metody testu Bradforda, zgodnie z instrukcjami producenta33. 
	UWAGA: Po odwirowaniu osad czasami wydaje się biały lub półprzezroczysty. Biały i nieprzezroczysty osad może wskazywać na obecność zanieczyszczeń solą, które mogą zakłócić separację 2D. Jeśli tak, powtarzaj etapy prania acetonem, aż granulka stanie się przezroczysta.</li>
	<li>Liofilizować 70 μg histonów, zgodnie z instrukcjami producenta. Ustawić liofilizator w temperaturze 30 °C na 60 min. Sprawdzić objętość probówki i powtórzyć ten krok w temperaturze 30 °C, aż próbka zostanie całkowicie zliofilizowana (zazwyczaj do całkowitej liofilizacji próbki potrzeba 90 minut). Po 60 minutach sprawdzaj objętość co 10 minut, ponieważ proces jest zależny od próbki. 
	UWAGA: Jeśli ilość białek histonowych jest niska, zacznij od 2 x 106 komórek. W takim przypadku użyj tej samej objętości odczynników, co dla 1 x 106 komórek. Sprawdź czystość wszystkich substancji chemicznych użytych podczas zabiegu; wszystkie odczynniki muszą być klasy HPLC.</li>
</ol>
2. Mini elektroforeza 2D żelowa trytonowo-kwasowo-mocznikowa (TAU)
<ol>
	<li>Przygotuj żel mini-TAU do mini pionowego systemu elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Przygotować żel separacyjny: 6 M mocznik, 15% akrylamid/bisakryloamid (29:1), 5% kwas octowy lodowcowy, 0,25% Triton X-100 (v/v), 0,4% TEMED (v/v), 0,1% APS (p/v). Aby przygotować roztwór, rozpuścić mocznik w akrylamidzie/bisie i 1 ml ultraczystej wody, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej; Dodaj pozostałe składniki i dostosuj głośność. Aby uzyskać żel mini-TAU, przygotuj 10 ml roztworu. Napełnij wstępnie ustawione płytki żelowe roztworem, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza zaledwie 1,5 cm od góry. Przykryj roztwór 1 ml izopropanolu, aby wyrównać żel.</li>
		<li>Przygotuj żel do układania: 6 M mocznika, 6% akrylamid/bisakryloamid (29:1), 5% kwas octowy lodowcowy, 0,25% Triton X-100 (v/v), 0,4% TEMED (v/v), 0,1% APS (p/v). Aby przygotować roztwór, rozpuścić mocznik w akrylamidzie/bisie i 1 ml ultraczystej wody; Dodaj pozostałe składniki i dostosuj głośność. Napełnij płytki żelowe roztworem do układania w stosy, umieść 10-dołkowy grzebień żelowy między płytkami i włóż go, aż roztwór żelu znajdzie się w połowie wysokości zębów grzebienia. Pozostawić żel do polimeryzacji przez 16 godzin w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Ostrożnie włóż grzebień, aby zapewnić regularne formowanie studzienek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 100 μl buforu do próbek TAU, rozpuszczając 6 M mocznika, 5% kwasu octowego i podwójnie destylowaną wodę. Tak przygotowaną liofilizowaną próbkę rozpuścić w 30 μl buforu do próbek TAU.</li>
	<li>Napełnij mini kasetę buforem do pracy TAU, 5% kwasem octowym o końcowym stężeniu. Przepłukać dołki żelu TAU strzykawką wypełnioną działającym buforem i załadować próbkę do studzienki za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Podłącz komorę elektroforetyczną do zasilania, tak aby elektroda dodatnia (czerwona) znajdowała się na dole. Zwróć uwagę, gdy IP > pH, białka są naładowane dodatnio, więc migracja odbywa się od elektrody dodatniej do ujemnej. Uruchom żel najpierw pod napięciem 30 V przez 70 minut, a następnie przy stałym napięciu 25 V przez 17 h. 
	UWAGA: W tym czasie od czasu do czasu wyłączaj zasilanie i przepłucz studzienki żelu za pomocą jednorazowej strzykawki. Zwrócić uwagę na usunięcie wszelkich pęcherzyków z dolnej powierzchni żelu za pomocą strzykawki, aby uniknąć utraty próbki i obecności rozmazywania się w rozwiązanych białkach.</li>
	<li>Usuń żel z płytek żelowych i przetnij interesującą Cię linię czystym skalpelem. Z żelem należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć jego pękania. Ponieważ linia zainteresowania jest bezbarwna, załaduj próbkę do studzienki numer 1, aby dokładnie zidentyfikować i przeciąć interesujący nas pas. 
	UWAGA: Aby sprawdzić separację na żelu mini-TAU, należy przygotować i uruchomić próbkę w dwóch egzemplarzach. Jeden z tych żeli można zabarwić za pomocą Coomassie Brilliant Blue. Wzorzec separacji jest opisany w Rysunek 1A.</li>
	<li>Umyj tor 15 ml 0,5 M Tris-HCl pH 8,8 przez 15 minut.</li>
	<li>Przygotuj 15 ml buforu równowagowego 1, używając 6 M mocznika, 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 30% glicerolu, 20% SDS i 2% ditioerytrytolu. Przygotuj 15 ml buforu równowagowego 2, używając 6 M mocznika, 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 30% glicerolu, 20% SDS i 2% jodoacetamidu. Przygotować bufor równowagi 1 i 2 tuż przed użyciem; Przechowuj bufor równowagi 2 w ciemności.</li>
	<li>Inkubować pas żelowy, pod delikatnym mieszaniem, w 10 ml buforu równoważącego 1 przez 15 minut, a następnie zdekantować. Inkubować pas żelowy, pod delikatnym mieszaniem, z 10 ml buforu równowagowego 2 przez 15 minut w ciemności, a następnie zdekantować.</li>
	<li>Przygotować rozdzielczy żel akryloamidowy SDS 15%, postępując zgodnie z Tabelą 1. Ustaw płytkę żelową i napełnij ją rozdzielczym roztworem żelu. Napełnij roztwór, aż znajdzie się 1,5 cm od końca długiej płytki żelowej. Umieść 1 ml izopropanolu na powierzchni, aby wyrównać żel i pozwolić mu spolimeryzować.</li>
	<li>Po polimeryzacji żelu zdekantować izopropanol i wysuszyć studzienkę bibułą chromatograficzną 3MM Chr. Włóż powstały pas z kroku 8 do dołka żelu.</li>
	<li>Uszczelnij tor do żelu rozdzielczego roztworem uszczelniającym zawierającym 0,5% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 1x buforze Tris/glicyna/SDS i 5 μl 0,003% błękitu bromofenolowego. Pozostawić polimeryzację w żelu agarozowym przez 30 min. 
	UWAGA: Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas uszczelniania agarozy, aby zapobiec rozmazywaniu się żelu.</li>
	<li>Umieść płytki żelowe w kasecie i napełnij 1x buforem Tris/glicyna/SDS. Uruchom żel pod napięciem 120 V, aż niebieski barwnik bromofenolowy dotrze do dna. Delikatnie usuń żel z płytek, wyrzuć nadmiar agarozy i zabarwij żel srebrem, stosując procedurę zgodną ze spektrometrią mas lub blot do testu immunologicznego.</li>
</ol>
3. Barwienie srebra 32
<ol>
	<li>Przygotuj następujące odczynniki - Utrwalacz: 50% metanolu, 5% kwasu octowego, 45% wody dejonizowanej; Roztwór do mycia: 50% metanolu, 50% wody dejonizowanej; Substancja uczulająca: 0,02% Na2S2O3 5H2O w wodzie dejonizowanej; Odczynnik srebra: 0,1% azotan srebra w zimnej (4°C) wodzie dejonizowanej; Wywoływacz: 0,04% formaliny i 2% Na2CO3, formaldehyd (37%) (dodać tuż przed użyciem) 0,4 ml wody dejonizowanej i napełnić do 1000 ml; Odczynnik stop: 5% kwas octowy; Roztwór do przechowywania żelu: 1% kwas octowy. 
	UWAGA: Ponieważ chemikalia używane do barwienia są niebezpieczne, wszystkie czynności należy wykonać pod wyciągiem chemicznym.</li>
	<li>Należy postępować zgodnie z procedurą opisaną w tabeli 2, biorąc pod uwagę następujące kwestie. Wszystkie inkubacje wykonuj z delikatnym mieszaniem. Przygotować odczynnik zatrzymujący przed rozpoczęciem etapu wywoływania; Zapewni to opracowanie żelu o odpowiedniej intensywności. Podczas etapu rozwoju plamy pojawią się jako żółte sygnały, które pod koniec inkubacji staną się jasnobrązowe. Intensywność różnych plam będzie zależeć od ilości proteoform histonowych. Żel jest gotowy do punktowego wycięcia i trawienia w żelu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)</li>
</ol>
4. Trawienie w żelu
<ol>
	<li>Przygotować następujące roztwory: 50 mM wodorowęglanu amonu (NH4HCO3)/50% (v/v) acetonitrylu; 10 mM ditiotreitol (DTT) w 50 mM NH4HCO3; 55 mM jodoacetamid (IAA) w 50 mM NH4HCO3; 0,1% TFA; 50 mM NH4HCO3, pH 8; Acetonitryl klasy HPLC; 1 ml probówki silikonowe. 
	UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia ludzką keratyną z włosów lub skóry, używaj czystych rękawic i pracuj w czystym miejscu.</li>
	<li>Wytnij interesujące miejsca histonów z barwionego żelu za pomocą czystego skalpela i umieść je w świeżej silikonowej probówce (1,5 ml). Uważaj, aby wyciąć jedno miejsce i umieścić je w jednej tubie, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego izoformą.</li>
	<li>Do każdego miejsca żelu dodać 250 μl 50 mM NH4HCO3/50% acetonitrylu i inkubować pod delikatnym mieszaniem w termomikserze w temperaturze pokojowej. Zdekantować roztwór i powtórzyć ten krok 3 razy. Kawałki żelu będą przezroczyste.</li>
	<li>Odwodnić plamy żelu, dodając acetonitryl (200 μl). Na tym etapie kawałki żelu przyjmą nieprzezroczysty biały kolor.</li>
	<li>Zdekantować acetonitryl i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Kawałek żelu będzie wyglądał na wysuszony w tubce. Redukcja i alkilacja nie są konieczne, ponieważ białka histonowe zostały zredukowane i alkilowane na etapie równoważenia.</li>
	<li>Uwodnić plamki żelu w 20 μl roztworu trypsyny (0,1 mM HCl) lub objętości wystarczającej do pokrycia kawałków żelu. Umieścić probówki w termomikserze i inkubować, pod delikatnym mieszaniem, w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 godziny do godziny 16 godzin.</li>
	<li>Przenieść supernatant zawierający peptydy tryptyczne do świeżej probówki. Dodać 50 μl roztworu ekstrakcyjnego (60% acetonitrylu, 1% TFA) do kawałków żelu i sonikować 2x w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant zawierający dodatkowe peptydy tryptyczne do świeżej probówki. Użyj liofilizatora, aby wysuszyć zebrane wyekstrahowane peptydy. Ustawić liofilizator na 30 °C i wysuszyć roztwór; W probówce pojawi się liofilizowany osad. 
	UWAGA: Ten krok jest zależny od woluminu; Generalnie wystarczy 1 godzina, ale sprawdzaj objętość co 10 minut, aż próbka całkowicie wyschnie.</li>
	<li>Dodać 15 μl 0,1 % TFA do każdej probówki i delikatnie inkubować w termomikserze w temperaturze 25 °C. Przenieść supernatant do fiolki w celu analizy LC-MS/MS.</li>
</ol>
5. 2DTAU western blot
<ol>
	<li>Przygotuj bufor transferowy, 250 mM zasady Tris, 92 mM glicyny i 10% metanolu przy użyciu podwójnie destylowanej wody.</li>
	<li>Przyciąć membranę nitrocelulozową i bibułę filtracyjną do wymiarów żelu.</li>
	<li>Zrównoważyć żel i zanurzyć membranę, bibułę filtracyjną i bibułę filtracyjną w buforze transferowym na 15 minut. Użyć membran nitrocelulozowych lub PVDF. W przypadku stosowania membran PVDF (polifluorku winylidenu) aktywuj je poprzez namoczenie w 100% MetOH.</li>
	<li>Przygotuj kanapkę z żelem w kasecie do transferu półsuchego w następujący sposób: elektroda ujemna/bibuła filtracyjna/żel/membrana nitrocelulozowa/bibuła filtracyjna/elektroda dodatnia. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza między żelem a membraną, aby zapewnić dobre rezultaty.</li>
	<li>Umieść kasetę w urządzeniu półsuchym i uruchom blot pod napięciem 25 V przez 30 minut. Na koniec zdemontuj kanapkę bibułkową i przechowuj błonę do testu immunologicznego. Sprawdź wydajność nanoszenia za pomocą barwienia Ponceau. Oznacz membranę znakiem w prawym górnym rogu, aby zachować właściwą orientację filtra.</li>
	<li>Inkubuj z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi w zależności od eksperymentu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>

2D Gel Separation for Histone Isoform Enrichment and PTM Characterization

<ol><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Cutter, A. R., Hayes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+nucleosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A brief review of nucleosome structure.</a> FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).</li>
<li>Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+post-translational+modifications+-+cause+and+consequence+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function.</a> Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+epigenetic+modifications+on+the+path+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer.</a> Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).</li>
<li>Kinnaird, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+control+of+epigenetics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metabolic control of epigenetics in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (11), 694-707 (2016).</li>
<li>Díaz-Hirashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+signaling+to+chromatin+modifications+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and signaling to chromatin modifications in tumorigenesis.</a> Adv Exp Med Biol. 1219, 225-241 (2020).</li>
<li>Panatta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+by+p53+prevents+R-loop-associated+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation by p53 prevents R-loop-associated genomic instability.</a> Cell Rep. 41 (5), 111568(2022).</li>
<li>Scumaci, D., Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+meets+metabolism%3A+novel+vulnerabilities+to+fight+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Epigenetic meets metabolism: novel vulnerabilities to fight cancer.</a> Cell Commun Signal. 21 (1), 249(2023).</li>
<li>Chiaradonna, F., Scumaci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metabolism+as+a+new+real+target+in+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cancer metabolism as a new real target in tumor therapy.</a> Cells. 10 (6), 1393(2021).</li>
<li>Scumaci, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DJ-1+proteoforms+in+breast+cancer+cells%3A+The+escape+of+metabolic+epigenetic+misregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">DJ-1 proteoforms in breast cancer cells: The escape of metabolic epigenetic misregulation.</a> Cells. 9 (9), 1968(2020).</li>
<li>Olivo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+beyond+the+tip+of+the+iceberg%3A+DJ-1+implications+in+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Moving beyond the tip of the iceberg: DJ-1 implications in cancer metabolism.</a> Cells. 11 (9), 1432(2022).</li>
<li>Zheng, Q., Maksimovic, I., Upad, A., David, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+covalent+modifications%3A+a+new+link+between+metabolism+and+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic covalent modifications: a new link between metabolism and epigenetics.</a> Protein Cell. 11 (6), 401-416 (2020).</li>
<li>Maksimovic, I., David, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+covalent+modifications+as+a+new+chapter+in+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic covalent modifications as a new chapter in the histone code.</a> Trends Biochem Sci. 46 (9), 718-730 (2021).</li>
<li>Lowe, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+mutations%3A+an+updated+view+of+their+role+in+chromatin+deregulation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Histone H3 mutations: an updated view of their role in chromatin deregulation and cancer.</a> Cancers. 11 (5), 660(2019).</li>
<li>Karsli-Ceppioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epigenetic+landscape+of+promoter+genome-wide+analysis+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The epigenetic landscape of promoter genome-wide analysis in breast cancer.</a> Sci Rep. 7 (1), 6597(2017).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methyltransferase+and+drug+resistance+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Histone methyltransferase and drug resistance in cancers.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 173(2020).</li>
<li>Vardabasso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+variants%3A+emerging+players+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Histone variants: emerging players in cancer biology.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (3), 379-404 (2014).</li>
<li>Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+alterations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic alterations in cancer.</a> Front Biosci. 25 (6), 1058-1109 (2020).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2AX+promotes+metastatic+progression+by+preserving+glycolysis+via+hexokinase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Histone H2AX promotes metastatic progression by preserving glycolysis via hexokinase-2.</a> Sci Rep. 12 (1), 3758(2022).</li>
<li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZNF506-dependent+positive+feedback+loop+regulates+H2AX+signaling+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ZNF506-dependent positive feedback loop regulates H2AX signaling after DNA damage.</a> Nat Commun. 9 (1), 2736(2018).</li>
<li>Ribeiro-Silva, C., Vermeulen, W., Lans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF%3A+Complex+complexes+in+genome+stability+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF: Complex complexes in genome stability and cancer.</a> DNA Repair. 77, 87-95 (2019).</li>
<li>Yang, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epigenetic+regulation+in+plasticity+of+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of epigenetic regulation in plasticity of tumor immune microenvironment.</a> Front Immunol. 12, 640369(2021).</li>
<li>Miranda Furtado, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidrugs%3A+targeting+epigenetic+marks+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epidrugs: targeting epigenetic marks in cancer treatment.</a> Epigenetics. 14 (12), 1164-1176 (2019).</li>
<li>Thomas, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%3A+best+practices+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: best practices and pitfalls.</a> Methods. 184, 53-60 (2020).</li>
<li>Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+characterization+of+histones+in+clinical+samples%3A+applications%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges.</a> FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).</li>
<li>Kwak, H. G., Dohmae, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+histone+variants+in+the+mouse+testis+by+mass+spectrometry-based+top-down+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Trends%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of histone variants in the mouse testis by mass spectrometry-based top-down analysis.</a> Biosci Trends. 10, 357-364 (2016).</li>
<li>Sidoli, S., Simithy, J., Karch, K. R., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resolution+data-independent+acquisition+in+an+LTQ-Orbitrap+allows+for+simplified+and+fully+untargeted+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-Orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications.</a> Anal Chem. 87, 11448-11454 (2015).</li>
<li>Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification+and+analysis+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification and analysis of histones.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).</li>
<li>Basak, S. K., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+electrophoretic+mobilities+of+proteins+and+peptides+with+their+physicochemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Correlation of electrophoretic mobilities of proteins and peptides with their physicochemical properties.</a> Anal Biochem. 226 (1), 51-58 (1995).</li>
<li>Nuccio, A. G., Bui, M., Dalal, Y., Nita-Lazar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+methodology+for+identification+of+native+histone+variant+modifications+from+mammalian+tissues+and+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based methodology for identification of native histone variant modifications from mammalian tissues and solid tumors.</a> Methods Enzymol. 586, 275-290 (2017).</li>
<li>Zhang, S., Roche, K., Nasheuer, H. P., Lowndes, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+histones+by+sugar+%CE%B2-N-acetylglucosamine+%28GlcNAc%29+occurs+on+multiple+residues%2C+including+histone+H3+serine+10%2C+and+is+cell+cycle-regulated%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modification of histones by sugar β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) occurs on multiple residues, including histone H3 serine 10, and is cell cycle-regulated.</a> J Biol Chem. 286 (43), 37483-37495 (2011).</li>
<li>Perri, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+proteomics+reveals+novel+post-translational+modifications+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Histone proteomics reveals novel post-translational modifications in breast cancer.</a> Aging. 11, 11722-11755 (2019).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Omenn, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+the+human+proteome+reaches+a+major+milestone%3A+%3E90%25+of+predicted+human+proteins+now+credibly+detected%2C+according+to+the+HUPO+human+proteome+project%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Research on the human proteome reaches a major milestone: >90% of predicted human proteins now credibly detected, according to the HUPO human proteome project.</a> J Proteome Res. 19 (12), 4735-4746 (2020).</li>
<li>Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+characterization+of+histones+in+clinical+samples%3A+applications%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges.</a> FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).</li>
<li>Starkova, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+profile+of+post-translational+modifications+of+histone+H1+in+chromatin+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">The profile of post-translational modifications of histone H1 in chromatin of mouse embryonic stem cells.</a> Acta Naturae. 11 (2), 82-91 (2019).</li>
<li>García-Giménez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+carbonylation+occurs+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Histone carbonylation occurs in proliferating cells.</a> Free Radic Biol Med. 52 (8), 1453-1464 (2012).</li>
<li>García-Saura, A. G., Schüler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP10+multi-site+auto-+and+histone+MARylation+visualized+by+acid-urea+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">PARP10 multi-site auto- and histone MARylation visualized by acid-urea gel electrophoresis.</a> Cells. 10, 654(2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W ciągu ostatniej dekady terapia pacjentów z rakiem została zrewolucjonizowana poprzez identyfikację różnych zmian molekularnych, które napędzają rozwój i progresję raka. Najważniejszym postępem we współczesnej onkologii jest opracowanie terapii opartej na kompleksowej analizie molekularnej. Postęp technologiczny w genomice i proteomice odegrał kluczową rolę w profilowaniu określonych biomarkerów na potrzeby wczesnego wykrywania, nadzoru, prognozowania i monitorowania leków. Proteomika jest definiowana jako analiza kompletnego zestawu białkowego komórki, tkanki lub organizmu w określonych warunkach, a także obejmuje badanie interakcji białek, modyfikacji potranslacyjnych i lokalizacji34. Specyficznym obszarem proteomiki jest epiproteomika, która polega na systematycznym badaniu potranslacyjnych modyfikacji histonów. Zostały one powiązane z rozwojem i progresją raka35. W artykule przedstawiono metodę identyfikacji określonych izoform histonów, które przyczyniają się do fenotypu komórkowego.
Krytycznym etapem metody jest ekstrakcja histonów ze względu na ich słabą rozpuszczalność i wysoką zasadowość. Jej głównymi ograniczeniami są złożoność mapy 2D oraz mała liczba wariantów, co może utrudniać analizę MS/MS. 
Ogólnie rzecz biorąc, główną zaletą tego podejścia jest to, że można je przeprowadzić w dowolnym laboratorium, a mini aparat żelowy może być posiadany z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności. W tym kontekście jesteśmy przekonani, że metoda ta może pomóc dużej liczbie naukowców, takich jak ci, którzy nie mogą skorzystać z dużego obiektu w swojej instytucji, w identyfikacji nowych epimarkerów, mających na celu poprawę wiedzy na temat epi-proteomu. Co więcej, metodę tę można połączyć ze spektrometrią mas, którą można zlecić na zewnątrz jako usługę, w celu odkrycia nowych proteoform. Może być również stosowany z testami immunologicznymi w celu potwierdzenia zmian w określonej modyfikacji potranslacyjnej, dla której dostępne jest komercyjne przeciwciało.
 Metodę wykorzystano do zbadania typowych zmian w modyfikacjach histonów związanych z rozwojem raka piersi28oraz do zbadania modyfikacji H1 w embrionalnych komórkach macierzystych myszy36. Ponadto metoda ta została z powodzeniem zastosowana do pomiaru poziomu karbonylacji histonów37 w szybko rosnących fibroblastach oraz do zbadania nowych modyfikacji histonów, takich jak glikacja histonów i MARylacja histonów38.
Z naszej perspektywy jesteśmy przekonani, że metoda ta może być z powodzeniem stosowana do profilowania nowych histonów PTM, szczególnie tych związanych z nieprawidłową aktywacją określonych szlaków metabolicznych, takich jak acetylacja, malonylacja, metylacja, lipidacja, laktylacja, butylacja i inne. Ostatecznie metoda ta może również służyć jako narzędzie mikropreparatywne do izolowania poszczególnych proteoform i może ułatwić analizę PTM związanych z metabolizmem, pogłębiając w ten sposób naszą wiedzę na temat tego kluczowego obszaru badań.

Początek, progresja i chemooporność raka są związane ze zdarzeniami genetycznymi i epigenetycznymi, w tym z histonami PTM. Histony przechodzą różne PTM, które regulują dynamikę chromatyny i decydują o losie komórki1.
Nukleosom jest jednostką funkcjonalną chromatyny i jest molekularnym kompleksem DNA i białek, który pozwala na upakowanie DNA w jądrze. Składa się z czterech par histonów (H3, H4, H2A i H2B), które tworzą rdzeń nukleosomu, a także histon łącznikowy H1, który pomaga ustabilizować strukturę chromatyny. Ogony aminowe (N)-końcowe histonów wystają ze swoich globularnych domen rdzeniowych i podlegają specyficznym modyfikacjom potranslacyjnym, które wpływają na krajobraz chromatyny2.
Do tej pory znane są co najmniej 23 klasy histonów PTM. Te PTM są kowalencyjnymi modyfikacjami, które składają się głównie z metylacji, acetylacji, fosforylacji, glikozylacji, ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji3. Ponadto niedawno zaproponowano ścisłą korelację między homeostazą epigenomu a ponownym okablowaniem metabolicznym, co wyjaśnia wykładniczy wzrost możliwej liczby histonów PTMs4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Histony PTM, zdeponowane, wymazane i transdukowane przez enzymy modyfikujące, są nazywane odpowiednio jako pisarze, gumki i czytniki. Wpływają one na właściwości fizyczne i chemiczne struktury chromatyny, wpływając na profil ekspresji genów, w tym na ekspresję genów supresorowych nowotworów i onkogenów14,15,16.
Liczba proteoform histonów wzrasta po włączeniu do nukleosomu jako warianty histonów. Warianty te są nieallelicznymi izoformami kanonicznych histonów i zwiększają złożoność poprzez zmianę chemicznych i fizycznych właściwości chromatyny. W porównaniu z histonami kanonicznymi, warianty histonów mają domeny funkcjonalne, które ulegają unikalnym modyfikacjom potranslacyjnym lub oddziałują z określonymi składnikami chromatyny, wpływając na dynamikę i stabilność nukleosomu17.
W komórkach nowotworowych deregulacja PTM i wariantów histonów wpływa na profil ekspresji genów, prowadząc do nieprawidłowej proliferacji komórek, inwazji, przerzutów i aktywacji szlaków oporności na leki3,18,19,20. Mutacje w histonach lub kompleksach przebudowujących chromatynę mogą zmieniać fenotyp komórki, przyczyniając się do transformacji nowotworowej. Nagromadzenie zmian epigenetycznych, takich jak metylacja histonów, jest kluczowym czynnikiem aktywującym szlaki oporności na leki21,22,23. Mutacje w obrębie kompleksu SWI/SNF, który składa się z 15 podjednostek kodowanych przez 29 genów, wpływają na ponad 20% nowotworów u ludzi w wielu typach nowotworów. W ciągu ostatniej dekady opracowano epigenetyczne strategie leków (epi-leki), a wiele leków ukierunkowanych na raka z nieprawidłowymi wzorcami modyfikacji histonów zostało zatwierdzonych przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA)23.
Analiza białek histonowych jest dość wymagająca, co czyni ją wymagającym obszarem badań. Ostatnio metody spektrometrii mas stały się preferowanym sposobem charakteryzowania i badania proteoform histonów. Jednak drastyczne warunki ekstrakcji, w połączeniu ze słabą rozpuszczalnością niektórych wariantów i wysoką homologią sekwencji, sprawiają, że ich analiza jest trudna.
W ciągu ostatniej dekady opracowano kilka metod opartych na spektrometrii mas do profilowania i badania histonów24,25,26,27. W niniejszej pracy przedstawiamy opłacalną i wiarygodną metodę tworzenia dwuwymiarowej mapy proteoform histonowych, która może zwiększyć szanse na odkrycie nowych modyfikacji potranslacyjnych.
2D Elektroforeza TAU łączy separację w warunkach kwaśnych z SDS PAGE. W pierwszym wymiarze kwaśny stan pożywki nadaje dodatni ładunek netto białkom zasadowym. Ponieważ histony są bardzo podstawowymi białkami i mają wyższy punkt izoelektryczny (pH) w porównaniu z podłożem, stają się naładowane dodatnio i migrują pod wpływem pola elektrycznego. W drugim wymiarze histony są denaturowane przez SDS i rozdzielane na podstawie ich masy cząsteczkowej. Uzyskana mapa 2D może być wykorzystana jako narzędzie do wzbogacania określonych proteoform w rozdzielczości pojedynczej plamki do analizy spektrometrii mas i badań immunologicznych28,29. Po elektroforezie plamki 2D TAU można odbarwić, trawić trypsyną i analizować za pomocą spektrometrii mas. Alternatywnie, mapę 2D TAU można nanieść na filtr nitrocelulozy/PVDF i zbadać za pomocą immunostainingu27.
W tym kontekście, metody te mogą być strategiczne dla poprawy identyfikacji i analizy nowych modyfikacji potranslacyjnych skorelowanych z przemianami metabolicznymi30,31.
Ulepszyliśmy oryginalną metodę, wprowadzając etap sonikacji, który jest pomocny w degradacji DNA i poprawie rozpuszczalności białek. Dodatkowo wydłużyliśmy etap inkubacji do ekstrakcji histonów, w celu uzyskania próbki białka o wysokiej czystości. Co więcej, w naszym protokole uruchomiliśmy pierwszy wymiar przy niskim napięciu przez dłuższy czas, aby osiągnąć lepszą rozdzielczość. Otrzymany żel wykorzystano do zbadania kanonicznych histonów PTM i scharakteryzowania nowych modyfikacji, takich jak glikacja10,32.
Ogólnie rzecz biorąc, opracowaliśmy metodę ekstrakcji i oczyszczania histonów, a następnie rozdzielczość proteoform histonów za pomocą dwuwymiarowej mapy. Praca obejmuje również procedurę trawienia w żelu do analizy spektrometrii mas oraz etapy dwuwymiarowej analizy western blot.

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditioerytrytol</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>D8255&nbsp;</td><td>Odczynnik do utrzymania &minus; Grupy SH w stanie zredukowanym; Ilościowo redukuje dwusiarczki.</td></tr><tr><td>1,5 M bufor Tris-HCL, pH 8,8</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0798</td><td>Żel rozdzielczy</td></tr><tr><td>10x Tris/Glicyna/SDS&nbsp;</td><td>BIO-RAD&nbsp;</td><td>1610772</td><td>Użyj tego wstępnie zmieszanego 10-krotnego buforu biegowego Tris/glicyna/SDS, aby oddzielić próbki białek za pomocą SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33539</td><td>2-Propanol (Isopropanol) jest alkoholem drugorzędowym. Został przetestowany jako substytut paliwa do stosowania w różnych ogniwach paliwowych. Proszek CuO rozpuszczony w 2-propanolu został wykorzystany do syntezy koloidów Cu wspomaganej ablacją laserową. Zawiesina 2-propanolu z Zn(NO3)2 została wykorzystana do wytworzenia fotoanody ze stali nierdzewnej pokrytej dwutlenkiem tytanu (P25-TiO2/SS) pokrytej jednolicie grubą warstwą P25-TiO2.Ta fotoanoda została wykorzystana w procesie elektrochemicznej degradacji fotokatalitycznej (ECPC).</td></tr><tr><td>30% roztwór akryloamidu/bis&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1610158</td><td>2,6% środkiem sieciującym. Odczynnik czystości do elektroforezy&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas octowy Lodowaty</td><td>Carlo Erba Reagennts</td><td>401392</td><td>Kwas octowy jest ważnym odczynnikiem chemicznym o wielu zastosowaniach przemysłowych.</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Panreac Applichem</td><td>211007.1214</td><td>Aceton&nbsp; to rozpuszczalnik znany ze swojej wszechstronności w różnych zastosowaniach laboratoryjnych, produkcyjnych i czyszczących.</td></tr><tr><td>Acetonityl</td><td>VWR</td><td>83640320</td><td>do HPLC&nbsp; &nbsp; LC-MS gatunek</td></tr><tr><td></td><td>Agaroza Invitrogen</td><td>15510-027</td><td>Agaroza&nbsp; jest&nbsp; Heteropolisacharyd&nbsp; Często stosowany w biologii molekularnej.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A6141</td><td>minimum 99,0%</td></tr> <tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A3678</td><td>Do biologii molekularnej, Do elektroforezy, &ge; 98%&nbsp;</td></tr><tr><td>Bioruptor plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001 - B01020002- B01020003</td><td>sonikator</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>D9163-5G</td><td>Środek redukujący stosowany w celu redukcji wiązań dwusiarczkowych w białkach.</td></tr><tr><td>Zestaw srebrnych bejc Dodeca&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0480</td><td>Zestaw do barwienia srebra Dodeca jest łatwy w użyciu do wykrywania poziomów nonagramowych białek w żelach poliakrylamidowych.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>GE - Healthcare Life Sciences</td><td>171325010L</td><td>Glicerol jest prostym związkiem triolowym, bierze udział w odlewaniu żeli gradientowych, stabilizatora białka i składnika bufora magazynowego.</td></tr><tr><td>Inhibitor fosfatazy zatrzymanej&nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>78428</td><td>Thermo Scientific Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail zachowuje stan fosforylacji białek podczas i po lizie komórek lub ekstrakcji białek tkankowych&nbsp; Koktajl jednorazowego użytku (100X).&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Zatrzymaj inhibitor proteazy&nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>78430</td><td>Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) to gotowe do użycia skoncentrowane roztwory podstawowe inhibitorów proteazy do dodawania do próbek w celu zapobiegania degradacji proteolitycznej podczas lizy komórek i ekstrakcji białek. Koktajl jednorazowego użytku (100X).&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H1758</td><td>BioReagent, do biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I6125</td><td>&ge; 99% (NMR), krystaliczny</td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541</td><td>Chlorek potasu, KCl, jest&nbsp; zwykle stosowany w procedurach laboratoryjnych. Jego zastosowanie jako bufora do przechowywania elektrod pH oraz jako roztworu referencyjnego do pomiarów przewodności jest dobrze znane.</td></tr><tr><td>Linia komórkowa MCF10</td><td>atcc</td><td>CRL-10317&nbsp;</td><td>linia komórkowa nabłonka, która została wyizolowana w 1984 roku z gruczołu sutkowego białej, 36-letniej kobiety z włóknisto-torbielowatymi piersiami. Ta linia komórkowa została zdeponowana przez Michigan Cancer Foundation.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>208337</td><td>Chlorek magnezu jest bezbarwnym krystalicznym ciałem stałym.</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametyloetylen-diamina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T9281</td><td>Do elektroforezy, ok. 99%</td></tr> <tr><td>Bufor soli fosforanowej 1X</td><td>Corning</td><td>15373631</td><td>1 X PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem) jest&nbsp; buforowany&nbsp; Zrównoważony roztwór soli&nbsp; Stosowany do różnych zastosowań biologicznych i hodowli komórkowych, takich jak mycie komórek przed dysocjacją, transport komórek lub tkanek, rozcieńczanie komórek do liczenia i przygotowywanie odczynników.</td></tr><tr><td>Heksacyjanożelazian potasu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>60299</td><td>Akceptor elektronów, stosowany w układach z udziałem transportu elektronów,</td></tr> <tr><td>SDS Roztwór 20% (w/v)&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0418</td><td>Dodecylosiarczan sodu. Odczynnik czystości do elektroforezy&nbsp;</td></tr><tr><td>Tiosiarczan sodu, ReagentPlus 99%</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>21,726-3</td><td>Tiosiarczan sodu, Reodagent Plus 99%</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339741</td><td>Kwas siarkowy, Odczynnik, jest&nbsp; Niezwykle kwas, który występuje w postaci żółtawej, lekko lepkiej cieczy. Jest rozpuszczalny w wodzie i jest kwasem diprotonowym . Posiada bardzo silne właściwości, odwadniające i utleniające, a także jest higroskopijny.</td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6399-5G</td><td>Kwas trichlorooctowy (TCA) jest&nbsp; Stosowany jako odczynnik do wytrącania białek1,2 i kwasów nukleinowych3.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Riedel-de Ha&euml; n</td><td>34957</td><td>Kwas trifluorooctowy</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>T9284-1L</td><td>Triton X-100 to niejonowy polioksyetylenowy środek powierzchniowo czynny, który jest najczęściej stosowany do ekstrakcji i rozpuszczania białek.</td></tr><tr><td>Trypsyna z trzustki świni</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6567</td><td>Klasa proteomiczna, BioReagent, Dimetylowany</td></tr><tr><td>MOCZNIK</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33247</td><td>Mocznik jest środkiem chaotropowym i służy do denaturacji białek. Zaburza wiązania wodorowe w drugorzędowej, trzeciorzędowej i czwartorzędowej strukturze białek. Może również zaburzać wiązania wodorowe obecne w drugorzędowej strukturze DNA</td></tr></tbody></table>

odsłonięcie proteoform histonów przy użyciu elektroforezy żelowej 2d-tau

Unveiling Histone Proteoforms using 2D-TAU Gel Electrophoresis

Histony przechodzą różne modyfikacje potranslacyjne (PTM), takie jak metylacja, acetylacja, fosforylacja, acylacja i ubikwitynacja, które kontrolują dynamikę nukleosomów i determinują los komórki. Nukleosom, który jest jednostką funkcjonalną chromatyny, składa się z DNA, czterech par histonów (H3, H4, H2A i H2B) tworzących jądro kuliste oraz łącznika histonu H1, który stabilizuje strukturę chromatyny. Ogony aminowe (N)-końcowe histonów wystają z domen jądra kulistego i przechodzą wyraźne PTM, które wpływają na krajobraz chromatyny. Niektóre dowody sugerują, że homeostaza histonów PTM ma kluczowe znaczenie dla zachowania wszystkich czynności fizjologicznych. Deregulacja histonów PTM jest główną przyczyną nieprawidłowej proliferacji, inwazji i przerzutów komórkowych. Dlatego kluczowe znaczenie ma opracowanie metod charakteryzowania histonów PTM. W tym miejscu opisujemy skuteczną technikę izolowania i analizowania izoform histonów. Metoda, oparta na połączeniu dwóch ortogonalnych separacji, pozwala na wzbogacenie izoform histonów i późniejszą identyfikację za pomocą spektrometrii mas. Technika, pierwotnie opisana przez Shechtera i wsp., łączy żele poliakryloamidowe kwasowo-mocznikowe (TAU-GEL), które mogą oddzielać podstawowe białka histonowe na podstawie wielkości i ładunku, oraz żele poliakryloamidosiarczanu sodu (SDS-PAGE), które mogą oddzielać białka według masy cząsteczkowej. Rezultatem jest dwuwymiarowa mapa izoform histonów, nadająca się do trawienia w żelu, a następnie identyfikacji za pomocą spektrometrii mas i analizy western blot. Rezultatem jest dwuwymiarowa mapa izoform histonów, odpowiednia zarówno do trawienia w żelu, jak i identyfikacji za pomocą spektrometrii mas i analizy western blot. To podejście proteomiczne jest solidną metodą, która pozwala na wzbogacenie pojedynczej izoformy histonu i scharakteryzowanie nowych histonów PTM.

Na Rysunku 1A można zaobserwować, w jaki sposób białka histonowe migrują w żelu 1D. Jest to istotny etap wstępny, pozwalający określić czas przebiegu w pierwszym wymiarze. Po ustaleniu odpowiedniego czasu rozdzielania należy przeprowadzić drugi wymiar. Mapa 2D proteoform histonowych wykazuje charakterystyczny wzór topograficzny (Rysunek 1B). Każda plamka na Rysunku 1B reprezentuje konkretny typ histonu. Należy zwrócić uwagę na dokładny obszar żelu, w którym znajduje się każda proteoforma histonu. Identyfikacja spektrometryczna dla każdej proteoformy histonowej została opisana w pracy Perri et al.32. Zatem w tych warunkach każda plamka jest powiązana z konkretnym typem histonu. Obecność dodatkowych plamek, obok tych kanonicznych, może wskazywać na istnienie nowych modyfikacji. Obrazy żeli można uzyskać za pomocą densytometrii, a otrzymany obraz można przeanalizować przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu.
Niezawodność mapy 2D TAU zależy od okrągłości plamek. Jeśli rozdział został przeprowadzony prawidłowo, plamki będą widoczne jako wyraźne sygnały, a smużenia poziome i pionowe nie będą występować. Z kolei zanieczyszczenia w próbce, roztworach oraz w warstwie agarozy mogą powodować powstawanie smug i/lub pasów w żelu. Jakość żelu wpłynie na digitalizację obrazu oraz następującą po niej analizę ilościową i jakościową. Ponadto może to wpłynąć na powodzenie analizy Western Blot oraz badań MS. Aby zweryfikować niezawodność metody, poddano działaniu przeciwciała pierwszorzędowego Acetylated-Lysine (Ac-K2-100) Rabbit mAb32 (Rycina 2) membranę nitrocelulozową z rozdzielonymi proteoformami histonów. Do detekcji sygnałów histonowych użyto przeciwciała wtórnego anty-króliczego HRP. Zgodnie z oczekiwaniami, przy użyciu densytometru możliwe jest ilościowe oznaczenie specyficznej modyfikacji potranslacyjnej każdego wariantu histonu obecnego na blocie.
<img alt="Wyniki elektroforezy białek; schemat żelu; mocznik triton-kwasowy, SDS, rozdział histonów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: 1D i 2D TAUgel. (A) Reprezentatywny obraz wzoru topograficznego histonów uzyskanego za pomocą 1D TAUgel. (B) Reprezentatywny obraz wzoru topograficznego histonów uzyskanego za pomocą 2D TAUgel. Identyfikacje danych zostały opisane przez Perri et al. 32. Zgodnie z oczekiwaniami, każda plamka reprezentuje konkretną proteoformę histonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rozdział białek za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej; schemat wymiarów triton-kwas mocznikowy i SDS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywny Western blot 2DTAU. Na obrazie można zaobserwować poziom acetylacji lizyny w każdej proteoformie histonów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynniki</td>
			<td>Stężenie: 15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% akrylamid/bis</td>
			<td>3.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5 M Tris pH 8,8</td>
			<td>2,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>woda MilliQ </td>
			<td>3,6 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS</td>
			<td>100 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% APS</td>
			<td>50 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED </td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład roztworu żelu rozdzielającego.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Krok </td>
			<td>Czas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixacja w 50% metanolu / 5% kwasie octowym </td>
			<td>1 h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przemyć 30% etanolem </td>
			<td>2 x 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przemyć wodą dejonizowaną </td>
			<td>1 x 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik uczulający tiosiarczan </td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przepłukać wodą dejonizowaną </td>
			<td>3 x 20 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Srebro Azotek srebra </td>
			<td>30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płukanie wodą dejonizowaną </td>
			<td>3 x 1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programista rozwoju </td>
			<td>25-30 min Uwaga: Wywoływać żel do momentu, aż plamy staną się widoczne (jasnobrązowe)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roztwór zatrzymujący </td>
			<td>1 x 10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płukanie wodą dejonizowaną </td>
			<td>2 x 5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przemyć wodą dejonizowaną  </td>
			<td>1 h</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Metoda barwienia srebrem.

Ta metoda opisuje prostą i szybką strategię charakterystyki i badania proteoform histonów.

Odsłonięcie proteoform histonów przy użyciu elektroforezy żelowej 2D-TAU

Histones undergo various post-translational modifications (PTMs) such as methylation, acetylation, phosphorylation, acylation, and ubiquitination, which ...

Nasze wysiłki koncentrują się obecnie na lepszym scharakteryzowaniu istniejącej korelacji między zmianami epigenetycznymi a przekształceniem metabolicznym, a ostatecznym celem jest zidentyfikowanie nowych epigenetycznych celów terapeutycznych. Biorąc pod uwagę dynamiczny i odwracalny charakter modyfikacji epigenetycznej, w ostatnim czasie opracowano kilka środków epilekowych, które doprowadziły do poprawy leczenia raka i zmniejszenia oporności na chemioterapię. W ostatnim czasie poczyniono znaczne postępy w dziedzinie charakterystyki instancji, dzięki zastosowaniu nowoczesnej spektrometrii mas w połączeniu z technikami separacji, takimi jak górna strona lub wysokosprawna chromatografia cieczowa.Głównym wyzwaniem w charakterystyce histonów jest istnienie niezliczonych proteoform histonowych, wynikających z wzajemnego oddziaływania między dynamicznie modyfikowanym enzymem a dostępnością metabolitów. Zacznij od przygotowania mini żelu TAU do mini pionowego żelu poliakrylamidowego, systemu elektroforezy. W tym celu należy rozpuścić sześć molowych moczników w roztworze 15% bis-akrylamidu i jednym mililitrze ultraczystej wody pod delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.Następnie dodaj pozostałe składniki i dostosuj głośność. Napełnij wstępnie ustawione płytki żelowe tym roztworem, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki powietrza i pozostawiając 1,5 centymetra od góry. Dodaj jeden mililitr izopropanolu na wierzch, aby wyrównać żel.Aby przygotować żel do układania w stosie, rozpuść mocznik w 6% akrylamidze, bis-akrylamidzie z jednym mililitrem ultraczystej wody. Po dodaniu pozostałych składników napełnij płytki żelowe tym roztworem i włóż grzebień z 10 dołkami między płytki, aż roztwór dotrze do połowy wysokości zębów grzebienia. Następnie rozpuść sześć molowego mocznika, 5% lodowaty kwas octowy i podwójnie destylowaną wodę, aby przygotować 100 mikrolitrów buforu do próbek TAU.Następnie rozpuść liofilizowaną próbkę histonów w 30 mikrolitrach buforu do próbek TAU. Napełnij mini kasetę buforem do pracy TAU o końcowym stężeniu 5% kwasu octowego. Za pomocą strzykawki przepłukać studzienki żelu za pomocą bieżącego buforu i załadować próbkę do studzienek za pomocą mikropipety.Następnie podłącz komorę elektroforetyczną do zasilania, umieszczając elektrodę dodatnią na dole. Od czasu do czasu wyłącz zasilanie i przepłucz studzienki żelu strzykawką, aby usunąć pęcherzyki z dolnej powierzchni żelu. Po wyjęciu żelu z płytek żelowych przetnij pas zainteresowania za pomocą czystego skalpela.Teraz umyj pas żelowy 15 mililitrami 0,5 M chlorowodorku tris o pH 8,8 przez 15 minut. Przygotuj 15 mililitrów buforu równowagi jeden i drugi, używając pokazanych tutaj składników. Następnie przechowuj bufor równowagi dwa w ciemności.Teraz inkubuj pas żelowy w 10 mililitrach bufora równowagi jeden z delikatnym mieszaniem przez 15 minut, a następnie zdekantuj. Następnie inkubuj pas żelowy w 10 mililitrach buforu równowagi dwa pod delikatnym mieszaniem przez 15 minut w ciemności przed dekantacją. Następnie przygotuj 15% żel rozpuszczający akrylamid, używając kompozycji pokazanej tutaj.Ustaw płytkę żelową i napełnij ją rozdzielczym roztworem żelu, pozostawiając 1,5 centymetra od końca długiej płytki żelowej. Dodaj jeden mililitr izopropanolu na wierzch, aby wyrównać żel i pozwolić mu spolimeryzować. Po polimeryzacji żelu zdekantować izopropanol i dobrze wysuszyć, używając bibuły do chromatografii celulozowej o średnicy trzech mm.Włóż przecięty pas żelu do dobrze rozdzielczego żelu za pomocą pęsety, aby zapobiec pęcherzykom powietrza, a następnie uszczelnij pas żelu do żelu rozdzielczego, używając 0,5% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w tris glicynie i buforze SDS, z pięcioma mikrolitrami 0,003% błękitu bromofenolowego. Umieść płytki żelowe w kasecie i napełnij je glicyną tris i buforem SDS. Uruchom żel pod napięciem 120 woltów, aż niebieski barwnik bromofenolowy dotrze do dna.Po uruchomieniu delikatnie usuń żel z płytek i wyrzuć nadmiar agarozy. Na początek wykonaj mini żel 2D z kwasem trytonowym, mocznik lub elektroforezę TAU na próbkach histonów, a następnie barwienie srebrem. Następnie przygotuj pokazane tutaj odczynniki.Za pomocą czystego skalpela wytnij interesujące miejsca histonów z poplamionego żelu i umieść każde miejsce w świeżej, 1,5-mililitrowej silikonowej probówce, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego izoformą. Dodaj 250 mikrolitrów 50-milimolowego wodorowęglanu amonu lub 50% nitro acetonu do każdego miejsca żelu i inkubuj pod delikatnym mieszaniem w mikserze termicznym w temperaturze pokojowej. Zdekantować roztwór i powtórzyć ten proces trzy razy, aż kawałki żelu staną się przezroczyste.Aby odwodnić plamy żelu, dodaj 200 mikrolitrów acetonu nitrolu. Na tym etapie kawałki żelu zmienią kolor na nieprzezroczysty biały. Zdekantuj nitryl acetonowy i pozostaw plamy żelu do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.Kawałki żelu będą wydawać się suche w tubkach. Następnie nawodnij miejsca żelu, dodając 20 mikrolitrów roztworu trypsyny lub objętość wystarczającą do pokrycia kawałków żelu. Inkubować probówki w mieszalniku termicznym w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod delikatnym mieszaniem przez co najmniej cztery godziny do 16 godzin.Przenieść supernatant zawierający peptydy tryptykowe do świeżej probówki. Dodać 50 mikrolitrów roztworu ekstrakcyjnego do kawałków żelu i dwukrotnie sonikować w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant zawierający dodatkowe peptydy tryptykowe do tej samej świeżej probówki.Użyj liofilizatora, aby wysuszyć zebrane wyekstrahowane peptydy w temperaturze 30 stopni Celsjusza. W probówce utworzy się liofilizowany osad. Teraz dodaj 15 mikrolitrów 0,1% kwasu trifluorooctowego do każdej probówki i delikatnie inkubuj w mikserze termicznym w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Przenieść supernatant do fiolki do tandemowej chromatografii cieczowej, analizy spektrometrii mas.

unveiling-histone-proteoforms-using-2d-tau-gel-electrophoresis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje protokół oceny stanu fosforylacji białka tau za pomocą testu fosfatazy w komórkach raka jelita grubego. Enzym fosfataza działa na grupy fosforanowe obecne na białku tau, zwiększając ruchliwość białka tau w żelu SDS PAGE w porównaniu z nietraktowanymi próbkami białka tau.

Test fosfatazy w komórkach CRC: metoda badania stanu fosforylacji białka Tau w komórkach raka jelita grubego

Ten film demonstruje użycie technik magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) do identyfikacji wielu fosforylacji w białku. Fosforylacja białka przy określonym aminokwasie powoduje deekranację sąsiedniego wodoru amidowego, co generuje różnicę widmową.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego w celu identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek

Źródło: Bennett, S. A.,  i wsp., Charakterystyka zmian modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelach neurodegeneracyjnej proteinopatii drożdży. J. Vis. Exp. (2019). Ten film przedstawia procedurę oceny modyfikacji histonów w komórkach drożdży z nadekspresją białek neurodegeneracyjnych. Etapy obejmują lizę komórek, wirowanie, elektroforezę, transfer błonowy i wykrywanie zmodyfikowanych histonów na podstawie przeciwciał.

Wykrywanie modyfikacji histonów w komórkach drożdży z nadekspresją białek neurodegeneracyjnych

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji wielokrotnych fosforylacji wewnętrznie nieuporządkowanego białka za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), używając białka Tau jako studium przypadku. Rekombinowany Tau jest izotopowo wzbogacany i modyfikowany in vitro przez kinazę przed pozyskaniem i analizą danych.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Ten manuskrypt opisuje standardowe protokoły pomiaru hiperfosforylacji tau, pomiaru wiązania tau z mikrotubulami oraz lokalizacji wewnątrzkomórkowego tau po leczeniu farmakologicznym. Protokoły te mogą być stosowane wielokrotnie do badań przesiewowych leków lub innych związków, które są ukierunkowane na hiperfosforylację tau lub wiązanie mikrotubul.

Test fosforylacji i wiązania mikrotubul wraz z lokalizacją białka Tau w komórkach raka jelita grubego

Tutaj prezentujemy dwuwymiarową elektroforezę żelową (2DE) w połączeniu ze spektrometrią mas (MS) w celu oddzielenia i identyfikacji proteomu tkankowego ludzkiego gruczolaka przysadki, który przedstawia dobry i powtarzalny wzór 2DE. Wiele białek obserwuje się w każdym miejscu 2DE podczas analizy złożonego proteomu nowotworu przy użyciu MS o wysokiej czułości.

Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa w połączeniu z metodami spektrometrii mas do analizy proteomu tkanki gruczolaka przysadki mózgowej

Ten protokół przedstawia procedury eksperymentalne do charakteryzowania zmian w całym genomie w poziomach modyfikacji potranslacyjnych histonów (PTM) występujących w związku z nadekspresją białek związanych z ALS i chorobą Parkinsona w modelach Saccharomyces cerevisiae. Po oddzieleniu SDS-PAGE poszczególne poziomy PTM histonów są wykrywane za pomocą przeciwciał specyficznych dla modyfikacji za pomocą Western blot.

Charakterystyka zmian modyfikacji potranslacyjnej histonów w modelach neurodegeneracyjnej proteinopatii drożdży

Tau jest białkiem neuronalnym obecnym zarówno w cytoplazmie, gdzie wiąże mikrotubule, jak i w jądrze, gdzie pełni niekonwencjonalne funkcje, w tym modulację genów związanych z chorobą Alzheimera. W tym miejscu opisujemy metodę badania funkcji jądrowego Tau przy jednoczesnym wykluczeniu wszelkich zakłóceń pochodzących z cytoplazmatycznego Tau.

Modulacja lokalizacji subkomórkowej Tau jako narzędzie do badania ekspresji genów związanych z chorobą

Poznaj elektroforezę żelową 2D-TAU do charakteryzacji proteoform histonów w badaniach epigenetycznych. Ta metoda umożliwia identyfikację nowych celów terapeutycznych w leczeniu nowotworów.

Odsłonięcie proteoform histonów przy użyciu elektroforezy żelowej 2D-TAU

Przeglądaj więcej filmów