Odsłonięcie proteoform histonów przy użyciu elektroforezy żelowej 2D-TAU

Nasze wysiłki koncentrują się obecnie na lepszym scharakteryzowaniu istniejącej korelacji między zmianami epigenetycznymi a przekształceniem metabolicznym, a ostatecznym celem jest zidentyfikowanie nowych epigenetycznych celów terapeutycznych. Biorąc pod uwagę dynamiczny i odwracalny charakter modyfikacji epigenetycznej, w ostatnim czasie opracowano kilka środków epilekowych, które doprowadziły do poprawy leczenia raka i zmniejszenia oporności na chemioterapię. W ostatnim czasie poczyniono znaczne postępy w dziedzinie charakterystyki instancji, dzięki zastosowaniu nowoczesnej spektrometrii mas w połączeniu z technikami separacji, takimi jak górna strona lub wysokosprawna chromatografia cieczowa.

Głównym wyzwaniem w charakterystyce histonów jest istnienie niezliczonych proteoform histonowych, wynikających z wzajemnego oddziaływania między dynamicznie modyfikowanym enzymem a dostępnością metabolitów. Zacznij od przygotowania mini żelu TAU do mini pionowego żelu poliakrylamidowego, systemu elektroforezy. W tym celu należy rozpuścić sześć molowych moczników w roztworze 15% bis-akrylamidu i jednym mililitrze ultraczystej wody pod delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj pozostałe składniki i dostosuj głośność. Napełnij wstępnie ustawione płytki żelowe tym roztworem, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki powietrza i pozostawiając 1,5 centymetra od góry. Dodaj jeden mililitr izopropanolu na wierzch, aby wyrównać żel.

Aby przygotować żel do układania w stosie, rozpuść mocznik w 6% akrylamidze, bis-akrylamidzie z jednym mililitrem ultraczystej wody. Po dodaniu pozostałych składników napełnij płytki żelowe tym roztworem i włóż grzebień z 10 dołkami między płytki, aż roztwór dotrze do połowy wysokości zębów grzebienia. Następnie rozpuść sześć molowego mocznika, 5% lodowaty kwas octowy i podwójnie destylowaną wodę, aby przygotować 100 mikrolitrów buforu do próbek TAU.

Następnie rozpuść liofilizowaną próbkę histonów w 30 mikrolitrach buforu do próbek TAU. Napełnij mini kasetę buforem do pracy TAU o końcowym stężeniu 5% kwasu octowego. Za pomocą strzykawki przepłukać studzienki żelu za pomocą bieżącego buforu i załadować próbkę do studzienek za pomocą mikropipety.

Następnie podłącz komorę elektroforetyczną do zasilania, umieszczając elektrodę dodatnią na dole. Od czasu do czasu wyłącz zasilanie i przepłucz studzienki żelu strzykawką, aby usunąć pęcherzyki z dolnej powierzchni żelu. Po wyjęciu żelu z płytek żelowych przetnij pas zainteresowania za pomocą czystego skalpela.

Teraz umyj pas żelowy 15 mililitrami 0,5 M chlorowodorku tris o pH 8,8 przez 15 minut. Przygotuj 15 mililitrów buforu równowagi jeden i drugi, używając pokazanych tutaj składników. Następnie przechowuj bufor równowagi dwa w ciemności.

Teraz inkubuj pas żelowy w 10 mililitrach bufora równowagi jeden z delikatnym mieszaniem przez 15 minut, a następnie zdekantuj. Następnie inkubuj pas żelowy w 10 mililitrach buforu równowagi dwa pod delikatnym mieszaniem przez 15 minut w ciemności przed dekantacją. Następnie przygotuj 15% żel rozpuszczający akrylamid, używając kompozycji pokazanej tutaj.

Ustaw płytkę żelową i napełnij ją rozdzielczym roztworem żelu, pozostawiając 1,5 centymetra od końca długiej płytki żelowej. Dodaj jeden mililitr izopropanolu na wierzch, aby wyrównać żel i pozwolić mu spolimeryzować. Po polimeryzacji żelu zdekantować izopropanol i dobrze wysuszyć, używając bibuły do chromatografii celulozowej o średnicy trzech mm.

Włóż przecięty pas żelu do dobrze rozdzielczego żelu za pomocą pęsety, aby zapobiec pęcherzykom powietrza, a następnie uszczelnij pas żelu do żelu rozdzielczego, używając 0,5% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w tris glicynie i buforze SDS, z pięcioma mikrolitrami 0,003% błękitu bromofenolowego. Umieść płytki żelowe w kasecie i napełnij je glicyną tris i buforem SDS. Uruchom żel pod napięciem 120 woltów, aż niebieski barwnik bromofenolowy dotrze do dna.

Po uruchomieniu delikatnie usuń żel z płytek i wyrzuć nadmiar agarozy. Na początek wykonaj mini żel 2D z kwasem trytonowym, mocznik lub elektroforezę TAU na próbkach histonów, a następnie barwienie srebrem. Następnie przygotuj pokazane tutaj odczynniki.

Za pomocą czystego skalpela wytnij interesujące miejsca histonów z poplamionego żelu i umieść każde miejsce w świeżej, 1,5-mililitrowej silikonowej probówce, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego izoformą. Dodaj 250 mikrolitrów 50-milimolowego wodorowęglanu amonu lub 50% nitro acetonu do każdego miejsca żelu i inkubuj pod delikatnym mieszaniem w mikserze termicznym w temperaturze pokojowej. Zdekantować roztwór i powtórzyć ten proces trzy razy, aż kawałki żelu staną się przezroczyste.

Aby odwodnić plamy żelu, dodaj 200 mikrolitrów acetonu nitrolu. Na tym etapie kawałki żelu zmienią kolor na nieprzezroczysty biały. Zdekantuj nitryl acetonowy i pozostaw plamy żelu do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.

Kawałki żelu będą wydawać się suche w tubkach. Następnie nawodnij miejsca żelu, dodając 20 mikrolitrów roztworu trypsyny lub objętość wystarczającą do pokrycia kawałków żelu. Inkubować probówki w mieszalniku termicznym w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod delikatnym mieszaniem przez co najmniej cztery godziny do 16 godzin.

Przenieść supernatant zawierający peptydy tryptykowe do świeżej probówki. Dodać 50 mikrolitrów roztworu ekstrakcyjnego do kawałków żelu i dwukrotnie sonikować w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant zawierający dodatkowe peptydy tryptykowe do tej samej świeżej probówki.

Użyj liofilizatora, aby wysuszyć zebrane wyekstrahowane peptydy w temperaturze 30 stopni Celsjusza. W probówce utworzy się liofilizowany osad. Teraz dodaj 15 mikrolitrów 0,1% kwasu trifluorooctowego do każdej probówki i delikatnie inkubuj w mikserze termicznym w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Przenieść supernatant do fiolki do tandemowej chromatografii cieczowej, analizy spektrometrii mas.