Name: Przyżyciowe obrazowanie podłużne dynamiki naczyń krwionośnych w szpiku kostnym kości nazębnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj dynamikę naczyń krwionośnych w szpiku kostnym kości nazębnej przy użyciu mikroskopii przyżyciowej. Ta metoda umożliwia długoterminowe obserwacje zmian naczyniowych w chorobach nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować całemu personelowi IMAG'IC i ośrodkom ds. zwierząt w Instytucie Cochin za wsparcie w zakresie eksperymentów mikroskopowych i pomieszczeń dla myszy. Myszy Tg(Nes-EGFP)33Enik i Tg(Pdgfb-icre/ERT2)1Frut były miłym darem dr Bonneta (The Francis Crick Institute, Londyn). Tg(Cdh5-cre/ERT2)1Rha oraz B6. Myszy Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J były miłym prezentem dr Rafii (Weill Cornell Medicine, Nowy Jork). Opisane prace były wspierane przez CNRS, INSERM i Université de Paris Cite oraz granty z ATIP-AVENIR, Fondation ARC pour la recherche sur le cancer (R19084KS - RSE20008KSA), Ville de Paris "Emergence" (R20192KK - RPH20192KKA), Laurette Fugain (R23197KK), Cancéropôle IDF (RPH23177KKA), INCA PLBIO (RPH21162KKA), Fondation de France (RAF23152KKA), Ligue contre le cancer (282273/807251), Institut du cancer Paris Carpem, Europejskie Towarzystwo Hematologiczne (RAK23130KKA) oraz Europejska Rada ds. Badań Naukowych ERC-STG (EEA24092KKA). Główny obiekt IMAG'IC jest wspierany przez National Infrastructure France BioImaging (grant ANR-10-INBS-04). Laboratorium Passaro jest stowarzyszone z "Institut Hors Murs des Sciences Cardiovasculaires" oraz z "Leukemia Institute Paris Saint-Louis".

<ol><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li>
<li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li>
<li>Itkin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+bone+marrow+blood+vessels+differentially+regulate+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis.</a> Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).</li>
<li>Christodoulou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+imaging+of+native+haematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).</li>
<li>Upadhaya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+reveals+motility+of+adult+hematopoietic+stem+cells+in+the+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging reveals motility of adult hematopoietic stem cells in the bone marrow niche.</a> Cell Stem Cell. 27 (2), 336-345.e4 (2020).</li>
<li>Hawkins, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+acute+leukaemia+exhibits+dynamic+interactions+with+bone+marrow+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell acute leukaemia exhibits dynamic interactions with bone marrow microenvironments.</a> Nature. 538 (7626), 518-522 (2016).</li>
<li>Duarte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+in+vivo+characteristics+of+acute+myeloid+leukemia+cells+behavior+by+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defining the in vivo characteristics of acute myeloid leukemia cells behavior by intravital imaging.</a> Immunol Cell Biol. 97 (2), 229-235 (2019).</li>
<li>Passaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+vascular+permeability+in+the+bone+marrow+microenvironment+contributes+to+disease+progression+and+drug+response+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to disease progression and drug response in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 32 (3), 324-341.e6 (2017).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLT3+inhibitors+upregulate+CXCR4+and+E-selectin+ligands+via+ERK+suppression+in+AML+cells+and+CXCR4%2FE-selectin+inhibition+enhances+anti-leukemia+efficacy+of+FLT3-targeted+therapy+in+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">FLT3 inhibitors upregulate CXCR4 and E-selectin ligands via ERK suppression in AML cells and CXCR4/E-selectin inhibition enhances anti-leukemia efficacy of FLT3-targeted therapy in AML.</a> Leukemia. 37 (6), 1379-1383 (2023).</li>
<li>Pendleton, E. G., Tehrani, K. F., Barrow, R. P., Mortensen, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+generation+characterization+of+collagen+in+whole+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Second harmonic generation characterization of collagen in whole bone.</a> Biomed Opt Express. 11 (8), 4379-4396 (2020).</li>
<li>Dispositif de liaison d'un animal de laboratoire à au moins un système d'expérimentation, et procédé de fixation d'un tel dispositif. France patent. , WO/2021/123449 (2021).</li>
<li>Horton, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukemia+induced+by+MLL-ENL+is+cured+by+oncogene+ablation+despite+acquisition+of+complex+genetic+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukemia induced by MLL-ENL is cured by oncogene ablation despite acquisition of complex genetic abnormalities.</a> Blood. 113 (20), 4922-4929 (2009).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683(2014).</li>
<li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+mouse+bone+marrow%3A+Hemodynamics+and+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of mouse bone marrow: Hemodynamics and vascular permeability.</a> Methods Mol Biol. 1763, 11-22 (2018).</li>
<li>Le, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+longitudinal+visualization+of+bone+marrow+engraftment+process+in+mouse+calvaria+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">In vivo longitudinal visualization of bone marrow engraftment process in mouse calvaria using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 7, 44097(2017).</li>
<li>Spencer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+local+oxygen+concentration+in+the+bone+marrow+of+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of local oxygen concentration in the bone marrow of live animals.</a> Nature. 508 (7495), 269-273 (2014).</li>
<li>Yang, M., Mahanty, A., Jin, C., Wong, A. N. N., Yoo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+metabolic+imaging+for+sensitive+and+robust+monitoring+of+anti-CD47+immunotherapy+response+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Label-free metabolic imaging for sensitive and robust monitoring of anti-CD47 immunotherapy response in triple-negative breast cancer.</a> J Immunother Cancer. 10 (9), e005199(2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+strain-specific+morphogenesis+and+angiogenesis+of+murine+calvaria+with+large-scale+optoacoustic+and+Ultrasound+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Tracking strain-specific morphogenesis and angiogenesis of murine calvaria with large-scale optoacoustic and Ultrasound Microscopy.</a> J Bone Miner Res. 37 (5), 1032-1043 (2022).</li>
<li>Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+imaging+reveals+structural+and+functional+heterogeneity+in+different+bone+marrow+compartments%3A+functional+implications+on+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells.</a> Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).</li>
<li>Rindone, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+imaging+of+the+cranial+microvascular+environment+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D imaging of the cranial microvascular environment at single-cell resolution.</a> Nat Commun. 12 (1), 6219(2021).</li>
<li>Mills, W. A. 3rd, Coburn, M. A., Eyo, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+the+calvarial+hematopoietic+niche+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The emergence of the calvarial hematopoietic niche in health and disease.</a> Immunol Rev. 311 (1), 26-38 (2022).</li>
<li>Bixel, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+is+uncoupled+from+osteogenesis+during+calvarial+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis is uncoupled from osteogenesis during calvarial bone regeneration.</a> Nat Commun. 15 (1), 4575(2024).</li>
<li>Koh, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+skull+bone+marrow+is+an+expanding+and+resilient+haematopoietic+reservoir%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult skull bone marrow is an expanding and resilient haematopoietic reservoir.</a> Nature. 636 (8041), 172-181 (2024).</li>
<li>Kolabas, Z. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+molecular+profiles+of+skull+bone+marrow+in+health+and+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct molecular profiles of skull bone marrow in health and neurological disorders.</a> Cell. 186 (17), 3706-3725.e9 (2023).</li>
<li>Rosenhain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+micro-computed+tomography+database+including+3D+whole+body+organ+segmentations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">A preclinical micro-computed tomography database including 3D whole body organ segmentations.</a> Sci Data. 5, 180294(2018).</li>
</ol>

Jozsua Fodor jest założycielem firmy YMETRY (nr 888312352 w rejestrze). Pozostali autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Główną zaletą mikroskopii przyżyciowej jest jej zdolność do uchwycenia dynamicznych procesów komórkowych w czasie rzeczywistym w ich naturalnym środowisku, pokonując ograniczenia tradycyjnych metod obrazowania histologicznego i ex vivo. Poprzez bezpośrednią obserwację BM kalwarii przy użyciu zaawansowanych technik obrazowania w połączeniu ze znakowaniem fluorescencyjnym, jak opisano w tym protokole, naukowcy mogą badać nie tylko parametry funkcjonalne naczyń krwionośnych 8,14, ale także procesy podłużne, takie jak wszczepienie i migracja komórek białaczkowych 6,15, proliferacja i aktywność metaboliczna16,17 zachowanie znaczenia fizjologicznego i unikanie artefaktów związanych z utrwalaniem i przetwarzaniem tkanek.
Zalety obrazowania przyżyciowego BM calvaria w porównaniu z alternatywnymi miejscami kostnymi obejmują łatwy dostęp, przezroczystość kości czaszki pozwalającą na lepszą wizualizację bez uszkodzenia kości, stabilność kości calwarii minimalizującą artefakty ruchu tkanek oraz odtwarzalność u zwierząt doświadczalnych ułatwiającą porównanie między różnymi grupami eksperymentalnymi. Możliwość odzyskania zwierząt i wykonania obrazowania podłużnego pozwala również na zmniejszenie liczby zwierząt wykorzystywanych w badaniu. Warto wspomnieć, że ponieważ zaobserwowano specyficzne dla szczepu różnice we wzorcach wzrostu naczyń czaszki i wynikającej z tego osteogenezie18, ważne jest, aby wziąć to pod uwagę podczas projektowania konkretnego implantu do obrazowania dla pożądanego szczepu myszy, aby umożliwić doskonałą zgodność anatomiczną i dostęp do pożądanego miejsca obrazowania.
Inną ważną kwestią, o której należy wspomnieć, są potencjalne różnice we właściwościach naczyniowych i krwiotwórczych w obrębie kości kalwarycznej BM w porównaniu z innymi kośćmi, co do niedawna było słabo zbadanym pytaniem. Nowe badania sugerują zlokalizowane funkcje różnych kości, przy czym BM kalwarii różni się od innych kości pod względem hematopoezy, struktury i funkcji kości i naczyń krwionośnych 19,20,21,22,23, a także odpowiedzi na patologie neurologiczne 24. Różnice te muszą być dalej badane i brane pod uwagę przed uogólnieniem konkretnych ustaleń dotyczących kalwarii.
Zaprojektowanie i skonstruowanie implantu do obrazowania jest kluczowym krokiem w tej eksperymentalnej konfiguracji, począwszy od wyboru materiału. Biokompatybilne implanty odgrywają kluczową rolę w badaniach biomedycznych, ułatwiając szeroki wachlarz zastosowań, od inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej po systemy dostarczania leków i urządzenia do monitorowania in vivo . Wybór materiału na implant głowy przystosowany do obrazowania przyżyciowego ma kluczowe znaczenie. Idealnie byłoby, gdyby materiał wykazywał doskonałą biokompatybilność, właściwości mechaniczne odpowiednie do zapewnienia minimalnej elastyczności i ogólnej stabilności, a wreszcie zdolność do integracji w czaszce bez wywoływania stanu zapalnego. Tytan jest idealny ze względu na dobrą tolerancję w organizmie zwierzęcia, bez wywoływania działań niepożądanych w kontakcie z tkankami biologicznymi, a także ze względu na odporność na korozję, zapewniając długotrwałą stabilność nawet w przypadku wystawienia na działanie płynów ustrojowych lub roztworów eksperymentalnych. Ponadto jego wytrzymałość mechaniczna sprawia, że jest odporny na odkształcenia i pękanie. Pomimo swojej wytrzymałości, tytan ma stosunkowo niską gęstość, co skutkuje lekkimi urządzeniami do obrazowania przyżyciowego, które minimalizują obciążenie zwierząt doświadczalnych i badaczy. Wreszcie, jego wszechstronność w produkcji pozwala na dostosowanie urządzeń do obrazowania przyżyciowego do konkretnych wymagań eksperymentalnych, takich jak rozmiar, kształt i funkcjonalność.
W tym przypadku zaprojektowaliśmy biokompatybilny implant do mocowania głowy przy użyciu oprogramowania CAD do modelowania parametrycznego z wbudowanymi funkcjami analizy elementów skończonych (MES), w szczególności SolidWorks. Takie podejście umożliwia precyzyjne, iteracyjne dostosowanie do wymagań strukturalnych i przestrzennych implantu, zapewniając zarówno zgodność anatomiczną, jak i odporność mechaniczną. Darmowe alternatywy, takie jak FreeCAD, oferują podobne funkcje modelowania i symulacji. Podstawowe dane wejściowe w procesie projektowania obejmują model anatomiczny czaszki myszy o wysokiej rozdzielczości, model obiektywu mikroskopu oraz model systemu mocowania, które razem informują o wymiarach i konfiguracji implantu. Końcowym wynikiem jest niezależny od platformy plik siatki, zwykle w formacie STL lub STEP, kompatybilny z większością programów do drukowania 3D.
Pierwszym krokiem jest uchwycenie szczegółowych cech anatomicznych głowy myszy za pomocą technik obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takich jak mikrotomografia komputerowa in vivo . Takie podejście zapewnia najwyższą szczegółowość anatomiczną i dokładność, uchwycając mikrostruktury czaszki. Skanowanie 3D przygotowanej, nagiej czaszki może być również opcją. Ta metoda, wykorzystująca skanery laserowe lub skanery światła strukturalnego, jest powszechnie stosowana na preparowanej czaszce i zapewnia dokładne kontury powierzchni, choć z mniejszą ilością szczegółów wewnętrznych w porównaniu z mikrotomografią komputerową. W przeciwnym razie modele anatomiczne można pobrać z publikacji i baz danych open source25 lub DigiMorph {https://www.digimorph.org/specimens/Mus_musculus/}. Chociaż modele te są wygodne, mogą nie mieć szczegółów specyficznych dla próbki, dlatego często konieczne są korekty dla konkretnego zwierzęcia w badaniu, takie jak skalowanie do rzeczywistej odległości Bregma-Lambda. Pozyskane dane są następnie wykorzystywane do stworzenia precyzyjnego modelu 3D czaszki myszy, który służy jako podstawowy szablon do projektu implantu.
Aby przymocować implant do czaszki, zaprojektowano strukturę cementową, która pokrywa pozostałą powierzchnię czaszki, która nie jest zajęta przez okno obserwacyjne. Struktura ta musi zapewniać solidne punkty mocowania, unikając jednocześnie krytycznych cech anatomicznych. Struktura cementująca ma wiele otworów, aby zapewnić optymalną polimeryzację cementu pod implantem poprzez dyfuzję. Dodatkowo ściany konstrukcji cementowej mają mały kąt pochylenia, co pozwala cementowi bezpiecznie zakotwić się do tych skośnych ścian. Ogon implantu, który rozciąga się od głównego korpusu do systemu mocowania, jest zaprojektowany. Element ten ma kluczowe znaczenie dla wyrównania i stabilizacji implantu podczas obserwacji, a jego konstrukcja musi uwzględniać dostępną przestrzeń i ograniczenia anatomiczne głowy myszy. Wreszcie, mechanizm jaskółczego ogona jest zintegrowany z konstrukcją implantu, co ułatwia zakładanie i odłączanie implantu od systemu mocowania. Ta cecha zwiększa praktyczność i użyteczność implantu podczas wielokrotnych obserwacji. Mechanizm jaskółczego ogona zapewnia powtarzalne utrwalanie w celu łatwego pobierania obserwowanych tkanek do powtarzających się sesji obrazowania.
Czytelnicy rozważający przyjęcie obrazowania pod mikroskopem przyżyciowym kości kalwarycznej powinni dokładnie ocenić swoje cele badawcze i wymagania eksperymentalne, aby określić, czy ta metoda jest odpowiednia dla ich badań. Chociaż mikroskopia przyżyciowa oferuje niezrównany wgląd w hematopoezę, regulację mikrośrodowiska tkanek i dynamikę naczyń krwionośnych in vivo, wiąże się również z pewnymi wyzwaniami i ograniczeniami technicznymi. Naukowcy powinni być przygotowani do sprostania tym wyzwaniom poprzez staranne projektowanie eksperymentów, optymalizację parametrów obrazowania i wykorzystanie odpowiednich kontroli. Ponadto badacze powinni wziąć pod uwagę dostępność specjalistycznego sprzętu do obrazowania, wiedzę specjalistyczną w zakresie technik znakowania fluorescencyjnego oraz zasoby obliczeniowe do analizy obrazu. Ogólnie rzecz biorąc, obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym kości kalczastej ma ogromny potencjał w zakresie pogłębiania naszej wiedzy na temat hematopoezy i biologii naczyniowej, oferując unikalne okno na dynamiczne procesy zachodzące w mikrośrodowisku BM.

Obrazowanie przyżyciowe szpiku kostnego nazębnego (BM) służy jako potężna i niezbędna technika do badania dynamicznych procesów hematopoezy, regulacji mikrośrodowiska tkanek i dynamiki naczyń w niszy BM. Głównym celem tego podejścia metodologicznego jest umożliwienie wizualizacji i analizy w czasie rzeczywistym zachowań, interakcji i organizacji przestrzennej komórek w mikrośrodowisku BM in vivo. Poprzez bezpośrednią obserwację kalwarii BM przy użyciu zaawansowanych technik obrazowania w połączeniu ze znakowaniem fluorescencyjnym, naukowcy mogą wyjaśnić złożone wzajemne oddziaływanie między hematopoetycznymi komórkami macierzystymi (HSC), komórkami zrębu i otaczającymi naczyniami krwionośnymi, dostarczając w ten sposób kluczowych informacji na temat regulacji hematopoezy i odpowiedzi immunologicznej.
Rozwój i wykorzystanie obrazowania za pomocą mikroskopii przyżyciowej wynika z ograniczeń tradycyjnych metod obrazowania histologicznego i ex vivo, które często nie są w stanie uchwycić dynamicznej natury zachowań komórkowych i interakcji w tkance. W przeciwieństwie do technik obrazowania statycznego, mikroskopia przyżyciowa umożliwia naukowcom obserwację dynamiki komórkowej w czasie rzeczywistym, co pozwala na badanie procesów podłużnych, takich jak migracja komórek, proliferacja i różnicowanie w ich rodzimej niszy, bez poświęcania zwierząt doświadczalnych. Co więcej, mikroskopia przyżyciowa zapewnia wyjątkową zaletę badania zachowań funkcjonalnych in vivo, takich jak funkcjonalność naczyń krwionośnych (np. perfuzja, przepuszczalność, niedotlenienie), zachowując w ten sposób znaczenie fizjologiczne i unikając artefaktów związanych z utrwalaniem i przetwarzaniem tkanek. Pionierskie badania w tej dziedzinie wykazały ogromne zalety tego podejścia 1,2, a ich wyniki zostały potwierdzone i rozszerzone przez ostatnio udoskonalone podejścia 3,4,5, które wykorzystywały mikroskopię przyżyciowe do śledzenia endogennej lokalizacji HSC, migracji i interakcji z naczyniami krwionośnymi w niszy BM. Co więcej, mikroskopia przyżyciowa odegrała zasadniczą rolę w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń krwiotwórczych, takich jak białaczka i zespoły niewydolności BM, oferując nowe informacje na temat ruchliwości komórek białaczkowych 6,7, implikacji naczyniowych związanych z chorobą8 i odpowiedzi na lek9.
Istnieje kilka zalet obrazowania pod mikroskopem przyżyciowym kości kalczastej w celu pokrycia alternatywnych miejsc kostnych. Po pierwsze, BM zawarty w kości czaszki zapewnia łatwy dostęp do obrazowania przyżyciowego w porównaniu z głębszymi kośćmi, takimi jak kość udowa lub piszczelowa. Ta dostępność ułatwia bezpośrednią obserwację mikrośrodowiska tkankowego, w tym samej kości, poprzez wizualizację generacji drugiej harmonicznej (SHG)10, bez konieczności wykonywania inwazyjnych zabiegów chirurgicznych. Po drugie, czaszka jest stosunkowo cienka i półprzezroczysta, co pozwala na lepszą wizualizację dynamiki komórkowej w niszy BM. Ta przezroczystość ułatwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii dwufotonowej, mikroskopii konfokalnej i mikroskopii z użyciem arkuszy świetlnych, bez konieczności stosowania technik rozrzedzania lub oczyszczania kości. Kość nazębna stanowi stabilną, płaską i sztywną platformę do eksperymentów obrazowania przyżyciowego, minimalizując artefakty ruchu tkanek i zapewniając spójne warunki obrazowania przez długie okresy obserwacji. Ta stabilność jest szczególnie korzystna w badaniach podłużnych śledzących zachowania i reakcje komórek w czasie. Powtarzalność jest kolejną wielką zaletą, biorąc pod uwagę stosunkowo małą i przestrzennie zdefiniowaną strukturę kości calwarialnej u zwierząt doświadczalnych. Ta jednorodność ułatwia porównywanie różnych grup eksperymentalnych i umożliwia solidną analizę statystyczną danych obrazowych.
Tutaj opisujemy metodę obrazowania BM kalwarii kalowej myszy za pomocą przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej poprzez wprowadzenie nowo opracowanego implantu mocującego głowę11, wydrukowanego w 3D przy użyciu biokompatybilnego stopu tytanu klasy 23 (Ti6Al4V), który posiada dedykowaną i łatwą do umiejscowienia twardą okładkę wykonaną z tego samego stopu tytanu, umożliwiającą bezpieczne zamknięcie rany, aby uniknąć infekcji lub uszkodzenia miejsca operacji. Implant mocno i stabilnie mocuje głowę myszy do stolika mikroskopowego za pomocą uchwytu implantu, minimalizując artefakty oddychania i umożliwiając obrazowanie wzdłużne tych samych obszarów w czasie. Podano kilka przykładów wielokolorowych obrazów przedstawiających komórki i struktury z mikrośrodowiska BM (powierzchnia kości SHG+; komórki mezenchymalne nestyny-GFP+; komórki śródbłonka cdh5-DSRED+, cdh5-GFP+ lub pdgfb-GFP+) i złośliwy przedział krwiotwórczy (komórki AML tdTOMATO+), a także fluorescencyjne środki kontrastowe obrazujące światło naczyń (dextran-TRITC). Parametry naczyniowe mierzone przez godziny lub dni, w tym długość naczynia, prostoliniowość i średnica, a także przepuszczalność w różnych obszarach naczyniowych, mogą dostarczyć ważnych informacji na temat zachowania i zdrowia tkanek.

<table><tbody><tr><td>Amira</td><td>Thermo ScientificTM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Znieczulenie</td><td></td><td></td><td>Izofluran 2% do 3%</td></tr><tr><td>Maska anestezjologiczna (wykrywanie zwierząt)</td><td>Minerve (Minerve)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednostka anestezjologiczna</td><td>Minerve (Minerve)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klasa B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdPomidor)Hze</td><td>Laboratoria Jacksona</td><td>MGI:3809523</td><td></td></tr><tr><td>Kalwaria</td><td>Metria</td><td>https://ymetry.com/site/head-fixation-implants/44-mouse-head-fixation-implant-for-calvaria.html</td><td></td></tr><tr><td>Cement dentystyczny</td><td>Kemdent powiedział:</td><td>SŁOŃCE527</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran 500 kDa-Cy5&nbsp;</td><td>Tebu-bio</td><td>DX500-S5-1</td><td>3 mg/mysz</td></tr><tr><td>Dekstran 70 kDa-TRITC</td><td>Sigma</td><td>Zobacz materiał T1162</td><td>3 mg/mysz</td></tr><tr><td>Środek odkażający</td><td>MP-Labo</td><td>Dermidyna-60ml</td><td></td></tr><tr><td>Elektryczna maszynka do golenia</td><td>Eskularny</td><td>Isis</td><td></td></tr><tr><td>Żel pod oczy</td><td>Żel okryl</td><td>10gr</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi&nbsp;</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td>v 17 30 maja</td><td></td></tr><tr><td>Wtyczki Fiji do mostka z Imaris</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td>Imaris_Bridge96.jar ; ImarisBridgeUtils.jar</td><td></td></tr><tr><td>Skrzynka grzewcza&nbsp;</td><td>Daktyle i</td><td>Ogrzewanie</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza do zabiegu chirurgicznego</td><td>Minerve (Minerve)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obrazowa poduszka grzewcza i sonda doodbytnicza</td><td>F. Haer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris v9.6.0</td><td>Instrumenty oksfordzkie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żel Intrasite</td><td>Chinoksia</td><td>2390766</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie LAS AF</td><td>Księga Leica</td><td>LAS X 3.5.7.23225</td><td></td></tr><tr><td>Lekarstwo</td><td></td><td></td><td>Buprecare, 0,01 mg/kg</td></tr><tr><td>Obiektyw HCX IRAPO L 25x/0,95 WODA</td><td>Księga Leica</td><td>506374</td><td></td></tr><tr><td>Bufor soli fizjologicznej (PBS 1x)</td><td>Sigma</td><td>Zobacz materiał P4417</td><td>Sterylizuj w autoklawie</td></tr><tr><td>SP8 DIVE FALCON Mikroskop wielofotonowy&nbsp;</td><td>Księga Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maska stereotoksyczna</td><td>Minerve (Minerve)</td><td>1201261</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki do sterylizatora</td><td>Sigma</td><td>Z742555</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Moria</td><td>4877A; 2183</td><td></td></tr><tr><td>Koc survivalowy</td><td>ZABEZPIECZONY</td><td>11006</td><td></td></tr><tr><td>Waciki / Chusteczki higieniczne</td><td></td><td></td><td>Sterylizuj w autoklawie</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml 26 g</td><td>BD Plastipak</td><td>305501</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>F. Haer</td><td>40-90-5D-02</td><td></td></tr><tr><td>Myszy Tg(Nes-EGFP)33Enik&nbsp;</td><td>Laboratoria Jacksona</td><td>MGI:5523870</td><td></td></tr><tr><td>Myszy Tg(Pdgfb-icre/ERT2)1Frut</td><td>Laboratoria Jacksona</td><td>MGI:3793852</td><td></td></tr><tr><td>Myszy Tg(Cdh5-cre/ERT2)1Rha</td><td>Laboratoria Jacksona</td><td>MGI:3848982</td><td></td></tr><tr><td>Żel do ultradźwięków&nbsp;</td><td>Laboratoria firmy Parker</td><td>Aquasonic 100</td><td></td></tr></tbody></table>

przyżyciowe obrazowanie podłużne dynamiki naczyń krwionośnych w szpiku kostnym kości nazębnej

Intravital Longitudinal Imaging of Vascular Dynamics in the Calvarial Bone Marrow

Obrazowanie za pomocą podłużnej mikroskopii fluorescencyjnej stało się kluczową techniką badania dynamicznych procesów biologicznych, zwłaszcza w kontekście regeneracji tkanek, rozwoju guza i odpowiedzi terapeutycznych. W szczególności szpik kostny calwarii jest tkanką wysoce dynamiczną, w której los układu krwiotwórczego jest powiązany z otaczającym mikrośrodowiskiem, z wyspecjalizowanymi naczyniami reagującymi na normalną i patologiczną hematopoezę. Tradycyjne obrazowanie tkanek utrwalonych dostarcza informacji statycznych, często ograniczając kompleksowe zrozumienie tych procesów. 
Integracja transgenicznych zwierząt wykazujących ekspresję markerów specyficznych dla komórek, znaczników żywych komórek, postęp w sprzęcie do obrazowania oraz wykorzystanie specjalistycznych komór sprawiły, że mikroskopia przykomórkowa stała się kluczowym narzędziem do uzyskiwania wglądu w dynamiczne zjawiska biologiczne. Jednym z zastosowań obrazowania przyżyciowego jest badanie zachowania naczyń nowotworowych i efektów terapeutycznych. Nowo zaprojektowany, wydrukowany w 3D tytanowy implant mocujący głowę może być stabilnie połączony z czaszką myszy i nadaje się do obrazowania wzdłużnego podczas wielu sesji. 
Proponowany protokół pozwala na przestrzenne i czasowe badanie dynamiki naczyń w szpiku kostnym kalwarii, w tym wizualizację i kwantyfikację niejednorodności naczyniowej, interakcję z komórkami zrębu i krwiotwórczemu oraz pomiar parametrów funkcjonalnych naczyń. Dodatkowo technika umożliwia wizualizację ustalonych łożysk naczyniowych oraz monitorowanie efektów terapeutycznych, mobilizacji komórek macierzystych oraz lokalizacji związków chemoterapeutycznych w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół obrazowania podłużnego przyżyciowego stanowi kompleksową platformę do badania zarówno zachowania naczyń nowotworowych, jak i dynamiki komórek krwiotwórczych, oferując cenny wgląd w skomplikowane procesy rządzące tymi zjawiskami biologicznymi.

Na Rysunku 1 oraz Rysunku 2 przedstawiono model CAD implantu do stabilizacji głowy wykonanego z tytanu, umieszczonego na zeskanowanej czaszce myszy. Implant został zaprojektowany tak, aby odzwierciedlać strukturę anatomiczną czaszki i stanowić lekkie, biokompatybilne urządzenie, które pozwala na stabilne zamocowanie do stołu mikroskopu, zapewniając stabilność na poziomie komórkowym. Dzięki zastosowaniu tego protokołu krok po kroku, implant zostaje stabilnie przymocowany do czaszki myszy i może zostać mocno zabezpieczony w uchwycie mikroskopu za pomocą połączenia typu jaskółczy ogon, co umożliwia uzyskanie płaskiego obszaru obrazowania dla retencji cieczy i obserwacji intravitalnych w czasie. Możliwość zamknięcia implantu pokrywką minimalizuje ryzyko uszkodzenia lub zakażenia rany, co pozwala na wielokrotne obrazowanie tego samego obszaru tkanki w ciągu wielu tygodni. Po wybudzeniu mysz z wszczepionym implantem głowy może swobodnie poruszać się, odżywiać i zachowywać regularny tryb życia.
Rysunek 3 przedstawia widok skanowania kafelkowego naczyń krwionośnych szpiku kostnego (BM) sklepienia czaszki, składających się z heterogenicznych naczyń kapilarnych, w tym tętniczek, kapilar przejściowych i zatok. Naczynia są osadzone w złożonym mikrośrodowisku tkankowym, w bliskim kontakcie z powierzchnią kości i okołmacdzyciowymi komórkami mezenchymalnymi. Podczas rozwoju białaczki w mikrośrodowisku BM można wykryć pojedyncze, odizolowane komórki białaczkowe w bliskim sąsiedztwie naczyń; ich liczba wzrasta z czasem, wypełniając sklepienie czaszki w późnych stadiach choroby.
Rysunek 4 pokazuje, w jaki sposób obrazy uzyskane zgodnie z tym protokołem mogą dostarczyć danych ilościowych, które można analizować za pomocą metod statystycznych. Przedstawiamy sposób segmentacji naczyń za pomocą narzędzia filament w programie IMARIS oraz pomiar długości i średnicy fragmentów naczyniowych, a także ich prostoliniowości. Można również ocenić korelację tych parametrów.
Rycina 5 przedstawia podłużne obrazowanie dwóch różnych pozycji szpiku kostnego (BM) czaszki podczas progresji AML w dniach 4, 7 i 10, przy czym dzień 10 wiąże się z ok. 50% zaprowadzeniem komórek białaczkowych w BM, co zmierzono za pomocą cytometrii przepływowej (nie pokazano). Można zaobserwować istotną przebudowę wielkości istniejących naczyń, a także tworzenie się nowych naczyń w obszarach związanych z lokalną utratą tkanki kostnej.
Na koniec, na Rysunku 6, pokazujemy, w jaki sposób przepuszczalność naczyniową można mierzyć jako parametr dynamiczny za pomocą obrazowania poklatkowego, wykazując zdolność różnych barier naczyniowych do zatrzymywania barwnika fluorescencyjnego w czasie.
<img alt="Układ biomechaniczny i mikroskopowy przedstawiający analizę naprężeń, komponenty i schemat montażu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67332/67332fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Projekt i wykonanie biokompatybilnego uchwytu do głowy na bazie tytanu. (A) Części implantu in situ: 1 pierścień obserwacyjny, 2 element cementujący, 3 kotwica stabilizująca, 4 ogon, 5 wpust jaskółczy, 6 otwór gwintowany, 7 Bregma. (B) Połączenie implantu głowy z uchwytem: 8 korpus mocujący, 9 zacisk, 10 dźwignia mimośrodowa, 11 struktura, 12 obiektyw mikroskopu. (C) Deformacja implantu pod obciążeniem w symulacji FEM, gdzie maksymalne przemieszczenie wynosi 0,23 µm przy sile 0,04 N. (D) Osłona ochronna i śruba. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/67332fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="schemat zestawu do obrazowania mózgu myszy z załącznikiem pokazującym obszar obrazowania, badanie eksperymentalne" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67332/67332fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przygotowanie myszy do obrazowania intravitalnego. (A) Widok implantu głowowego i chirurgicznie odsłoniętego obszaru obrazowania przed rozpoczęciem procedury. (B) Implant głowowy mocno przymocowany do czaszki myszy. (C) Budząca się mysz w klatce regeneracyjnej z zamkniętą osłoną implantu głowowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/67332fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Immunofluorescencja VE-CAD w naczyniach kostnych, obraz mikroskopowy, analiza struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67332/67332fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Obrazowanie intravitalne naczyń krwionośnych czaszki. (A) Projekcja z widoku skanowania kafelkowego naczyń czaszki oznakowanych cdh5-DSRED. (B) Powiększenie zaznaczonych obszarów w celu opisania różnych typów naczyń wskazanych strzałkami: tętniczek (strzałki czerwone), kapilar przejścia (strzałki pomarańczowe), sinusoid (strzałki żółte). (i) i (ii) projekcje z tkanki o grubości X µm; (iii) pojedynczy przekrój. (C) Pojedyncze przekroje kilku pól widzenia naczyń BM, wykazujące powierzchnię kości (SHG), komórki okołonaczyniowe (nes-GFP+) oraz światło naczyniowe (dekstran-TRITC). (D) Nisza naczyniowa związana z progresją AML. Reprezentatywne przekroje dla wczesnych (góra) i późnych (dół) punktów czasowych rozwoju AML. Leukemia MLL-AF9 jest oznakowana tdTOMATO (strzałki czerwone), podczas gdy naczynia są oznakowane pdgfb-GFP (strzałki zielone), powierzchnia kości SHG, a makrofagi kolorem żółtym (autofluorescencja, żółta gwiazdka). Paski skali = 200 µm (A), 40 µm (B,D-panel dolny), 50 µm (C). Skróty: BM = szpik kostny; GFP = zielone fluorescencyjne białko; AML = ostra białaczka szpikowa; EC = komórki śródbłonka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/67332fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza mikronaczyniowa; średnica, długość i prostota naczyń; dane z mikroskopii i wykresu rozrzutu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67332/67332fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Ilościowe oznaczenie parametrów naczyniowych. (A) Pomiar parametrów naczyniowych za pomocą narzędzia filament tool w programie IMARIS na reprezentatywnej projekcji z naczyń szpiku kostnego znakowanych TRITC-dekstranem. Przedstawiono reprezentacje liniowe i stożkowe. (B) Ilościowe oznaczenie parametrów naczyń na obrazie przedstawionym w punkcie A. (C) Korelacja między parametrami naczyniowymi wykazująca przeciwstawną korelację między prostotą a długością naczyń (ujemna, Spearman r = -3523; p &lt; 0.0001; R2 = 0.2102) w porównaniu do średnicy (dodatnia; Spearman r = 0.4110; p &lt; 0.0001; R2 = 0.1299). Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/67332fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki mikroskopii VE-cad+EC w kości, analiza z-stack/przekroju time-lapse dla dnia 4, 7, 10." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67332/67332fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Obrazowanie podłużne dwóch różnych pozycji BM sklepienia czaszki podczas rozwoju AML. Komórki śródbłonka wyściełające naczynia są znakowane cdh5-GFP, powierzchnia kości za pomocą SHG, a makrofagi na żółto (autofluorescencja). Przedstawiono przebudowę istniejących naczyń (czerwone strzałki) oraz tworzenie nowych naczyń (żółte strzałki). Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/67332fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza nieszczelności naczyń krwionośnych z obrazami mikroskopowymi, schematem segmentacji i wynikami wykresu nieszczelności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67332/67332fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Przepuszczalność naczyniowa. (A) Schematy pomiaru przepuszczalności naczyniowej za pomocą narzędzia powierzchniowego (surface tool) w programie IMARIS. (B) Projekcja Z tego samego obszaru obrazowanego podłużnie w ciągu 1 h. (C) Ilościowe oznaczenie przepuszczalności naczyniowej w obszarach przedstawionych w punkcie A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/67332fig06large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rysunek uzupełniający S1: Przygotowana czaszka. W płaszczyźnie pośrodkowej należy utworzyć oś styczną do sklepienia czaszki, a następnie zapisać przygotowaną czaszkę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/Sup_fig_1_JoVE67332R1_screenfile5_prepared_skull.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina dodatkowa S2: Płaszczyzny w odstępach 2 mm. Jak utworzyć zestaw równomiernie rozmieszczonych płaszczyzn (odstępy 2 mm) w obrębie czaszki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/Sup_fig_2_JoVE67332R1_screenfile4_plans_2mm_spaced.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca S3: Obserwowalny kontur powierzchni.Wykonaj szkic w płaszczyźnie sklepienia czaszki i stwórz gruszkowaty spline od AP +6,5 do -2, o szerokości 6 mm w punkcie AP 0,0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/Sup_fig_3_JoVE67332R1_screenfile3_Observable_Surface_Contour.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca S4: Okno obserwacyjne.Stwórz szkic w płaszczyźnie sklepienia czaszki i narysuj kształt litery C o grubości 0,5 mm łączący się z oknem obserwacyjnym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/Sup_fig_4_JoVE67332R1_screenfile1_1.4.1.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek dodatkowy S5: Kliknij nową analizę. Przejdź do karty Simulation (jeśli jest widoczna) lub wybierz Simulation | Study. W oknie dialogowym Study wybierz Static jako study type. Kliknij OK, aby utworzyć nową analizę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/Sup_fig_5_JoVE67332R1_screenfile2_clic_new_study.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina dodatkowa S6: Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby utworzyć siatkę. Uściśl siatkę w obszarach, w których spodziewane są wysokie naprężenia lub odkształcenia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/Sup_fig_6_JoVE67332R1_screenfile6_right_clic_create_mesh.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Mikroskopia przyżyciowa umożliwia badanie dynamicznych procesów biologicznych, takich jak regeneracja tkanek i rozwój guza. Szpik kostny kalwarii, wysoce dynamiczna tkanka, oferuje wgląd w hematopoezę i funkcję naczyń krwionośnych. Korzystanie z biokompatybilnego, wydrukowanego w 3D implantu mocującego głowę pozwala na powtarzalne obrazowanie podłużne, zwiększając naszą wiedzę na temat dynamiki tkanek i mikrośrodowiska guza.

Przyżyciowe obrazowanie podłużne dynamiki naczyń krwionośnych w szpiku kostnym kości nazębnej

Intravital longitudinal fluorescence microscopy imaging has emerged as a crucial technique for studying dynamic biological processes, notably in the ...

Badania te koncentrują się na zrozumieniu dynamiki naczyń krwionośnych w makrośrodowisku szpiku kostnego za pomocą mikroskopii przyżyciowej, mając na celu ujawnienie, w jaki sposób naczynia krwionośne reagują na normalną i patologiczną hematopoezę. Korzystamy z zaawansowanych technologii obrazowania, takich jak fotomikroskopia, transgeniczne modele zwierzęce i analizujemy znacznik, aby wizualizować i określać ilościowo dynamiczne zmiany naczyniowe w żywej tkance w czasie. Kluczowym postępem jest udoskonalenie naszego protokołu w celu poprawy dobrostanu zwierząt i dostosowania go do trzech R. Nasze podejście podłużne minimalizuje etapy chirurgiczne i znacznie zmniejsza liczbę zwierząt potrzebnych do naszego badania.Nasz protokół odpowiada na potrzebę nietoksycznego, długoterminowego obrazowania przyżyciowego przy użyciu mikroskopu dwufotonowego, który umożliwia głęboką penetrację tkanek i wizualizację zachowania i interakcji komórek w wysokiej rozdzielczości. Korzystanie z implantu głowy wydrukowanego w 3D bardzo ułatwi znalezienie obszaru zainteresowania podczas sesji obrazowania podłużnego bez dążenia do zmiany wysokości, kąta lub kolejności. Obecnie używamy tego protokołu do śledzenia określonych podtypów śródbłonka i ich odpowiedzi na rozwój białaczki i leczenie farmakologiczne, aby lepiej zrozumieć ich wpływ na patogenezę choroby.Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie do segmentacji i zaimportuj pliki DICOM mikro-CT, aby wyizolować czaszkę. Wykonaj segmentację opartą na progach, aby oddzielić tkankę kostną od otaczających struktur. Ręcznie dostosuj złożone lub zaszumione regiony, aby uściślić segmentację.We fragmentatorze 3D Slicer zaimportuj pliki DICOM i załaduj zestaw danych. Obserwuj wycinki CT w widokach osiowym, strzałkowym i koronalnym. Otwórz edytor segmentów i kliknij przycisk Dodaj, aby utworzyć nową segmentację, a następnie ponownie kliknij przycisk Dodaj, aby utworzyć nowy segment na potrzeby progów.W panelu edytora segmentów kliknij efekt progu. Dostosuj dolny i górny suwak progu lub wprowadź wartości liczbowe, aby podświetlić podzielony na segmenty region na czerwono. Aby wyeksportować podzieloną na segmenty czaszkę jako plik stl, przełącz się na moduł segmentacji.Upewnij się, że wybrano segment progowy. W sekcji eksportu/importu modeli i map etykiet ustaw typ eksportu na modele i format pliku na stl, a następnie kliknij przycisk eksportuj, aby zapisać plik. Aby przygotować model czaszki w CAD, najpierw zaimportuj uproszczony model czaszki w formacie stl do oprogramowania CAD jako nową część lub model.W płaszczyźnie pasa rozdzielającego utwórz oś styczną do kalwarii, a następnie zapisz przygotowany model czaszki. Utwórz szkic w płaszczyźnie kalwarii i zaprojektuj splajn w kształcie gruszki od AP plus 6,5 do minus dwa. Przy szerokości sześciu milimetrów przy AP 0,0 będzie to obserwowalny kontur powierzchni.Zaprojektuj ogon implantu tak, aby był zgodny ze strukturą czaszki w celu prawidłowego zamocowania przy jednoczesnym poszanowaniu dostępnej objętości. Na koniec utwórz osłonę ochronną, aby zabezpieczyć okno obserwacyjne, gdy nie jest używane. Umieść znieczuloną mysz na poduszce grzewczej ustawionej na 37 stopni Celsjusza i wizualnie monitoruj częstość oddechów.Ogol głowę myszy elektryczną maszynką do golenia. Następnie nałóż kroplę żelu okulistycznego na oczy myszy. Upewnij się, że wszystkie włosy zostały usunięte, aby zapobiec artefaktom obrazowania i zmniejszyć ryzyko infekcji rany.Teraz użyj sterylnych kleszczy i nożyczek, aby wykonać małe nacięcie w środkowej części skóry głowy, aby odsłonić centralną bliznę kostną. Usuń tkankę łączną między czaszką a skórą głowy. Wymieszaj wystarczającą ilość cementu dentystycznego na szalce Petriego, aby uzyskać pastę.Szybko nałóż go na spód implantu mocującego głowę. Nie dopuszczając do przedostania się cementu dentystycznego do obszaru obrazowania, umieść uchwyt na głowę na odsłoniętej czaszce i pozwól mu zastygnąć. Włączyć przepływ izofluranu w kierunku maski stereotaktycznej mikroskopu.Teraz szybko przyłóż mysz do mikroskopu. Ostrożnie włóż zęby myszy do maski, aby zapewnić prawidłową penetrację izofluranu, unosząc nos jedną ręką. Trzymając mysz jedną ręką, delikatnie wsuń jaskółczy ogon implantu mocującego głowę do uchwytu mocującego drugą ręką.Zabezpiecz go półobrotowym obrotem pokrętła. Następnie wprowadź sondę doodbytniczą wstępnie osadzoną w żelu na bazie wody, aby monitorować temperaturę myszy. Napełnij komorę obrazowania głowy dużą ilością żelu na bazie wody lub PBS.Obniż obiektyw zanurzenia w wodzie, aż zostanie całkowicie zanurzony, aby uzyskać optymalne wzbudzenie i wykrywanie sygnału podczas wzbudzenia dwufotonowego. Przesuń stolik x, y i napęd z, aby skupić się na centralnej kości w bliźnie rusztowania. Zidentyfikuj tkankę oznaczoną przez powierzchnię kości i żyłę centralną.Wyłącz światło w pomieszczeniu i zamknij pudełko wokół statywu mikroskopu. Po aktywacji detektorów innych niż TOSCAN. Ustaw PMT1 tak, aby wykrywał drugi SHG przy 423 do 461 nanometrach, wysoki D2 dla GFP przy 485 do 548 nanometrach i wysoki D3 dla TD D'Amato przy 551 do 645 nanometrach.Pozostaw przesunięcie na poziomie zero. Teraz ustaw wzmocnienie PMT SHG na 850 woltów, a wysokie wzmocnienie D na 100%Zwiększ moc lasera w podczerwieni, aż obraz o dynamicznym zakresie 200 poziomów szarości będzie widoczny na najniższym z trzech kanałów. W oprogramowaniu do akwizycji, obszar lokalizacyjny zawierający kieszenie szpiku kostnego, wskazane zamknięte w powierzchniach kości.Aby zidentyfikować różne obszary zainteresowania lub ROI, aktywuj Nawigatora strat i utwórz przegląd za pomocą trybu spiralnego. Kliknij ikonę pojedynczego obrazu, aby zapisać wybrane pozycje ROI i zmienić nazwę każdej pozycji na liście zadań. Aby uzyskać wolumin stosu Z, wybierz tryb stosu Z i zdefiniuj rozmiar kroku na poziomie trzech mikrometrów.Usuń zaznaczenie opcji ten sam rozmiar stosu dla wszystkich regionów, a następnie naciśnij początek, aby rozpocząć i koniec, aby zakończyć. Po przechwyceniu kliknij przycisk zdefiniuj ponownie stos. Naciśnij start, aby rozpocząć zbieranie obrazów i zapisać obrazy w odpowiednim folderze.Aby zmierzyć cechę dynamiczną, taką jak przepuszczalność naczyń krwionośnych, zmień tryb akwizycji na XYZT, aby uzyskać upływ czasu. W module T ustaw przedział czasu na trzy minuty, a czas trwania na jedną godzinę. Teraz wstrzyknij dożylnie 100 mikrolitrów 70 kilodaltonów Dextranu TRITC w stężeniu czterech miligramów na mililitr i rozpocznij akwizycję.Po przeniesieniu myszy do znaku chirurgicznego na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, nałóż żel wewnątrzzakładowy na czaszkę, aby utrzymać jej nawilżenie. Zamknij obszar obrazowania implantu głowy specjalną osłoną i ostrożnie zabezpiecz osłonę śrubą. Umieść mysz w skrzynce grzewczej ustawionej na 37 stopni Celsjusza i poczekaj, aż się obudzi.Gdy mysz w pełni wyzdrowieje, przetransportuj ją do obiektu dla zwierząt i umieść w czystej klatce z hydrożelem i wzbogaceniem środowiska. W przypadku akwizycji podłużnej umieść małą kroplę żelu okulistycznego na oczach myszy z już zainstalowanym uchwytem na głowę. Uzyskaj obraz ogólny, jak pokazano wcześniej.W razie potrzeby wyrównaj poprzedni i nowy obraz za pomocą modułu ładowania i wyrównania obrazu. Otwórz obraz zrzutu ekranu, aby zaznaczyć pozycje w ich pierwotnym miejscu. Model CAD tytanowego implantu mocującego głowę został zaprojektowany tak, aby pasował do anatomicznej struktury czaszki, zapewniając stabilne mocowanie do stolika mikroskopu w celu obrazowania na poziomie komórkowym.Implant został z powodzeniem przymocowany do czaszki myszy i umożliwił stabilne obrazowanie w czasie, jednocześnie pozwalając myszy na utrzymanie normalnej aktywności. Unaczynienie szpiku kostnego kości kalwarycznej uwidoczniono za pomocą skanu kafelkowego, odsłaniając złożoną sieć tętniczek, naczyń włosowatych przejściowych i sinusoid. Ilościowa analiza naczyń wykazała segmentację struktur naczyniowych, co pozwoliło na pomiar średnicy, długości i prostoliniowości naczynia oraz ich korelacji.Obrazowanie podłużne uchwyciło postępującą przebudowę naczynia kalwarycznego podczas progresji białaczki ze zwiększoną gęstością naczyń obserwowaną w czasie. Przepuszczalność naczyń oceniano dynamicznie, wykazując różnicową retencję barwnika fluorescencyjnego w czasie, wykazując zróżnicowaną przepuszczalność różnych naczyń szpiku kostnego.

intravital-longitudinal-imaging-vascular-dynamics-calvarial-bone

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą i praktyczną technikę odlewu naczyniowego mózgu, która jest łatwa w wykonaniu i może być wykorzystana do obrazowania drzewa naczyniowego mózgu dorosłej myszy.

Odlewanie naczyń mózgowych dorosłej myszy do obrazowania 3D i analizy morfologicznej

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Implantacja autologicznych i allogenicznych przeszczepów kostnych stanowi akceptowane metody leczenia dużych ubytków kości twarzoczaszki. Jednak wpływ składu przeszczepu na wzajemne oddziaływanie między neowaskularyzacją, różnicowaniem komórek i tworzeniem kości jest niejasny. Przedstawiamy protokół obrazowania multimodalnego, którego celem jest wyjaśnienie współzależności angiogenezy i osteogenezy w pobliżu przeszczepu.

Tomografia komputerowa i obrazowanie optyczne sprzężenia osteogeneza-angiogeneza w celu oceny integracji autoprzeszczepów kości czaszki i alloprzeszczepów

Ten artykuł opisuje metodę, za pomocą której architektura naczyniowa w mózgu może być określona ilościowo za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo i ex vivo.

Kwantyfikacja architektury naczyń mózgowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej w mysim modelu zapalenia nerwów wywołanego przez HIV

Ten manuskrypt opisuje procedurę śledzenia przebudowy układu naczyniowo-mózgowego podczas gromadzenia się blaszek amyloidowych in vivo za pomocą podłużnej mikroskopii dwufotonowej. Preparat z rozcieńczoną czaszką umożliwia wizualizację barwników fluorescencyjnych w celu oceny postępu uszkodzenia naczyń mózgowych w mysim modelu choroby Alzheimera.

Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN

Celem tego artykułu jest przedstawienie metody, która pozwala na trójwymiarową rekonstrukcję drzewa naczyniowo-mózgowego u myszy po mikrotomografii komputerowej i określeniu objętości całych segmentów naczynia, które mogą być użyte do ilościowego określenia skurczu naczyń mózgowych w mysich modelach krwotoku podpajęczynówkowego.

Wolumetryczna metoda ilościowego oznaczania skurczu naczyń mózgowych w mysim modelu krwotoku podpajęczynówkowego

Opisujemy tutaj metodę obrazowania megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kości czaszki żywych myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym czaszki myszy

Ten protokół przedstawia kroki do pozyskiwania i analizy fluorescencyjnych obrazów wapnia z perycytów otaczających mózg oraz danych o przepływie krwi z pobliskich naczyń krwionośnych u znieczulonych myszy. Techniki te są przydatne do badań nad fizjologią komórek szkieletowych i mogą być dostosowane do badania stanów przejściowych wapnia w dowolnym typie komórki.

Obrazowanie wapnia i hemodynamiki perycytów mózgu u myszy transgenicznych in vivo

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Poznaj dynamikę naczyń krwionośnych w szpiku kostnym kości nazębnej przy użyciu mikroskopii przyżyciowej. Ta metoda umożliwia długoterminowe obserwacje zmian naczyniowych w chorobach nowotworowych.

Przyżyciowe obrazowanie podłużne dynamiki naczyń krwionośnych w szpiku kostnym kości nazębnej

Przeglądaj więcej filmów