Przyżyciowe obrazowanie podłużne dynamiki naczyń krwionośnych w szpiku kostnym kości nazębnej

Badania te koncentrują się na zrozumieniu dynamiki naczyń krwionośnych w makrośrodowisku szpiku kostnego za pomocą mikroskopii przyżyciowej, mając na celu ujawnienie, w jaki sposób naczynia krwionośne reagują na normalną i patologiczną hematopoezę. Korzystamy z zaawansowanych technologii obrazowania, takich jak fotomikroskopia, transgeniczne modele zwierzęce i analizujemy znacznik, aby wizualizować i określać ilościowo dynamiczne zmiany naczyniowe w żywej tkance w czasie. Kluczowym postępem jest udoskonalenie naszego protokołu w celu poprawy dobrostanu zwierząt i dostosowania go do trzech R. Nasze podejście podłużne minimalizuje etapy chirurgiczne i znacznie zmniejsza liczbę zwierząt potrzebnych do naszego badania.

Nasz protokół odpowiada na potrzebę nietoksycznego, długoterminowego obrazowania przyżyciowego przy użyciu mikroskopu dwufotonowego, który umożliwia głęboką penetrację tkanek i wizualizację zachowania i interakcji komórek w wysokiej rozdzielczości. Korzystanie z implantu głowy wydrukowanego w 3D bardzo ułatwi znalezienie obszaru zainteresowania podczas sesji obrazowania podłużnego bez dążenia do zmiany wysokości, kąta lub kolejności. Obecnie używamy tego protokołu do śledzenia określonych podtypów śródbłonka i ich odpowiedzi na rozwój białaczki i leczenie farmakologiczne, aby lepiej zrozumieć ich wpływ na patogenezę choroby.

Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie do segmentacji i zaimportuj pliki DICOM mikro-CT, aby wyizolować czaszkę. Wykonaj segmentację opartą na progach, aby oddzielić tkankę kostną od otaczających struktur. Ręcznie dostosuj złożone lub zaszumione regiony, aby uściślić segmentację.

We fragmentatorze 3D Slicer zaimportuj pliki DICOM i załaduj zestaw danych. Obserwuj wycinki CT w widokach osiowym, strzałkowym i koronalnym. Otwórz edytor segmentów i kliknij przycisk Dodaj, aby utworzyć nową segmentację, a następnie ponownie kliknij przycisk Dodaj, aby utworzyć nowy segment na potrzeby progów.

W panelu edytora segmentów kliknij efekt progu. Dostosuj dolny i górny suwak progu lub wprowadź wartości liczbowe, aby podświetlić podzielony na segmenty region na czerwono. Aby wyeksportować podzieloną na segmenty czaszkę jako plik stl, przełącz się na moduł segmentacji.

Upewnij się, że wybrano segment progowy. W sekcji eksportu/importu modeli i map etykiet ustaw typ eksportu na modele i format pliku na stl, a następnie kliknij przycisk eksportuj, aby zapisać plik. Aby przygotować model czaszki w CAD, najpierw zaimportuj uproszczony model czaszki w formacie stl do oprogramowania CAD jako nową część lub model.

W płaszczyźnie pasa rozdzielającego utwórz oś styczną do kalwarii, a następnie zapisz przygotowany model czaszki. Utwórz szkic w płaszczyźnie kalwarii i zaprojektuj splajn w kształcie gruszki od AP plus 6,5 do minus dwa. Przy szerokości sześciu milimetrów przy AP 0,0 będzie to obserwowalny kontur powierzchni.

Zaprojektuj ogon implantu tak, aby był zgodny ze strukturą czaszki w celu prawidłowego zamocowania przy jednoczesnym poszanowaniu dostępnej objętości. Na koniec utwórz osłonę ochronną, aby zabezpieczyć okno obserwacyjne, gdy nie jest używane. Umieść znieczuloną mysz na poduszce grzewczej ustawionej na 37 stopni Celsjusza i wizualnie monitoruj częstość oddechów.

Ogol głowę myszy elektryczną maszynką do golenia. Następnie nałóż kroplę żelu okulistycznego na oczy myszy. Upewnij się, że wszystkie włosy zostały usunięte, aby zapobiec artefaktom obrazowania i zmniejszyć ryzyko infekcji rany.

Teraz użyj sterylnych kleszczy i nożyczek, aby wykonać małe nacięcie w środkowej części skóry głowy, aby odsłonić centralną bliznę kostną. Usuń tkankę łączną między czaszką a skórą głowy. Wymieszaj wystarczającą ilość cementu dentystycznego na szalce Petriego, aby uzyskać pastę.

Szybko nałóż go na spód implantu mocującego głowę. Nie dopuszczając do przedostania się cementu dentystycznego do obszaru obrazowania, umieść uchwyt na głowę na odsłoniętej czaszce i pozwól mu zastygnąć. Włączyć przepływ izofluranu w kierunku maski stereotaktycznej mikroskopu.

Teraz szybko przyłóż mysz do mikroskopu. Ostrożnie włóż zęby myszy do maski, aby zapewnić prawidłową penetrację izofluranu, unosząc nos jedną ręką. Trzymając mysz jedną ręką, delikatnie wsuń jaskółczy ogon implantu mocującego głowę do uchwytu mocującego drugą ręką.

Zabezpiecz go półobrotowym obrotem pokrętła. Następnie wprowadź sondę doodbytniczą wstępnie osadzoną w żelu na bazie wody, aby monitorować temperaturę myszy. Napełnij komorę obrazowania głowy dużą ilością żelu na bazie wody lub PBS.

Obniż obiektyw zanurzenia w wodzie, aż zostanie całkowicie zanurzony, aby uzyskać optymalne wzbudzenie i wykrywanie sygnału podczas wzbudzenia dwufotonowego. Przesuń stolik x, y i napęd z, aby skupić się na centralnej kości w bliźnie rusztowania. Zidentyfikuj tkankę oznaczoną przez powierzchnię kości i żyłę centralną.

Wyłącz światło w pomieszczeniu i zamknij pudełko wokół statywu mikroskopu. Po aktywacji detektorów innych niż TOSCAN. Ustaw PMT1 tak, aby wykrywał drugi SHG przy 423 do 461 nanometrach, wysoki D2 dla GFP przy 485 do 548 nanometrach i wysoki D3 dla TD D'Amato przy 551 do 645 nanometrach.

Pozostaw przesunięcie na poziomie zero. Teraz ustaw wzmocnienie PMT SHG na 850 woltów, a wysokie wzmocnienie D na 100%Zwiększ moc lasera w podczerwieni, aż obraz o dynamicznym zakresie 200 poziomów szarości będzie widoczny na najniższym z trzech kanałów. W oprogramowaniu do akwizycji, obszar lokalizacyjny zawierający kieszenie szpiku kostnego, wskazane zamknięte w powierzchniach kości.

Aby zidentyfikować różne obszary zainteresowania lub ROI, aktywuj Nawigatora strat i utwórz przegląd za pomocą trybu spiralnego. Kliknij ikonę pojedynczego obrazu, aby zapisać wybrane pozycje ROI i zmienić nazwę każdej pozycji na liście zadań. Aby uzyskać wolumin stosu Z, wybierz tryb stosu Z i zdefiniuj rozmiar kroku na poziomie trzech mikrometrów.

Usuń zaznaczenie opcji ten sam rozmiar stosu dla wszystkich regionów, a następnie naciśnij początek, aby rozpocząć i koniec, aby zakończyć. Po przechwyceniu kliknij przycisk zdefiniuj ponownie stos. Naciśnij start, aby rozpocząć zbieranie obrazów i zapisać obrazy w odpowiednim folderze.

Aby zmierzyć cechę dynamiczną, taką jak przepuszczalność naczyń krwionośnych, zmień tryb akwizycji na XYZT, aby uzyskać upływ czasu. W module T ustaw przedział czasu na trzy minuty, a czas trwania na jedną godzinę. Teraz wstrzyknij dożylnie 100 mikrolitrów 70 kilodaltonów Dextranu TRITC w stężeniu czterech miligramów na mililitr i rozpocznij akwizycję.

Po przeniesieniu myszy do znaku chirurgicznego na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, nałóż żel wewnątrzzakładowy na czaszkę, aby utrzymać jej nawilżenie. Zamknij obszar obrazowania implantu głowy specjalną osłoną i ostrożnie zabezpiecz osłonę śrubą. Umieść mysz w skrzynce grzewczej ustawionej na 37 stopni Celsjusza i poczekaj, aż się obudzi.

Gdy mysz w pełni wyzdrowieje, przetransportuj ją do obiektu dla zwierząt i umieść w czystej klatce z hydrożelem i wzbogaceniem środowiska. W przypadku akwizycji podłużnej umieść małą kroplę żelu okulistycznego na oczach myszy z już zainstalowanym uchwytem na głowę. Uzyskaj obraz ogólny, jak pokazano wcześniej.

W razie potrzeby wyrównaj poprzedni i nowy obraz za pomocą modułu ładowania i wyrównania obrazu. Otwórz obraz zrzutu ekranu, aby zaznaczyć pozycje w ich pierwotnym miejscu. Model CAD tytanowego implantu mocującego głowę został zaprojektowany tak, aby pasował do anatomicznej struktury czaszki, zapewniając stabilne mocowanie do stolika mikroskopu w celu obrazowania na poziomie komórkowym.

Implant został z powodzeniem przymocowany do czaszki myszy i umożliwił stabilne obrazowanie w czasie, jednocześnie pozwalając myszy na utrzymanie normalnej aktywności. Unaczynienie szpiku kostnego kości kalwarycznej uwidoczniono za pomocą skanu kafelkowego, odsłaniając złożoną sieć tętniczek, naczyń włosowatych przejściowych i sinusoid. Ilościowa analiza naczyń wykazała segmentację struktur naczyniowych, co pozwoliło na pomiar średnicy, długości i prostoliniowości naczynia oraz ich korelacji.

Obrazowanie podłużne uchwyciło postępującą przebudowę naczynia kalwarycznego podczas progresji białaczki ze zwiększoną gęstością naczyń obserwowaną w czasie. Przepuszczalność naczyń oceniano dynamicznie, wykazując różnicową retencję barwnika fluorescencyjnego w czasie, wykazując zróżnicowaną przepuszczalność różnych naczyń szpiku kostnego.