Name: Mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Odkryj mikrobiotę ogrodów grzybów mrówek attine i jej interakcje z biofilmami za pomocą zoptymalizowanej skaningowej mikroskopii elektronowej. Ta metoda pozwala szczegółowo zbadać organizację przestrzenną mikroorganizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) za wsparcie finansowe (Grant #2019/03746-0). MOB dziękuje za stypendium doktoranckie otrzymane od FAPESP (proces 2021/08013-0) i Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazylia (CAPES) - Kod finansowy 001. AR dziękuje również Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) za stypendium badawcze (#305269/2018). Autorzy chcieliby podziękować Marci Reginie de Moura Aouada i Antonio Teruyoshi Yabuki za pomoc w testach pilotażowych w celu przygotowania próbki, Renato Barbosa Salaroli za pomoc techniczną oraz Enzo Sorrentino za pomoc w sesji zdjęciowej. Badanie to zostało przeprowadzone w ramach autoryzacji dostępu do dziedzictwa genetycznego #SISGen AA39A6D.

 Microscale SEM Analysis of Microbial Communities in Fungus-Growing Ant Cultures

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

SEM wykorzystuje wiązkę elektronów do skanowania próbki, generując jej powiększony obraz, dzięki czemu można wizualizować trójwymiarowe mikrostruktury w wysokiej rozdzielczości. Ponieważ SEM działa w warunkach wysokiej próżni, wymagane jest usunięcie do/więcej niż 99% wody z próbek. Wewnątrz komory próżniowej SEM częściowo uwodnione próbki mogą ulec odwodnieniu i zapadnięciu się, oprócz rozpraszania elektronów. W przypadku obrazowania w wysokiej rozdzielczości w SEM przygotowanie próbki powinno obejmować procedury usuwania wody przy jednoczesnym utrzymaniu zmian objętości i morfologii na minimalnym poziomie, a także powlekanie zapobiegające ładowaniu podczas obrazowania 55,56,57.
Po pierwsze, próbka jest chemicznie utrwalana poprzez sieciowanie jej białek i kwasów nukleinowych, co uzyskuje się za pomocą różnych technik. Szeroko stosowana metoda polega na połączeniu aldehydu glutarowego i formaldehydu (lub paraformaldehydu) w buforze, takim jak piperazyno-1,4-bis [kwas 2-etanosulfonowy] (PIPES); Kwas N-[2-hydroksyetylo]-piperazyno-N′-2-etanosulfonowy (HEPES); sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS); lub kakodylan sodu. Utrwalenie chemiczne wzmacnia próbkę, zachowując jej strukturę do wysuszenia. W zależności od ich charakteru, próbki mogą wymagać wtórnego utrwalenia (w tetratlenku osmu), a nawet trzeciorzędowego (w octanie uranylu). Po drugie, próbki muszą być odwodnione. Ponieważ suszenie powietrzem powoduje rozległe zapadanie się drobnych struktur, powszechną alternatywną techniką jest suszenie w punkcie krytycznym (CPD). W CPD próbka nie jest poddawana napięciu powierzchniowemu, co zapobiega tworzeniu się artefaktów. Z jednej strony woda osiąga punkt krytyczny przy ciśnieniu 228,5 bara i temperaturze 374 °C, co łatwo zniszczyłoby próbkę. Z drugiej strony punkt krytyczny CO2 wynosi 73,8 bara i 31 °C, co uzasadnia jego stosowanie jako płynu przejściowego. Przy zwiększaniu temperatury CO2 przekształca się w postać gazową i usuwa z próbki 58,59,60,61,62,63. Po trzecie, próbki nieprzewodzące powinny być powlekane, aby zapobiec ich ładowaniu i zwiększyć uzysk elektronów wtórnych, co w konsekwencji przyczynia się do uzyskania ostrych sygnałów obrazu64.
Przedstawiony tutaj protokół łączy procedury konserwacji próbekgrzybów 32,33,45,65,66,67,68 i biofilmów 69,70, upraszczając jednak proces poprzez usunięcie etapów postfiksacji i skrócenie czasu odwadniania. Udało się jednak zachować delikatną strukturę ogrodu, szczegółowo opisując fizyczne interakcje mikrobioty i odsłaniając strukturę przestrzenną biofilmu. Przestrzenne gromadzenie mikrobioty ma zasadnicze znaczenie zarówno dla ustanawiania interakcji, jak i wyznaczania ich wzorców regulacyjnych. Dystrybucja przestrzenna kształtuje dynamikę społeczną drobnoustrojów, z której mogą wyłonić się wewnętrzne właściwości. Są one niezbędne, aby poradzić sobie ze zmiennością i złożonością, z jakimi borykają się ekosystemy mikrobiologiczne 71,72,73. Nasze odkrycia wzmacniają mikrobiotę integrującą wzorce strukturalne ogrodu, wspierając jej przypuszczalny udział w reakcjach fizjologicznych 32,42,43,44. Dostarczyliśmy dowodów in situ, że biofilmy są istotne dla interakcji mikrobiologicznych w kulturze grzybów attynowych42,44. Biofilmy to złożone i niejednorodne systemy wielokomórkowe, w których mikroorganizmy osadzone w samowydzielającej się matrycy EPS tworzą sieci społeczne. Kooperatywnie i/lub antagonistycznie, interakcje w obrębie biofilmu determinują otwieranie, zajmowanie i modyfikację nisz 71,72,73,74. Projekt SEM umożliwił lepsze zrozumienie organizacji przestrzennej mikrobioty w różnych regionach ogrodu, szczegółowo opisując fizyczne interakcje między mikrobiotą a substratem oraz mikrobiotą i strzępkami, a jednocześnie uprościł metody przyszłych badań w tej dziedzinie.
Badania nad mikrobiotą ogrodową cieszą się coraz większym zainteresowaniem, koncentrując się w szczególności na procesach, które mogą kształtować skład tych wyjątkowych zbiorowisk75,76, a także ich funkcję i interakcje 42,43,44. Interakcje między roślinami bakteryjnymi i grzybowymi mogą pomóc grzybowi w rozpuszczaniu fosforanów, wytwarzaniu sideroforów oraz degradacji celulozy i chityny. Takie interakcje, które mogą zachodzić jako kontinuum wzajemności-antagonizmu, mogą regulować funkcjonowanie ogrodu44. Podejście metodologiczne, które tu prezentujemy, pozwala na spojrzenie in situ na wymiar strukturalny, w którym mogą zachodzić interakcje. Podkreślono w nim, że podobnie jak większość przebadanych już ekosystemów mikrobiologicznych, ogrody attynowe są wzorzyste, niejednorodnie zorganizowane w przestrzeni 5,7,8. Projekt SEM zapewnił już perspektywę przestrzenną in situ dotyczącą dynamiki mikrobioty w różnych społecznościach związanych z gospodarzami, takich jak sinice77, skóra humbaka78, grzyby66, parzydełka79, ludzkie jelita80, porosty81, przyczyniając się również do opisu plastisfery (nowego ekosystemu wywodzącego się antropogenicznie)82. W każdym z tych badań stosowano jednak nieco odrębną metodę etapowego przygotowania próbki.
Próbki ogrodowe są bardzo delikatne i niejednorodne, z strzępkami grzybów uważanymi za przystosowane do tego, aby nie tracić wody26, oprócz zróżnicowanego zestawu wbudowanych substratów24, mikrobioty i jej biofilmu. Jednak dostosowany przez nas protokół przygotowania próbki zachował większość takich struktur i pozwolił nam rozszerzyć charakterystykę struktury przestrzennej mikrobioty. Uważamy, że fiksacja na rozwiązaniu Karnovsky'ego jest krytycznym krokiem w protokole, ponieważ trójwymiarowy aspekt tak delikatnej próbki może się w tym momencie zapaść i/lub spłaszczyć. Złożone próbki na bazie grzybów są zwykle przygotowywane do SEM przez utrwalenie aldehydem glutarowym i utrwalenie za pomocą OsO4 65,66,67,68. Doniesiono jednak, że połączenie aldehydów (paraformaldehydu i aldehydu glutarowego) poprawia zachowanie biofilmu dla SEM69,70. Metody konserwacji biofilmów mogą również obejmować 0,15% błękitu alkijskiego lub 0,15% czerwieni rutenowej do początkowego utrwalacza Karnovsky'ego, a także 1% kwasu garbnikowego do 1% osmu do postfiksacji. Mocowanie ogrodów i odpadów za pomocą Karnovsky'ego i postfixingu za pomocą OsO4 zakonserwowało bakterie w starych próbkach ogrodowych i odpadowych, choć nie wykazało biofilmu32. Ponieważ w naszych próbkach struktura ogrodu, mikrobiota i biofilmy zostały zachowane bez etapu postfiksacji osmu zastosowanego w poprzednich protokołach 32,33,69,70, woleliśmy uprościć protokół, usuwając ten krok. OsO4 jest utleniaczem stosowanym do utrwalania (zwłaszcza) lipidowych składników komórek83. Ponieważ jest silnie, OsO4 może powodować poważne oparzenia w kontakcie ze skórą i błonami śluzowymi, a także uszkadzać drogi oddechowe lub pokarmowe w przypadku wdychania lub spożycia84,85. Usuwając OsO4 po fiksacji, protokół konsekwentnie zmniejsza liczbę toksycznych regentów, którymi można manipulować.
Sugerujemy również serię mycia etanolem zamiast acetonu, który może być zbyt ostry dla delikatnych próbek86. Seria mycia etanolem z 10-minutowymi krokami upraszcza również poprzednie protokoły SEM45 bez ograniczania rozdzielczości obrazu. Poza tym empirycznie zweryfikowaliśmy, że dodatkowe etapy rozpylania renderowały obrazy o wyższej jakości, co było spójne dla próbek ogrodowych wszystkich badanych przez nas gatunków. Takie dodatkowe etapy prawdopodobnie pokrywały próbki bardziej równomiernie, ponieważ rozpraszanie elektronów było znacznie częstsze w próbkach pokrytych tylko raz (ryc. 4A). W związku z tym zachęcamy do przyszłych prac nad testowaniem dodatków i warunków, które mogłyby zapewnić ulepszony protokół wizualizacji biofilmu w próbkach ogrodowych.
SEM to potężne narzędzie do szczegółowego określania morfologii komórkowej mikrobioty i rozmieszczenia przestrzennego EPS na powierzchniach, ujawniając topografię i teksturę próbek ogrodowych w wysokiej rozdzielczości i powiększeniu 70,87. Nie zapewnia jednak dyskryminacji taksonomicznej członków społeczności, a co za tym idzie, nie mamy rozróżnienia, kto jest gdzie. Ponadto, pomimo dużej głębokości ogniskowej SEM, nie informuje on o trójwymiarowych cechach próbki. Aby uzyskać pełny opis ogrodu mikrobiologicznego attyny, w tym biogeografię taksonomiczną i trójwymiarową rozdzielczość przestrzenną, analizę SEM można uznać za pierwszą procedurę w technikach obrazowania krokowego próbek ogrodowych. W celu uzyskania rozdzielczości taksonomicznej, SEM można połączyć z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH)88,89 i jej wariantami, takimi jak FISH o wysokiej rozdzielczości filogenetycznej (HiPR-FISH)90, znakowanie kombinatoryczne i obrazowanie spektralne FISH (CLASI-FISH)9,91 oraz projekcje 3D92. Trójwymiarowa analiza mikrostruktury może być bardziej szczegółowo opisana za pomocą mikrotomografii rentgenowskiej (X-ray μCT)93. Do tej pory SEM umożliwił nam szczegółową obserwację organizacji przestrzennej mikrobioty wokół strzępek oraz na powierzchni podłoża, bruzd i wgłębień. Takie wzorce mikrobiologiczne budują naszą wiedzę na temat przypuszczalnych interakcji mikrobiologicznych w ogrodach attyńskich. Wierzymy, że przedstawione przez nas etapy przygotowawcze mogą być szeroko stosowane do udoskonalenia badań nad mikrobiologiczną organizacją przestrzenną w innych delikatnych ekosystemach mikrobiologicznych.

Ekosystemy składają się z organizmów połączonych procesami w określonej lokalizacji geograficznej (tj. w środowisku). Organizmy wchodzą w interakcje ze swoim środowiskiem w czasie, w wyniku czego wyłaniają się złożone i heterogeniczne wzorce przestrzenne. Wzorowanie przestrzenne determinuje różnorodność i stabilność ekologiczną, a w konsekwencji funkcjonowanie ekosystemu1,2,3,4. W ekosystemach w skali makro, takich jak tereny podmokłe, sawanny, rafy koralowe i ekosystemy aridowe, wzorce przestrzenne są skorelowane z przepływem i koncentracją zasobów. Umożliwiając optymalizację zasobów, heterogeniczność i wzorowanie przestrzenne prowadzą do powstania ekosystemów bardziej odpornych niż ekosystemy homogeniczne2. Przestrzenna lokalizacja organizmów, stanowiąca podstawę ekologii wspólnot, przekłada się również na świat drobnoustrojów.
Ekosystemy mikrobiologiczne, zamiast być organizmami wymieszanymi w sposób losowy i jednorodny w obrębie mikrośrodowisk, wykazują wzorce przestrzenne, które w znacznym stopniu definiują ich funkcjonowanie5,6,7. Od kolumn Winogradskiego po mikrobiotę środowiskową i związaną z gospodarzem, ekosystemy te są zorganizowane przestrzennie w sposób niejednorodny, a ich układy przestrzenne wywołują różne odpowiedzi fenotypowe. Gatunki współbytujące z większym prawdopodobieństwem wchodzą w interakcje i wpływają na swoją fizjologię. Zatem przestrzenna organizacja społeczności, w większym stopniu niż sam skład per se, określa właściwości ekosystemu i nisze ekologiczne5,7,8. Ilustrując te koncepcje, zmiany we wzorcach przestrzennych wydają się być skorelowane z patologicznym przebiegiem zmian w płytce nazębnej, próchnicą, chorobami dziąseł9,10, nieswoistymi zapaleniami jelit11, infekcjami płuc w mukowiscydozie, przewlekłymi infekcjami ran12,13, rakiem jelita grubego oraz gruczolakami14.
W ramach biogeografii mikroorganizmów (badania nad rozkładem i wzorcami różnorodności biologicznej w przestrzeni i czasie w mikroskali), wiedza na temat ekosystemów mikrobowych jest w ogromnym stopniu wzbogacana dzięki zrozumieniu ich wzorców przestrzennych6,13,15,16,17. Przeanalizowaliśmy wzorce przestrzenne ekosystemu mikrobowego stworzonego przez owady, który znajduje się w centrum kolonii charakterystycznych mrówek attin hodujących grzyby (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini: Attina). Znajduje się tam „mikrobowy ogród”, skupiony wokół grzyba podstawczakowego z plemienia Leucocoprinae (Basidiomycota: Agaricaceae) lub z rodziny Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales)18,19,20,21,22. Ogród jest gąbczastą strukturą wyłaniającą się ze splecionej sieci strzępek, która rośnie poprzez metabolizowanie dostarczanego przez mrówki substratu, składającego się głównie z materiałów roślinnych (Rysunek 1). W zależności od rodzaju mrówek attin, mogą to być: suche części roślin, odchody i zwłoki owadów, świeżo odcięte liście, nasiona oraz części kwiatowe23,24. Podobnie jak zewnętrzny układ pokarmowy roślinożerca, ogród enzymatycznie i chemicznie przekształca trudnorozkładalne polimery w łatwo przyswajalne zasoby odżywcze, zapewniając mrówkom niezbędne aminokwasy, lipidy i cukry rozpuszczalne21,25,26,27,28.
Analizy ultrastrukturalne, enzymatyczne i transkryptomiczne przeprowadzone dla ogrodów grzybowych generów tnących liście Atta i Acromyrmex sugerują, że środowiska te tworzą kontinuum degradacji podłoża i plam odżywczych26,29,30,31,32. Młode części ogrodu mają tendencję do bycia ciemniejszymi ze względu na świeżo włączone, pofragmentowane podłoże. Te niedawno dodane podłoża są często kolonizowane od krawędzi, które zostały przecięte przez robotnice mrówek i zaszczepione grudkami grzybni. Strzałkując od przeciętych krawędzi, strzępki grzyba rozprzestrzeniają się po podłożu29,32,33. Obfitość strzępek wzrasta w miarę postępu degradacji podłoża, co prowadzi do powstania białawych i metabolicznie aktywnych obszarów30,31,32. Starsze regiony, z bardziej zdegradowanym podłożem i obfitą mikrobiotą29,32, wykazują tendencję do przyjmowania brązowych odcieni i wyższej wilgotności. Robotnice usuwają fragmenty tego regionu, oddzielając je w pryzmach odpadów, do których przenoszą również podłoża szkodliwe dla symbionta grzybowego34,35,36. Pryzmy odpadów, choć fizycznie oddzielone od ogrodu, są miejscem ciągłej degradacji podłoża i cyklu nutrientów prowadzonego przez obfitą mikrobiotę mieszkańców29,32,37,38,39.
W ogrodzie bytuje również mikrobiota składająca się głównie z Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Pseudomonas oraz Serratia, która najwyraźniej jest wspólna dla różnych systemów uprawy grzybów u mrówek z podrodziny Attina. Kodując szlaki metaboliczne, które mogłyby uzupełniać metabolizm grzybów, mikrobiota ta potencjalnie uczestniczy w odpowiedziach fizjologicznych ogrodu40,41,42,43,44. Dane metagenomiczne nie tylko wskazały na obecność mikrobioty41,42, ale analiza za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) uprawy grzybów mrówek tnących liście wykazała obecność głównie bakterii pałeczkowatych na podłożu roślinnym32. Choć bakterie (w tym szczepy celulolityczne) wyizolowano z całego ogrodu, wizualizowano je jedynie w starszych częściach ogrodu i w pryzach odpadów, a także w początkowej grudce przenoszonej przez królowe założycielki29,32. Nie było również pewności, czy mikrobiota może tworzyć biofilmy in vivo (tj. w ogrodzie i odpadach), co sugerowały ich możliwości metaboliczne42 oraz obserwacje in vitro44.
W niniejszej pracy wykorzystano SEM w celu dalszego zrozumienia przestrzennej organizacji mikrobioty w obrębie obszarów ogrodu, szczegółowo analizując fizyczne oddziaływania mikrobioty z podłożem oraz mikrobioty z strzępkami. Dzięki uzyskaniu obrazów o większej głębi ostrości, SEM umożliwia obserwację trójwymiarowych struktur mikroskopowych w wysokiej rozdzielczości, co pozwala na gruntowną analizę wzorców przestrzennych mikrobioty ogrodowej. Szczegółowo opisujemy etapy utrwalania, odwadniania, suszenia, napylania i obrazowania tak heterogenicznych i delikatnych próbek opartych na grzybach. Poprzez usunięcie etapu postfiksacji przy użyciu czwartotlenku osmu (OsO4) oraz skrócenie czasu odwadniania, uprościliśmy protokoły32,33,45 przygotowania próbek z ogrodu i odpadów do analizy SEM. Ten zmodyfikowany protokół zachowuje strukturalne wzorce strzępek, a także przestrzenną organizację mikrobioty i biofilmu, i może zostać zastosowany do innych delikatnych ekosystemów mikrobiologicznych i biofilmów.
<img alt="Koncepcja interakcji mikrobiologicznych w ogrodzie mrówek attinowych; ilustracja mikroskopowa z analizą biofilmu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Mikrobiologiczne ogrody mrówek attinowych. Ogród to gąbczasta struktura powstała z przeplatającej się sieci strzępek, która rośnie poprzez metabolizowanie substratu pochodzenia głównie roślinnego dostarczanego przez mrówki. W ogrodzie bytuje również mikrobiota, która koduje szlaki metaboliczne mogące uzupełniać metabolizm grzyba. Dane metagenomiczne oraz wcześniejsze analizy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) wskazywały na jej obecność, choć dysponowaliśmy ograniczoną wiedzą na temat jej organizacji przestrzennej oraz fizycznych interakcji z substratem i strzępkami grzyba. Zastosowaliśmy SEM, aby odsłonić organizację przestrzenną i strukturę mikrobioty oraz biofilmu. Ilustracje: Mariana Barcoto (ogród i mikrobiota zaadaptowane z Barcoto i Rodrigues 94), zdjęcia: Mariana Barcoto i Enzo Sorrentino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Probówka 2 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-BRA</td><td>Do utrwalania i odwadniania próbek</td></tr><tr><td>Bezwodny chlorek wapnia</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td>CaCl2 bezwodny do przygotowania Karnovsky' s fixative</td></tr><tr><td>Suszarka do punktów krytycznych</td><td>Leica</td><td>EM CPD 300</td><td>Do suszenia w punkcie krytycznym</td></tr><tr><td>Dwustronna taśma przewodząca z włókna węglowego, 12 mm (W) X 5 m (L)</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>Sciences 77819-12</td><td>Do montażu próbek</td></tr><tr><td>Kleszcze entomologiczne</td><td>Brak konkretnego dostawcy</td><td></td><td>Do manipulowania próbkami ogrodowymi</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy (=etanol), czysty (&ge; 99,5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>Do odwodnienia</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Brak konkretnego dostawcy</td><td></td><td>Do manipulowania próbkami ogrodowymi</td></tr><tr><td>Szklana zlewka</td><td>Brak konkretnego dostawcy</td><td></td><td>Do odwodnienia</td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego</td><td>Brak konkretnego dostawcy</td><td></td><td>Do manipulowania próbkami ogrodowymi</td></tr><tr><td>Pipeta szklana</td><td>Brak konkretnego dostawcy</td><td></td><td>Do utrwalania i odwadniania próbek</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy (wodny aldehyd glutarowy klasy EM 25%)</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>16220</td><td>Aby przygotować Karnovsky' s utrwalacz</td></tr><tr><td>Złoty cel&nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>8071</td><td>Do napylania powłoki złotem</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich 320331</td><td></td><td>Do regulacji roztworów pH</td></tr><tr><td>Edytor obrazów</td><td>Photoshop</td><td>dowolna wersja</td><td>Aby dostosować obrazy</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (paraformaldehyd 20% roztwór wodny klasy EM)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15713</td><td>Aby przygotować Karnovsky' s utrwalacz</td></tr><tr><td>Odbiorca propilenu</td><td>Brak konkretnego dostawcy</td><td></td><td>Do utrzymania żywych kolonii mrówek</td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>JEOL&nbsp;</td><td>IT300 SEM</td><td>Do obrazowania próbek&nbsp;</td></tr><tr><td>Kakodylan sodu trójwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>Do przygotowania buforu kakodylanu sodu</td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td>Brak konkretnego dostawcy</td><td></td><td>Do manipulowania próbkami</td></tr><tr><td>ogrodowymi Pojemniki na próbki o średnicy 15 mm x wysokości 10 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>4591</td><td>Do suszenia w punkcie krytycznym</td></tr><tr><td>Powlekarka napylająca</td><td>Baltec&nbsp;</td><td>SCD 050</td><td>Do pokrycia złotym</td></tr><tr><td>Króćcem (mocowanie aluminiowe, kołek płaski) 12,7 mm x 8 mm&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>Sciences 75520</td><td>Do mocowania próbek</td></tr></tbody></table>

mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Microbiota of Attine Ants' Gardens: Visualizing a Microbial Landscape by Scanning Electron Microscopy

W ekosystemach makroskalowych, takich jak lasy deszczowe czy rafy koralowe, przestrzenna lokalizacja organizmów jest podstawą naszego zrozumienia ekologii społeczności. Podobnie w świecie mikrobiologicznym ekosystemy w mikroskali są dalekie od przypadkowej i jednorodnej mieszanki organizmów i siedlisk. Dostęp do przestrzennego rozmieszczenia mikroorganizmów ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia funkcjonowania i ekologii mikrobioty, ponieważ gatunki współżyjące z innymi organizmami są bardziej skłonne do interakcji i wzajemnego wpływania na swoją fizjologię.
Międzykrólestwowy ekosystem mikrobiologiczny jest sercem kolonii mrówek hodujących grzyby, które uprawiają grzyby podstawczakowe jako źródło pożywienia. Mrówki Attine żerują na różnych podłożach (głównie roślinnych), metabolizowanych przez uprawiane grzyby, tworząc gąbczastą strukturę, "ogród mikrobiologiczny", który działa jak zewnętrzne jelito. Ogród jest splecioną siatką strzępek grzybów, które rosną poprzez metabolizowanie podłoża, otwierając nisze dla charakterystycznej i przystosowanej mikrobioty. Uważa się, że mikrobiota przyczynia się do degradacji substratu i wzrostu grzybów, chociaż jej organizacja przestrzenna nie została jeszcze ustalona.
Tutaj opisujemy, jak wykorzystujemy skaningową mikroskopię elektronową (SEM) do zbadania, z niespotykaną dotąd szczegółowością, organizacji przestrzennej mikrobioty i biofilmu w różnych systemach hodowli grzybów mrówek. Obrazowanie SEM dostarczyło opisu struktury przestrzennej i organizacji mikrobioty. Projekt SEM ujawnił, że mikrobiota często gromadzi się w biofilmach, które są szeroko rozpowszechnioną strukturą krajobrazów mikrobiologicznych w kulturze grzybów. Przedstawiamy protokoły stosowane do naprawy, odwadniania, suszenia, napylania powłoki i obrazowania tak złożonej społeczności. Protokoły te zostały zoptymalizowane pod kątem radzenia sobie z delikatnymi i niejednorodnymi próbkami, zawierającymi biomasę roślinną i grzybową, a także mikrobiotę i biofilm.

W niniejszej pracy przedstawiliśmy uproszczony protokół wizualizacji składników próbek ogrodów i odpadów mrówek z rodzaju Atta, takich jak strzępki grzybni, substrat, mikrobiota oraz biofilmy. SEM pozwolił na lepsze zrozumienie sposobu, w jaki ogród i odpady kształtują strukturalne wzorce mikrobioty (Rysunek 3). W ogrodach mrówek z rodzaju *Attine*, strzępki grzybniowe są strukturami rozgałęzionymi, pokryваjącymi fragmenty powierzchni podłoża. Ponieważ strzępki grzybniowe wykazują dużą wrażliwość na odwodnienie i przerwanie, użytkownik może kierować się ich wyglądem przy ocenie efektów przygotowania próbek. Jak zaobserwowano również w poprzednich pracach32,33,45, strzępki wykazują postać rurkowatą; nienaruszone, rurkowate strzępki świadczą o prawidłowym przygotowaniu próbki (Rycina 3A i Rycina 4C). W przypadku strzępek w kształcie wstążki, takie spłaszczenie może być artefaktem zastosowanej techniki (Rycina 4C).
Powierzchnie podłoża roślinnego mogą być rozpoznawane po warstwach kutykuli i epidermy, a także po aparatach szparkowych i trichomach. Struktury te są bardziej rozpoznawalne, gdy podłoża nie zostały jeszcze skolonizowane przez strzępki grzybni i mikrobiotę (Rycina 3A oraz Rycina 4C). W przypadku skolonizowania podłoża, mikrobiota i/lub strzępki grzybni pokrywają jego powierzchnię w taki sposób, że poszczególne struktury roślinne nie są łatwo rozróżnialne (Rycina 3A). Mikrobiota może kolonizować albo strzępki grzybni, albo podłoże, przy czym każda z tych opcji wykazuje pozornie odmienną organizację przestrzenną. Na Rycini 3 schematycznie przedstawiono takie wzorce przestrzenne i obramowano je na odpowiednich obrazach SEM, na których zostały zidentyfikowane; może to ułatwić powiązanie wyników SEM z ich interpretacją.
Mikrobiota kolonizująca strzępki jest rzadziej obserwowana, a gdy występuje, składa się z komórek prątkowatych lub kokoidnych, występujących pojedynczo lub w małych grupach przytwierdzonych do powierzchni strzępki. Macierz egzopolisacharydowa (EPS) biofilmu, przypominająca strukturę „koronkowej tkaniny”, może być widoczna wokół strzępek w postaci małych skupisk (Rycina 3A). Znacznie częściej spotykana jest mikrobiota kolonizująca podłoże, występująca w ogrodach różnych gatunków mrówek z rodzaju attine. Wzorce kolonizacji wydają się być w pewnym stopniu zdefiniowane przez etapy rozkładu podłoża. Zatem podczas kolonizacji podłoży jeszcze niedegradowanych, mikrobiota może występować jako pojedyncze komórki lub gromadzić się w małych grupach. Mikrobiota może tworzyć warstwę na podłożu, gdy wykazuje ono mikroskopijne oznaki rozkładu (t.j. gdy warstwy kutykularne/epidermalne roślin oraz inne struktury roślinne nie są już rozróżnialne, a występują liczne bruzdy i wgłębienia).
W tych „matach mikrobiologicznych” morfologia komórek jest bardziej rozpoznawalna w przypadku braku macierzy EPS. W sytuacjach, gdy komórki mikrobiologiczne są zatopione w macierzy EPS, ich morfologia nie jest łatwo rozróżnialna. Ze względu na organizację przestrzenną scharakteryzowano biofilmy jako „rozprzestrzenione” lub „trójwymiarowe”. Gdy biofilm jest rozprzestrzeniony, komórki mikrobiologiczne i macierz EPS przerywanym sposobem pokrywają powierzchnię podłoża, tworząc płaską warstwę o grubości 1-3 komórek (Rysunek 3B). Gdy biofilm jest trójwymiarowy, komórki mikrobiologiczne i macierz EPS spiętrzają się, tworząc skupiska o grubości wielu komórek. Obszary ogrodowe składające się z zdegradowanych podłoży (takich jak stary ogród i odpady) chronią mikrobiotę w swoich bruzdach i wgłębieniach, gdzie tworzy ona grube społeczności (Rysunek 3C). W szczególności silnie zdegradowane podłoża w próbkach odpadów goszczą obfitą mikrobiotę, która jest najbardziej zróżnicowana morfologicznie spośród wszystkich regionów. Drożdże zwiększają złożoność tej społeczności, wchodząc w fizyczne interakcje z prokariotami poprzez biofilm. W próbkach odpadów Atta sexdens i Acromyrmex sp. zaobserwowano macierze EPS tworzące wyraźną sieć włókien otaczającą pałeczkowate i kokoidalne prokarioty, a także wrzecionowate i sferyczne drożdże (Rysunek 3C).
Ze względu na splątaną sieć strzępek, gąbczasta struktura ogrodu wymaga dodatkowego napylania, aby bardziej równomiernie pokryć próbkę. Takie kroki pozwalają uniknąć rozpraszania elektronów, które zniekształca obraz i pogarsza jego rozdzielczość (Rysunek 4A). Etapy przygotowania próbek pozwoliły zachować większość struktury ogrodu, ujawniając rozkład przestrzenny i organizację mikrobioty. Warto jednak powtórzyć, że struktury takie jak strzępki grzybów i macierz EPS są bardzo wrażliwe na odwodnienie i bardzo trudne do zachowania, zwłaszcza w przypadku SEM. Struktura strzępek została zachowana stosunkowo dobrze, jednak można przyjąć, że biofilm wizualizowany w niektórych próbkach ogrodu mógł być pozbawiony niektórych komponentów strukturalnych macierzy EPS. Chociaż w niektórych próbkach zachowała się gładka, zewnętrzna warstwa polisacharydów otaczająca mikrobiotę (Rysunek 3A, B), w innych zachowano cechy morfologiczne mikrobioty, ale nie było macierzy EPS. Nie jest jednak jasne, czy macierz EPS rzeczywiście była nieobecna, czy została usunięta podczas przygotowania próbki.
Z jednej strony usunięcie gładkiej warstwy biofilmu utrudnia zrozumienie jego dokładnej struktury. Z drugiej strony pozwala ono na ujawnienie morfologii, organizacji przestrzennej i oddziaływań fizycznych komórek bytujących pod tą warstwą, co stanowi główny cel naszych badań. Wcześniejsze prace zgłaszały zachowanie zarówno strzępek grzybowych, jak i macierzy biofilmu dzięki zastosowaniu oparów czterotlenku osmu (OsO4) jako głównego utrwalacza44,50,51,52,53,54. Przeprowadziliśmy zatem eksperyment porównawczy, utrwalając świeże próbki ogrodów za pomocą oparów OsO4 , co najwyraźniej zachowało gładki aspekt biofilmów (Rycina 4B). Metoda ta spowodowała jednak znaczne spłaszczenie strzępek i mikrobioty. Spłaszczenie to doprowadziło do utraty ogólnych aspektów przestrzennych ogrodów opisanych wcześniej29,33,32,45, co ograniczyło dalsze badania nad wzorcami strukturalnymi ogrodów. Utrwalanie za pomocą OsO4  utrudniło zarówno rozróżnienie morfologii i rozmieszczenia drobnoustrojów, jak i odróżnienie struktur komórkowych od artefaktów technicznych, co skomplikowało interpretację danych.
<img alt="Kolonizacja strzępek, rozprzestrzenianie się na podłożu, trójwymiarowe klastry na podłożu; SEM, strzępki grzybni, macierz EPS biofilmu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wzorce architektoniczne mikrobioty. Mikrobiota kolonizuje albo strzępki grzybni, albo podłoże w odrębnej organizacji przestrzennej. Takie wzorce przestrzenne przedstawiono schematycznie i obramowano na odpowiadających im obrazach SEM, na których zostały zidentyfikowane (oznaczone na rycinie białymi kwadratami): (A) mikrobiota kolonizująca strzępki składa się z pojedynczych komórek lub małych grup komórek, przy czym w niektórych próbkach wykrywalna jest egzosakarydowa macierz biofilmu. (B) mikrobiota kolonizująca podłoże rozprzestrzenia się w całym podłożu, a macierz EPS pokrywa komórki w taki sposób, że ich morfologia nie jest łatwo rozróżnialna. (C) mikrobiota kolonizująca podłoże tworząca trójwymiarowe grupy, stanowiące biofilmy mono- lub multi-morfologiczne, w niektórych przypadkach z widoczną macierzą EPS. Ilustracje: Mariana Barcoto. Skrót: EPS = macierz egzosakarydowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig03largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy SEM z rozproszeniem elektronów; tekstura biofilmu w porównaniu utrwalaczy. Analiza struktury strzępek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Obrazowanie nieefektywne. Obrazy niskiej jakości dające nieskuteczne wyniki i/lub utrudniające interpretację wzorców architektonicznych. (A) Rozproszenie elektronów zniekształca obraz, pogarszając jego rozdzielczość i w konsekwencji utrudniając identyfikację morfologii. Zjawisko to często obserwowano w próbkach napylonych tylko raz; zostało ono zredukowane poprzez dodatkowe napylanie. (B) Utrwalanie świeżych próbek ogrodowych za pomocą parą tetratlenku osmu (OsO4) jako głównego utrwalacza44,50,51,52,53,54 najwyraźniej zachowało gładki aspekt biofilmów. Jednakże spowodowało to rozległe spłaszczenie strzępek i mikrobioty, niszcząc architektoniczne wzorce ogrodowe. (C) Przygotowanie próbek z użyciem utrwalacza Karnovskiego pozwoliło uzyskać obrazy wyższej jakości w porównaniu z preparatami z użyciem OsO4, zachowując większość struktury strzępek, rozmieszczenie mikrobioty oraz przestrzenne wzorce ogrodów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig04largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Proponujemy zoptymalizowany protokół skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji wysoce heterogenicznych i delikatnych próbek zawierających biomasę roślinną i grzybową, wraz z mikrobiotą i biofilmem. Protokół ten pozwala na opisanie wymiarów przestrzennych organizacji mikrobioty.

Mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

In macroscale ecosystems, such as rainforests or coral reefs, the spatial localization of organisms is the basis of our understanding of community ...

Badamy mikrobiotę żyjącą w ogrodach grzybowych na mrówkach hodujących grzyby. Chcemy wiedzieć, kim są i jak organizują ten ekosystem mikrobiologiczny. W szczególności chcemy wiedzieć, w jaki sposób mikrobiota oddziałuje fizycznie z grzybami hodowanymi przez mrówki.A te interakcje są głównie pośredniczone przez biofilm. Ogrody mikrobiologiczne uprawiane przez mrówki to złożona i niejednorodna próbka złożona z uprawianego grzyba, substratu dodanego do uprawy i mikrobioty. Oprócz tego, że są bardzo delikatne, trudno jest znaleźć metody, które zachowają wszystkie elementy ogrodu do obrazowania.Nasze odkrycia sugerują, że mikrobiota integruje struktury ogrodowe grzybów, co potwierdza również, że mogą one uczestniczyć w fizjologicznych reakcjach tego środowiska. Dostarczamy również zestaw dowodów na to, że biofilmy są ważne dla tych interakcji. Nasz protokół zachowuje struktury grzybów w biofilmach, jednocześnie upraszczając inne procesy.Zachowuje jednak delikatną strukturę ogrodu, szczegółowo opisując fizyczną interakcję mikrobioty i odsłaniając strukturę przestrzenną biofilmu. Biofilm to systemy komórkowe, w których mikroorganizmy osadzone w matrycy EPS tworzą sieci społeczne. Elektromikroskopia skaningowa pozwala nam obserwować z niespotykaną dotąd szczegółowością, jak mikrobiota organizuje się przestrzennie w ogrodzie grzybów, otaczających strzępkach i na całym podłożu.Wierzymy, że zaproponowane przez nas kroki przygotowawcze będą szeroko stosowane w celu udoskonalenia badań nad innymi ekosystemami mikrobiologicznymi. Aby rozpocząć, zlokalizuj i oznacz kolonię gatunku mrówek attine. Wykop rów otaczający obszar gniazda, aż komora ogrodowa zostanie odsłonięta.Otwórz komorę ogrodową na boki, aby zapobiec zapadaniu się gleby na powierzchnię ogrodu. Za pomocą kleszczy entomologicznych ostrożnie zbierz próbki ogrodowe. Przenieś próbki ogrodowe do czystego plastikowego pojemnika zawierającego warstwę tynku, aby zrównoważyć wilgotność.Po przeniesieniu robotnic ogrodowych i mrówek hermetycznie zamknij pojemnik, aby zapobiec wysuszeniu próbki. Zamknij rów za pomocą wcześniej usuniętej gleby. Przechowuj próbki ogrodowe w temperaturze od 23 do 25 stopni Celsjusza, do czasu dalszej obróbki.Do utrwalenia próbki użyj kleszczy entomologicznych, aby usunąć robotnice, jaja, poczwarki i larwy z próbek ogrodowych. Odłóż na bok fragmenty ogrodu nie większe niż pięć milimetrów sześciennych i dodaj je do dwumililitrowej tuby. Następnie za pomocą szklanej pipety Pasteura dodaj około jednego mililitra roztworu utrwalającego Karnofsky'ego do probówek, aby całkowicie zanurzyć próbki.Delikatnie zamieszać probówkę, aby próbki mogły się namoczyć i inkubować próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny. Na początek uzyskaj fragmenty kolonii gatunków mrówek attine w roztworze utrwalającym Karnofsky'ego. Po utrwaleniu należy całkowicie usunąć roztwór utrwalający Karnofsky'ego za pomocą szklanej pipety, nie naruszając próbki.Seryjnie inkubować próbkę z jednym mililitrem rosnącego stężenia etanolu, upewniając się, że próbka pozostaje nienaruszona. Po całkowitym usunięciu etanolu, za pomocą kleszczy i szpatułki, ostrożnie przenieś próbkę do pojemnika na próbki do suszarki w punkcie krytycznym. Umieść pokrywkę na pojemniku i zanurz ją w szklanej zlewce z podziałką zawierającą wystarczającą ilość 100% etanolu, aby zanurzyć pojemnik.Następnie przenieść pojemnik na próbkę do innej szklanej zlewki miarowej zawierającej wystarczającą ilość 100% etanolu. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś pojemnik do suszarki w punkcie krytycznym.Na początek należy pozyskać fragmenty kolonii mrówek attine poddane suszeniu w punkcie krytycznym. Aby przygotować uchwyty na próbki, owiń kikuty kawałkiem folii aluminiowej, przykrywając tylko górę. Napisz przykładowy kod lub numer na spodzie każdego odcinka, aby je zidentyfikować, zanim zakryjesz górną część odcinków dwustronną taśmą węglową.Następnie otwórz pokrywę pojemnika na próbkę i ostrożnie przenieś wysuszoną próbkę na szklaną szalkę Petriego za pomocą kleszczyków i szpatułki. Ostrożnie umieść fragmenty próbki ogrodowej na lepkiej powierzchni kikuta pokrytego taśmą. Po napyleniu złotem umieść kikuty w uchwycie na próbkę do skaningowej mikroskopii elektronowej.Użyj opcji ekranowych lub sterowania ręcznego, aby dostosować powiększenie i pozycję obrazu. Przesunąć stolik, aby uzyskać pełny widok próbki. Użyj funkcji RDC, aby skupić się na określonych obszarach.Obserwując interesującą strukturę, dostosuj odpowiednio powiększenie, ostrość, jasność, kontrast i stygmatyzację. Aby uzyskać poprawną stygmatyzację, za pomocą ręcznego interfejsu użytkownika, przesuń stolik w kierunku X i Y. Dostosuj szybkość rastra, aby sprawdzić rozdzielczość obrazu.Dostosuj powiększenie do obrazowanej części. Aby zapisać obraz, użyj funkcji zamrażania i kliknij ikonę zdjęcia. Skonfiguruj ścieżkę do pliku do zapisania obrazu.Na koniec przeanalizuj co najmniej trzy fragmenty ogrodu, robiąc obrazy we wszystkich wymienionych zakresach powiększenia. Strzępki grzybów w ogrodach attynowych zaobserwowano jako nienaruszone struktury w kształcie rurki pokrywające powierzchnię podłoża, co wskazuje na skuteczne przygotowanie próbki. Rozprzestrzeniające się biofilmy składały się z komórek drobnoustrojów tworzących cienką warstwę od jednej do trzech komórek pokrywającą powierzchnię podłoża.

microbiota-attine-ants-gardens-visualizing-microbial-landscape

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy film przedstawia technikę izolacji DNA z gatunków mikroorganizmów zasiedlających jelito tylne termitów. Zaprezentowano również przygotowanie preparatu świeżego, który jest przydatny do wizualizacji mikrobioty jelitowej, a także przeprowadzono przegląd bogatego gatunkowo środowiska jelita.

Izolacja DNA z mikroorganizmów jelitowych termita (Zootermopsis angusticollis) oraz wizualizacja mikroorganizmów jelitowych

Jared Leadbetter wyjaśnia, dlaczego społeczność mikrobowa w jelitach termitów stanowi doskonały system do badania złożonych interakcji między mikroorganizmami. Omówiono symbiotyczną relację zachodzącą między owadem-gospodarzem a degradującymi lignocelulozę mikrobami jelitowymi, a także przemysłowe zastosowania tych mikroorganizmów w rozkładzie biomasy roślinnej i produkcji biopaliw.

Badanie społeczności mikrobowej w jelicie tylnym termitów – Wywiad

Jared Leadbetter zabiera nas na spacer po naturze, ukazując różnorodność życia zamieszkującego jelito tylne termita – mikrośrodowisko zawierające 250 różnych gatunków, których nie spotkamy nigdzie indziej na Ziemi. Jared wykazuje, że symbioza występująca w tym systemie jest wielowarstwowa i obejmuje nie tylko relację między termitem a mieszkańcami jego jelit, ale także złożoną sieć zależności symbiotycznych pomiędzy samymi mikrobami jelitowymi.

Warstwy symbiozy – wizualizacja społeczności mikrobiologicznej jelita tylnego termitów

Tutaj prezentujemy protokół do przestrzennej i czasowej oceny obecności żywotnej mikroflory w jelitach kleszczy przy użyciu zmodyfikowanego podejścia do hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja mikrobioty w jelitach kleszczy poprzez hybrydyzację in situ w całości

Ten uproszczony protokół szczegółowo opisuje proces wykrywania i obrazowania bakterii w złożonych próbkach tkanek, od utrwalania tkanki po barwienie mikrobów za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Niniejszy protokół demonstruje prostą technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek służącą do wizualizacji replikacji DNA przez poszczególne replisomy w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody1. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Fenestrowana komórka śródbłonka wątroby sinusoidalnej jest biologicznie ważnym systemem filtrów, na który duży wpływ mają różne choroby, toksyny i stany fizjologiczne. Zmiany te mają znaczący wpływ na pracę wątroby. Opisano metody standaryzacji pomiaru wielkości i liczby okien w tych komórkach.

Znormalizowana metoda analizy sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby i ich fenestracji za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Pokazana tutaj jest metoda wizualizacji ultrastruktury macierzy zewnątrzkomórkowej w zdecelularyzowanych tkankach serca.

Skaningowa mikroskopia elektronowa zmacerowanej tkanki w celu wizualizacji macierzy zewnątrzkomórkowej

Odkryj mikrobiotę ogrodów grzybów mrówek attine i jej interakcje z biofilmami za pomocą zoptymalizowanej skaningowej mikroskopii elektronowej. Ta metoda pozwala szczegółowo zbadać organizację przestrzenną mikroorganizmów.

Mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów