Mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej
4 października 2024
Proponujemy zoptymalizowany protokół skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji wysoce heterogenicznych i delikatnych próbek zawierających biomasę roślinną i grzybową, wraz z mikrobiotą i biofilmem. Protokół ten pozwala na opisanie wymiarów przestrzennych organizacji mikrobioty.
Badamy mikrobiotę żyjącą w ogrodach grzybowych na mrówkach hodujących grzyby. Chcemy wiedzieć, kim są i jak organizują ten ekosystem mikrobiologiczny. W szczególności chcemy wiedzieć, w jaki sposób mikrobiota oddziałuje fizycznie z grzybami hodowanymi przez mrówki.
A te interakcje są głównie pośredniczone przez biofilm. Ogrody mikrobiologiczne uprawiane przez mrówki to złożona i niejednorodna próbka złożona z uprawianego grzyba, substratu dodanego do uprawy i mikrobioty. Oprócz tego, że są bardzo delikatne, trudno jest znaleźć metody, które zachowają wszystkie elementy ogrodu do obrazowania.
Nasze odkrycia sugerują, że mikrobiota integruje struktury ogrodowe grzybów, co potwierdza również, że mogą one uczestniczyć w fizjologicznych reakcjach tego środowiska. Dostarczamy również zestaw dowodów na to, że biofilmy są ważne dla tych interakcji. Nasz protokół zachowuje struktury grzybów w biofilmach, jednocześnie upraszczając inne procesy.
Zachowuje jednak delikatną strukturę ogrodu, szczegółowo opisując fizyczną interakcję mikrobioty i odsłaniając strukturę przestrzenną biofilmu. Biofilm to systemy komórkowe, w których mikroorganizmy osadzone w matrycy EPS tworzą sieci społeczne. Elektromikroskopia skaningowa pozwala nam obserwować z niespotykaną dotąd szczegółowością, jak mikrobiota organizuje się przestrzennie w ogrodzie grzybów, otaczających strzępkach i na całym podłożu.
Wierzymy, że zaproponowane przez nas kroki przygotowawcze będą szeroko stosowane w celu udoskonalenia badań nad innymi ekosystemami mikrobiologicznymi. Aby rozpocząć, zlokalizuj i oznacz kolonię gatunku mrówek attine. Wykop rów otaczający obszar gniazda, aż komora ogrodowa zostanie odsłonięta.
Otwórz komorę ogrodową na boki, aby zapobiec zapadaniu się gleby na powierzchnię ogrodu. Za pomocą kleszczy entomologicznych ostrożnie zbierz próbki ogrodowe. Przenieś próbki ogrodowe do czystego plastikowego pojemnika zawierającego warstwę tynku, aby zrównoważyć wilgotność.
Po przeniesieniu robotnic ogrodowych i mrówek hermetycznie zamknij pojemnik, aby zapobiec wysuszeniu próbki. Zamknij rów za pomocą wcześniej usuniętej gleby. Przechowuj próbki ogrodowe w temperaturze od 23 do 25 stopni Celsjusza, do czasu dalszej obróbki.
Do utrwalenia próbki użyj kleszczy entomologicznych, aby usunąć robotnice, jaja, poczwarki i larwy z próbek ogrodowych. Odłóż na bok fragmenty ogrodu nie większe niż pięć milimetrów sześciennych i dodaj je do dwumililitrowej tuby. Następnie za pomocą szklanej pipety Pasteura dodaj około jednego mililitra roztworu utrwalającego Karnofsky'ego do probówek, aby całkowicie zanurzyć próbki.
Delikatnie zamieszać probówkę, aby próbki mogły się namoczyć i inkubować próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny. Na początek uzyskaj fragmenty kolonii gatunków mrówek attine w roztworze utrwalającym Karnofsky'ego. Po utrwaleniu należy całkowicie usunąć roztwór utrwalający Karnofsky'ego za pomocą szklanej pipety, nie naruszając próbki.
Seryjnie inkubować próbkę z jednym mililitrem rosnącego stężenia etanolu, upewniając się, że próbka pozostaje nienaruszona. Po całkowitym usunięciu etanolu, za pomocą kleszczy i szpatułki, ostrożnie przenieś próbkę do pojemnika na próbki do suszarki w punkcie krytycznym. Umieść pokrywkę na pojemniku i zanurz ją w szklanej zlewce z podziałką zawierającą wystarczającą ilość 100% etanolu, aby zanurzyć pojemnik.
Następnie przenieść pojemnik na próbkę do innej szklanej zlewki miarowej zawierającej wystarczającą ilość 100% etanolu. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś pojemnik do suszarki w punkcie krytycznym.
Na początek należy pozyskać fragmenty kolonii mrówek attine poddane suszeniu w punkcie krytycznym. Aby przygotować uchwyty na próbki, owiń kikuty kawałkiem folii aluminiowej, przykrywając tylko górę. Napisz przykładowy kod lub numer na spodzie każdego odcinka, aby je zidentyfikować, zanim zakryjesz górną część odcinków dwustronną taśmą węglową.
Następnie otwórz pokrywę pojemnika na próbkę i ostrożnie przenieś wysuszoną próbkę na szklaną szalkę Petriego za pomocą kleszczyków i szpatułki. Ostrożnie umieść fragmenty próbki ogrodowej na lepkiej powierzchni kikuta pokrytego taśmą. Po napyleniu złotem umieść kikuty w uchwycie na próbkę do skaningowej mikroskopii elektronowej.
Użyj opcji ekranowych lub sterowania ręcznego, aby dostosować powiększenie i pozycję obrazu. Przesunąć stolik, aby uzyskać pełny widok próbki. Użyj funkcji RDC, aby skupić się na określonych obszarach.
Obserwując interesującą strukturę, dostosuj odpowiednio powiększenie, ostrość, jasność, kontrast i stygmatyzację. Aby uzyskać poprawną stygmatyzację, za pomocą ręcznego interfejsu użytkownika, przesuń stolik w kierunku X i Y. Dostosuj szybkość rastra, aby sprawdzić rozdzielczość obrazu.
Dostosuj powiększenie do obrazowanej części. Aby zapisać obraz, użyj funkcji zamrażania i kliknij ikonę zdjęcia. Skonfiguruj ścieżkę do pliku do zapisania obrazu.
Na koniec przeanalizuj co najmniej trzy fragmenty ogrodu, robiąc obrazy we wszystkich wymienionych zakresach powiększenia. Strzępki grzybów w ogrodach attynowych zaobserwowano jako nienaruszone struktury w kształcie rurki pokrywające powierzchnię podłoża, co wskazuje na skuteczne przygotowanie próbki. Rozprzestrzeniające się biofilmy składały się z komórek drobnoustrojów tworzących cienką warstwę od jednej do trzech komórek pokrywającą powierzchnię podłoża.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje mikrobiotę w ogrodach grzybowych pielęgnowanych przez mrówki hodujące grzyby, koncentrując się na ich interakcjach strukturalnych i organizacji. Podkreślono w nim znaczenie biofilmów w tych interakcjach oraz przedstawiono zoptymalizowany protokół skaningowej mikroskopii elektronowej, który skutecznie konserwuje zaangażowane w nie delikatne struktury.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Ekologia mikroorganizmów
- Symbioza grzybowa
- Interakcje w biofilmach
Wprowadzenie
- Mikrobiota w ogrodach grzybowych mrówek stanowi złożony ekosystem.
- Istnieją wyzwania związane z obrazowaniem delikatnych próbek biologicznych.
- Zrozumienie tych oddziaływań jest kluczowe dla pojmowania dynamiki ekosystemu.
Zastosowane metody
- Zoptymalizowany protokół skaningowej mikroskopii elektronowej
- Ogrody grzybowe hodowane przez mrówki z rodzaju Atta
- Techniki analizy i obrazowania biofilmu
Główne wyniki
- Mikrobiota integruje się z grzybem i podłożem w ogrodzie.
- Udokumentowano organizację przestrzenną mikrobioty oraz jej interakcje ze strukturami grzybowymi.
- Podkreślono rolę biofilmów w wspieraniu tych interakcji.
Wnioski
- Badanie dostarcza wiedzy na temat dynamiki ekosystemów mikrobiologicznych.
- Zaproponowany protokół obrazowania może usprawnić badania nad podobnymi systemami biologicznymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wizualizacja organizacji przestrzennej drobnoustrojów w złożonych macierzach biologicznych o wysokiej rozdzielczości ma kluczowe znaczenie dla minimalizacji ryzyka na etapie wczesnego odkrywania i walidacji celów w badaniach nad mikrobiomem. Opisany protokół SEM umożliwia precyzyjne mapowanie oddziaływań między mikrobiotą a biofilmem, zwiększając wiarygodność wyników w badaniach funkcjonalnych konsorcjów mikrobiologicznych. Możliwość ta jest bezpośrednio istotna dla zespołów biofarmaceutycznych dążących do zrozumienia relacji między strukturą a funkcją społeczności w mikrobiomach związanych z chorobami lub w mikrobiomach modyfikowanych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację przestrzennego rozmieszczenia drobnoustrojów w celu weryfikacji hipotez dotyczących funkcji społeczności.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ujawnianie fizycznych oddziaływań między mikrobiotą a strukturami gospodarza lub podłoża.
- Ułatwia walidację celów funkcjonalnych poprzez mapowanie oddziaływań pośredniczonych przez biofilm in situ.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane protokoły obrazowania do przygotowania heterogenicznych próbek biologicznych do późniejszej analizy ilościowej.
- Standaryzuje konserwację próbek i obrazowanie, poprawiając odtwarzalność w ramach kampanii przesiewowych.
- Generuje ilościowe dane przestrzenne służące do opracowania testów dla związków modulujących mikrobiom.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie przestrzennego mapowania mikrobioty z translacyjnym odkrywaniem biomarkerów w złożonych ekosystemach mikrobiologicznych.
- Zapewnia ciągłość przejścia od obrazowania na etapie odkrywania do walidacji interwencji w zakresie mikrobiomu w modelach przedklinicznych.
- Wspiera rozwój z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez wyjaśnienie zależności między strukturą a funkcją w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten oparty na SEM proces roboczy integruje się z kontinuum od odkrycia do etapu przedklinicznego w programach ukierunkowanych na mikrobiom, wspierając zarówno weryfikację hipotez, jak i ciągłość translacyjną.
- Biologia odkrywcza: Dostarcza danych o rozdzielczości przestrzennej do testowania hipotez i wyjaśniania szlaków w konsorcjach mikrobiologicznych.
- Przesiewanie: Ustanawia powtarzalne standardy obrazowania do ilościowej oceny organizacji biofilmu i mikrobioty.
- Analityka: Zapewnia wysokotreściowe odczyty przestrzenne do porównywania warunków eksperymentalnych i interwencji.
- Badania translacyjne: Łączy obrazowanie odkrywcze z przedkliniczną walidacją hipotez dotyczących relacji struktura-funkcja mikrobiomu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje protokół wielokrotnego użytku, który można dostosować do różnorodnych ekosystemów mikrobiologicznych i typów próbek.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad mikrobiomem.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje obrazowanie i przygotowanie próbek dla skalowalnych, reprodukowalnych przepływów pracy.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań poprzez wyjaśnienie organizacji przestrzennej i potencjału funkcjonalnego społeczności mikrobiologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów i interwencji ukierunkowanych na mikrobiom z uwzględnieniem dostosowania do ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze SEM oraz w przygotowywaniu próbek z zakresu ekologii mikroorganizmów.
- Wymaga dostępu do aparatury do suszenia w punkcie krytycznym, napylania oraz wysokorozdzielczego SEM.
- Wymaga standaryzacji protokołów pobierania i przygotowywania próbek pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych złożonych matryc biologicznych poza ogrodami grzybów mrówek.
- Delikatność i heterogeniczność próbek mogą ograniczać przepustowość lub wymagać optymalizacji protokołu dla nowych układów.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:53
Isolation and Fixation of Ant Colonies for Characterizing the Spatial Structure of Microbiota in Fungus Gardens with SEM Techniques
3:25
Dehydration of Fixed Fungus Cultures of Attine Ants for Unveiling the Microbial Biofilm Structure
4:32
Scanning Electron Microscopy for Imaging Microbial Biofilms in Fungus-Growing Ant Colonies
6:34
Representative Results
