Multimodalne badanie przebudowy układu sercowo-naczyniowego u myszy: czterowymiarowe obrazowanie ultrasonograficzne i spektrometria mas

Nasze laboratorium wykorzystuje przedkliniczne obrazowanie ultrasonograficzne do badania biomechaniki układu sercowo-naczyniowego w różnych chorobach i stanach fizjologicznych. Wykorzystujemy również obrazowanie metodą spektrometrii mas do badania przestrzennego rozkładu lipidów w tkance sercowo-naczyniowej i mózgowej. Próbujemy zobaczyć, gdzie w tkance zachodzą zmiany funkcjonalne i molekularne.

Chociaż powszechne techniki obrazowania molekularnego, takie jak histologia i immunohistochemia, mogą dostarczyć danych molekularnych, są one ograniczone przez obecnie dostępne barwniki i przeciwciała. Z drugiej strony, obrazowanie metodą spektrometrii mas jest nieukierunkowanym podejściem do badań multiomicznych, które nadal zachowuje integralność przestrzenną tkanki. Dzięki naszej technice możemy rozszerzyć multiomikę o lipidy, glikany i peptydy, a następnie połączyć je z funkcjonalnymi technikami obrazowania, takimi jak ultradźwięki.

Dzięki tym technikom naukowcy mogą teraz połączyć obrazowanie funkcjonalne z technikami obrazowania molekularnego. W naszym laboratorium skupiamy się na dwóch głównych obszarach chorób sercowo-naczyniowych, a jednym z nich jest analiza przebudowy serca za pomocą zawałów serca lub leczenia raka, a więc kardiotoksyczności. Naszym drugim dużym celem sercowo-naczyniowym jest przyjrzenie się starzeniu się i temu, jak starzenie się wpływa na układ naczyniowy.

Aby wykonać czterowymiarowe badanie ultrasonograficzne serca, umieść mysz w pozycji leżącej na płytce obrazowej. Następnie umieść przetwornik w uchwycie w pozycji półzablokowanej. Dopasuj wypukłą kropkę na przetworniku do niebieskiej kropki na ekranie, ustawiając ją w kierunku prawej strony myszy.

Obróć przetwornik, aby wyrównać go wzdłuż płaszczyzny strzałkowej myszy z podniesionym wycięciem skierowanym doogonowo. Nałóż dużą ilość żelu ultradźwiękowego na brzuszną powierzchnię klatki piersiowej w celu sprzężenia akustycznego z przetwornikiem. Opuść przetwornik, aż zetknie się z żelem ultradźwiękowym.

Dokonaj precyzyjnych regulacji za pomocą pokręteł XY u podstawy płytki w celu precyzyjnego dostrojenia. Następnie upewnij się, że widok długoosiowy wokół mostka na ekranie obejmuje wierzchołek, drogę odpływu lewej komory i aortę, ustawione poziomo w celu dokładnego obrazowania. Wybierz opcję Nazwij obraz w dolnym rogu ekranu, aby zapisać obraz w bieżącej serii.

Obróć przetwornik o 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby uzyskać peristernalny view w krótkiej osi. Upewnij się, że lewa komora jest wyraźnie zaznaczona na obrazie, a mięśnie brodawkowate są widoczne. Wybierz ikonę sześcianu w lewym górnym rogu ekranu, aby skonfigurować czterowymiarowy obraz.

Po zresetowaniu przetwornika ustaw pozycję początkową na tuż poniżej wierzchołka, a pozycję końcową na łuk aorty. Ustaw rozmiar kroku na 0,08 do 0,13 milimetra, a liczbę klatek na sekundę na 200 do 300 herców. Upewnij się, że parametry życiowe i sygnał EKG pozostają stabilne przed rozpoczęciem skanowania.

Po zakończeniu skanowania i przetwarzania włącz opcję Zapisz dane EKV/4D i bramkowanie oddychania, aby uzyskać przetwarzanie końcowe. Wybierz Obraz nazwy w prawym dolnym rogu i dołącz identyfikator myszy do nazwy. Aby zobrazować każdą płaszczyznę widoku w cyklu pracy serca, wybierz opcję Więcej elementów sterujących, a następnie wybierz opcję Załaduj do czterowymiarowego.

Przejrzyj każdy widok płaski serca, potwierdzając, że środek serca pozostaje stabilny przez cały cykl pracy serca. Na początek przygotuj łódeczki z folii aluminiowej do błyskawicznego zamrażania tkanek myszy. Za pomocą kleszczy nałóż skórę myszy poddanej eutanazji i przetnij skórę namiotu nożyczkami nad szyją w przypadku dostępu naczyniowego lub tuż pod mostkiem w przypadku dostępu do serca.

Kontynuuj przecinanie warstw skóry i mięśni, aby odsłonić naczynia krwionośne. W celu usunięcia serca przetnij kość, aby odsłonić serce. Za pomocą rozwarstwienia za pomocą wacików odizoluj serce lub naczynia krwionośne od otaczających tkanek, w tym tłuszczu.

Ostrożnie oddziel naczynie szyjne od nerwu. Następnie usuń serce lub naczynia krwionośne za pomocą narzędzi chirurgicznych. Umieść naczynie szyjne, serce i naczynia krwionośne na wstępnie oznakowanej łodzi z folii aluminiowej.

Następnie umieść łodzie w ciekłym azocie w celu błyskawicznego zamrożenia. Na początek napełnij zlewkę wodą HPLC i odłóż ją na bok wraz z pięcio- i jednomililitrowymi strzykawkami. Następnie ustaw temperaturę kriostatu na minus 25 stopni Celsjusza i włóż ostrze.

Umieść parę kleszczyków w komorze kriostatu, aby ostygły przed zamontowaniem chusteczki. Pobrać pięć mililitrów wody HPLC do strzykawki i umieścić ją w kriostacie, aby częściowo zamrozić wodę. Zanim woda w strzykawce całkowicie zamarznie, należy ją nalać na metalowy uchwyt i pozostawić do całkowitego zamrożenia.

Teraz napełnij jednomililitrową strzykawkę wodą HPLC i umieść ją w kriostacie. Po 30 do 60 sekundach umieść niewielką kroplę częściowo zestalonej wody na środku uchwytu. Za pomocą kleszczy szybko umieść wyekstrahowane serce myszy w kropli wody i trzymaj je tam, aż otaczająca woda całkowicie zamarznie.

Aby rozpocząć, wyjmij szkiełko z zamontowanym sercem myszy z zamrażarki i umieść je w eksykatorze do wyschnięcia. Włącz urządzenie HTX M3+Sprayer (Urządzenie natryskiwacze HTX M3+). Otwórz aplikację HTX na laptopie i w Metodzie ustaw temperaturę dyszy na 75 stopni Celsjusza, natężenie przepływu na 100 mikrolitrów na minutę, a ciśnienie na 10 psi.

Zapisz nazwę próbki, polarność, matrycę, rozpuszczalnik i stężenie w notatniku laboratoryjnym. Następnie oblicz ilość matrycy wymaganą dla pożądanego stężenia. Następnie zważyć żądaną ilość kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego dla matrycy w trybie dodatnim.

Rozpuść matrycę w 70% metanolu w 15-mililitrowej probówce. Sonikować roztwór matrycy przez 10 minut. Podczas sonikacji należy wyjąć szkiełko z eksykatora.

Otwórz tacę opryskiwacza. Następnie umieść suwak w lewym dolnym rogu i przyklej krawędzie. Wybierz obszar rozpylania próbki i zamknij tacę.

Za pomocą strzykawki i filtra pobrać roztwór matrycy do strzykawki. Przefiltrować roztwór matrycy przez strzykawkę do fiolki z czarną pokrywką umieszczoną po lewej stronie rozpylacza. Umieścić fiolkę z powrotem w wyznaczonym miejscu na opryskiwaczu i bezpiecznie włożyć rurkę przewodu D do fiolki.

Następnie włącz gaz obojętny i upewnij się, że wskaźnik na opryskiwaczu wskazuje 10 psi. Naciśnij Start, a gdy opryskiwacz osiągnie ustawioną temperaturę, wybierz przycisk Start, aby rozpocząć opryskiwanie. Po zakończeniu natryskiwania wyjmij próbkę z opryskiwacza i umieść ją w uchwycie szkiełkowym MALDI.

Zeskanuj uchwyt na szkiełko MALDI i szkiełko za pomocą skanera. Zapisz obraz na dysku flash do wykorzystania w obrazowaniu metodą spektrometrii mas. Wybierz opcję Mycie w opryskiwaczu i przesuń linię D z fiolki z matrycą do zlewki na odpady.

Na koniec rozpyl metanol na tackę opryskiwacza i wytrzyj ją do czysta. Wyłącz azot. Obrazowanie metodą spektrometrii mas MALDI tkanki mięśnia sercowego po zawale zidentyfikowało masę jonów cząsteczkowych do ładowania 577,52, prawdopodobnie odpowiadającą COHb w C lub D, co sugeruje udział w przebudowie mięśnia sercowego.

Czterowymiarowy obraz ultrasonograficzny pokazał obszary mięśnia sercowego o powierzchni mniejszej niż 20% naprężenia, uwidocznione jako zielono-żółta tkanka, wskazująca na strefy zawału. W widoku długoosiowym tkanki zawału mięśnia sercowego widoczna była delokalizacja lipidów, co komplikowało korelację między biomechaniką tkanki a składem molekularnym.