Name: Indukowanie wnikania w trzecim stadium dyspersyjnych młodych osobników Bursaphelenchus xylophilus do kryptobiozy poprzez regulację osmotyczną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Poznaj metodę indukcji kryptobiozy u młodych osobników Bursaphelenchus xylophilus poprzez regulację osmotyczną chlorkiem potasu. Protokół umożliwia badanie mechanizmów przetrwania nicieni w ekstremalnych warunkach niskich temperatur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały sfinansowane przez Centralną Instytucję Naukową Pożytku Publicznego Basal Research Fund of State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (numer grantu CAFYBB2020ZY001-2), projekty badawcze przedsiębiorstw (202404016-4320) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC 32271896).

1. Pobieranie JIII B. xylophilus
<ol>
	<li>Pozyskiwanie zainfekowanych krążków P. massoniana 
	UWAGA: Wszystkie procedury były zgodne z Administracyjnymi Środkami dla Obszarów Epidemii Choroby Więdnięcia Sosny i Zainfekowanego Drewna oraz innymi obowiązującymi przepisami. Jako miejsce poboru próbek wybrano las P. massoniana zainfekowany B. xylophilus w powiecie Xiangshan, mieście Ningbo, prowincji Zhejiang. Drzewa P. massoniana, które obumarły z powodu choroby więdnięcia sosny, zostały ścięte w obrębie miejsca poboru próbek.
	<ol>
		<li>Pobierz okrągłe kłody (grubości 5 cm) z górnej, środkowej i dolnej sekcji głównego pnia ściętych drzew.</li>
		<li>Pokrój zebrane okrągłe kłody P. massoniana na plastry o grubości 0,5-1 cm, a następnie przytnij je do małych pasków o długości 2-3 cm.</li>
		<li>Umieść małe paski drewna w szczelnych woreczkach i przechowuj je w laboratorium do dalszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus
	<ol>
		<li>Przymocuj gumową rurkę do wąskiego końca szklanego lejka z długą szyjką o przybliżonej średnicy 15 cm. Zabezpiecz gumową rurkę zaciskiem. Umieść zmontowany lejek na statywie do lejków.</li>
		<li>Zawiń małe paski drewna całkowicie w pojedynczą warstwę papieru chłonnego, a następnie umieść je w lejku. Dolewaj do lejka wodę destylowaną, aż wszystkie paski drewna zostaną zanurzone. 
		​UWAGA: Po pozostawieniu na 12-24 h nicienie wywędrowały z pasków drewna i osiadły na dnie lejka10. Papier chłonny zapobiegał osadzaniu się resztek drewna, umożliwiając jednocześnie przejście nicieni.</li>
		<li>Powoli zwolnij zacisk na dnie lejka i pozwól, aby 2000-5000 µL mieszaniny wypłynąć do szalki Petriego (średnica 5 cm) w celu badania mikroskopowego i identyfikacji morfologicznej.</li>
		<li>Zidentyfikuj <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus, obserwując takie cechy jak stylesy, środkowe bulwy przełyku, kropelki lipidowe oraz „palczaste” kształty ogona11.</li>
		<li>Pod mikroskopem przenieś pojedyncze osobniki <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus na szkiełko, odsysając za każdym razem 10 µL cieczy wraz z jednym nicieniem za pomocą pipety o pojemności 10 µL. Powtórz ten proces 30 razy, aby zebrać około 300 µL mieszaniny zawierającej nicienie.</li>
		<li>Po ekstrakcji <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus, wysterylizuj pozostałe paski drewna i zainfekowane materiały drzewne, aby zapobiec dalszemu zanieczyszczeniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kontrola procesu regulacji osmotycznej
<ol>
	<li>Przygotowanie mieszaniny do regulacji osmotycznej
	<ol>
		<li>Przygotować 8% roztwór wodny KCl.</li>
		<li>Za pomocą pipety dodać 10 µL 8% roztworu wodnego KCl na szkiełko zawierające mieszaninę <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus, otrzymując około 310 µL mieszaniny nematod i roztworu KCl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Regulacja zwiększonego ciśnienia osmotycznego i dehydratacja <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus​
	<ol>
		<li>Umieścić szkiełko na stole mikroskopu, pozwalając na naturalne odparowanie wody. Doprowadzi to do stopniowego zwiększenia ciśnienia osmotycznego środowiska zewnętrznego, powodując dehydratację nematod w czasie około 30-60 min. 
		UWAGA: Operator musi jedynie czekać na naturalne odparowanie wody aż do wytrącenia kryształów KCl i obserwować stan nematod pod mikroskopem. Naturalne odparowanie 310 µL mieszaniny do momentu wytrącenia kryształów KCl trwa około 30-60 min.</li>
		<li>Obserwować pod mikroskopem proces dehydratacji (np. zwijanie się ciała, agregację itp.) <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus. Gdy woda całkowicie odparuje, a kryształy KCl się wytrącą, <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus przestaje się poruszać i wchodzi w stan kryptobiozy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opracowanie stresu niskotemperaturowego kryptobiotycznych <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus
	<ol>
		<li>Umieścić kryptobiotyczne <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus w środowisku o stałej temperaturze -20 °C przez 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Regulacja zmniejszonego ciśnienia osmotycznego i rehydratacja <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety dodać około 300 µL wody destylowanej wokół osobników młodzieżnych, które zostały poddane działaniu niskiej temperatury. Proces rehydratacji, trwający około 30-60 min, stopniowo obniża ciśnienie osmotyczne ich środowiska zewnętrznego.</li>
		<li>Obserwować pod mikroskopem proces rehydratacji <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus (np. prostowanie ciała, powrót do ruchu itp.). Obliczyć przeżywalność po 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Cryptobiosis of Bursaphelenchus xylophilus Juveniles

<ol><li>Li, Y., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+on+the+trend+of+invasion+and+expansion+of+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Forest+Pest+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Analysis on the trend of invasion and expansion of Bursaphelenchus xylophilus.</a> Forest Pest and Disease. 37 (5), 1-4 (2018).</li>
<li>Futai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Annu Rev Phytopathol. 51 (51), ?61(2013).</li>
<li>Crowe, J. H., Cooper, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptobiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Am%22%5BJournal%5D)">Cryptobiosis.</a> Sci Am. 225, 30-36 (1971).</li>
<li>Wharton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anhydrobiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Anhydrobiosis.</a> Curr Biol. 25, 1107-1125 (2015).</li>
<li>Browne, J., Tunnacliffe, A., Burnell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anhydrobiosis%3A+plant+desiccation+gene+found+in+a+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Anhydrobiosis: plant desiccation gene found in a nematode.</a> Nature. 416 (6876), 38(2002).</li>
<li>Shatilovich, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+nematodes+from+late+Pleistocene+permafrost+of+the+Kolyma+river+lowland%5BTitle%5D)+AND+%22Dokl+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Viable nematodes from late Pleistocene permafrost of the Kolyma river lowland.</a> Dokl Biol Sci. 480 (1), 100-102 (2018).</li>
<li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+regulation+of+seamless+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Osmotic regulation of seamless tube growth.</a> Nat Cell Biol. 15 (2), 137-139 (2013).</li>
<li>Erkut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+renders+the+dauer+larva+of+Caenorhabditis+elegans+resistant+to+extreme+desiccation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Trehalose renders the dauer larva of Caenorhabditis elegans resistant to extreme desiccation.</a> Curr Biol. 21 (1), 1331-1336 (2012).</li>
<li>Pan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-stage+dispersal+juveniles+of+Bursaphelenchus+xylophilus+can+resist+low-temperature+stress+by+entering+cryptobiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Third-stage dispersal juveniles of Bursaphelenchus xylophilus can resist low-temperature stress by entering cryptobiosis.</a> Biology. 10 (8), 785(2021).</li>
<li>Mao, X. F., Li, H. X., Chen, X. Y., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+efficiency+of+soil+nematodes+by+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+J+Ecol%22%5BJournal%5D)">Extraction efficiency of soil nematodes by different methods.</a> Chinese J Ecol. 23 (3), 149-151 (2004).</li>
<li>Pan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+pine+wood+nematode+in+Pinus+koraiensis+in+Fengcheng%2C+Liaoning+province%5BTitle%5D)+AND+%22Forest+Pest+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of pine wood nematode in Pinus koraiensis in Fengcheng, Liaoning province.</a> Forest Pest and Disease. 38 (1), 4(2019).</li>
<li>Pan, L., Cui, R., Li, Y., Feng, Y., Zhang, X. Investigation of pinewood nematodes in Pinus tabuliformis Carr. under low-temperature conditions in Fushun, China. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPan%2C+L+%22Forests%22">Forests</a>. 11 (9), 993(2020).</li>
<li>Madin, K. A. C., Crowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anhydrobiosis+in+nematodes%3A+Carbohydrate+and+lipid+metabolism+during+dehydration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Anhydrobiosis in nematodes: Carbohydrate and lipid metabolism during dehydration.</a> J Exp Zool. 3, 193(2010).</li>
<li>Wharton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anhydrobiosis%3A+The+model+worm+as+a+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Anhydrobiosis: The model worm as a model.</a> Curr Biol. 21 (15), 578-579 (2011).</li>
<li>Li, Y., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+risk+of+invasion+and+expansion+of+pine+wood+nematode+in+the+middle+temperate+zone+of+China%5BTitle%5D)+AND+%22J+Temperate+Res%22%5BJournal%5D)">High risk of invasion and expansion of pine wood nematode in the middle temperate zone of China.</a> J Temperate Res. 1 (1), 4(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym badaniu <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus pobrano z martwych okazów P. massoniana w Ningbo, w prowincji Zhejiang. Należy zaznaczyć, że <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus wyselekcjonowano z populacji mieszanej o różnych stadiach rozwojowych. W szczególności wybrano okrągłe kłody o wysokiej gęstości występowania B. xylophilus, a następnie przeprowadzono przesiew <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus. Zimą, gdy dobowa temperatura minimalna w prowincji Liaoning wynosi około -20 °C, z martwych okazów Pinus tabuliformis można pozyskać dużą liczbę osobników <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus o jednolitym stadium rozwojowym, co uprościło proces selekcji w niniejszym eksperymencie12.
Podczas procesu kryptobiozy powolne tempo odwodnienia nicieni sprzyja ich przeżyciu i zapobiega uszkodzeniom strukturalnym ich białek13. Czas odwodnienia ma krytyczne znaczenie dla określenia przeżywalności <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus. W niniejszym badaniu zastosowano roztwór KCl o początkowym stężeniu 8%, którego stężenie zwiększano stopniowo poprzez naturalne odparowywanie wody, co pozwoliło <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus na powolne odwodnienie i wejście w stan kryptobiozy. Jeśli woda odparowuje zbyt szybko lub jeśli nicienie zostaną umieszczone bezpośrednio w roztworze KCl o wysokim stężeniu, ich przeżywalność znacząco spada.
Metoda opisana w niniejszym badaniu wykazuje szereg zalet. Materiały eksperymentalne są łatwo dostępne, ponieważ do regulacji odwodnienia i rehydratacji <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus wymagany jest jedynie roztwór KCl i woda destylowana. Procedury są proste: odwodnienie zachodziło poprzez naturalne odparowanie, a rehydratację osiągnięto poprzez dodanie wody destylowanej. Cały proces może zostać zakończony w ciągu 2 h. Metoda ta charakteryzuje się wysokim wskaźnikiem sukcesu i przeżywalnością, przy czym większość osobników <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus wchodzi w kryptobiozę po odwodnieniu, a większość z nich ożywa po rehydratacji11.
Proponowana metoda jest możliwa do zastosowania w celu regulacji stanu kryptobiozy zarówno w przypadku <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus, jak i w przypadku młodzieży rozproszonej w czwartym stadium (<img alt="równowaga statyczna, ΣFx=0, schemat, wektory sił równoważących, fizyka edukacyjna, analiza sił" src="/files/ftp_upload/67350/67350eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 3">)14. Może ona jednak nie być skuteczna w odniesieniu do propagatywnych form B. xylophilus.
W ostatnich latach choroba więdnięcia sosny wywoływana przez B. xylophilus rozprzestrzeniła się z południowych Chin na obszary północne. <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne.

" src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus, który zasiedla sosny w tych chłodniejszych regionach północnych, wykazuje tendencję do większej mrozoodporności15. Proponowana metoda pozwala na indukcję kryptobiozy u <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne.

" src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus, zwiększając ich odporność na zimno i suszę. Wspólnie metoda ta może zapewnić wsparcie techniczne w badaniu mechanizmów odporności na stres B. xylophilus oraz mechanizmu transmisji choroby więdnięcia sosny.

Choroba więdnięcia sosen jest jedną z najpoważniejszych chorób lasów w Chinach1. Nematod sosnowy Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) stanowi istotne zagrożenie dla gatunków sosen, takich jak Pinus massoniana (P. massoniana), ponieważ rozmnaża się wewnątrz gospodarza, co prowadzi do szybkiego więdnięcia i obumarcia drzewa. W niekorzystnych warunkach środowiskowych po śmierci gospodarza, młodzieńce reprodukcyjne B. xylophilus mogą przejść w stadium młodzieńczych form pre-dauer (<img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">). Młodzieńce te poszukują owadów-wektorów, aby kontynuować migrację i rozprzestrzenianie się, co powoduje rozległe zamieranie lasów sosnowych2.
Kryptobioza to stan, w którym organizmy tracą niemal całą wodę wewnętrzną i wchodzą w stan anhydrobiozy pod wpływem ekstremalnego stresu środowiskowego3. W tym procesie organizmy stopniowo ulegają odwodnieniu, co skutkuje zatrzymaniem ruchu, ograniczeniem metabolizmu i zawieszeniem cyklu życiowego4. W odpowiednich warunkach mogą one odzyskać sprawność po rehydratacji. Kryptobioza pozwala organizmom przetrwać w ekstremalnych środowiskach, takich jak niskie temperatury, i wydłużyć ich czas życia5. W antarktycznej zmarzlinie znaleziono nicienie, które przetrwały w stanie kryptobiozy przez 30 000 lat6.
Poprzednie badania wykazały, że nicienie mogą adaptować się do różnych stresorów abiotycznych – takich jak niska temperatura, susza i wysokie ciśnienie osmotyczne – podczas dehydratacji poprzez regulację przepuszczalności swojej powierzchni7. Ponadto nicienie potrafią zwijać ciało, aby zmniejszyć powierzchnię i zminimalizować tempo utraty wody. Na przykład Caenorhabditis elegans reguluje równowagę osmotyczną, pozwalając jonom i małym cząsteczkom na swobodny transport przez kutykulę, podczas gdy większe cząsteczki nie mogą przenikać8. <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus również wykazuje zdolność do kryptobiozy. Podczas etapów dehydratacji i rehydratacji w kryptobiozie regulacja osmotyczna jest niezbędna do kontrolowania wymiany substancji przez kutykulę, co czyni ją kluczową dla wejścia w stan kryptobiozy lub wybudzenia się z niego9.
Niniejsza praca przedstawia metodę indukowania kryptobiozy u <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne.

" src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus poprzez regulację osmotyczną. Metoda ta jest prosta, wydajna i wysoce niezawodna, zapewniając wsparcie techniczne dla badań nad mechanizmami odporności na stres u <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne.

" src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus.

<table><tbody><tr><td>Zjeżdżalnia szklana</td><td>Tereny biologiczne</td><td>GS7101-7525</td><td>75 mm i razy; 25 mm i razy; 1 mm</td></tr><tr><td>Szklany lejek z długą szyjką</td><td>Eksperymentalna technologia Nanjing Kangluoda</td><td>N/A</td><td>150 mm</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Phenix</td><td>XSP-35-1600X</td><td>PH100-2B41L-IPL</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Eksperymentalna technologia Nanjing Kangluoda</td><td>&nbsp; TB-624935792745</td><td>50 mm i razy; 50 mm</td></tr><tr><td>Szczypta Kurka</td><td>Eksperymentalna technologia Nanjing Kangluoda</td><td>&nbsp; TB-624973311743</td><td>36 mm i razy; 11 mm&nbsp; &czasy; 55 mm</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>3123000012</td><td>10&ndash; 100 &mikro; L</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCL)</td><td>Solarbio Nauki przyrodnicze</td><td>Zobacz materiał P9921</td><td>500 gramów</td></tr><tr><td>Gumowa rurka</td><td>Eksperymentalna technologia Nanjing Kangluoda</td><td>TB-624923457094</td><td>7 mm i czasy; 5 mm</td></tr><tr><td>Sterylizator</td><td>BinJiang&nbsp;</td><td>https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm= a2615.7691456.co_0_0_wangpu _score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0</td><td>75L</td></tr><tr><td>Bibuła&nbsp;</td><td>Nadruk od serca do serca</td><td>Klasa M3</td><td>22,5 cm i razy; 21,5 cm</td></tr></tbody></table>

indukowanie wnikania w trzecim stadium dyspersyjnych młodych osobników bursaphelenchus xylophilus do kryptobiozy poprzez regulację osmotyczną

Inducing the Entry of Third Stage Dispersal Juveniles of Bursaphelenchus xylophilus into Cryptobiosis Through Osmotic Regulation

Kryptobioza to stan, w którym organizmy tracą niemal całą wodę wewnętrzną i przechodzą w anhydrobiozę pod wpływem ekstremalnego stresu środowiskowego. Rozprzestrzeniające się młodociane stadium trzecie (młodociane pre-dauer, <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">) Bursaphelenchus xylophilus mogą wejść w stan kryptobiozy poprzez odwodnienie i odżywić się po rehydratacji, gdy warunki środowiskowe ulegną poprawie. Regulacja osmotyczna ma kluczowe znaczenie dla ich przetrwania w tym procesie. W niniejszej studyjnej analizie okazy <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus zostały pobrane z martwych drzew Pinus massoniana dotkniętych chorobą więdnięcia sosny w Ningbo, prowincja Zhejiang, Chiny. Po zanurzeniu w 8% roztworze chlorku potasu (KCl), <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus weszły w stan kryptobiozy w wyniku stopniowego odwodnienia spowodowanego zwiększonym zewnętrznym ciśnieniem osmotycznym w wyniku naturalnego parowania wody. <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus potrafi przetrwać stres niskotemperaturowy w -20 °C. <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus mogą odżyć po rehydratacji, przy stopniu przeżywalności wynoszącym 92,1%. Proces ten może regulować przejście <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus w stan kryptobiozy, umożliwiając im odporność na ekstremalne warunki środowiskowe. Opisana w naszej pracy metoda jest prosta i niezawodna, stanowiąc wsparcie techniczne dla badań nad mechanizmami odporności na stres B. xylophilus.

W 8% roztworze KCl, w miarę odparowywania wody, <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne.

" src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus początkowo wykazywał wyraźne „zwijanie się”, pozostając jednocześnie ruchliwym (Rysunek 1A). Po całkowitym odparowaniu wody nematody przestały się poruszać i zwinięły się, wykazując zapadnięte powierzchnie oraz nagromadzone krople lipidów (Rysunek 1B), co wskazywało na wejście w stan kryptobiozy. Po dodaniu wody destylowanej do otoczenia, nematody nawodniły się i ożyły (Rysunek 1C). Po odparowaniu wody pojawią się kryształy KCl (Rysunek 1D). Rysunek 1E przedstawia cechy morfologiczne <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne.

" src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus.
Eksperyment z odwodnienia wykazał, że w początkowym 8% roztworze KCl parowanie wody spowodowało utratę wody przez <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus. Po odwodnieniu <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus poddano stresowi niskiej temperatury w -20 °C przez 24 h; średni wskaźnik przeżywalności wyniósł 92,1%11. W porównaniu ze wskaźnikiem przeżywalności wynoszącym 0% w grupie kontrolnej, która nie weszła w stan kryptobiozy, powyższe dane sugerują, że odwodnienie może znacząco zwiększyć przeżywalność <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus w warunkach niskiej temperatury.
Podczas fazy rehydratacji po kryptobiozie <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus zaobserwowano, że 100% nicieni wykazywało obecność „pęcherzyków” in vivo podczas przenoszenia z 40% roztworu KCl do wody destylowanej (Rycina 2).
<img alt="Obraz mikroskopowy formacji kryształów; rysunki A-E pokazują różne struktury w różnych skalach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67350/67350fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Proces odwodnienia-kryptobiozy-rehydratacji <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus. Obraz ten ilustruje proces kryptobiozy u <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus, w tym (A) etap odwodnienia, (B) etap kryptobiozy, (C) etap rehydratacji, (D) etap krystalizacji KCL oraz (E) <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67350/67350fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy nitki spirogiry, podkreślający układ chloroplastów w strukturze komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67350/67350fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Akumulacja granulek tłuszczu w niepobudzonych <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus. Obraz przedstawia stan <img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, MA=0, schemat analizy strukturalnej, siły mechaniczne." src="/files/ftp_upload/67350/67350eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> B. xylophilus po rehydratacji, charakteryzujący się obecnością bąbelkowych granulek tłuszczu in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67350/67350fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Niniejszy protokół opisuje metodę indukowania dyspersji młodocianych osobników trzeciego stadium (młodocianych osobników sprzed dauer, JIII.) Bursaphelenchus xylophilus do kryptobiozy poprzez osmotyczną regulację jonów chlorku potasu (KCl). Metoda ta może stanowić wsparcie techniczne dla badań nad mechanizmami odporności B . xylophilus na stres.

Indukowanie wnikania w trzecim stadium dyspersyjnych młodych osobników Bursaphelenchus xylophilus do kryptobiozy poprzez regulację osmotyczną

Cryptobiosis is a state where organisms lose nearly all their internal water and enter anhydrobiosis under extreme environmental stress. The dispersal ...

Nasze badania koncentrują się przede wszystkim na mechanizmach podatności na zimno młodocianych osobników sosnowego etapu dyspersji, a w szczególności na tym, jak nicienie sosnówki wytrzymują stres niskotemperaturowy przy około minus 20. Obecnym wyzwaniem eksperymentalnym jest czas odwodnienia, który ma kluczowe znaczenie dla określenia wskaźnika przeżywalności młodocianych osobników Bursaphelenchus xylophilus w trzecim stadium. Radzimy, że im dłuższy czas, tym lepsze naciski.Ustaliliśmy, że wejście w trzecie stadium dyspersyjnych młodocianych Bursaphelenchus xylophilus do kryptobiozy umożliwia im wytrzymanie ekstremalnie niskich temperatur, podkreślając kluczowy mechanizm przetrwania w trudnych warunkach. Nasz protokół wypełnia lukę badawczą poprzez indukowanie kryptobiozy u nicieni sosnowych i skuteczne ożywienie ich pod względem architektonicznym. Umożliwia kontrolowane badania mechanizmów ich przetrwania i dodatkowe zastosowania.Nasz protokół jest prosty i niezawodny i zapewnia bardzo solidne wsparcie techniczne w zakresie odporności na stres mechanizmów odporności nicieni sosnowych, dzięki czemu jest bardziej dostępny i wydajny w porównaniu z innymi technikami. Zacznij od pokrojenia zebranych okrągłych kłód Pinus massoniana na plastry o grubości od 0,5 do jednego centymetra za pomocą piły. Przytnij plastry w małe paski o długości od dwóch do trzech centymetrów.Umieść małe drewniane paski w szczelnie zamkniętych torebkach i przechowuj je w laboratorium do dalszego wykorzystania. Przymocuj gumową rurkę do wąskiego końca szklanego lejka z długą szyjką o przybliżonej średnicy 15 centymetrów. Zabezpiecz gumową rurkę zaciskiem i umieść zmontowany lejek na stojaku na lejek.Całkowicie owiń małe drewniane paski w jedną warstwę bibuły. Umieść owinięte drewniane paski w lejku i dodaj wodę destylowaną, aż wszystkie drewniane paski zostaną zanurzone, a następnie powoli zwolnij szczypiec na dnie lejka i pozwól, aby od 2000 do 5 000 mikrolitrów mieszaniny wyciekło na szalkę Petriego o średnicy pięciu centymetrów w celu przeprowadzenia badań mikroskopowych i identyfikacji morfologicznej. Obserwuj mieszaninę, aby zidentyfikować J3 Bursaphelenchus xylophilus, zwracając uwagę na takie cechy, jak stylety, środkowe opuszki przełyku, kropelki lipidów i kształty ogona przypominające palce.Za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów odessać za każdym razem 10 mikrolitrów płynu wraz z jednym nicieniem, aby przenieść pojedyncze J3 Bursaphelenchus xylophilus na szkiełko. Na koniec wysterylizuj pozostałe paski drewna i zainfekowane materiały drewniane po ekstrakcji J3 Bursaphelenchus xylophilus, aby zapobiec dalszemu zanieczyszczeniu. Na początek wyekstrahuj próbki J3 Bursaphelenchus xylophilus z Pinus massoniana, a następnie przygotuj 8% wodny roztwór chlorku potasu do regulacji osmotycznej.Za pomocą pipety dodać 10 mikrolitrów 8% wodnego roztworu chlorku potasu do szkiełka zawierającego mieszaninę J3 Bursaphelenchus xylophilus. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i pozwól, aby woda naturalnie odparowała. Obserwuj proces odwadniania J3 Bursaphelenchus xylophilus pod mikroskopem.Monitoruj objawy, takie jak zwijanie się ciała i agregacja. Kiedy woda całkowicie odparuje i wytrącą się kryształy chlorku potasu, obserwuj, jak nicienie zatrzymują ruch i wchodzą w kryptobiozę. Umieść kryptobiotyczny J3 Bursaphelenchus xylophilus w środowisku o stałej temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 24 godziny.Po 24 godzinach za pomocą pipety dodaj około 300 mikrolitrów wody destylowanej wokół młodych osobników, które zostały poddane obróbce w niskiej temperaturze. Obserwuj proces nawadniania J3 Bursaphelenchus xylophilus pod mikroskopem. Monitoruj objawy, takie jak rozciąganie ciała i wznowienie ruchu.

inducing-entry-third-stage-dispersal-juveniles-bursaphelenchus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy film wyjaśnia mechanizmy odporności rośliny żywicielskiej na roślinożerność oraz demonstruje test bez wyboru (no-choice test), który pozwala oszacować względny wkład antybiozy i tolerancji w odporność gatunków Brachiaria na spittlebugi.

Charakterystyka mechanizmów odporności na roślinożerców: przykład pluskwiaków piankowych na gatunkach Brachiaria

Organizm modelowy C. elegans wykorzystuje płyn pseudocelomiczny jako pasywny układ krążenia. Bezpośrednia analiza tego płynu nie była wcześniej możliwa. Przedstawiamy tutaj nową technikę bezpośredniego badania przestrzeni zewnątrzkomórkowej, wykorzystując systemowe sygnały wyciszania podczas odpowiedzi RNAi jako przykład potwierdzający zasadność tej metody.

Wampiryczna izolacja płynu zewnątrzkomórkowego z Caenorhabditis elegans

W tym filmie pokazujemy metodę wytwarzania rozwojowo zsynchronizowanej populacji bezpłodnych dorosłych C. elegans. Przykładowy protokół synchronizuje robaki w celu zbadania wskaźników zużycia tlenu u żywych zwierząt.

Synchronizacja nicieni: metoda uzyskiwania populacji robaków w identycznych stadiach rozwoju

Przedstawiono protokół badania zachowań godowych nicienia sosnowego, Bursaphelenchus xylophilus. Cechy behawioralne B. xylophilus są opisane w procesie krycia.

Obserwacja i kwantyfikacja zachowań godowych nicieni sosnówki, Bursaphelenchus xylophilus

Komary Aedes aegypti zakażone Wolbachią są uwalniane do naturalnych populacji w celu zahamowania transmisji arbowirusów. Opisujemy metody hodowli Ae. aegypti z infekcjami Wolbachia w laboratorium do eksperymentów i uwolnienia w terenie, podejmując środki ostrożności w celu zminimalizowania adaptacji i selekcji laboratoryjnej.

Utrzymywanie komarów Aedes aegypti zakażonych Wolbachia

Narażenie na toksyczne czynniki środowiskowe może poważnie wpłynąć na rozwój z długoterminowymi skutkami. Przedstawiono szczegółowe protokoły ilustrujące strategię wykorzystującą skuteczny model laboratoryjny do badania wpływu wczesnej ekspozycji embrionalnej na bisfenol A. Zapewniamy testy płodności i behawioralne w celu monitorowania skuteczności naszych testów biologicznych narażenia na toksyny.

Długoterminowe behawioralne i reprodukcyjne konsekwencje narażenia zarodków na toksyczne substancje w niskich dawkach

Tutaj prezentujemy protokół do badania preferencji przepoczwarzania dojrzałych larw Ectropis grisescens w odpowiedzi na czynniki glebowe (np. rodzaj podłoża i wilgotność) za pomocą wybranych testów biologicznych. Przedstawiamy również protokół testów biologicznych bez wyboru w celu określenia czynników wpływających na zachowania przepoczwarzające i przeżywalność E. grisescens.

Testy biologiczne typu "choice" i "no-choice" w celu zbadania preferencji przepoczwarzenia i powodzenia w pojawianiu się Ectropis grisescens

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji aktywnego ekstraktu jądrowego z larwalnego stadium 4 C. elegans i wizualizacji aktywności transkrypcyjnej w systemie in vitro.

Izolacja aktywnego ekstraktu jądrowego Caenorhabditis elegans i rekonstytucja do transkrypcji in vitro

Nicienie entomopatogeniczne żyją w symbiozie z bakteriami i razem skutecznie infekują owady, osłabiając ich wrodzony układ odpornościowy. W celu wspierania badań nad genetycznymi podstawami zakażenia nicieniami opisano metody utrzymywania i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogenicznymi.

Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Ten artykuł przedstawia laboratoryjne utrzymanie (w tym krycie i karmienie) muchówki niższej Bradysia (Sciara) coprophila.

Utrzymanie laboratoryjne muchówki dolnej Bradysia (Sciara) coprophila: nowy/stary wyłaniający się organizm modelowy

Przedstawiamy dwie metody masowego rozmnażania nicieni entomopatogenicznych jako bioinsektycydów dla rolników. Pierwsza metoda wykorzystuje żel poliakrylamidu jako podłoże do hodowli nicieni, podczas gdy druga metoda wykorzystuje bawełnę polimerową jako podłoże do hodowli. Obie metody opierają się na in vivo rozmnażaniu nicieni wewnątrz padlin owadów.

Uprawa oparta na hodowli in vivo nicieni entomopatogenicznych

Poznaj metodę indukcji kryptobiozy u młodych osobników Bursaphelenchus xylophilus poprzez regulację osmotyczną chlorkiem potasu. Protokół umożliwia badanie mechanizmów przetrwania nicieni w ekstremalnych warunkach niskich temperatur.

Indukowanie wnikania w trzecim stadium dyspersyjnych młodych osobników Bursaphelenchus xylophilus do kryptobiozy poprzez regulację osmotyczną (Wideo) | JoVE Journal

Indukowanie wnikania w trzecim stadium dyspersyjnych młodych osobników Bursaphelenchus xylophilus do kryptobiozy poprzez regulację osmotyczną

Przeglądaj więcej filmów