Name: Analiza ekspresji tkankowych w ludzkich płytkach krwi przepływową za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj metodę pomiaru płytek z dodatnim czynnikiem tkankowym za pomocą cytometrii przepływowej pełnej krwi. Protokół umożliwia standaryzację badań nad krzepnięciem i biologią płytek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te zostały wsparte grantem włoskiego Ministerstwa Zdrowia (Ricerca Corrente 2023 dla M.C.).

Protokół został zatwierdzony przez Komitet Etyczny Instytucji (nr 70/24, CE 18.06.24), a wszyscy dawcy krwi uzyskali pisemną świadomą zgodę. Protokół przeprowadzi użytkownika przez siedem głównych kroków (Rysunek 1). Pierwszy krok dotyczy procedury pobierania próbek krwi. Kroki 2 i 3 określają protokół miareczkowania przeciwciał oraz przygotowanie próbki do analizy intrakomórkowej ekspresji TF przy użyciu monoklonalnego przeciwciała (mAb) znakowanego przez fitoerytrynę (PE) αCD142/HTF1. Krok 4 opisuje protokół oceny białka eksponowanego na powierzchni płytek krwi przy użyciu metody pośredniego barwienia αCD142/HTF1 mAb. Ze względu na steryczną utrudnienie fluorochromu, mAb znakowany PE używany do barwienia wewnątrzkomórkowego nie wiąże się z domeną katalityczną białka wystawionego na powierzchnię. Dlatego proponuje się protokół pośredniego barwienia za pomocą wtórnego mAb znakowanego przez Alexa Fluor 633. Kroki 5 i 6 szczegółowo opisują fazy analizy cytometrii przepływowej. Ostatni etap określa procedurę przygotowania osocza bogatopłytkowego (PRP), aby uniknąć utraty dużej subpopulacji płytek krwi. Szczegóły dotyczące odczynników i używanego sprzętu znajdują się w Tabeli Materiałów.
1. Odstawienie krwi
UWAGA: Pobieranie krwi z ludzi powinno być przeprowadzane wyłącznie po uzyskaniu zgody Komisji Etycznej.
<ol>
	<li>Pobieranie próbek krwi przez obwodowe pobieranie żył lub igiełkowych z ramienia niedotkniętego infuzjami żylnymi obwodowymi, najlepiej z żyły przedkubitalnej.<ol>
		<li>Do pobrania żylnych obwodowych pobierania żylnych należy założyć opaski uciskową, a po wprowadzeniu igły motylkowej G19 do żyły usunąć ją, aby zapobiec aktywacji płytek krwi (Rysunek 2). UWAGA: Nie używaj igły motylkowej mniejszej niż G21, aby uniknąć aktywacji płytek.</li>
		<li>W przypadku pobierania żylnych z użyciem kaniuli igłowej nie zakładaj opaski uciskowej w żadnym momencie podczas pobierania. W razie potrzeby przed podaniem próbki przemyj ją roztworem soli fizjologicznej 0,9%. Zawsze wyrzucaj pierwsze 5 ml krwi przed napełnianiem probówek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobierz 2 mL krwi do wakutainera EDTA (do pomiaru liczby komórek). Delikatnie wymieszaj tubkę trzy razy, aby zapewnić pełne połączenie krwi i antykoagulantu.</li>
	<li>Pobrać krew do wakutainera z cytrynianem sodu o stężeniu 0,129 M w celu analizy ekspresji TF powiązanej z płytkami krwi. Ostrożnie napełnij wakutainer do wskazanego poziomu, aby utrzymać prawidłowy stosunek krwi do antykoagulantów. Delikatnie odwróć rurki pięć razy, aby zapewnić dokładne wymieszanie krwi z antykoagulantem, zapobiegając powstawaniu skrzepów i hemolizie próbek. UWAGA: Zaleca się stosowanie antykoagulantu 0,129 M cytrynianu w celu optymalizacji wykrywania TF powiązanych z płytkami krwi za pomocą klona HTF1 αCD142 mAb. Jeśli konieczne jest wyizolowanie płytek krwi pełnej – należy pobrać drugi wakutainer o stężeniu 0,129 M cytrynianu sodu do przygotowania osocza bogatopłytkowego (PRP).</li>
	<li>Trzymaj wakuaanty pionowo w tubce. Nie potrząsaj nimi na obracanych ani przechylających się płytach i unikaj pneumatycznych systemów transportowych. Nie trzymaj próbek krwi w lodówce, aby zapobiec aktywacji płytek. UWAGA: Próbki krwi powinny być najlepiej przetwarzane w ciągu 15 minut po wycofaniu, jeśli ma być zmierzony kolejny marker aktywacji płytek krwi związany z granulami wraz z TF. W przeciwnym razie próbki powinny być przetwarzane nie później niż 3 godziny od pobrania (Rysunek 3).</li>
</ol>
2. Dawkowanie przeciwciał przeciwtlenowych (do oceny wewnątrzkomórkowej TF)
UWAGA: Określanie wewnątrzkomórkowo przechowywanych TF przeprowadza się za pomocą mAb PE-αCD142/HTF1.
<ol>
	<li>Miareczkowanie przeciwciał za pomocą kulek UWAGA: Użycie kulek pozwala zdefiniować właściwą ilość przeciwciał (czyli stężenie przeciwciał powodujące największe rozdzielenie pików fluorescencyjnych między próbkami dodatnimi a ujemnymi). Analiza ta przeprowadza się na dwóch próbkach: jednej naprawdę pozytywnej, drugiej naprawdę negatywnej. Stężenie przeciwciał nie jest podawane przez producenta (patrz Tabela materiałów), dlatego miareczkowanie przeciwciał przeprowadza się przy użyciu pięciu punktów rozcieńczenia.<ol>
		<li>Wiruj przeciwciało w dawce 17 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Aby przygotować pięć punktów rozcieńczenia przeciwciał, pipetować 40 μL przeciwciał do probówki 1 oraz 20 μL PBS do probówek 2 do 5. Wykonaj cztery kolejne rozcieńczenia seryjne 1:2, przenosząc 20 μL z rurki 1 do rurki 2 i dalej.</li>
		<li>Przygotuj jedną probówkę na każdą objętość przeciwciał do testu. Dodaj jedną kroplę ujemnych koralików i jedną kroplę pozytywnych do każdej probówki. Natychmiast dodaj 20 μL każdego rozcieńczenia przeciwciał do probówki i wiru. Inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
		<li>Dodaj 1 ml 1x PBS bez Ca++ i Mg++, pH 7,4, do każdej probówki i wiru.</li>
		<li>Pobierz próbki na cytometrze przepływowym zgodnie z instrukcjami producenta i zapisz plik danych z 10 000 zdarzeń w bramce "kulki". Optymalne stężenie przeciwciał to takie, które zapewnia największą separację między dodatnimi a ujemnymi szczytami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Titracja przeciwciał na płytkach krwi UWAGA: Z zasady optymalne stężenie przeciwciał zidentyfikowane za pomocą kulek powinno być weryfikowane na komórkach do barwienia – w tym przypadku na płytkach krwi pełnej krwi.<ol>
		<li>Fiksacja<ol>
			<li>Delikatnie odwróć wakutainer z cytrynianem sodu pięć razy, aby dokładnie wymieszać krew i antykrzep. Przelej 50 μL krwi do probówki o pojemności 1,5 mL, dodaj 950 μL 1% paradehydu (PFA), delikatnie wymieszaj i inkubuj próbkę przez 90 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Wiruj próbkę w 1 500 x g przez 5 minut, z hamulcem, w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet, delikatnie pipetując 1 mL 1x PBS bez Ca++ i Mg++, pH 7,4.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Permeabilizacja<ol>
			<li>Przygotuj jedną probówkę dla każdego objętości przeciwciał do badania (zmierz objętość zidentyfikowaną przy miareczce kulek wraz z wyższym i mniejszym rozcieńczeniem, np. 10 μL, 5 μL, 2,5 μL jeśli zidentyfikowana objętość wynosi 5 μL) oraz jedną probówkę do kontroli Fluorescence Minus One (FMO).</li>
			<li>Do każdej probówki należy podać 100 μL stałej krwi i wirować je w 1 500 x g przez 5 minut, z hamulcem, w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Usuń supernatant, ponownie zawiesij pellet w 100 μL 0,1% Triton-PBS, aby przepuścić próbki, i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Barwienie<ol>
			<li>Wiruj przeciwciało w stężeniu 17 000 x g przez 5 minut w 4 °C. Dodaj wymagane objętości przeciwciał do każdej probówki zgodnie z ustaleniami w 2.2.2.1 i wymieszaj.</li>
			<li>Inkubuj próbki przez 15 minut w ciemności i w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Dodaj 300 μL 1x PBS bez Ca++ i Mg++, pH 7,4, do każdej probówki i wymieszaj. Pobierz próbki na cytometrze przepływowym (patrz krok 5).</li>
			<li>Oblicz indeks plamy według następującego wzoru15:                        <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67356/67356eq01.jpg" style="margin: auto;" /> gdzie MFIpos to średnia intensywność fluorescencji zdarzeń pozytywnych, MFIneg to intensywność zdarzeń ujemnych, a SD to odchylenie standardowe populacji ujemnej.</li>
			<li>Wybierz najniższe stężenie przeciwciał, które zapewnia najwyższy wskaźnik barwienia. UWAGA: W obecnych warunkach eksperymentalnych najwyższy wskaźnik barwienia dla mAb PE-αCD142/HTF1 osiąga się przy użyciu 5 μL przeciwciała.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki do analizy ekspresji TF wewnątrzkomórkowej cytometrią przepływową
<ol>
	<li>Fiksacja i permeabilizacja całej krwi<ol>
		<li>W przypadku analizy TF wewnątrzkomórkowej należy utrwalić i przepuszczać krew pełną zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura barwienia UWAGA: W następującym protokole populacja płytek krwi jest identyfikowana za pomocą barwienia αCD61-PerCP. Inne wskaźniki populacji mogą być używane według uznania operatora.<ol>
		<li>Przygotuj jedną probówkę do kontroli fluorescence minus One (FMO) i jedną do barwienia TF. Do każdej rurki należy dodać 100 μL stałej i permeabilizowanej krwi pełnej wraz z przeciwciałami wymienionymi w Tabeli 1.</li>
		<li>Inkubuj próbki przez 15 minut w ciemności i w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj 300 μL 1x PBS bez Ca++ i Mg++, pH 7,4, do każdej probówki i wymieszaj. Przechowuj zabarwione próbki w ciemności do czasu analizy cytometrii przepływowej (patrz krok 5). UWAGA: Aby obliczyć macierz kompensacji, przygotuj próbki zgodnie z Tabelą 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbek do analizy ekspresji TF związanej z powierzchnią komórek w płytkach spoczynkowych i aktywowanych
UWAGA: Do wykrywania tlenu tlenowego związanego z powierzchnią komórek należy stosować nieoznakowane αCD142/HTF1 mAb (1 mg/mL) oraz Alexa Fluor 633 kozi antymyszy IgG (2 mg/ml) jako przeciwciało wtórne do wykrywania sygnałów. Adenozyna 5'-difosforan (ADP) jest stosowany jako agonista płytek krwi do indukowania ekspozycji na TF na powierzchni komórki. Przeciwciało oznakowane PE jest używane jako wskaźnik populacji płytek krwi, aby zminimalizować przelewanie, co jest kontrolowane przez kompensację sygnału.
<ol>
	<li>Barwienie TF<ol>
		<li>Rozcieńcz αCD142/HTF1 mAb 1:100 w 1x PBS bez Ca++ i Mg++, pH 7,4, aby uzyskać stężenie robocze 10 μg/mL. Rozcieńcz Alexa Fluor 633 koziego przeciwmysiego IgG 1:10 w 1x PBS bez Ca++ i Mg++, pH 7,4, aby uzyskać stężenie robocze 200 μg/mL.</li>
		<li>Przygotuj trzy probówki i podaj 1x PBS bez Ca++ i Mg++, pH 7,4, zgodnie z Tabelą 3.</li>
		<li>Podawaj 7,5 μL rozcieńczonego αCD142/HTF1 mAb i dodaj 5 μL ADP (200 μM), aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM ADP. Delikatnie odwróć wakutainer cytrynianowy 5 razy, aby dokładnie wymieszać krew i antykrzep, a następnie podaj 5 μL pełnej krwi do każdej probówki. Delikatnie mieszaj próbki.</li>
		<li>Inkubuj próbki przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalanie próbki<ol>
		<li>Każdą próbkę utrwalaj, dodając 300 μL 1% paradehydu (PFA) i inkubuj próbki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. UWAGA: Oznaczone próbki zafiksowane 1% PFA i przechowywane w temperaturze 4 °C pozostają stabilne do 4 dni.</li>
		<li>Dodaj 300 μL 1x PBS bez Ca++ i Mg++, pH 7,4, do każdej probówki i wiruj w 1500 x g przez 5 minut z hamulcem w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet w 95 μL 1x PBS bez Ca++ i Mg++, pH 7,4, delikatnie pipetując.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie przeciwciałem wtórnym<ol>
		<li>Podaj 5 μL rozcieńczonego Alexa Fluor 633 IgG i inkubuj próbki przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj 300 μL 1x PBS bez Ca++ i Mg++, pH 7,4, do każdej probówki i wiruj w 1500 x g przez 5 minut z hamulcem w temperaturze pokojowej. Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet w 95 μL 1x PBS bez Ca++ i Mg++, pH 7,4.</li>
		<li>Do każdej probówki należy podać 5 μL αCD41-PE (patrz Tabela 4). Inkubuj próbki przez 15 minut w ciemności i w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj 300 μL 1x PBS bez Ca++ i Mg++, pH 7,4, do każdej probówki i wymieszaj.</li>
		<li>Przechowuj zabarwione próbki w ciemności do analizy cytometrii przepływowej (patrz krok 6). UWAGA: Aby obliczyć macierz kompensacji, przygotuj próbki zgodnie z krokami 4.1-4.3 oraz zgodnie z Tabelą 5 i Tabelą 6.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza ekspresji TF wewnątrzkomórkowej cytometrią przepływową
UWAGA: Poniższa procedura dotyczy akwizycji na cytometrze przepływowym referencyjnym; dlatego zgłoszone miejsca i wykresy powinny być uznane za reprezentatywne. Protokół ten można zastosować do każdego cytometru przepływowego nowej generacji o wysokiej czułości. Włącz cytometr przepływowy na długo przed pobraniem próbki, aby zapewnić stabilność lasera. Dokładnie umyj komorę fluidyczną i przepływową, ponieważ płytki są małe, a wszelkie zanieczyszczenia komórkowe mogą zakłócać wizualizację populacji płytek w wykresie punktowym obszaru rozpraszania przedniego/bocznego (FSC-A/SSC-A). Wykonaj kontrolę jakości przy użyciu kulek QC zgodnie z instrukcjami producenta i ponownie umyj fluidyki, aby usunąć pozostałości kulek.
<ol>
	<li>Konfiguracja przejęcia<ol>
		<li>Stwórz wykres punktowy FSC-A/SSC-A na skali logarytmicznej wyświetlający Wszystkie zdarzenia (Rysunek 4A). Stwórz wykres kropkowy CD61-A/SSC-A na skali logarytmicznej wyświetlający Wszystkie zdarzenia (rysunek 4B).</li>
		<li>Dostosowuj wzmocnienie PE (Y-585) i PerCP (B690) zgodnie z codzienną kontrolą jakości. Ustaw próg około 2000 dla SSC-H i do 1000 dla PerCP (B690-H), aby zobrazować populację płytek. Ustaw przepływ na NISKI.</li>
		<li>Narysuj obszar między 103 a 105 o nazwie "CD61+", aby zidentyfikować populację płytek.</li>
		<li>Zdobądź pojedyncze metody kontroli barw, aby obliczyć macierz kompensacyjne, a następnie pobierz próbki. Zapisz plik danych z 10 000 zdarzeń w bramce "CD61+" (rysunek 4D,E). Zacznij nagrywać 5-10 sekund po rozpoczęciu pobierania próbki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza cytometrii przepływowej ekspresji TF na powierzchni
<ol>
	<li>Wykonaj wykres kropkowy FSC-A/SSC-A na skali logarytmicznej z Wszystkimi Zdarzeniami (Rysunek 5A) oraz wykres kropkowy CD41-A/SSSC-A na skali logarytmicznej z Wszystkimi Zdarzeniami (Rysunek 5B).</li>
	<li>Dostosuj wzmocnienie Alexa Fluor 633 i wzrost PE (Y-585) zgodnie z codzienną kontrolą jakości, ustaw próg około 1000 na SSC-H i na 2500 na PE (Y585-H), aby zwizualizować populację płytek krwi, jak pokazano na Rysunku 5B. Ustaw przepływ na NISKI.</li>
	<li>Narysuj obszar między 104 a 105 o nazwie "CD41+", aby zidentyfikować populację płytek.</li>
	<li>Zdobądź pojedyncze metody kontroli barw, aby obliczyć macierz kompensacyjne, a następnie pobierz próbki. Zapisz plik danych z 10 000 zdarzeń w bramce "CD41+" (rysunek 5D,E). Zacznij nagrywać 5-10 sekund po rozpoczęciu pobierania próbki.</li>
</ol>
7. Analiza płytek krwi TF-dodatnich w plazmie bogatej w płytki
<ol>
	<li>Przygotowanie osocza bogatopłytkowego (PRP) UWAGA: Izolacja płytek musi być przeprowadzona w temperaturze pokojowej, aby zapobiec aktywacji komórek. Upewnij się, że temperatura odczynników i instrumentów wynosi od 18 °C do 22 °C. Unikaj szybkiego pipetowania i intensywnego potrząsania przez cały proces.<ol>
		<li>Delikatnie wymieszaj wakutainer o stężeniu 0,129 M sodu 5 razy i zmierz liczbę płytek dwukrotnie na liczniku krwinek, aby obliczyć procent odzyskanych płytek krwi. UWAGA: Użyj średniej wartości obu określeń jako stężenia płytek krwi.</li>
		<li>Wiruj wakutainer o stężeniu 0,129 M sodu w dawce 100 x g przez 10 minut, bez hamulca, w temperaturze pokojowej (Rysunek 6). Zbierz uzyskany PRP, przelej go do probówki polipropylenowej o pojemności 10 mL i zapisz zebraną objętość. UWAGA: Nie używaj rurek polistyrenowych, aby zapobiec aktywacji płytek.</li>
		<li>Policz płytki krwi dwukrotnie w PRP za pomocą licznika krwi i obliczaj procent regeneracji płytek krwi w następujący sposób: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67356/67356eq02.jpg" style="margin: auto;" /> UWAGA: Jeśli wyzdrowienie jest niższe niż 65%, populacja płytek krwi nie jest w pełni reprezentatywna dla tej w krwi pełnej krwi. Rozważ wyrzucenie przygotowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki do analizy cytometrii przepływowej ekspresji TF wewnątrzkomórkowej i powierzchniowej w PRP<ol>
		<li>Aby analizować intrakomórkową i powierzchniową ekspresję TF w PRP, należy stosować ten sam protokół, co opisany w analizie pełnej krwi (patrz kroki 3-6).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Assessing Intracellular and Surface TF-Positive Platelets via Flow Cytometry

<ol><li>Camera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+activation+induces+cell-surface+immunoreactive+tissue+factor+expression%2C+which+is+modulated+differently+by+antiplatelet+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelet activation induces cell-surface immunoreactive tissue factor expression, which is modulated differently by antiplatelet drugs.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (9), 1690-1696 (2003).</li>
<li>Brambilla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+methodological+differences+account+for+the+current+controversy+on+tissue+factor+expression+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Do methodological differences account for the current controversy on tissue factor expression in platelets.</a> Platelets. 29 (4), 406-414 (2018).</li>
<li>Zillmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-associated+tissue+factor+contributes+to+the+collagen-triggered+activation+of+blood+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Platelet-associated tissue factor contributes to the collagen-triggered activation of blood coagulation.</a> Biochem Biophys Res Commun. 281 (2), 603-609 (2001).</li>
<li>Camera, M., Brambilla, M., Toschi, V., Tremoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+expression+on+platelets+is+a+dynamic+event%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tissue factor expression on platelets is a dynamic event.</a> Blood. 116 (23), 5076-5077 (2010).</li>
<li>Panes, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelets+synthesize+and+express+functional+tissue+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human platelets synthesize and express functional tissue factor.</a> Blood. 109 (12), 5242-5250 (2007).</li>
<li>Camera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response%3A+functionally+active+platelets+do+express+tissue+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Response: functionally active platelets do express tissue factor.</a> Blood. 119 (18), 4339-4341 (2012).</li>
<li>Brambilla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+in+patients+with+acute+coronary+syndromes%3A+Expression+in+platelets%2C+leukocytes%2C+and+platelet-leukocyte+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue factor in patients with acute coronary syndromes: Expression in platelets, leukocytes, and platelet-leukocyte aggregates.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (5), 947-953 (2008).</li>
<li>Canzano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+and+endothelial+activation+as+potential+mechanisms+behind+the+thrombotic+complications+of+COVID-19+patients%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Basic+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Platelet and endothelial activation as potential mechanisms behind the thrombotic complications of COVID-19 patients.</a> JACC Basic Transl Sci. 6 (3), 202-218 (2021).</li>
<li>Trabattoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migraine+in+patients+undergoing+PFO+closure%3A+Characterization+of+a+platelet-associated+pathophysiological+mechanism%3A+The+LEARNER+study%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Basic+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Migraine in patients undergoing PFO closure: Characterization of a platelet-associated pathophysiological mechanism: The LEARNER study.</a> JACC Basic Transl Sci. 7 (6), 525-540 (2022).</li>
<li>Falanga, A., Schieppati, F., Russo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+tissue+procoagulant+mechanisms+and+the+hypercoagulable+state+of+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Cancer tissue procoagulant mechanisms and the hypercoagulable state of patients with cancer.</a> Semin Thromb Hemost. 41 (7), 756-764 (2015).</li>
<li>Tsantes, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis-induced+coagulopathy%3A+An+update+on+pathophysiology%2C+biomarkers%2C+and+current+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Life+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Sepsis-induced coagulopathy: An update on pathophysiology, biomarkers, and current guidelines.</a> Life (Basel). 13 (2), 350(2023).</li>
<li>Osterud, B., Olsen, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelets+do+not+express+tissue+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Human platelets do not express tissue factor.</a> Thromb Res. 132 (1), 112-115 (2013).</li>
<li>Bouchard, B. A., Krudysz-Amblo, J., Butenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+tissue+factor+is+not+expressed+transiently+after+platelet+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelet tissue factor is not expressed transiently after platelet activation.</a> Blood. 119 (18), 4338-4339 (2012).</li>
<li>Basavaraj, M. G., Olsen, J. O., Osterud, B., Hansen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ability+of+tissue+factor+antibody+clones+on+detection+of+tissue+factor+in+blood+cells+and+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Differential ability of tissue factor antibody clones on detection of tissue factor in blood cells and microparticles.</a> Thromb Res. 130 (3), 538-546 (2012).</li>
<li>Maecker, H. T., Frey, T., Nomura, L. E., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+fluorochrome+conjugates+for+maximum+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity.</a> Cytometry A. 62 (2), 169-173 (2004).</li>
<li>Butenas, S., Bouchard, B. A., Brummel-Ziedins, K. E., Parhami-Seren, B., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+activity+in+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tissue factor activity in whole blood.</a> Blood. 105 (7), 2764-2770 (2005).</li>
<li>Camera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+and+atherosclerosis%3A+Not+only+vessel+wall-derived+TF%2C+but+also+platelet-associated+TF%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue factor and atherosclerosis: Not only vessel wall-derived TF, but also platelet-associated TF.</a> Thromb Res. 129 (3), 279-284 (2012).</li>
<li>Siddiqui, F. A., Desai, H., Amirkhosravi, A., Amaya, M., Francis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+and+release+of+tissue+factor+from+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">The presence and release of tissue factor from human platelets.</a> Platelets. 13 (4), 247-253 (2002).</li>
<li>Munnix, I. C., Cosemans, J. M., Auger, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+response+heterogeneity+in+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Platelet response heterogeneity in thrombus formation.</a> Thromb Haemost. 102 (6), 1149-1156 (2009).</li>
<li>Heemskerk, J. W., Mattheij, N. J., Cosemans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-based+coagulation%3A+Different+populations%2C+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Platelet-based coagulation: Different populations, different functions.</a> J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).</li>
<li>Brambilla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+megakaryocytes+confer+tissue+factor+to+a+subset+of+shed+platelets+to+stimulate+thrombin+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Human megakaryocytes confer tissue factor to a subset of shed platelets to stimulate thrombin generation.</a> Thromb Haemost. 114 (3), 579-592 (2015).</li>
<li>Vignoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+expression+on+platelet+surface+during+preparation+and+storage+of+platelet+concentrates%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Med+Hemother%22%5BJournal%5D)">Tissue factor expression on platelet surface during preparation and storage of platelet concentrates.</a> Transfus Med Hemother. 40 (2), 126-132 (2013).</li>
<li>Rao, L. V., Kothari, H., Pendurthi, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+encryption+and+decryption%3A+facts+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue factor encryption and decryption: facts and controversies.</a> Thromb Res. 129 (Suppl 2), S13-S17 (2012).</li>
<li>Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-labeled+antibodies%3A+Balancing+functionality+and+degree+of+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling.</a> Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).</li>
<li>Brambilla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+platelet+tissue+factor+expression%3A+Regulation+by+P2Y%2812%29+and+Link+to+residual+platelet+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell surface platelet tissue factor expression: Regulation by P2Y(12) and Link to residual platelet reactivity.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 43 (10), 2042-2057 (2023).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowe protokoły oceny płytek krwi TF-dodatnich za pomocą cytometrii przepływu krwi, uwzględniając analizę białka wyrażanego zarówno wewnątrz, jak i na powierzchni płytek.
W ciągu ostatnich 20 lat obecność TF w ludzkich płytkach krwi została dobrze udokumentowana 1,2,3,4,5,17,18. Podzbiór płytek, stanowiący 20%-30% całkowitej populacji płytekkrwi 2, ekspresjonuje to białko, wzmacniając koncepcję heterogeniczności płytek, która staje się coraz bardziej istotna w tej dziedzinie. Warto wspomnieć, że płytki TF-dodatnie mają wysoką średnią objętość płytek, co wcześniej wykazała wysoce czuła cytometria przepływowa2. Kluczowe jest uwzględnienie tej cechy, zwłaszcza gdy ekspresję TF musi być analizowana w płytkach krwi wyizolowanych od innych składników krwi. Możliwe jest, że etap wirowania stosowany do izolacji płytek krwi może skutkować utratą dużych płytekkrwi 2. Ten problem przedanalityczny jest prawdopodobnie jednym z głównych powodów kontrowersji – która trwała do kilku lat temu – dotyczącej obecności TF w płytkachkrwi 7,12,13. Cytometria pełnego przepływu krwi jest w tym zakresie niezwykle użytecznym podejściem, umożliwiającym analizę wszystkich podzbiorów płytek krwi bez konieczności ich izolowania.
Drugim powodem, który skłonił do dyskusji na temat obecności TF w płytkach krwi, był wybór antyludzkiego przeciwciała TF użytego do analizy. Istnieje wiele komercyjnie dostępnych przeciwciał, które zostały wykorzystane do oceny TF związanej z płytkami krwi i które rozpoznają różne epitopy białka. Niektóre przeciwciała, takie jak klony TF9-10H10 3,21,22 oraz VIC7 1,3, wiążą się z niefunkcjonalnym obszarem TF bez wpływu na wiązanie FVII/FVIIa. Inne przeciwciała, w tym klony VD8 1,2,3 oraz HTF118 – ten ostatni używany w obecnych protokołach – rozpoznają miejsce katalityczne białka, konkurując z FVII/FVIIa o wiązanie z TF, blokując tym samym jego funkcję prokoagulantną. Ważne jest, aby zauważyć, że w zależności od stanu glikozylacji domeny zewnątrzkomórkowej oraz od konformacji miejsca katalitycznego TF23, które może być modyfikowane w określonych warunkach (np. podczas aktywacji komórek lub choroby), niektóre z tych przeciwciał mogą różnicowanie rozpoznawać, za pomocą cytometrii przepływowej, powierzchniową ekspresję TF powiązaną z płytkami krwi. Ponadto warunki barwienia, czyli czy próbka do analizy jest świeża, stała i/lub permeabilizowana, mogą wpływać na konformację epitopu, a tym samym na wiązanie antygen-przeciwciało14.
Kolejnym czynnikiem zasługującym na uwagę jest wybór fluorochromu wiązanego z przeciwciałem. Ponieważ TF jest wyrażane tylko przez 20%-30% populacji płytek krwi, fluorochromy o niskiej emisji wraz z zastosowaniem cytometrów przepływowych o niskiej czułości mogą nie być odpowiednie do rozróżniania sygnałów o niskiej wartości dodatniej. Z tego powodu preferowane są przeciwciała oznaczane jasnymi fluorochromami, takimi jak PE lub APC. Warto jednak zauważyć, że duży rozmiar fluorochromu, takiego jak PE, może utrudniać wiązanie oznakowanego przeciwciała z białkiem24. Aby rozwiązać ten problem, w obecnym protokole barwienie powierzchniowe TF było wykonywane jako pośrednie oznakowanie niesprzężonym αCD142/HTF1 mAb, a następnie ujawniane za pomocą przeciwciała wtórnego. Hamownictwo PE-steryczne nie wpływa na wiązanie αCD142/HTF1 mAb z TF przechowywanymi wewnątrzkomórkowo, gdzie miejsce katalityczne jest bardziej dostępne dla wiązania przeciwciał. Jest jasne, że ocena powierzchniowej ekspresji TF związanej z płytkami krwi poprzez bezpośrednie oznakowanie, w porównaniu do pośredniego, byłoby lepsze – jeśli to możliwe – aby skrócić czas przetwarzania próbki. Takie podejście musi jednak uwzględniać kluczowe kwestie wspomniane powyżej oraz związane ze zdolnością wiązania kilku komercyjnie dostępnych przeciwciał do trombocytów TF, wynikającą z konformacji samego białka, warunków barwienia oraz sterycznej utrudnienia różnych stosowanych fluorochromów. Dlatego, aby uniknąć fałszywie negatywnych wyników, bezpośrednie oznakowanie powierzchniowo eksprimowanych trombocytów związanych z trombocytami wymaga obowiązkowego, starannego procesu optymalizacji. Te aspekty są przedmiotem trwającego badania mające na celu ocenę skuteczności bezpośredniego barwienia różnymi komercyjnie dostępnymi klonami przeciwciał oznaczanych fluorochromami w całości.
Kilka badań wykazało, że ekspresja TF jest podwyższona w różnych stanach patologicznych, charakteryzujących się wysokim ryzykiem zakrzepowym 8,9,10,11,17. Ostatnio przedstawiono dowody na to, że poziomy płytek krwi TF-dodatniej, dokładnie określane analizą cytometrii przepływowej, mogą identyfikować pacjentów sercowo-naczyniowych, którzy mimo optymalnej odpowiedzi na leczenie aspiryną i antagonistami P2Y12, utrzymują wysokie ryzyko zakrzepowe25. Rzeczywiście, TF związane z płytkami krwi jest funkcjonalnie aktywna i potencjalnie może wspierać generację trombin 1,3,4. W tym kontekście możliwość przeprowadzenia analizy cytometrii przepływowej na kilku mikrolitrach krwi jest istotną zaletą umożliwiającą rozszerzenie analizy TF związanej z płytkami krwi na środowisko kliniczne. W tym celu warto wspomnieć, że walidacja pomiaru TF związanego z naczyniami krwi za pomocą cytometrii przepływowej była celem międzynarodowego projektu, który niedawno koordynowaliśmy przy wsparciu Międzynarodowego Towarzystwa Hemostazy i Zakrzepicy, mający na celu dostarczenie metodologicznych wskazówek do oceny.
W przeciwieństwie do innych klasycznych markerów aktywacji płytek, takich jak P-selektyna i agregaty krwiotekowo-płytkowo-leukocytowe, które muszą być analizowane bezpośrednio po pobieraniu krwi, aby uniknąć artefaktów, ekspresja TF jest znacznie bardziej stabilna. W rzeczywistości próbka krwi może zostać przetworzona w ciągu kilku godzin po pobraniu krwi bez istotnej zmiany w ekspresji trombocytów TF; Ponadto możliwość poprawy próbki i jej późniejszego oznakowania/przetwarzania sprawia, że analiza ta jest odpowiednia dla wielu szpitali i laboratoriów. Warto zauważyć, że choć protokół opisany w tym manuskrypcie jest stosunkowo prosty do wykonania, technika cytometrii przepływowej nadal wymaga specjalistycznego szkolenia technicznego. Z tego powodu technologia zmierza w kierunku coraz prostszych cytometrów przeznaczonych do testów w miejscu opieki.
Podsumowując, proponowany protokół dostarcza metod poprawnej analizy TF powiązanej z płytkami krwi, podkreślając zalety techniki opartej na analizie cytometrii przepływowej w jej określaniu. Ponadto podkreśla zmienne przedanalityczne, które mogą wpływać na analizę tego białka, podkreślając środki zapobiegające ich unikaniu.

<a href="https://app.jove.com/t/6667">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/67356-v">10.3791/67356-v</a>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/67356">Flow Cytometry Analysis of Tissue Factor Expression in Human Platelets</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Flow Cytometry Analysis of Tissue Factor Expression in Human Platelets

Czynnik tkankowy (TF), glikoprotein transbłonowy i kluczowy aktywator kaskady krzepnięcia krwi, jest wyrażany przez podzbiór, ~20%-30%, krążących ludzkich płytekkrwi 1, szczególnie tych o większym rozmiarze2. Po aktywacji przez klasycznych agonistów płytek, takich jak adenozynodifosforan (ADP) i trombina, płytki krwi odsłaniają funkcjonalnie aktywne TF na swojej powierzchni w sposób zależny od stężenia, co pozwala im wiążyć czynnik VII/VIIa, co ostatecznie prowadzi do generacji trombiny 1,3,4,5,6. Warto zauważyć, że w stanach patologicznych, takich jak choroba wieńcowa (CAD)7, ciężki ostry zespół oddechowy-koronawirus-2 (SARS-CoV-2)8, migrena z aurą związaną z otworem jajowym (MHA-PFO)9, nowotwor10 oraz sepsa11, liczba płytek krwionośnych TF-dodatnich znacznie wzrasta, przyczyniając się do większego ryzyka zakrzepowowego obserwowanego w tych warunkach klinicznych.
Pomimo tych przekonujących dowodów, wykrywanie trombocytów TF-dodatnich pozostaje przedmiotem debat w środowisku naukowym 6,12,13. Wyzwania metodologiczne, w tym zmienne przedanalityczne, przygotowanie próbki oraz specyficzność przeciwciał, zostały zasugerowane jako możliwe przyczyny sprzecznych wyników przedstawionych w literaturze 2,4,12,14. Dlatego kluczowe jest ustanowienie standaryzowanego testu opartego na dobrze określonym protokole pomiaru TF w ludzkich płytkach krwi.
W tym kontekście cytometria przepływu pełnej krwi jest jedyną technologią umożliwiającą analizę płytek TF-dodatnich przy minimalnym obsłudze próbek, co jest kluczowe, aby uniknąć utraty tej podgrupy płytek.
W tym artykule proponujemy protokół pomiaru TF związanego z płytkami krwi za pomocą cytometrii przepływu całej krwi, oceniając białko (1) wewnątrzkomórkowo w warunkach spoczynku oraz (2) na powierzchni komórki zarówno w stanie spoczynku, jak i aktywacji. Instrukcje są również podawane, jeśli wymagana jest ocena płytek TF-dodatnich w osocze bogatym w płytki krwi (PRP).

<table><tbody><tr><td>Adenozyna 5'-difosforan (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2754</td><td>&nbsp; Agonista płytek krwi</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 koza &-mysz IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21052</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Biotube 10 mL</td><td>Biosigma</td><td>BSP048</td><td>Do pobierania PRP</td></tr><tr><td>Igła motylowa G19</td><td>Rozwiązanie PIC</td><td>02044019030010</td><td>Na odstawienie krwi</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CytExpert</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Analiza danych cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Cytoflex S</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Cytometr przepływowy</td></tr><tr><td>Lampy Eppendorfa 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>1,20,086</td><td>&nbsp; Fiksacja krwi</td></tr><tr><td>ImageStreamX Mk II</td><td>Cytek Biosciences</td><td></td><td>Cytometr przepływowy obrazujący</td></tr><tr><td>Kaluza Software</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Analiza danych cytometrii przepływowej&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd &nbsp;</td><td>Antibioticos &ndash; Divisione Carlo Erba Reagenti</td><td>387507</td><td>Naprawiać krew i płytki krwi</td></tr><tr><td>PerCP-&alpha; CD45</td><td>BD</td><td>345809</td><td>Marker populacji leukocytów</td></tr><tr><td>PerCP-&alpha; CD61</td><td>BD</td><td>347408</td><td>Marker poulacji płytek krwi</td></tr><tr><td>PE-&alpha; CD142</td><td>BD</td><td>550312</td><td>Przeciwciało przeciwko czynnikowi tkankowemu przeciwludzkiego</td></tr><tr><td>PE-&alpha; CD41</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07781</td><td>Marker poulacji płytek krwi</td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS) 1x bez wapnia i magnezu</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>Dla przeciwciał i rozcieńczenia próbki</td></tr><tr><td>Końcówki Pipeta 10 & mikro; L&nbsp; &nbsp;</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F161630</td><td>Aby przygotować próbki</td></tr><tr><td>Końcówki Pipet 1000 & micro; L</td><td>Gilson</td><td>F161670</td><td>Aby przygotować próbki</td></tr><tr><td>Końcówki Pipet 200 & micro; L</td><td>Gilson</td><td>F161930</td><td>Aby przygotować próbki</td></tr><tr><td>Rurka z okrągłym dnem 5 mL</td><td>Corning</td><td>352052</td><td>Do pozyskiwania cytometrem przepływowym</td></tr><tr><td>Chlorek sodu 0,9 %</td><td>BD</td><td>306575</td><td>Do mycia kaniuli igły po odbraniu krwi</td></tr><tr><td>Sysmex XN-450</td><td>Dasit</td><td></td><td>Analizator komórek krwi</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carlo Erba Reagenti</td><td>9002-93-1</td><td>Przepuszczanie błony krwinek</td></tr><tr><td>Rurki z cytrynianem wakutainerowym 0,129M</td><td>BD</td><td>363079</td><td>Do pobierania krwi</td></tr><tr><td>Lampy Vacutainer K2 EDTA</td><td>BD</td><td>368857</td><td>Do pobierania krwi</td></tr><tr><td>Adapter luer wielokrotnych próbek do wakuaana</td><td>BD</td><td>367300</td><td>&nbsp; Na odstawienie krwi</td></tr><tr><td>Uchwyt na jednorazowe użycie wakutainera</td><td>BD</td><td>364815</td><td>&nbsp; Na odstawienie krwi</td></tr><tr><td>Zestaw koralików Versacomp Antibody Capture</td><td>Beckman Coulter</td><td>B22804</td><td>Miareczkowanie przeciwciał</td></tr><tr><td>&alpha; CD142 (klon HTF-1)</td><td>Invitrogen</td><td>16-1429-82</td><td>Przeciwciało przeciwko czynnikowi tkankowemu przeciwludzkiego</td></tr></tbody></table>

analiza ekspresji tkankowych w ludzkich płytkach krwi przepływową za pomocą cytometrii przepływowej

Flow Cytometry Analysis of Tissue Factor Expression in Human Platelets

Podgrupa krążących ludzkich płytek komórkowo przechowuje czynnik tkankowy (TF), kluczowy aktywator kaskady krzepnięcia krwi i powstawania zakrzepów. Po aktywacji płytek krwi TF jest wystawiany na błonę komórkową, gdzie wiąże się z FVII, co ostatecznie prowadzi do powstawania trombiny. Biorąc pod uwagę, że (1) poziom płytek TS-dodatnich wzrasta w różnych warunkach klinicznych, co przyczynia się do fenotypu protrombowego pacjenta, oraz (2) różne leki mogą modulować ekspresję TF związaną z płytkami, cenna jest ustandaryzowana metoda oceny płytek TF-dodatnich, ponieważ jej ocena była w przeszłości kontrowersyjna. Przedstawiamy tutaj protokół pomiaru procentu płytek TF-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej w osoczu pełnym i bogatopłytkowym (PRP)/wypłukanych płytkach. Protokół ten ma na celu szczegółowe instrukcje dotyczące ilościowego określenia procentu trombocytów TF-dodatnich poprzez ocenę białka (1) wewnątrzkomórkowo w warunkach spoczynku oraz (2) na powierzchni komórki, zarówno w stanie spoczynku, jak i aktywacji. Pierwsza sekcja dostarcza niezbędnych informacji do prawidłowego przeprowadzenia pobierania krwi, aby upewnić się, że procedury przedanalityczne nie wpływają na wyniki. Następnie protokół koncentruje się na przygotowaniu próbki i procedurach znakowania do analizy cytometrii przepływowej. Szczegółowe kroki stymulacji komórek, oznaczania, utrwalania i permeabilizacji – tam, gdzie to konieczne – zostały przedstawione. Na koniec opisano instrukcje dotyczące ustawień cytometrii przepływowej, aby prawidłowo zidentyfikować populację płytek i analizować zdarzenia TF-dodatnie. Na koniec, metoda obejmuje procedurę przygotowania PRP, jeśli płytki krwi TF-dodatnie mają być mierzone w izolowanych płytkach. Ponieważ tylko część płytek zawiera TF, ważne jest, aby upewnić się, że nie zostaną one utracone podczas etapów wirowania niezbędnych do uzyskania PRP.

Podsumowanie analizy ekspresji TF związanej z płytkami krwi opisano na diagramie przepływu pokazanym na Rysunku 1. Kroki obejmują: (1) Pobranie krwi: Pobranie krwi z ludzkiej żyły obwodowej, najlepiej z żyły przedkubitalnej, za pomocą igły motylkowej G19 lub kaniuli igłowej bez opaski uciskowej oraz z wakuanerami zawierającymi antyzakrzepły. (2) Przetwarzanie próbek: Przetwarzanie próbek zgodnie z typem oceny TF, która ma być wykonana. (3) Oznaczanie próbek: Oznaczanie próbek konkretnymi przeciwciałami. (4) Analiza cytometrii przepływowej: Analiza próbek w celu wykrycia powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych TF.
Podczas pobierania krwi należy zwrócić szczególną uwagę na zapobieganie aktywacji płytek. W tym celu stosuje się dwie środki ostrożności: usunięcie opaski uciskowej krótko po włożeniu igły do żyły oraz odrzucenie krwi w pierwszym pobranym wakutainerze. Bez użycia opaski uciskowej populacja płytek, pokazana na wykresie kropkowym FSC-A/SSC-A, ma typowy kształt, jak pokazano na rysunku 2A. Natomiast przy użyciu opaski uciskowej właściwości fizyczne populacji płytek krwi powodują wydłużony kształt przypominający morfologię obserwowaną po stymulacji klasycznym agonistą płytek, takim jak ADP (Rysunek 2B,C).
Eksperymenty przeprowadzone w celu oceny stabilności ekspresji TF powiązanej z płytkami krwi w czasie wykazały, że była ona stabilna przez 3 godziny od pobrania krwi (Rysunek 3). Łącząc pomiar ekspresji TF z markerem aktywacji płytek, takim jak P-selektyna, zaleca się jak najszybsze przetworzenie próbki krwi, aby uniknąć degranulacji płytek.
Do analizy wewnątrzkomórkowo przechowywanych TF cała krew jest utrwalana w 1% PFA, permeabilizowana PBS-Triton, a następnie barwiona przeciwciałem znakowanym przez PE. Populacja płytek krwi została zidentyfikowana na wykresie logarytmicznym FSC-A/SSC-A (Rysunek 4 A,D) oraz za pomocą barwienia αCD61 mAb (Rysunek 4 B,E). Wyniki analizy intrakomórkowej TF u zdrowych osób (n = 377) wskazały, że TF występuje w 26,8% ± 4,8% krążących płytek krwi (Rysunek 4F).
Analiza cytometrii przepływowej ekspresji TF związanej z powierzchnią została przeprowadzona w warunkach spoczynku oraz po stymulacji komórek ADP 10 μM. Cała populacja płytek krwi, oznaczona αCD41 mAb, została zidentyfikowana na logarytmicznym wykresie FSC-A/SSC-A (Rysunek 5A,B). Wyniki wykazały, że u zdrowych osób (n = 377) TF wyraża się w 2,8% ± 1,4% spoczynkowych płytek krwi (rysunek 5D-F) i wzrasta do 24,5% ± 5,8% po aktywacji (rysunek 5G-I). TF wyraża się przez podzbiór płytek o największym rozmiarze (rysunek 5D, G, zielone kropki). Ponadto analiza za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wskazuje, że sygnał TF jest związany wyłącznie z dodatnimi zdarzeniami αCD61, a nie z dodatnimi αCD45 (Rysunek 7).
Jak wspomniano wcześniej, TF jest przechowywana w podzbiorze płytek krwi charakteryzujących się największym rozmiarem w całej populacji. Dlatego ważne jest, aby nie tracić tej frakcji płytek podczas przygotowania PRP. Zgodnie z wskazaniami zawartymi w sekcji metody (krok 7) możliwe jest wyizolowanie populacji płytek krwi w PRP, która jest reprezentatywna dla tej obecnej we krwi pełnej krwi. Jak pokazano na Rysunku 6, wykres punktowy cytometrii przepływowej populacji płytek uzyskany przez 100 x g wirowania pełnej krwi jest bardzo podobny do wykresu krwi pełnej pod względem rozkładu FSC (Rysunek 6 A,B). Dla porównania, przy użyciu większej siły i dłuższego czasu wirowania, jak często podawane w literaturze12, 14, 16, populacja odzyskanych płytek krwi ma niższy FSC w porównaniu do krwi pełnej (rysunek 6C), co sugeruje utratę płytek o większych rozmiarach, które są tymi wysoce TF-dodatnimi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67356/67356fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Schemat do analizy ekspresji TF powiązanej z płytkami krwiotoplowymi i izolacji płytek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67356/67356fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67356/67356fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Reprezentatywne wykresy gęstości populacji płytek krwi analizowane za pomocą cytometrii przepływu całej krwi. (A) Populacja płytek krwi analizowana w próbce krwi pobranej bez opaski uciskowej lub (B) z uciskiem uciskiem. (C) Populacja płytek krwi stymulowana ADP jest raportowana do porównania. WBC: Białe krwinki; RBC: Czerwone krwinki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67356/67356fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67356/67356fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Stabilność ekspresji TF związanej z powierzchnią komórek w czasie. Ekspresja krwi spoczynkowej związana z trombocytami krwi w spoczynku została przeanalizowana w 4 różnych punktach po pobraniu krwi zgłoszonej na osi x w następujący sposób: T0 = bezpośrednio po pobraniu krwi; T1 = 1 godzina po pobraniu krwi; T2 = 2 godziny po pobraniu krwi; T3 = 3 godziny po pobraniu krwi. Dane podawane są jako średnia ± SD, n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67356/67356fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67356/67356fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Reprezentatywna analiza cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowo przechowywanych TF. Populacja płytek krwi (czerwona) w krwi pełnej jest identyfikowana na wykresie punktowym FSC/SSC-A (A,D) oraz za pomocą barwienia αCD61 mAb (B,E). Ekspresja TF jest analizowana za pomocą mAb PE-αCD142/HTF1 (zielone kropki). Wykresy histogramowe służą do identyfikacji zdarzeń negatywnych (C) i dodatnich (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67356/67356fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67356/67356fig5v2.jpg" /> 
Rysunek 5: Reprezentatywna analiza cytometrii przepływowej płytki krwi TF-dodatniej związanych z powierzchnią. Świeża krew pełna jest oznaczana αCD142/HTF1 mAb, następnie utrwala się 1% PFA i oznaczała wtórnym mAb oraz αCD41 mAb. Populacja płytek krwi (czerwona) w krwi pełnej jest identyfikowana na wykresie punktowym FSC/SSC-A (A,D,G) oraz za pomocą barwienia αCD41 mAb (B,E,H). Ekspresja TF w stanie spoczynku (D-F) oraz po stymulacji ADP (G-I) jest ilościowo określana przez oznakowanie αCD142/HTF1 mAb (zielone kropki). Przedstawiane są reprezentatywne wykresy histogramowe dla próbek ujemnych (C) i dodatnich (F,I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67356/67356fig5v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67356/67356fig06v2.jpg" /> 
Rysunek 6: Wpływ różnych sił wirowania na przygotowanie PRP. (A-C) Analiza cytometrii przepływowej populacji płytek krwi pełnej w krwi pełnej PRP, przygotowana w dawce 100 x g i 350 x g. Zakres referencyjny populacji płytek krwi na FSC-H/SSC-H jest oznaczony przerywanymi liniami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67356/67356fig06largev2.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67356/67356fig07.jpg" /> 
Rysunek 7: Ocena ekspresji TF w płytkach krwi i leukocytach za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawiono reprezentatywne obrazy kanałowe jasnego pola (BF, szary), czynnika tkankowego (TF, zielony), αCD61 (czerwony), αCD45 (szary), barwienia jąder Hoechst (magenta) oraz obrazu kompozytowego (merge), uzyskanego przy 60-krotnym powiększeniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67356/67356fig07large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Identyfikacja probówki</td>
			<td>Naprawa/trwała krew pełna (μL)</td>
			<td>αCD142-PE (μL)</td>
			<td>αCD61-PerCP (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMO</td>
			<td>100</td>
			<td>-</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TF</td>
			<td>100</td>
			<td>5</td>
			<td>15</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Protokół barwienia do analizy ekspresji TF wewnątrzkomórkowej cytometrią przepływową.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Identyfikacja probówki</td>
			<td>Naprawa/trwała krew pełna (μL)</td>
			<td>αCD142-PE (μL)</td>
			<td>αCD61-PerCP (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nieskażone</td>
			<td>100</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>αCD142-PE</td>
			<td>95</td>
			<td>5</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>αCD61-PerCP</td>
			<td>85</td>
			<td>-</td>
			<td>15</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Pojedyncza kontrola barwienia dla matrycy kompensacji wewnątrzkomórkowej ekspresji TF.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Identyfikacja probówki</td>
			<td>PBS 1x (μL)</td>
			<td>αCD142 (μL)</td>
			<td>ADP (μL)</td>
			<td>Świeża krew pełna (μL)</td>
			<td>PFA 1% (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMO</td>
			<td>95</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>5</td>
			<td>300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odpoczynek</td>
			<td>87.5</td>
			<td>7.5</td>
			<td>-</td>
			<td>5</td>
			<td>300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP aktywowane</td>
			<td>82.5</td>
			<td>7.5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>300</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Protokół barwienia do analizy cytometrii przepływowej ekspresji TF na powierzchni.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Identyfikacja probówki</td>
			<td>PBS 1x (μL)</td>
			<td>Alexa Fluor 633 IgG (μL)</td>
			<td>αCD41-PE (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMO</td>
			<td>90</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odpoczynek</td>
			<td>90</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP aktywowane</td>
			<td>90</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Protokół barwienia przeciwciał wtórnych do analizy TF związanej z powierzchnią.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Identyfikacja probówki</td>
			<td>PBS 1x (μL)</td>
			<td>αCD142 (μL)</td>
			<td>ADP (μL)</td>
			<td>Świeża krew pełna (μL)</td>
			<td>PFA 1% (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nieskażone</td>
			<td>90</td>
			<td>-</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TF + Alexa Fluor 633 IgG</td>
			<td>82.5</td>
			<td>7.5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>αCD41-PE</td>
			<td>90</td>
			<td>-</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>300</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: Przygotowanie macierzy kompensacyjnej do analizy TF wewnątrzkomórkowej.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Identyfikacja probówki</td>
			<td>PBS 1x (μL)</td>
			<td>Alexa Fluor 633 IgG (μL)</td>
			<td>αCD41-PE (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nieskażone</td>
			<td>100</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TF + Alexa Fluor 633 IgG</td>
			<td>95</td>
			<td>5</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>αCD41-PE</td>
			<td>95</td>
			<td>-</td>
			<td>5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 6: Przygotowanie macierzy kompensacyjnej do analizy TF związanej z powierzchnią.

Niniejszy artykuł przedstawia protokół ilościowego określania procentu płytek krwi (TF) za pomocą cytometrii przepływu pełnej krwi, oceniając białko: (1) wewnątrzkomórkowo w warunkach spoczynku oraz (2) na powierzchni komórki, zarówno w stanie spoczynku, jak i aktywacji. Przedstawiono również wskazówki dotyczące oceny trombocytów TF-dodatnich w osoczu bogatym w płytki.

Analiza ekspresji tkankowych w ludzkich płytkach krwi przepływową za pomocą cytometrii przepływowej

A subset of circulating human platelets stores Tissue Factor (TF) intracellularly, the key activator of the blood coagulation cascade and thrombus ...

W tym protokole proponujemy krok po kroku samouczek dotyczący pomiaru czynnika tkankowego związanego z płytkami krwi za pomocą cytometrii przepływu krwi, oceny białka w przedziale wewnątrzkomórkowym, warunkach zatrzymania oraz na powierzchni komórki, zarówno w stanie spoczynku, jak i po aktywacji. Przy DP jednym z najczęściej występujących czynników agonistów płytek jest wyrażany przez podzbiór płytek. Jeśli dodatnie płytki tkankowe są mierzone w osoczu bogatym w płytki PRP lub w wymytych płytkach, ten podzbiór może zostać utracony podczas przygotowania próbki. To ryzyko nie występuje, gdy ta ocena jest przeprowadzana w ścianie.Czynnik tkankowy powiązany z płytkami krwi budzi kontrowersje od czasu pierwszego raportu opublikowanego na początku wieku ze względu na problemy przedanalityczne i metodologiczne. Protokół ten rzuca światło na te kwestie, a jest również wykorzystywany do realizacji międzynarodowego projektu wspieranego przez Międzynarodowe Towarzystwo Zakrzepicy i Hemostazy ISDH, mający na celu standaryzację pomiaru czynników tkankowych związanych z płytkami krwi lub cytometrii przepływu krwi, wykonywanej na kilku mikrolitrach krwi, co pozwala na odpowiednią analizę czynników tkankowych związanych z płytkami krwi odpowiednią w warunkach klinicznych. Ponadto możliwość poprawy próbki i późniejszego oznakowania sprawia, że taka analiza jest możliwa w wielu szpitalach i laboratoriach.Na początek przygotuj jedną probówkę na każdą objętość przeciwciał. Aby sprawdzić, dodaj jedną kroplę ujemnych koralików i jedną kroplę pozytywnych do każdej probówki. Dodaj 20 mikrolitrów każdego rozcieńczenia przeciwciał do probówki i wiru.Natychmiast inkubuj probówki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie dodaj po jednym mililitrze PBS bez wapnia i magnezu o pH 7,4 do każdej rurki i wiru, delikatnie odwróć wakutainer z cytrynianem sodu pięć razy, aby dokładnie wymieszać krew i antykoagulant. Przelej 50 mikrolitrów krwi do rurki o pojemności 1,5 mililitra.Następnie dodaj 950 mikrolitrów aldehydu 1% paraform. Delikatnie wymieszaj i inkubuj próbkę przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Teraz wiruj próbkę w temperaturze 1 500 G przez pięć minut z przerwą w temperaturze pokojowej.Po usunięciu supernatantu Reese, zawiesz granulat w jednym mililitrze PBS bez wapnia i magnezu. Przy pH 7,4 należy podać 100 mikrolitrów stałej krwi do każdej probówki i wirować je w 1 500 G przez pięć minut. Z przerwą w temperaturze pokojowej, a następnie usuwam resurę supernatantu.Zawiesz granulek w 100 mikrolitrach 0,1% Triton PBS, aby przepuścić próbki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Na początek przygotuj jedną probówkę do fluorescencji minus jedna kontrolna oraz jedną do barwienia tkankowego. Dodaj przeciwciała do 100 mikrolitrów krwi stałej i trwałej w każdej rurce.Dodaj 300 mikrolitrów PBS bez wapnia i magnezu przy pH 7,4 do każdej probówki i wymieszaj. Następnie przechowywać zabarwione próbki w ciemności do czasu analizy cytometrii przepływowej, rozcieńczyć alfa CD 1 42 HTF, jedno przeciwciało monoklonalne oraz Alexa Fluer 6 33 kozi immunoglobulin G antymyszy w PBS bez wapnia i magnezu. Następnie przygotuj trzy probówki i podawaj PBS bez wapnia i magnezu.Przy pH 7,4 podano 7,5 mikrolitra rozcieńczonego alfa CD 1 42 htf jednego przeciwciała monoklonalnego oraz dodano pięć mikrolitrów adenozyniodfosforanu. Delikatnie odwróć cytrynianowy wakutainer pięć razy, aby dokładnie wymieszać krew i antykrzep. Do każdej probówki podaj pięć mikrolitrów pełnej krwi.Delikatnie wymieszaj próbki i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Aby utrwalić próbkę, dodaj 300 mikrolitrów 1% PFA do każdej probówki i wiruj w 1 500 G przez pięć minut z przerwą w temperaturze pokojowej. Po usunięciu supernatantu resus zawiesz pellet w 90 mikrolitrach PBS bez wapnia i magnezu.Przy pH 7,4, delikatnie pipetując, podaj do każdej probówki pięć mikrolitrów rozcieńczonej Alexa Fluer 6 33 immunoglobuliny G oraz pięć mikrolitrów alfa CD 41 PE. Inkubuj próbki przez 15 minut w ciemności i w temperaturze pokojowej. Następnie do każdej probówki dodaj 300 mikrolitrów PBS bez wapnia i magnezu o pH 7,4 i wymieszaj.Aby zacząć, stwórz punktowy wykres rozproszeń w kierunku przedniego i bocznego obszaru rozproszenia na skali logarytmicznej pokazujący wszystkie zdarzenia, stwórz wykres punktowy CD 61 A oraz wykres punktowy obszaru rozproszenia bocznego na skali logarytmicznej pokazujący wszystkie zdarzenia. Aby zobrazować populację płytek, ustaw próg na około 2000 na wysokości rozpraszania po bokach i 1000 na poziomie CP B 6 90 H. Dostosuj PE Y 5 8 5 oraz na CP B 6 90 przyrostu zgodnie z dzienną kontrolą jakości i ustaw przepływ na niski. Teraz narysuj obszar od 10 promieni do potęgi trzech i 10 promieni do potęgi pięciu, nazywany dodatnim CD 61.Aby zidentyfikować populację płytek, następnie zduplikuj FMO i przemianuj ją na TFIC. Pobierz próbki i zapisz plik danych z 10 000 zdarzeń w ramach pozytywnej bramki CD 61. Stwórz punktowy wykres punktowy obszaru rozproszenia do przodu i obszaru bocznego na skali logarytmicznej, pokazując wszystkie zdarzenia.Stwórz wykres punktowy CD 41 A oraz obszar rozproszenia bocznego na skali logarytmicznej, wyświetlając wszystkie zdarzenia. Następnie dostosuj wzmocnienie Alexa na poziomie 6 33 oraz wzmocnienie PE wifi 5 8 5 zgodnie z codzienną kontrolą jakości. Ustaw próg około 1000 na wysokości rozpraszania bocznego i na 2 500 na PEY 5 85 H.To wizualizacji populacji płytek, ustaw przepływ na niski.Teraz narysuj obszar od 10 promieni do potęg czterech do 10, podniesiony do potęgi pięciu, zwany liczbą CD 41 dodatnią, aby zidentyfikować populację płytek. Następnie stwórz probkę dla każdej próbki i nazwij TF Unstimulated i TF Stimulated. Pobierz próbki i zapisz plik danych z 10 000 zdarzeń w wirówce z pozytywnym chodem na CD 41.Wakutainer o stężeniu 0,129 molowego cytrynianu sodu przy 100 G przez 10 minut bez przerwy w temperaturze pokojowej. Następnie wyjmij odkurzacz z wirówki. Pobierz pobrane osoczenie bogate w płytki krwi, przelej je do probówki z polipropylenem o pojemności 10 mililitrów i zapisz objętość, licz płytki dwukrotnie w osoczu bogatym w płytki krwi, używając licznika krwinek.Populacja płytek krwi zidentyfikowana przez barwienie przeciwciał alfa CD 61 wykazała, że około 26,8% krążących płytek krwi zawierało wewnątrzkomórkową analizę przepływu tkankowego czynnika przepływowego, która wykazała, że czynnik tkankowy jest wyrażany przez około 2,8% spoczynkowych płytek krwi i wzrasta do 24,5% po aktywacji z difosforanem adenozyny. Wykazano, że większe płytki krwi wykazują wyższy poziom czynników tkankowych, a zielone kropki oznaczają większą podgrupę płytek. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że osocze bogate w płytki krwi przygotowane przy użyciu wirowania 100 g zachowało populację podobną do krwi pełnej krwi, zachowując większe płytki krwi o wyższej pozytywności tkankowej.Wyższa siła wirowania prowadziła do utraty płytek o większym czynniku tkankowym, co wskazuje zmniejszone rozpraszanie w przód w populacji PRP.

flow-cytometry-analysis-of-tissue-factor-expression-in-human-platelets

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

Tutaj opisujemy wewnętrzny test aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Testy oparte na aktywności i testy oparte na antygenach zastosowano do pomiaru czynnika tkankowego w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych z próbek ludzkiego osocza. Testy oparte na aktywności mają wyższą czułość i swoistość niż testy oparte na antygenach.

Test aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Wielokolorowa cytometria przepływowa dla płytek krwi może zidentyfikować nowe podtypy płytek krwi w klasycznych subpopulacjach płytek krwi, takie jak płytki spoczynku, agregacyjne, prokoagulacyjne i apoptotyczne. Pozwala to na porównanie różnych wzorców subpopulacji indukowanych przez różnych agonistów płytek krwi. Tutaj szczegółowo opisano procedurę tworzenia wielokolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza subpopulacji płytek krwi za pomocą wielobarwnej cytometrii przepływowej

Obecny protokół dostarcza obszerny zestaw procedur niezbędnych do analizy prokoagulacyjnych płytek krwi, które wykazują nakładające się cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi.

Kompleksowa analiza płytek krwi prokoagulantów wykazujących cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi

Opisano krótki protokół barwienia białek Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 w żelach poliakrylamidowych, który nie wymaga użycia rozpuszczalników organicznych ani kwasu octowego, stosowanych w klasycznych procedurach barwienia CBB.

Barwienie białek w żelach Coomassie G-250 bez użycia rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego

Opisano wydajną metodę otrzymywania wysokiej czystości żywych frakcji meiotycznych z jądra myszy, która łączy udoskonalony protokół dysocjacji komórek z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS). Metoda ta wykorzystuje różnice w zawartości DNA oraz gęstości jąder poszczególnych frakcji meiotycznych.

Oczyszczanie komórek meiotycznych myszy metodą cytometrii przepływowej

Skuteczne zastosowanie barwników do śledzenia komórek w celu monitorowania funkcji i proliferacji komórek odpornościowych obejmuje kilka krytycznych etapów. Opisujemy metody: 1) uzyskiwania jasnego, jednorodnego i powtarzalnego znakowania barwnikami błonowymi; 2) wyboru fluorochromów i warunków akwizycji danych; oraz 3) wyboru modelu do ilościowego określania proliferacji komórek na podstawie rozcieńczenia barwnika.

Zoptymalizowane metody barwienia i modelowania proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników do śledzenia komórek

Generowany przez rzęski przepływ płynu w pęcherzyku Kupffera (KV) kontroluje formację zarodka danio pręgowanego w lewo-prawo. Tutaj opisujemy technikę modulowania funkcji genów specyficznie w komórkach KV. Ponadto pokazujemy, jak dostarczyć kulki fluorescencyjne do KV, aby zobrazować przepływ płynu.

Analiza funkcji genów i wizualizacja przepływu płynu generowanego przez rzęski w pęcherzyku Kupffera

Opisujemy technikę analizy globalnej syntezy RNA w hipoksji za pomocą obrazowania. Znakowanie chemiczne RNA metodą kliknięcia nie było wcześniej wykonywane w warunkach hipoksji i umożliwia wizualizację globalnych zmian RNA na poziomie pojedynczej komórki. Podejście to uzupełnia istniejące techniki uśredniania RNA, umożliwiając bezpośrednią wizualizację zmian między komórkami w globalnej syntezie RNA.

Analiza globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki po niedotlenieniu

Poznaj metodę pomiaru płytek z dodatnim czynnikiem tkankowym za pomocą cytometrii przepływowej pełnej krwi. Protokół umożliwia standaryzację badań nad krzepnięciem i biologią płytek.

Analiza ekspresji tkankowych w ludzkich płytkach krwi przepływową za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów