Analiza ekspresji tkankowych w ludzkich płytkach krwi przepływową za pomocą cytometrii przepływowej

W tym protokole proponujemy krok po kroku samouczek dotyczący pomiaru czynnika tkankowego związanego z płytkami krwi za pomocą cytometrii przepływu krwi, oceny białka w przedziale wewnątrzkomórkowym, warunkach zatrzymania oraz na powierzchni komórki, zarówno w stanie spoczynku, jak i po aktywacji. Przy DP jednym z najczęściej występujących czynników agonistów płytek jest wyrażany przez podzbiór płytek. Jeśli dodatnie płytki tkankowe są mierzone w osoczu bogatym w płytki PRP lub w wymytych płytkach, ten podzbiór może zostać utracony podczas przygotowania próbki. To ryzyko nie występuje, gdy ta ocena jest przeprowadzana w ścianie.

Czynnik tkankowy powiązany z płytkami krwi budzi kontrowersje od czasu pierwszego raportu opublikowanego na początku wieku ze względu na problemy przedanalityczne i metodologiczne. Protokół ten rzuca światło na te kwestie, a jest również wykorzystywany do realizacji międzynarodowego projektu wspieranego przez Międzynarodowe Towarzystwo Zakrzepicy i Hemostazy ISDH, mający na celu standaryzację pomiaru czynników tkankowych związanych z płytkami krwi lub cytometrii przepływu krwi, wykonywanej na kilku mikrolitrach krwi, co pozwala na odpowiednią analizę czynników tkankowych związanych z płytkami krwi odpowiednią w warunkach klinicznych. Ponadto możliwość poprawy próbki i późniejszego oznakowania sprawia, że taka analiza jest możliwa w wielu szpitalach i laboratoriach.

Na początek przygotuj jedną probówkę na każdą objętość przeciwciał. Aby sprawdzić, dodaj jedną kroplę ujemnych koralików i jedną kroplę pozytywnych do każdej probówki. Dodaj 20 mikrolitrów każdego rozcieńczenia przeciwciał do probówki i wiru.

Natychmiast inkubuj probówki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie dodaj po jednym mililitrze PBS bez wapnia i magnezu o pH 7,4 do każdej rurki i wiru, delikatnie odwróć wakutainer z cytrynianem sodu pięć razy, aby dokładnie wymieszać krew i antykoagulant. Przelej 50 mikrolitrów krwi do rurki o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie dodaj 950 mikrolitrów aldehydu 1% paraform. Delikatnie wymieszaj i inkubuj próbkę przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Teraz wiruj próbkę w temperaturze 1 500 G przez pięć minut z przerwą w temperaturze pokojowej.

Po usunięciu supernatantu Reese, zawiesz granulat w jednym mililitrze PBS bez wapnia i magnezu. Przy pH 7,4 należy podać 100 mikrolitrów stałej krwi do każdej probówki i wirować je w 1 500 G przez pięć minut. Z przerwą w temperaturze pokojowej, a następnie usuwam resurę supernatantu.

Zawiesz granulek w 100 mikrolitrach 0,1% Triton PBS, aby przepuścić próbki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Na początek przygotuj jedną probówkę do fluorescencji minus jedna kontrolna oraz jedną do barwienia tkankowego. Dodaj przeciwciała do 100 mikrolitrów krwi stałej i trwałej w każdej rurce.

Dodaj 300 mikrolitrów PBS bez wapnia i magnezu przy pH 7,4 do każdej probówki i wymieszaj. Następnie przechowywać zabarwione próbki w ciemności do czasu analizy cytometrii przepływowej, rozcieńczyć alfa CD 1 42 HTF, jedno przeciwciało monoklonalne oraz Alexa Fluer 6 33 kozi immunoglobulin G antymyszy w PBS bez wapnia i magnezu. Następnie przygotuj trzy probówki i podawaj PBS bez wapnia i magnezu.

Przy pH 7,4 podano 7,5 mikrolitra rozcieńczonego alfa CD 1 42 htf jednego przeciwciała monoklonalnego oraz dodano pięć mikrolitrów adenozyniodfosforanu. Delikatnie odwróć cytrynianowy wakutainer pięć razy, aby dokładnie wymieszać krew i antykrzep. Do każdej probówki podaj pięć mikrolitrów pełnej krwi.

Delikatnie wymieszaj próbki i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Aby utrwalić próbkę, dodaj 300 mikrolitrów 1% PFA do każdej probówki i wiruj w 1 500 G przez pięć minut z przerwą w temperaturze pokojowej. Po usunięciu supernatantu resus zawiesz pellet w 90 mikrolitrach PBS bez wapnia i magnezu.

Przy pH 7,4, delikatnie pipetując, podaj do każdej probówki pięć mikrolitrów rozcieńczonej Alexa Fluer 6 33 immunoglobuliny G oraz pięć mikrolitrów alfa CD 41 PE. Inkubuj próbki przez 15 minut w ciemności i w temperaturze pokojowej. Następnie do każdej probówki dodaj 300 mikrolitrów PBS bez wapnia i magnezu o pH 7,4 i wymieszaj.

Aby zacząć, stwórz punktowy wykres rozproszeń w kierunku przedniego i bocznego obszaru rozproszenia na skali logarytmicznej pokazujący wszystkie zdarzenia, stwórz wykres punktowy CD 61 A oraz wykres punktowy obszaru rozproszenia bocznego na skali logarytmicznej pokazujący wszystkie zdarzenia. Aby zobrazować populację płytek, ustaw próg na około 2000 na wysokości rozpraszania po bokach i 1000 na poziomie CP B 6 90 H. Dostosuj PE Y 5 8 5 oraz na CP B 6 90 przyrostu zgodnie z dzienną kontrolą jakości i ustaw przepływ na niski. Teraz narysuj obszar od 10 promieni do potęgi trzech i 10 promieni do potęgi pięciu, nazywany dodatnim CD 61.

Aby zidentyfikować populację płytek, następnie zduplikuj FMO i przemianuj ją na TFIC. Pobierz próbki i zapisz plik danych z 10 000 zdarzeń w ramach pozytywnej bramki CD 61. Stwórz punktowy wykres punktowy obszaru rozproszenia do przodu i obszaru bocznego na skali logarytmicznej, pokazując wszystkie zdarzenia.

Stwórz wykres punktowy CD 41 A oraz obszar rozproszenia bocznego na skali logarytmicznej, wyświetlając wszystkie zdarzenia. Następnie dostosuj wzmocnienie Alexa na poziomie 6 33 oraz wzmocnienie PE wifi 5 8 5 zgodnie z codzienną kontrolą jakości. Ustaw próg około 1000 na wysokości rozpraszania bocznego i na 2 500 na PEY 5 85 H.To wizualizacji populacji płytek, ustaw przepływ na niski.

Teraz narysuj obszar od 10 promieni do potęg czterech do 10, podniesiony do potęgi pięciu, zwany liczbą CD 41 dodatnią, aby zidentyfikować populację płytek. Następnie stwórz probkę dla każdej próbki i nazwij TF Unstimulated i TF Stimulated. Pobierz próbki i zapisz plik danych z 10 000 zdarzeń w wirówce z pozytywnym chodem na CD 41.

Wakutainer o stężeniu 0,129 molowego cytrynianu sodu przy 100 G przez 10 minut bez przerwy w temperaturze pokojowej. Następnie wyjmij odkurzacz z wirówki. Pobierz pobrane osoczenie bogate w płytki krwi, przelej je do probówki z polipropylenem o pojemności 10 mililitrów i zapisz objętość, licz płytki dwukrotnie w osoczu bogatym w płytki krwi, używając licznika krwinek.

Populacja płytek krwi zidentyfikowana przez barwienie przeciwciał alfa CD 61 wykazała, że około 26,8% krążących płytek krwi zawierało wewnątrzkomórkową analizę przepływu tkankowego czynnika przepływowego, która wykazała, że czynnik tkankowy jest wyrażany przez około 2,8% spoczynkowych płytek krwi i wzrasta do 24,5% po aktywacji z difosforanem adenozyny. Wykazano, że większe płytki krwi wykazują wyższy poziom czynników tkankowych, a zielone kropki oznaczają większą podgrupę płytek. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że osocze bogate w płytki krwi przygotowane przy użyciu wirowania 100 g zachowało populację podobną do krwi pełnej krwi, zachowując większe płytki krwi o wyższej pozytywności tkankowej.

Wyższa siła wirowania prowadziła do utraty płytek o większym czynniku tkankowym, co wskazuje zmniejszone rozpraszanie w przód w populacji PRP.