Name: Pomiar aktywności enzymatycznej enzymów deubikwitytylacyjnych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi za pomocą testu rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności enzymów deubikwitytylacyjnych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi. Technika ta pozwala bezpośrednio ocenić wpływ wariantów genetycznych na aktywność katalityczną DUB.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez fundusze startowe Sanford Research dla FB oraz grant NIH R01CA233700 dla MJS. Grafikę wykonał Felipe G. Serrano (www.illustrative-science.com). Dziękujemy dr Gregowi Findlayowi (University of Dundee) za plazmid GST-USP27X.

Poniższy protokół można dostosować do białek rekombinowanych z zastosowaniem różnych znaczników powinowactwa ekspresowanych w różnych szczepach kompetentnych komórek. W zależności od ekspresowanego białka, warunki hodowli i nocnej ekspresji mogą wymagać optymalizacji wartości OD600 w momencie indukcji ekspresji, czasu ekspresji, temperatury ekspresji oraz stężenia IPTG. Przegląd protokołu przedstawiono na Ryc. 1. Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu wykorzystanego w tej badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Transformacja kompetentnych Rosetta 2 E. coli plazmidem ekspresyjnym rekombinowanego GST-USP27X
UWAGA: Aby zachować sterylność hodowli bakteryjnej, należy wykonywać czynności związane z otwartymi pojemnikami z pożywką w pobliżu płomienia palnika Bunsena. Aby zapewnić optymalny transfer tlenu, wstrząsanie hodowli bakteryjnej należy przeprowadzić w laboratoryjnym inkubatorze wytrząsowym z kontrolą temperatury, przy orbicie od 19 mm do 50 mm i prędkości 200 rpm29.
<ol>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem rozmrozić 20 µL chemicznie kompetentnych komórek Rosetta 2 E. coli na lodzie. Dodać 1-10 ng plazmidu ekspresyjnego pGEX6P1-USP27X (kodującego USP27X z N-końcowym znacznikiem Glutathione-S-transferase (GST)30 i zawierającego gen oporności na ampicylinę) i inkubować przez 5 min na lodzie.</li>
	<li>Przeprowadzić szok termiczny przez 30 s w temperaturze 42 °C w bloku grzewczym. Inkubować na lodzie przez 2 min.</li>
	<li>Dodać 80 µL pożywki SOC o temperaturze pokojowej (RT). Inkubować przez 60 min w temperaturze 37 °C przy 200 rpm w laboratoryjnej inkubatorze z wytrząsaniem i kontrolą temperatury o orbicie 19 mm.</li>
	<li>Wykulturzyć 50 µL hodowli na płytce z agarem LB uzupełnionym o 25 µg/L chloramfenikolu i 50 µg/L ampicyliny. Inkubować przez 20 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z kontrolą temperatury, ustawiając płytki dnem do góry.</li>
</ol>
2. Nocna ekspresja bakteryjna białka rekombinowanego z plazmidu ekspresyjnego
UWAGI: Aby zachować sterylność hodowli bakteryjnej, kroki wymagające otwarcia pojemników z pożywką należy przeprowadzać w pobliżu płomienia palnika Bunsena. W celu zapewnienia optymalnego transferu tlenu, inkubację z wytrząsaniem hodowli bakteryjnej należy prowadzić w laboratoryjnym inkubatorze z wytrząsaniem z kontrolą temperatury, przy orbicie od 19 mm do 50 mm i prędkości 200 rpm29. Wartość OD600 hodowli należy zmierzyć przy użyciu spektrofotometru.
<ol>
	<li>Przygotować 1 L pożywki Terrific Broth (TB), dodając 47,6 g proszku TB do 1 L wody ultrapurej z 0,4% glicerolu w 2 L kolbie hodowlanej z przegrodami. Autoklawować pożywkę przez 30 min, a następnie schłodzić do RT.</li>
	<li>Wybrać pojedynczą kolonię transformowanych bakterii i dodać do 10 mL sterylnej pożywki LB uzupełnionej o 25 µg/L chloramphenicolu i 50 µg/L ampicyliny. Inkubować przez 20 h w temperaturze 37 °C przy 200 rpm w inkubatorze wytrząsowym z kontrolą temperatury o orbicie 19 mm.</li>
	<li>Dodać 10 mL kultury nocnej do 1 L pożywki TB uzupełnionej o 25 µg/L chloramphenicolu i 50 µg/L ampicyliny (stosunek kultury startowej do kultury ekspresyjnej 1:100). Inkubować w temperaturze 37 °C przy 200 rpm w inkubatorze wytrząsowym z kontrolą temperatury o orbicie 19 mm, aż OD600 kultury osiągnie wartość od 0,5 do 0,6.</li>
	<li>Dodać do kultury 50 µM IPTG w celu indukcji ekspresji, schłodzić do 16 °C i inkubować przez 20 h w temperaturze 16 °C przy 200 rpm.</li>
	<li>Zbiór komórek z kultury ekspresyjnej poprzez wirowanie przez 20 min przy ≥3,000 x g i 4 °C. Przechowywać osad w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 h. 
	UWAGA: Na tym etapie eksperyment można przerwać i wznowić później (najlepiej w tym samym tygodniu). Osad można przechowywać długoterminowo w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie białka przy użyciu kolumny powinowactwa z przepływem grawitacyjnym
UWAGA: Żywica oraz bufory wiążące, piorące, elucyjne i do przechowywania, odpowiednie dla każdej oczyszczania, zależą od oczyszczanego białka rekombinowanego. Próbki z osadu komórkowego, supernatantu, frakcji przepływowej, frakcji piorących i frakcji elucyjnych należy zbierać w buforze do SDS-PAGE. W celu oceny skuteczności oczyszczania należy przeprowadzić SDS-PAGE oraz barwienie Coomassie dla pobranych próbek. Proces oczyszczania należy prowadzić w temperaturze 4 °C, a frakcje przechowywać na lodzie. Odcinanie znaczników białkowych można przeprowadzić na kolumnie lub poza nią, wykorzystując odpowiednią proteazę skierowaną na właściwe miejsce cięcia specyficzne dla danej proteazy.
<ol>
	<li>Zamocuj pustą kolumnę grawitacyjną w statywie i wypełnij ją żywicą agarozową z glutationem. Do oczyszczania osadu komórkowego zebranego z 1 L kultury ekspresyjnej należy użyć 2-3 mL żywicy.</li>
	<li>Przemyj kolumnę jedną objętością złoża żywicy 20% etanolem. Przemyj kolumnę 3 razy jedną objętością złoża buforem MS500 (20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.5 mM TCEP). Zatrzymaj przepływ w kolumnie tak, aby żywica pozostała pokryta buforem, co zapobiegnie jej wyschnięciu podczas przygotowywania osadu komórkowego.</li>
	<li>Rozmroź osad komórkowy w temperaturze 4 °C. Do rozmrożonego osadu dodaj 30 mL buforu MS500 (20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.5 mM TCEP, 60 mg lizozymu oraz jedną tabletkę inhibitora proteaz). Lizuj przez 30 min w temperaturze 4 °C, stosując delikatne obracanie end-over-end.</li>
	<li>Sonicuj lizowane komórki w probówce wirówkowej 50 mL lub metalowym zlewce w lodzie, aż lizat będzie swobodnie wypływać z końcówki pipety. Wirować przez 30 min w temperaturze 4 °C przy ≥20,000 x g w celu sklarowania nadsączu. 
	UWAGA: Ustawienia sonikatora należy dobrać empirycznie. Skonfiguruj sonikator tak, aby całkowity czas 120 s był wystarczający do przekształcenia lepkiego lizatu w swobodnie płynną i przezroczystą ciecz.</li>
	<li>Zlej nadsącz do zlewki i nałóż sklarowany lizat na kolumnę. Pozostaw lizat do przepływu przez kolumnę grawitacyjnie, zbierając frakcję niezatrzymaną. Ponownie nałóż zebraną frakcję niezatrzymaną na kolumnę i przepuść ją przez złoże.</li>
	<li>Przemyj kolumnę co najmniej pięciokrotnie, używając za każdym razem dwóch objętości złoża żywicy buforu piorącego MS500 (20 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.5 mM TCEP). Zbieraj frakcje z płukania w objętościach 5 mL. Dodaj 1 µL każdej frakcji do 100 µL odczynnika Bradforda, aby wizualnie sprawdzić obecność białka. Płucz do momentu, aż w ostatniej frakcji nie będzie już obecne niezatrzymane białko, dodając w razie potrzeby kolejne etapy płukania.</li>
	<li>Odzyskaj białko, przepuszczając przez kolumnę bufor elucyjny MS500 (bufor MS500 uzupełniony o 10 mM glutationu i 10 mM NaOH), zbierając frakcje elucyjne po 5 mL. Sprawdź obecność białka, dodając 1 µL eluatu do 100 µL odczynnika Bradforda. Zaprzestań zbierania frakcji, gdy odczynnik Bradforda nie będzie już wskazywał obecności białek.</li>
	<li>Przeprowadź wymianę buforu poprzez wytrącanie i wirowanie. Wytrąć białko, dodając do eluatu dwie objętości 4 M siarczanu amonu, delikatnie odwracając naczynie do momentu zmętnienia, a następnie wirując przez 30 min w temperaturze 4 °C przy ≥20,000 x g, a następnie ponownie przez 5 min. Usuwaj nadsącz po każdym wirowaniu, uważając, aby nie naruszyć osadu białkowego.</li>
	<li>Ponownie rozpuść i przechowuj białko w buforze MS500 uzupełnionym o 25% glicerolu. Przechowuj osady białkowe lub białko w buforze do przechowywania w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Analiza rozszczepiania łańcuchów ubikwityny in vitro
UWAGA: Długość łańcucha ubikwityny oraz typy wiązań należy dobrać na podstawie swoistości DUB opisanej w poprzednich raportach31 lub określić empirycznie. W razie potrzeby protokół ten można wykorzystać do przetestowania aktywności badanego DUB typu dzikiego na panelu komercyjnie dostępnych łańcuchów ubikwityny o określonej długości i typie wiązania. Jako wartości początkowe dla analizy można przyjąć ilość łańcucha di-ubikwityny wynoszącą 375-750 ng oraz stężenie DUB na poziomie 1-2 µM27.
<ol>
	<li>Przygotować 10x bufor aktywacyjny DUB (500 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl oraz 100 mM TCEP).</li>
	<li>Dla każdego punktu czasowego dla każdego DUB przygotować łącznie 10 µL roztworu 2 µM oczyszczonego białka GST-USP27X w 1x buforze aktywacyjnym DUB (mieszanina DUB). Przygotować mieszaniny główne (master mixes), a następnie rozdzielić je na poszczególne punkty czasowe.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę DUB przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Do próbki dla czasu 0 dodać 7 µL buforu do ładowania SDS-PAGE przed dodaniem łańcuchów ubikwityny, aby zapobiec rozpoczęciu reakcji deubikwitylacji.</li>
	<li>Do każdego punktu czasowego dla każdego DUB dodać 375 ng łańcuchów di-ubikwityny K-63 rozpuszczonych w 10 µL 1x buforu aktywacyjnego DUB. Objętość całkowita wynosi 20 µL na reakcję.</li>
	<li>Inkubować probówki w temperaturze 30 °C, zatrzymując reakcję w każdym punkcie czasowym poprzez dodanie 7 µL buforu do ładowania SDS-PAGE.</li>
	<li>Przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE z użyciem żelu gradientowego 4%-12%, a następnie wykonać immunoblotting7,32 w kierunku ubikwityny i USP27X, aby przeanalizować zmiany w obecności mono-ubikwityny w wybranych punktach czasowych.</li>
</ol>
<img alt="Schemat procesu oczyszczania białka: transformacja, ekspresja, liza, powinowactwo, analiza SDS-PAGE." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat projektu badania. (A) Transformacja kompetentnych komórek E. coli plazmidem do ekspresji białka rekombinowanego. (B) Nocna ekspresja bakteryjna rekombinowanego białka deubikwitylazy. (C) Oczyszczanie białka rekombinowanej deubikwitylazy przy użyciu kolumny powinowactwa z przepływem grawitacyjnym. (D) Test cięcia łańcucha ubikwityny in vitro w celu oceny aktywności deubikwitylazy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Assessing DUB Variants in Neurodevelopmental Disorders Using a Cleavage Assay

<ol><li>Morris-Rosendahl, D. J., Crocq, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+disorders%3A+the+history+and+future+of+a+diagnostic+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Dialogues+Clin+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental disorders: the history and future of a diagnostic concept.</a> Dialogues Clin Neurosci. 22 (1), 65-72 (2020).</li>
<li>Ebstein, F., Küry, S., Papendorf, J. J., Krüger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+disorders+%28NDD%29+caused+by+genomic+alterations+of+the+ubiquitin-proteasome+system+%28UPS%29%3A+the+possible+contribution+of+immune+dysregulation+to+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental disorders (NDD) caused by genomic alterations of the ubiquitin-proteasome system (UPS): the possible contribution of immune dysregulation to disease pathogenesis.</a> Front Mol Neurosci. 14, 733012(2021).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67 (10), 425-479 (1998).</li>
<li>Pickart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying ubiquitination.</a> Annu Rev Biochem. 70 (1), 503-533 (2001).</li>
<li>Komander, D., Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+structure+and+function+of+the+deubiquitinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 550-563 (2009).</li>
<li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nat Cell Biol. 18 (6), 579-586 (2016).</li>
<li>Koch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP27X+variants+underlying+X-linked+intellectual+disability+disrupt+protein+function+via+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">USP27X variants underlying X-linked intellectual disability disrupt protein function via distinct mechanisms.</a> Life Sci Alliance. 7 (3), e202302258(2024).</li>
<li>Hao, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP7+acts+as+a+molecular+rheostat+to+promote+WASH-dependent+endosomal+protein+recycling+and+is+mutated+in+a+human+neurodevelopmental+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">USP7 acts as a molecular rheostat to promote WASH-dependent endosomal protein recycling and is mutated in a human neurodevelopmental disorder.</a> Mol Cell. 59 (6), 956-969 (2015).</li>
<li>Fountain, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+variants+in+USP7+cause+a+neurodevelopmental+disorder+with+speech+delays%2C+altered+behavior%2C+and+neurologic+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogenic variants in USP7 cause a neurodevelopmental disorder with speech delays, altered behavior, and neurologic anomalies.</a> Genet Med. 21 (8), 1797-1807 (2019).</li>
<li>Santiago-Sim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biallelic+variants+in+OTUD6B+cause+an+intellectual+disability+syndrome+associated+with+seizures+and+dysmorphic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Biallelic variants in OTUD6B cause an intellectual disability syndrome associated with seizures and dysmorphic features.</a> Am J Hum Genet. 100 (4), 676-688 (2017).</li>
<li>Beck, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage-specific+deubiquitylation+by+OTUD5+defines+an+embryonic+pathway+intolerant+to+genomic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Linkage-specific deubiquitylation by OTUD5 defines an embryonic pathway intolerant to genomic variation.</a> Sci Adv. 7 (4), eabe2116(2021).</li>
<li>Cho, J., Park, J., Kim, E. E., Song, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+systems+for+profiling+deubiquitinating+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Assay systems for profiling deubiquitinating activity.</a> Int J Mol Sci. 21 (16), 1-16 (2020).</li>
<li>Matsui, S., Sandberg, A. A., Negoro, S., Seon, B. K., Goldstein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isopeptidase%3A+A+novel+eukaryotic+enzyme+that+cleaves+isopeptide+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Isopeptidase: A novel eukaryotic enzyme that cleaves isopeptide bonds.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79 (5), 1535-1539 (1982).</li>
<li>Rose, I. A., Warms, J. V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme+with+ubiquitin+carboxy-terminal+esterase+activity+from+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme with ubiquitin carboxy-terminal esterase activity from reticulocytes.</a> Biochemistry. 22 (18), 4234-4237 (1983).</li>
<li>Wilkinson, K. D., Cox, M. J., Mayer, A. N., Frey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+ubiquitin+ethyl+ester%2C+a+new+substrate+for+ubiquitin+carboxyl-terminal+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of ubiquitin ethyl ester, a new substrate for ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase.</a> Biochemistry. 25 (21), 6644-6649 (1986).</li>
<li>Pickart, C. M., Rose, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+carboxyl-terminal+hydrolase+acts+on+ubiquitin+carboxyl-terminal+amides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase acts on ubiquitin carboxyl-terminal amides.</a> J Biol Chem. 260 (13), 7903-7910 (1985).</li>
<li>Hadari, T., Warms, J. V. B., Rose, I. A., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ubiquitin+C-terminal+isopeptidase+that+acts+on+polyubiquitin+chains%3A+Role+in+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A ubiquitin C-terminal isopeptidase that acts on polyubiquitin chains: Role in protein degradation.</a> J Biol Chem. 267 (2), 719-727 (1992).</li>
<li>Woo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ubiquitin+C-terminal+hydrolases+from+chick+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple ubiquitin C-terminal hydrolases from chick skeletal muscle.</a> J Biol Chem. 270 (32), 18766-18773 (1995).</li>
<li>Woo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+new+ubiquitin+C-terminal+hydrolase+%28UCH-1%29+with+isopeptidase+activity+from+chick+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a new ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH-1) with isopeptidase activity from chick skeletal muscle.</a> J Biochem. 121 (4), 684-689 (1997).</li>
<li>Baek, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+novel+ubiquitin-specific+protease%2C+UBP41%2C+with+isopeptidase+activity+in+chick+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a novel ubiquitin-specific protease, UBP41, with isopeptidase activity in chick skeletal muscle.</a> J Biol Chem. 272 (41), 25560-25565 (1997).</li>
<li>Wilkinson, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+the+polyubiquitin+degradation+signal%3A+Structure%2C+mechanism%2C+and+role+of+isopeptidase+T%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolism of the polyubiquitin degradation signal: Structure, mechanism, and role of isopeptidase T.</a> Biochemistry. 34 (44), 14535-14546 (1995).</li>
<li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+UBP-family+deubiquitinating+enzyme+in+isolation+and+in+complex+with+ubiquitin+aldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a UBP-family deubiquitinating enzyme in isolation and in complex with ubiquitin aldehyde.</a> Cell. 111 (7), 1041-1054 (2002).</li>
<li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanisms+of+the+proteasome-associated+deubiquitinating+enzyme+USP14%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanisms of the proteasome-associated deubiquitinating enzyme USP14.</a> EMBO J. 24 (21), 3747-3756 (2005).</li>
<li>Gorka, M., Magnussen, H. M., Kulathu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+biology+tools+to+study+deubiquitinases+and+UBL+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical biology tools to study deubiquitinases and UBL proteases.</a> Semin Cell Dev Biol. 132, 86-96 (2022).</li>
<li>Faesen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+modulation+of+USP+activity+by+internal+regulatory+domains%2C+interactors%2C+and+eight+ubiquitin+chain+types%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">The differential modulation of USP activity by internal regulatory domains, interactors, and eight ubiquitin chain types.</a> Chem Biol. 18 (12), 1550-1561 (2011).</li>
<li>Mevissen, T. E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OTU+deubiquitinases+reveal+mechanisms+of+linkage+specificity+and+enable+ubiquitin+chain+restriction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">OTU deubiquitinases reveal mechanisms of linkage specificity and enable ubiquitin chain restriction analysis.</a> Cell. 154 (1), 169-184 (2013).</li>
<li>Kwasna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+ZUFSP%2FZUP1%2C+a+distinct+deubiquitinase+class+important+for+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of ZUFSP/ZUP1, a distinct deubiquitinase class important for genome stability.</a> Mol Cell. 70 (1), 150-164.e6 (2018).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-exome+sequencing+of+405+unresolved+families+identifies+seven+novel+intellectual+disability+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">X-exome sequencing of 405 unresolved families identifies seven novel intellectual disability genes.</a> Mol Psychiatry. 21 (1), 133-148 (2016).</li>
<li>Hartmann, I. Shaker Orbit - Revolving in Space Around the Samples? Eppendorf Lab Academy. Eppendorf Lab Academy. , at 
 <a target="_blank" href="https://www.eppendorf.com/us-en/lab-academy/lab-solutions/others/shaker-orbit-revolving-in-space-around-the-samples">https://www.eppendorf.com/us-en/lab-academy/lab-solutions/others/shaker-orbit-revolving-in-space-around-the-samples</a> (2020).</li>
<li>Smith, D. B., Johnson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+purification+of+polypeptides+expressed+in+Escherichia+coli+as+fusions+with+glutathione+S-transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase.</a> Gene. 67 (1), 31-40 (1988).</li>
<li>Ritorto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+DUB+activity+and+specificity+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Screening of DUB activity and specificity by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nat Commun. 5, 4763(2014).</li>
<li>Bustos, F., Bustos, F. Immunoblotting using precast gels. , protocols.io (2024).</li>
<li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+purification+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Overview of the purification of recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. 80, 6.1.1-6.1.35 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W artykule przedstawiono protokół ekspresji i oczyszczania rekombinowanych USP27X DUB oraz test rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro w celu porównania aktywności deubikwitylojącej białek USP27X typu dzikiego i wariantów NDD. Test ten wykazał, że warianty związane z XLID105 zakłócają aktywność katalityczną USP27X7. Ten mechanistyczny wgląd pomógł nam zdefiniować XLID105 jako zaburzenie zaburzeń funkcjonalnych USP27X.
Protokół ten można dostosować do innych DUB, które są związane z chorobami genetycznymi o słabo poznanych mechanizmach molekularnych. Optymalizacja protokołu ekspresji i oczyszczania dla konkretnego DUB będącego przedmiotem zainteresowania ma kluczowe znaczenie. Jeśli dla danego DUB będącego przedmiotem zainteresowania nie opisano żadnych konkretnych protokołów, opisana tutaj metoda może służyć jako punkt wyjścia. Podczas optymalizacji protokołu ekspresji i oczyszczania białek krytyczne kroki obejmują wybór odpowiednich parametrów dla (1) systemu ekspresji (np. szczepy bakterii, komórki owadów lub komórki ssaków), (2) wektorów ekspresji, (3) żywicy znacznikowej i powinowactwa, które mają być użyte, (4) warunków wzrostu, (5) ilości kultury oraz (6) potrzeby dalszego oczyszczania (np. poprzez wykluczenie wielkości lub chromatografię jonowymienną). Omówiono szczegółowe zalecenia dotyczące tych i innych aspektów metody33.
Test rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro jest prostym sposobem pomiaru aktywności deubikwitytylacyjnej DUB typu dzikiego lub zmutowanego. Zależna od czasu analiza rozszczepienia ubikwityny może dostarczyć informacji na temat wpływu zmienności genetycznej na kinetykę enzymatyczną DUB, umożliwiając określenie parametrów takich jak K, m i V,max. Umożliwiłoby to rozróżnienie defektów w miejscu aktywnym DUB, które upośledzają katalizę (zmniejszone Vmax) i tych, które upośledzają rozpoznawanie substratu (zwiększone Km). Wszechstronność tego testu wynika z różnorodności łańcuchów ubikwityny, które można wykorzystać do dostarczenia odrębnych informacji mechanistycznych na interesującym DUB. Łańcuchy ubikwityny o różnych długościach i topologiach wiązań są dostępne na rynku, dzięki czemu test ten jest dostępny dla osób niebędących ekspertami. Specyficzne DUB mają unikalne właściwości kinetyki enzymatycznej, rozpoznawania sprzężeń i rozszczepienia. Kluczowe etapy tego testu obejmują (1) zdefiniowanie stężenia roboczego DUB, (2) określenie optymalnego czasu reakcji, (3) wybór typu i długości ogniwa łańcucha ubikwityny oraz (4) wybór metody wykrywania.
Testy rozszczepienia łańcucha ubikwityny mierzą wpływ wariantów NDD na aktywność DUB 7,11, pomagając zidentyfikować warianty, które zakłócają aktywność DUB i napędzają nietypowy rozwój. Test ten może być stosowany w wielu sytuacjach, w których zmienność genetyczna napędza patologię, w tym rak i neurodegeneracja. Jako test niezależny od substratu, nie jest wymagana wcześniejsza identyfikacja specyficznego ubikwitylowanego substratu białkowego. Jednak test ogranicza się do pomiaru zmian w aktywności rozszczepienia łańcucha ubikwityny i nie może ocenić wpływu wariantów na funkcje DUB, takie jak interakcje białko-białko, lokalizacja subkomórkowa i modyfikacje potranslacyjne. Identyfikacja szerokich ścieżek sygnałowych, w których działa DUB będący przedmiotem zainteresowania, jest niezbędna do opracowania specyficznych testów określających, w jaki sposób te warianty napędzają dyskretne NDD.

Zaburzenia neurorozwojowe (NDD) wynikają z różnych etiologii z uwarunkowaniami środowiskowymi lub genetycznymi, które napędzają nietypowy rozwój układu nerwowego1. Sekwencjonowanie genetyczne nowej generacji powiązało rosnącą liczbę wariantów genów związanych z układem ubikwityny z genetycznymi NDDs2. System ubikwityny katalizuje ligację małego modyfikatora białka ubikwityny do reszt lizyny w substratach białkowych, aby napędzać zmiany w zachowaniu komórek, w tym lokalizację, stabilność, interakcje białko-białko lub aktywność3. Ubikwitylacja jest pośredniczona przez enzymy aktywujące E1, sprzężone E2 i ligazy E34 i jest odwracalna przez aktywność enzymów deubikwitytylacyjnych (DUB), które katalizują rozszczepianie i usuwanie ubikwityny z substratów białkowych5. Ubikwityna może być ligowana do substratu jako monomer (monoubikwitylacja) lub łańcuchy polimerowe (poliubikwitylacja), które powstają na dowolnej z siedmiu reszt lizyny (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) lub reszcie M1 ubikwityny. Te różne topologie łańcuchów ubikwityny i ich kombinacje tworzą kod komórkowy, który jest kluczowy dla transdukcji sygnału6.
DUBs, takie jak USP27X, USP7, USP9X, USP48, STAMBP, OTUD4, OTUD6B i OTUD5 zostały powiązane z NDDs2,7,8,9,10,11. W przypadku większości NDD mechanizmy molekularne, które napędzają patogenezę, pozostają eksperymentalnie niezdefiniowane. Niektóre z DUB powodujących ostatnio opisane zaburzenia są słabo poznane i brakuje im znanych odczytów komórkowych, które można wykorzystać do oceny wpływu zmienności genetycznej na funkcję białek. In vitro, testy rozszczepienia łańcucha ubikwityny przezwyciężają to ograniczenie, ponieważ niezależne od substratu odczyty aktywności DUB, które mogą mierzyć wpływ wariantów genów na aktywność enzymatyczną12.
Testy in vitro na rozszczepienie ubikwityny są stosowane od lat 80. Testy te z użyciem substratów znakowanych radioaktywnie pozwoliły na odkrycie pierwszych DUB, w tym izopeptydazy, zidentyfikowanej ze względu na jej zdolność do deubikwitylacji histonu H2A13, oraz hydrolazy karboksylowej ubikwityny (UCH), identyfikowanej przez jej zdolność do hydrolizy ubikwityny z różnych koniugatów chemicznych14,15,16. Ponadto do identyfikacji izopeptydazy T i kilku UCH oraz proteaz specyficznych dla ubikwityny ubikwityny (UBP) z erytrocytów i mięśni szkieletowych wykorzystano znakowane radioizopomagnetycznie białka lub peptydy o pełnej długości17,18,19,20. Łańcuchy ubikwityny o określonej długości i typie wiązań (tetra-ubikwityna sprzężona z K48) zostały po raz pierwszy użyte do pomiaru aktywności DUB izopeptydazy T21. Od tego czasu test ten stał się złotym standardem pomiaru aktywności DUB w analizach mutacyjnych22,23. Udoskonalenie tego testu pozwala obecnie na wizualizację rozszczepienia ubikwityny za pomocą elektroforezy i konwencjonalnych barwników żelowych, takich jak niebieski Coomassie, pomarańczowy SYPRO, rubinowy i srebrny barwnik lub detekcja fluorescencyjna lub immunologiczna12,24. Molekularne aspekty aktywności DUB, takie jak minimalna długość łańcucha i swoistość wiązania25,26,27,28, można wyjaśnić za pomocą łańcuchów ubikwityny o różnych długościach (np. di-, tri-, tetra-ubikwityna) i wiązaniach (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63, liniowe) w testach funkcjonalnych. Warianty związane z NDD mogą napędzać defekty aktywności DUB, które są specyficzne dla typu ogniwa łańcucha ubikwityny11.
Test rozszczepienia di-ubikwityny przy użyciu oczyszczonych rekombinowanych białek DUB może bezpośrednio mierzyć wpływ wariantów NDD na aktywność DUB. USP27X, który jest zmutowany w zaburzeniu niepełnosprawności intelektualnej sprzężonym z NDD X 105 (XLID105)7,28 modeluje przedstawiony tutaj proces. Podejście to pozwala na określenie, w jaki sposób aktywność DUB jest zakłócana przez warianty genów w istniejących i nieznanych NDD związanych z DUB.

<table><tbody><tr><td>Amersham Protran 0,45 NC 200 mm i razy 200 mm 25/PK</td><td>Cytiva</td><td>10600041</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC205872500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760 25</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ubikwityna (mysi monoklonalny)</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 646302, RRID:AB_1659269(</td><td>WB: 1:1000)</td></tr><tr><td>Anti-GST (Owca poliklonalna)</td><td>Odczynniki i usługi MRC-PPU</td><td>Cat# S902A Trzecie krwawienie</td> <td>(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr> <tr><td>Kolby hodowlane z przegrodami 2 l</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-042-5N</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Bradford</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-25</td><td></td></tr><tr><td>Complete, tabletki inhibitora proteazy</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>5056489001</tr><tr><td>Kolumna Econo-Column 1,5 i razy 5 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7371507</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer F1,5&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td></tr><tr><td>Glycerol Genesee</td><td>Scientific</td><td>18-205</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td>https://www.adobe.com/products/illustrator.html</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>https://www.licor.com/bio/image-studio/ </td></tr><tr><td>Inkscape</td><td>Inkscape</td><td></td><td>https://inkscape.org/</td></tr> <tr><td>Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 12-dołkowy żel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranoside)</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-109</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Donkey anty-kozi IgG Przeciwciało wtórne</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-32214</td><td>(WB: 1:10000)</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Osioł Przeciwciało wtórne przeciw myszym IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-32212</td><td>(WB: 1:10000)</td></tr><tr><td>Cyfrowa sucha kąpiel</td><td>Isotemp Fisher Scientific</td><td>88860022</td><td></td></tr><tr><td>K63 Di-Ubiquitin</td><td>South Bay Bio LLC</td><td>SBB-UP0072</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-119</td> LB Rosół Genesee Scientific 11-118 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Gold Biotechnology</td><td>L-040-100</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 Wytrząsarka orbitalna</td><td>laboratoryjna Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE4000-7</td><td></td></tr><tr><td>MES-SDS Bufor do biegania</td><td>Boston Bioproducts Inc</td><td>BP-177</td><td></td></tr><tr><td>Mini rotator rurkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-051</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbek NuPage LDS 4x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Odyseja&nbsp; Fc Imager</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>43214</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26620</td><td></td></tr><tr><td>pGEX6P1 human USP27X</td><td>MRC-PPU Reagents and Services</td><td>DU21193</td><td>https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr> <tr><td>pGEX6P1 human USP27X F313V</td><td>Addgene</td><td>225715</td><td>Koch et at 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 human USP27X S404N</td><td>Addgene</td><td>225717</td><td>Koch i w 2024 r. (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 ludzki USP27X Y381H</td><td>Addgene</td><td>225716</td><td>Koch i w 2024 r. (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>Pierce Glutathione Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16100</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P-470-10</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbat 20 (Tween 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC233360010</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta 2 Competent Cells</td><td>Millipore Sigma</td><td>71402-M</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-216</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson</td><td>100-132-135</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall RC 6 Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (chlorowodorek tris-(karboksetylo)fosfiny)</td><td>Złoto Biotechnologia</td><td>TCEP10</td><td></td></tr><tr><td>Wspaniały bulion w proszku</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-225</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-146</td><td></td></tr><tr><td>Moduł XCell SureLock Mini-Cell i XCell II Blot&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EI0002</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar aktywności enzymatycznej enzymów deubikwitytylacyjnych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi za pomocą testu rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Zaburzenia neurorozwojowe (NDD) są związane z upośledzeniem funkcji układu nerwowego, ale często pozostają słabo poznane na poziomie molekularnym. Odrębne zaburzenia wywołane przez pojedyncze geny dostarczają modeli do badania mechanizmów napędzających nietypowy rozwój neurologiczny. Warianty genów kodujących białka z rodziny enzymów deubikwitylujących (DUB) są związane z kilkoma NDD, ale istnieje potrzeba określenia patogennych mechanizmów zaburzeń napędzanych przez te warianty genów. Wpływ wariantów genów na aktywność DUB można określić eksperymentalnie za pomocą niezależnego od substratu testu rozszczepienia ubikwityny in vitro. Test ten nie wymaga znajomości dalszych substratów do bezpośredniego pomiaru aktywności katalitycznej. W tym przypadku protokół określania wpływu wariantów genów na aktywność enzymatyczną jest modelowany przy użyciu DUB Ubiquitin Specific Protease 27, sprzężonej z chromosomem X (USP27X), która jest zmutowana w niepełnosprawności intelektualnej sprzężonej z chromosomem X 105 (XLID105). Ten eksperymentalny proces może zostać wykorzystany do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń neurorozwojowych napędzanych przez warianty genów DUB.

Aby określić wpływ wariantów związanych z XLID105 na aktywność katalityczną USP27X, z bakterii oczyszczono białka USP27X typu dzikiego oraz warianty związane z XLID105: F313V, Y381H i S404N, wszystkie znakowane GST. Warianty te znajdują się w domenie katalitycznej USP białka USP27X (Rysunek 2A). Ponieważ wcześniej zgłoszono, że USP27X rozszczepia łańcuchy ubikwityny K6331, białka USP27X typu dzikiego oraz warianty związane z XLID105: F313V, Y381H i S404N inkubowano z łańcuchami di-ubikwityny powiązanymi K63 przez 1 h. Próbki te rozdzielono metodą SDS-PAGE32, a białka ubikwityny i USP27X analizowano metodą immunoblottingu. USP27X typu dzikiego indukuje rozszczepienie di-ubikwityny, generując mono-ubikwitynę (Rysunek 2B oraz Rysunek uzupełniający 1). Białka wariantowe USP27X F313V, Y381H i S404N związane z XLID105 nie rozszczepiły tych łańcuchów. Ponieważ warianty F313V, Y381H i S404N zaburzają aktywność katalityczną USP27X, dysfunkcja USP27X wydaje się być głównym mechanizmem leżącym u podstaw XLID1057. Dodatkowe pomiary ilościowe i eksperymenty uzupełniające zostały opisane wcześniej7.
<img alt="Schemat mutacji domeny proteazy ubikwityny (USP27X) i analiza immunoblot dla di-Ub." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wpływ wariantów XLID105 na aktywność deubikwitynującą USP27X. (A) Schemat struktury białka USP27X człowieka, przedstawiający numery reszt oraz lokalizację ocenianych wariantów XLID105 w domenie USP (kolor fioletowy). (B) Oznakowane GST białko USP27X typu dzikiego oraz warianty XLID105 (F313V, Y381H i S404N) inkubowano z łańcuchami di-ubikwityny K63 przez wskazany czas. Analizę immunoblot przeprowadzono z użyciem przeciwciał anty-GST (USP27X) oraz przeciwciał przeciwko ubikwitynie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig02largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Nieprzycięte obrazy blotów do Ryciny 2B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/R1%20Koch%202024%20Jove%20supplemental%20Figure.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół wyjaśnia, jak mierzyć wpływ zmienności genetycznej związanej z zaburzeniami neurorozwojowymi na aktywność enzymu deubikwitylizującego, łącząc oczyszczanie rekombinowanych białek z testami rozszczepienia łańcucha ubikwityny.

Pomiar aktywności enzymatycznej enzymów deubikwitytylacyjnych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi za pomocą testu rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

Interesuje nas określenie molekularnych podstaw zaburzeń neurorozwojowych związanych z wariantami genów w enzymach układu ubikwityny. Wykorzystujemy najnowocześniejsze techniki do analizy szlaków sygnałowych kontrolowanych przez te enzymy i do określenia wpływu wariantów genów na biologię białek. Zaletą tej metody jest to, że jest to technika niezależna od substratu, która nie wymaga wcześniejszej wiedzy na temat podłoży, które są regulowane przez konkretny DUB.W ten sposób możemy bezpośrednio zmierzyć wpływ wariancji genów związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi na aktywność katalityczną DUB i zasugerować możliwe mechanizmy patogenne. Ponieważ funkcje komórkowe większości DUB są słabo poznane, nasze laboratorium skupi się na identyfikacji szlaków sygnałowych, w których pośredniczą te enzymy i jak warianty genów związane z chorobą genetyczną wpływają na te procesy. Na początek rozmrozić 20 mikrolitrów chemicznie kompetentnych komórek Rosetta 2 Escherichia coli na lodzie bezpośrednio przed użyciem.Dodaj od jednego do 10 nanogramów plazmidu ekspresyjnego pGEX6P1 USP27X i inkubuj przez pięć minut na lodzie. Szok cieplny komórek przez 30 sekund w temperaturze 42 stopni Celsjusza w suchej kąpieli. Następnie inkubuj komórki na lodzie przez dwie minuty.Dodaj 80 mikrolitrów pożywki SOC o temperaturze pokojowej do komórek. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z obrotem 200 obr./min w 19-milimetrowej wytrząsarce stołowej z kontrolowaną temperaturą. Następnie umieść 50 mikrolitrów kultury na płytce agarowej LB, uzupełnionej chloramfenikolem i ampicyliną.Inkubować przez 20 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, pokrywką do dołu, w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze. Wybierz pojedynczą kolonię przekształconych bakterii i dodaj ją do 10 mililitrów sterylnego podłoża LB uzupełnionego chloramfenikolem i ampicyliną. Inkubować przez 20 godzin, jak pokazano wcześniej.Następnie dodaj 10 mililitrów nocnej kultury do jednego litra pożywki gruźliczej uzupełnionej chloramfenikolem i ampicyliną. Inkubować, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,5 do 0,6. Następnie dodaj 50-mikromolowy beta-d-1-tiogalaktopiranozyd izopropylowy do hodowli w celu wywołania ekspresji.Po schłodzeniu próbki do 16 stopni Celsjusza inkubować przez 20 godzin w temperaturze 16 stopni Celsjusza z obrotem 200 obr./min. Następnie odwirować komórki przez 20 minut w temperaturze 3000 G lub wyższej w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzać komórki z hodowli ekspresyjnej. Na koniec przechowuj granulat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę.Na początek zabezpiecz pustą kolumnę przepływu grawitacyjnego w stojaku na retortę. Napełnij kolumnę dwoma do trzech mililitrów żywicy agarozowej glutationu, aby oczyścić osad komórkowy zebrany z jednego litra kultury ekspresyjnej. Umyć kolumnę jednym złożem żywicy o objętości 20% etanolu.Po umyciu kolumny rozmrozić osad komórkowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj 30 mililitrów buforu MS500 do rozmrożonego osadu i inkubuj z delikatnym obracaniem od końca do końca. Teraz sonikuj zlizowane komórki w 50-mililitrowej probówce wirówkowej na lodzie, aż lizat będzie swobodnie przepływał po dozowaniu z końcówki pipety.Wirować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 20 000 g lub wyższej w celu usunięcia sklarowanego nad osadem. Następnie zdekantować supernatant do zlewki i załadować oczyszczony lizat na kolumnę. Przepuść lizat przez kolumnę za pomocą przepływu grawitacyjnego, jednocześnie zbierając przepływ.Następnie przemyć kolumnę co najmniej dwiema objętościami złoża żywicy buforu płuczącego MS500 i zebrać przepływ płukania w pięciu mililitrowych frakcjach. Następnie dodaj jeden mikrolitr każdej frakcji do 100 mikrolitrów odczynnika Bradford, aby sprawdzić obecność białka. Odzyskaj białko, uruchamiając bufor elucji MS500 przez kolumnę i zbierając pięć mililitrowych frakcji elucyjnych.Aby wytrącić białko, dodaj dwie objętości czteromolowego siarczanu amonu do eluatu i delikatnie odwróć probówkę, aż stanie się mętna. Wirować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 20 000 g lub wyższej. Usunąć supernatant po każdym wirowaniu, nie naruszając osadu białkowego.Następnie ponownie rozpuść białko w buforze MS500 uzupełnionym 25% glicerolem przed przechowywaniem. Przygotuj 10 mikrolitrów oczyszczonego USP27X oznaczonego GST w buforze aktywacji enzymu deubikwitylującego dla każdego punktu czasowego dla każdego enzymu deubikwitylacyjnego. Przed dodaniem łańcuchów ubikwityny dodaj siedem mikrolitrów bufora ładującego SDS-PAGE do próbki czasu zero, aby zapobiec rozpoczęciu reakcji deubikwitylacji.Do każdego punktu czasowego dla każdego enzymu deubikwitylującego dodaj 375 nanogramów łańcuchów di-ubikwityny połączonych K63 rozcieńczonych w 10 mikrolitrach buforu aktywującego enzym. Inkubuj probówki w temperaturze 30 stopni Celsjusza, zatrzymując każdy punkt czasowy, dodając siedem mikrolitrów bufora ładującego SDS-PAGE. Wykonaj SDS-PAGE za pomocą żelu gradientowego od czterech do 12%.Dziki typ USP27X rozszczepił łańcuchy di-ubikwityny połączone K63 na mono-ubikwitynę po godzinie inkubacji. Związana z XLID-105 wariancja F313V, Y381H i S404N nie rozszczepiała łańcuchów di-ubikwityny połączonych K63 po jednej godzinie inkubacji.

measuring-enzymatic-activity-neurodevelopmental-disorder-associated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ubikwitynacja jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zestaw trzech enzymów. Mutacje genów zaangażowanych w tę modyfikację są powiązane z wieloma różnymi chorobami ludzi. W niniejszej pracy opisujemy protokoły wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych in vivo oraz w probówkach in vitro.

Wykrywanie ubikwitynacji białek

Obecny protokół szczegółowo opisuje metodę pomiaru aktywności funkcjonalnie homologicznych enzymów deubikwitynujących. Specjalistyczne sondy kowalencyjnie modyfikują enzym i pozwalają na jego wykrycie. Metoda ta ma potencjał w zakresie identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Metoda pomiaru aktywności enzymów deubikwitynujących w liniach komórkowych i próbkach tkanek

Ubikwitynacja to modyfikacja potranslacyjna, która odgrywa ważną rolę w procesach komórkowych i jest ściśle koordynowana przez deubikwitynację. Defekty w obu reakcjach leżą u podstaw ludzkich patologii. Udostępniamy protokoły do przeprowadzania reakcji ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych składników.

Testy ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro histonów nukleosomalnych

Ten protokół ma na celu efektywne ilościowe określanie aktywności systemu ubikwityna-proteasom (UPS) w różnych przedziałach komórkowych mózgu gryzoni. Użytkownicy mogą badać działanie UPS we frakcjach jądrowych, cytoplazmatycznych i synaptycznych u tego samego zwierzęcia, co skraca czas i liczbę zwierząt potrzebnych do przeprowadzenia tych złożonych analiz.

Kwantyfikacja subkomórkowej aktywności ubikwityny-proteasomu w mózgu gryzoni

Ta metoda opisuje ocenę globalnych zmian w topologii łańcucha ubikwityny. Ocena jest przeprowadzana poprzez zastosowanie ukierunkowanego podejścia proteomicznego opartego na spektrometrii mas.

Analiza łańcucha ubikwityny za pomocą równoległego monitorowania reakcji

Niniejsze badanie dostarcza szczegółowych protokołów testów ubikwitylacji in vitro do analizy aktywności katalitycznej ligazy ubikwityny E3. Rekombinowane białka ulegały ekspresji przy użyciu systemów prokariotycznych, takich jak hodowla Escherichia coli.

In vitro Analiza funkcji ligazy ubikwityny E3

Opracowano prostą i skalowalną metodę oceny funkcjonalnego znaczenia wariantów missense w Ube3a, genie, którego utrata i zysk funkcji są związane zarówno z zespołem Angelmana, jak i zaburzeniem ze spektrum autyzmu.

Skalowalna, komórkowa metoda oceny funkcjonalnej wariantów Ube3A

Eksperyment wykorzystany tutaj pokazuje metodę dokowania molekularnego w połączeniu z technologiami sond do przewidywania i walidacji interakcji między małymi cząsteczkami tradycyjnej medycyny chińskiej a celami białkowymi.

Badania przesiewowe związków tradycyjnej medycyny chińskiej pod kątem hamowania aktywności UCHL3 w oparciu o technologię molekularnego dokowania i deubikwitynacji sondy enzymatycznej

Opisano wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych enzymów. Ten multipleksowany, gotowy do użycia zestaw testowy składa się z wstępnie wybranych substratów Chromogennego Polymeru Hydrogelu (CPH) i złożonych Inierozpuszczalnych wC hromogennych substratach ioB (ICB). Enzymy docelowe to endoenzymy i proteazy rozkładające polisacharydy.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe enzymów rozkładających węglowodany przy użyciu nowatorskich zestawów do oznaczania nierozpuszczalnych substratów chromogennych

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest aktywowana w fazie G2 cyklu komórkowego i reguluje wiele szlaków komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu kinazy in vitro z Cdk1, który umożliwia identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w celu ustalenia celów komórkowych tej ważnej kinazy.

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Poznaj metodę pomiaru aktywności enzymów deubikwitytylacyjnych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi. Technika ta pozwala bezpośrednio ocenić wpływ wariantów genetycznych na aktywność katalityczną DUB.

Pomiar aktywności enzymatycznej enzymów deubikwitytylacyjnych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi za pomocą testu rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar aktywności enzymatycznej enzymów deubikwitytylacyjnych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi za pomocą testu rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro

Przeglądaj więcej filmów