Pomiar aktywności enzymatycznej enzymów deubikwitytylacyjnych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi za pomocą testu rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro
27 września 2024
Ten protokół wyjaśnia, jak mierzyć wpływ zmienności genetycznej związanej z zaburzeniami neurorozwojowymi na aktywność enzymu deubikwitylizującego, łącząc oczyszczanie rekombinowanych białek z testami rozszczepienia łańcucha ubikwityny.
Interesuje nas określenie molekularnych podstaw zaburzeń neurorozwojowych związanych z wariantami genów w enzymach układu ubikwityny. Wykorzystujemy najnowocześniejsze techniki do analizy szlaków sygnałowych kontrolowanych przez te enzymy i do określenia wpływu wariantów genów na biologię białek. Zaletą tej metody jest to, że jest to technika niezależna od substratu, która nie wymaga wcześniejszej wiedzy na temat podłoży, które są regulowane przez konkretny DUB.
W ten sposób możemy bezpośrednio zmierzyć wpływ wariancji genów związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi na aktywność katalityczną DUB i zasugerować możliwe mechanizmy patogenne. Ponieważ funkcje komórkowe większości DUB są słabo poznane, nasze laboratorium skupi się na identyfikacji szlaków sygnałowych, w których pośredniczą te enzymy i jak warianty genów związane z chorobą genetyczną wpływają na te procesy. Na początek rozmrozić 20 mikrolitrów chemicznie kompetentnych komórek Rosetta 2 Escherichia coli na lodzie bezpośrednio przed użyciem.
Dodaj od jednego do 10 nanogramów plazmidu ekspresyjnego pGEX6P1 USP27X i inkubuj przez pięć minut na lodzie. Szok cieplny komórek przez 30 sekund w temperaturze 42 stopni Celsjusza w suchej kąpieli. Następnie inkubuj komórki na lodzie przez dwie minuty.
Dodaj 80 mikrolitrów pożywki SOC o temperaturze pokojowej do komórek. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z obrotem 200 obr./min w 19-milimetrowej wytrząsarce stołowej z kontrolowaną temperaturą. Następnie umieść 50 mikrolitrów kultury na płytce agarowej LB, uzupełnionej chloramfenikolem i ampicyliną.
Inkubować przez 20 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, pokrywką do dołu, w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze. Wybierz pojedynczą kolonię przekształconych bakterii i dodaj ją do 10 mililitrów sterylnego podłoża LB uzupełnionego chloramfenikolem i ampicyliną. Inkubować przez 20 godzin, jak pokazano wcześniej.
Następnie dodaj 10 mililitrów nocnej kultury do jednego litra pożywki gruźliczej uzupełnionej chloramfenikolem i ampicyliną. Inkubować, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,5 do 0,6. Następnie dodaj 50-mikromolowy beta-d-1-tiogalaktopiranozyd izopropylowy do hodowli w celu wywołania ekspresji.
Po schłodzeniu próbki do 16 stopni Celsjusza inkubować przez 20 godzin w temperaturze 16 stopni Celsjusza z obrotem 200 obr./min. Następnie odwirować komórki przez 20 minut w temperaturze 3000 G lub wyższej w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzać komórki z hodowli ekspresyjnej. Na koniec przechowuj granulat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę.
Na początek zabezpiecz pustą kolumnę przepływu grawitacyjnego w stojaku na retortę. Napełnij kolumnę dwoma do trzech mililitrów żywicy agarozowej glutationu, aby oczyścić osad komórkowy zebrany z jednego litra kultury ekspresyjnej. Umyć kolumnę jednym złożem żywicy o objętości 20% etanolu.
Po umyciu kolumny rozmrozić osad komórkowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj 30 mililitrów buforu MS500 do rozmrożonego osadu i inkubuj z delikatnym obracaniem od końca do końca. Teraz sonikuj zlizowane komórki w 50-mililitrowej probówce wirówkowej na lodzie, aż lizat będzie swobodnie przepływał po dozowaniu z końcówki pipety.
Wirować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 20 000 g lub wyższej w celu usunięcia sklarowanego nad osadem. Następnie zdekantować supernatant do zlewki i załadować oczyszczony lizat na kolumnę. Przepuść lizat przez kolumnę za pomocą przepływu grawitacyjnego, jednocześnie zbierając przepływ.
Następnie przemyć kolumnę co najmniej dwiema objętościami złoża żywicy buforu płuczącego MS500 i zebrać przepływ płukania w pięciu mililitrowych frakcjach. Następnie dodaj jeden mikrolitr każdej frakcji do 100 mikrolitrów odczynnika Bradford, aby sprawdzić obecność białka. Odzyskaj białko, uruchamiając bufor elucji MS500 przez kolumnę i zbierając pięć mililitrowych frakcji elucyjnych.
Aby wytrącić białko, dodaj dwie objętości czteromolowego siarczanu amonu do eluatu i delikatnie odwróć probówkę, aż stanie się mętna. Wirować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 20 000 g lub wyższej. Usunąć supernatant po każdym wirowaniu, nie naruszając osadu białkowego.
Następnie ponownie rozpuść białko w buforze MS500 uzupełnionym 25% glicerolem przed przechowywaniem. Przygotuj 10 mikrolitrów oczyszczonego USP27X oznaczonego GST w buforze aktywacji enzymu deubikwitylującego dla każdego punktu czasowego dla każdego enzymu deubikwitylacyjnego. Przed dodaniem łańcuchów ubikwityny dodaj siedem mikrolitrów bufora ładującego SDS-PAGE do próbki czasu zero, aby zapobiec rozpoczęciu reakcji deubikwitylacji.
Do każdego punktu czasowego dla każdego enzymu deubikwitylującego dodaj 375 nanogramów łańcuchów di-ubikwityny połączonych K63 rozcieńczonych w 10 mikrolitrach buforu aktywującego enzym. Inkubuj probówki w temperaturze 30 stopni Celsjusza, zatrzymując każdy punkt czasowy, dodając siedem mikrolitrów bufora ładującego SDS-PAGE. Wykonaj SDS-PAGE za pomocą żelu gradientowego od czterech do 12%.
Dziki typ USP27X rozszczepił łańcuchy di-ubikwityny połączone K63 na mono-ubikwitynę po godzinie inkubacji. Związana z XLID-105 wariancja F313V, Y381H i S404N nie rozszczepiała łańcuchów di-ubikwityny połączonych K63 po jednej godzinie inkubacji.
Przegląd
Niniejszy protokół wyjaśnia, w jaki sposób mierzyć wpływ wariacji genetycznych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi na aktywność enzymów deubikwitynujących. Metoda ta łączy oczyszczanie białek rekombinowanych z testami rozszczepiania łańcuchów ubikwityny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Zaburzenia neurorozwojowe
- System ubikwitynowy
- Enzymy deubikwitynujące (DUB)
Wprowadzenie
- Warianty genów w enzymach systemu ubikwitynowego są powiązane z zaburzeniami rozwoju neurologicznego.
- Zrozumienie funkcji komórkowych DUB jest kluczowe dla wyjaśnienia ich roli w chorobach.
- Celem badania jest analiza szlaków sygnalizacyjnych kontrolowanych przez DUB.
- Do zastosowania tej metody nie jest wymagana uprzednia wiedza na temat substratów.
Cel badania
- Pomiar wpływu wariantów genów na aktywność katalityczną DUB.
- Zaproponowanie możliwych mechanizmów patogennych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi.
- Identyfikacja szlaków sygnalizacyjnych pośredniczących przez DUB.
Zastosowane metody
- Oczyszczanie białek rekombinowanych.
- Analizy cięcia łańcuchów ubikwityny.
- Wykorzystanie chemicznie kompetentnych komórek Escherichia coli Rosetta 2.
- Analiza aktywności DUB w odniesieniu do wariantów genetycznych.
Główne wyniki
- Bezpośredni pomiar wpływu wariancji genetycznej na aktywność DUB.
- Identyfikacja potencjalnych szlaków sygnalizacyjnych zależnych od DUB.
- Wgląd w molekularne podstawy zaburzeń neurorozwojowych.
- Opracowanie techniki analizy DUB niezależnej od substratu.
Wnioski
- Badanie dostarcza ram dla zrozumienia roli DUB w zaburzeniach neurorozwojowych.
- Podkreśla ono znaczenie wariantów genetycznych w aktywności enzymatycznej.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu zbadania możliwości terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośredni pomiar aktywności enzymu deubikwitynującego (DUB) z wykorzystaniem niezależnego od substratu testu rozszczepiania łańcucha ubikwityny in vitro umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka wariantów genów związanych z zaburzeniami rozwoju neurologicznego. Podejście to zapewnia wiarygodność prognostyczną w walidacji celów i wyjaśnia wpływ zmian genetycznych na aktywność enzymatyczną, wspierając wczesną selekcję projektów w obszarze neurobiologii i rzadkich chorób.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez bezpośrednie powiązanie wariantów genowych z dysfunkcją enzymatyczną.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez wyjaśnienie mechanistycznego wpływu mutacji DUB bez konieczności znajomości substratu.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów w przypadku genów powiązanych z zaburzeniami neurorozwojowymi.
- Dostarcza praktycznych danych dla zwiększenia pewności prognostycznej i wczesnego podejmowania decyzji dotyczących portfolio.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Służy do przygotowania zwalidowanych rekombinowanych białek DUB do dalszych analiz biochemicznych i fenotypowych.
- Standaryzuje ilościowy pomiar aktywności DUB przy użyciu powtarzalnych odczytów niezależnych od substratu.
- Umożliwia tworzenie skalowalnych platform analitycznych do badania wpływu wariantów w obrębie rodzin genów DUB.
- Wspiera wiarygodną ocenę związków poprzez ustanowienie stabilnych linii bazowych aktywności enzymatycznej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje odkrycia molekularne z mechanizmami istotnymi dla chorób w zaburzeniach neurorozwojowych.
- Zapewnia ciągłość przejścia od odkryć genetycznych do wyboru modeli przedklinicznych i opracowania biomarkerów.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka poprzez wyjaśnienie patogenności wariantu na poziomie molekularnym.
- Minimalizuje ryzyko w procesie translacyjnym poprzez ustanowienie bezpośrednich zależności między genotypem a funkcją.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy test rozszczepiania łańcucha ubikwityny wpisuje się w wczesny etap procesu od odkrycia do identyfikacji wiodących cząsteczek, stanowiąc pomost między identyfikacją wariantów genetycznych a walidacją funkcjonalną i priorytetyzacją przedkliniczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez bezpośredni pomiar aktywności katalitycznej DUB w kontekście wariantów związanych z chorobami.
- Przesiewowanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki w celu oceny gotowości testu oraz porównania między różnymi wariantami.
- Analityka: Dostarcza precyzyjne pomiary aktywności enzymatycznej, które służą do analiz specyficznych dla danej kondycji oraz badań nad mechanizmami.
- Badania translacyjne: Łączy dysfunkcję molekularną z mechanizmami chorobowymi, wspierając dopasowanie biomarkerów i wybór modeli.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny funkcjonalnej wariantów DUB w obszarze chorób neurorozwojowych oraz innych jednostek chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu terapeutycznego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne testy aktywności enzymatycznej.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie portfelem kapitałowym dzięki wczesnemu wyjaśnieniu wpływu wariantów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój genetycznie zwalidowanych celów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu ekspresji i oczyszczania białek rekombinowanych.
- Wymagany jest dostęp do infrastruktury analitycznej do przeprowadzania elektroforezy SDS-PAGE oraz ilościowych analiz białek.
- Konieczna jest standaryzacja warunków analizy i interpretacji danych pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja metody dla różnych członków rodziny DUB lub typów wariantów.
- Metoda ogranicza się do aktywności enzymatycznej in vitro; nie uwzględnia kontekstu komórkowego ani efektów potokowych.
