Name: Mysi model transformacji krwotocznej wywołanej ostrą hiperglikemią w połączeniu z przejściowym ogniskowym niedokrwieniem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj protokół modelu krwotocznej transformacji u myszy C57BL/6 z ostrą hiperglikemią przy użyciu techniki MCAO/R. Metoda zapewnia wysoką powtarzalność, stabilność i niską śmiertelność zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rysunek 1 został stworzony za pomocą oprogramowania BioRender (https://www.biorender.com/). Badanie to zostało wsparte grantami z projektu przewodniego Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Hubei (nr 2022CFC057).

Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Jianghan (JHDXLL2024-080) i przeprowadzony zgodnie z Wytycznymi Etycznymi dla Zwierząt Doświadczalnych wydanymi przez Centrum Kontroli Chorób w Chinach. W badaniu wykorzystano dorosłe samce myszy C57BL/6J o masie ciała 21–26 g. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Grupowanie zwierząt i wywoływanie ostrej hiperglikemii
<ol>
	<li>Trzymaj myszy w centrum zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Jianghan w 12-godzinnym środowisku kontrolowanym cyklem światła/ciemności (20–22 °C, 50%–55% wilgotności) z jedzeniem i wodą ad libitum.</li>
	<li>Losowo podziel myszy na cztery grupy: Sham + sól fizjologiczna (n = 12), Sham + glukoza (n = 12), MCAO + sól fizjologiczna (n = 12) i MCAO + glukoza (n = 20).</li>
</ol>
2. Przygotowanie przedoperacyjne
UWAGA: Wszystkie eksperymentalne myszy pościły przez 12 godzin przed operacją.
<ol>
	<li>Analgezję ogólnoustrojową (meloksykam, 5 mg/kg mc. podskórnie) i znieczulenie miejscowe w miejsce nacięcia należy podawać w okresie okołooperacyjnym (bupiwakaina, 2 mg/kg mc. podskórnie).</li>
	<li>Sterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne, waciki i szwy chirurgiczne przez autoklawowanie w warunkach 121 °C i 15 psi przez 30 minut.</li>
	<li>Przetrzyj platformę chirurgiczną i otaczający ją obszar roboczy 75% etanolem i włącz przełącznik ogrzewania przy temperaturze ustawionej na 37 °C.</li>
	<li>Znieczulij mysz mieszaniną 3% izofluranu i 20% tlenu gazowego w komorze indukcyjnej znieczulenia. Następnie oceń odruch szczypania palca u nogi, aby przetestować głębokość znieczulenia.</li>
	<li>Przesuń mysz po platformie operacyjnej w pozycji leżącej i szybko włóż nos myszy do stożka nosowego. Otwórz przepływ gazu do stożka nosowego, zamykając przepływ do komory indukcyjnej znieczulenia. Dostosuj proporcję izofluranu do 2% i ustaw przepływ mieszaniny gazów na 0,4 ml/min w celu utrzymania znieczulenia.</li>
	<li>Nałóż żel pod oczy myszy, aby utrzymać wilgoć podczas zabiegu.</li>
	<li>Ogol włosy w okolicy szyi za pomocą maszynki do strzyżenia zwierząt. Oczyść i zdezynfekuj skórę, naprzemiennie nakładając jod i 70% etanol za pomocą dezynfekującego bawełnianego patyczka.</li>
	<li>Przykryj jałową gazę na szyi i wytnij otwór, aby odsłonić obszar operacyjny.</li>
</ol>
3. Podstawowy pomiar przepływu krwi w mózgu
<ol>
	<li>Ogol włosy w okolicy skóry głowy za pomocą maszynki do strzyżenia zwierząt. Oczyść i zdezynfekuj skórę głowy, naprzemiennie nakładając jod i 70% etanol za pomocą dezynfekującego bawełnianego patyczka.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie linii środkowej o długości 1,0 cm w skórze nad obszarem czołowym, aby odsłonić ciemiączko czaszki. Utrzymuj czaszkę wilgotną zwykłą solą fizjologiczną.</li>
	<li>Przygotować przyrząd do laserowego przepływomierza dopplerowskiego (LDF) i trzymać końcówkę sondy LDF prostopadle do powierzchni lewej czaszki ciemieniowej (1 mm z tyłu i 5 mm z boku do bregmy); gdy FLUX jest stabilny i zapisać wartość wyjściową. 
	UWAGA: Jednostką miary dla FLUX są jednostki perfuzji (PU), z zakresem pomiarowym 0-1000 PU. Idealne wyjściowe CBF w laserowym przepływomierzu dopplerowskim to >600 PU. Ciągły okres 5 sekund z zakresem wahań mniejszym niż 10% jest uważany za prawidłowy odczyt FLUX.</li>
	<li>Zszyj mięsień i skórę oddzielnie za pomocą szwu wchłanialnego 5.0 PGA. Na ranę nałożyć diklofenak, żel sodowy i maść mupirocyny.</li>
</ol>
4. Zabieg chirurgiczny MCAO
UWAGA: MCAO jest wykonywane przy użyciu zmodyfikowanej metody gwintowania, jak wcześniej opisali Chiang et al.13.
<ol>
	<li>Delikatnie obróć mysz do pozycji leżącej na plecach i podawaj myszom dootrzewnowo 30% glukozy (7,2 ml/kg) lub sól fizjologiczną na 15 minut przed zabiegiem chirurgicznym. 
	UWAGA: Myszy z grup Sham + glukoza i MCAO + glukoza otrzymały dootrzewnowe zastrzyki glukozy. Myszy z grup Sham + sól fizjologiczna i MCAO + sól fizjologiczna otrzymały dootrzewnowe zastrzyki normalnej soli fizjologicznej.</li>
	<li>Ogol włosy w okolicy szyi za pomocą maszynki do strzyżenia zwierząt. Oczyść i zdezynfekuj skórę, naprzemiennie nakładając jod i 70% etanol za pomocą dezynfekującego bawełnianego patyczka. Przykryj szyję sterylną gazą i wytnij otwór, aby odsłonić obszar operacyjny. 
	UWAGA: Upewnij się, że nacięcie jest proste, aby uzyskać optymalną wizualizację tętnicy szyjnej.</li>
	<li>Wykonaj 1,5 cm nacięcie w linii środkowej na brzusznej stronie szyi za pomocą skalpela. Rozsuń tkankę podskórną i powięź powierzchowną za pomocą pęsety chirurgicznej. 
	UWAGA: Upewnij się, że nacięcie jest proste, aby uzyskać optymalną wizualizację tętnicy szyjnej.</li>
	<li>Pod powięzią powierzchowną zlokalizuj gruczoł podżuchwowy i odwrócony trójkąt utworzony przez trzy mięśnie: mostek gnykowo-gnykowy, umieszczony na linii środkowej nad tchawicą; tylny brzuch mięśnia dwubrzuścowego, rozpoznawalny po błyszczącej białej części ścięgnistej; i wreszcie mięsień mostkowo-sutkowy.</li>
	<li>Wykonaj rozwarstwienie w odwróconym trójkącie, aby zidentyfikować i oddzielić lewą tętnicę szyjną wspólną (CCA).</li>
	<li>Wypreparuj nerw błędny przylegający do CCA i tkankę śluzówkową otaczającą naczynia krwionośne za pomocą kleszczy okulistycznych. Wykonaj dzwonek na CCA za pomocą wchłanialnego szwu z kwasu poliglikolowego 5.0 (PGA), ale nie utrzymuj szwu napiętego.</li>
	<li>Oddzielony w górę wzdłuż CCA można zaobserwować rozwidlenie "Y", które dzieli CCA na tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) i tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA).</li>
	<li>Oddziel rozwidlenie, aby w pełni odsłonić ECA i ICA. Zapętlić i mocno zawiązać wchłanialny szew 5.0 PGA wokół ECA dystalnie od rozwidlenia. 
	UWAGA: Zapewnić wystarczającą odległość między miejscem stałego podwiązania a rozwidleniem naczyń krwionośnych, aby zapobiec przemieszczaniu się nici podczas obracania ECA.</li>
	<li>Tymczasowo zaciśnij zarówno CCA, jak i ICA za pomocą dwóch lekkich zacisków mikro serrafine tętnic tętniczych o wymiarach 8 mm x 2 mm, aby zablokować przepływ krwi z CCA do ICA.</li>
	<li>Rozciągnij opaskę szwów na dystalnej części ECA i CCA, aby wyprostować segment ECA.</li>
	<li>Użyj mikronożyczek, aby wykonać małe nacięcie między dwoma mocowaniami szwów na ECA.</li>
	<li>Włożyć do ECA nici monofilamentowy pokryty silikonem (o długości 30 mm, silikon powlekany 3–4 mm). Zapętlić i lekko zawiązać drugi wchłanialny szew 5.0 PGA na ECA w pobliżu rozwidlenia, aby zapobiec cofaniu się szwu monofilamentowego.</li>
	<li>Całkowicie przeciąć ECA dystalnie do stałego podwiązania i usunąć zacisk kleszczy tętniczych z ICA.</li>
	<li>Wycofaj szew do rozwidlenia CCA, a następnie ostrożnie schuj i obróć kikut ECA. Dostosuj kierunek wprowadzania szwu i powoli wprowadzaj go, około 9,0–10,0 mm od rozwidlenia CCA do ICA, aby zamknąć MCA.</li>
	<li>Zaciśnij drugi wchłanialny szew PGA wokół ECA i usuń zacisk tętnicy z CCA.</li>
	<li>Zszyj mięsień i skórę oddzielnie za pomocą szwu wchłanialnego 5.0 PGA. Na ranę nałożyć diklofenak, żel sodowy i maść mupirocyny.</li>
	<li>Delikatnie obróć mysz do pozycji leżącej i powtórz krok 3.4., aby zarejestrować przepływ krwi po okluzji MCA. 
	UWAGA: Myszy wykazujące zmniejszenie przepływu krwi o mniej niż 40% wartości wyjściowej po MCAO zostały wykluczone z badania14.</li>
	<li>Włącz wyłącznik ogrzewania klatki rekonwalescencji z temperaturą ustawioną na 37°C. Umieść mysz w klatce odzyskiwania w okresie po okluzji (60 min).</li>
</ol>
5. Usuwanie i reperfuzja monofilamentu
<ol>
	<li>Ponownie znieczulij mysz zgodnie z wcześniejszym opisem tuż przed zakończeniem okresu okluzji.</li>
	<li>Zacisnąć CCA za pomocą zacisku tętniczego z mikroklipsem.</li>
	<li>Częściowo wycofaj żyłkę z ICA, aż końcówka pokryta silikonem stanie się widoczna przez ICA.</li>
	<li>Umieść kolejny zacisk tętnicy mikroklipsowej na ICA nad końcówką pokrytą silikonem.</li>
	<li>Całkowicie wyciągnij żyłkę i mocno podwiąż kikut ECA.</li>
	<li>Usuń zacisk tętnicy mikroklipsowej odpowiednio z ICA i CCA.</li>
	<li>Zszyj mięsień i skórę warstwa po warstwie za pomocą wchłanialnego szwu 5.0 PGA.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze odzyskiwania i monitoruj wszystkie myszy, aż w pełni się obudzą. Meloksykam (5 mg/kg mc., podskórnie) należy podawać w celu złagodzenia bólu co 12 godzin przez okres do 24 godzin.</li>
</ol>
6. Pomiar stężenia glukozy we krwi
UWAGA: Poziom glukozy we krwi mierzono w następujących punktach czasowych: (1) tuż przed operacją MCAO (wartość wyjściowa), (2) bezpośrednio po wprowadzeniu monofilamentu (15 minut po wstrzyknięciu glukozy), (3) bezpośrednio po odstawieniu monofilamentu bezpośrednio po włożeniu monofilamentu (75 minut po wstrzyknięciu glukozy).
<ol>
	<li>Przetrzyj ogon myszy wacikiem nasączonym alkoholem, aby żyła ogonowa była całkowicie przekrwiona.</li>
	<li>Odetnij końcówkę ogona o 1–2 mm za pomocą nożyczek chirurgicznych.</li>
	<li>Delikatnie ściśnij wzdłuż nasady ogona do czubka ogona, ułatwiając przepływ krwi z nacięcia.</li>
	<li>Umieść zbiornik absorpcyjny próbki bibułki testowej na krawędzi kropli krwi. 
	UWAGA: Krew zostanie wciągnięta do papieru testowego ze względu na efekt syfonowania.</li>
	<li>Odczytaj odczyt glukometru i zapisz wynik. 
	UWAGA: Wyklucz myszy, u których poziom glukozy we krwi nie wzrósł powyżej 10 mmol/L po 15 minutach wstrzyknięcia glukozy.</li>
	<li>Usuń nadmiar krwi za pomocą wacika i uciskaj, aby zatrzymać krwawienie.</li>
</ol>
7. Barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC)
<ol>
	<li>Poddać mysz eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie przedawkowania pentobarbitalu (300 mg/kg).</li>
	<li>Gdy mysz przestanie oddychać, natychmiast unieruchom ją w pozycji leżącej.</li>
	<li>Otwórz klatkę piersiową za pomocą nożyczek i wytnij przeponę, aby odsłonić serce.</li>
	<li>Wprowadzić igłę do wstrzykiwań 23 G do lewej komory myszy i naciąć wyrostek uszny nożyczkami.</li>
	<li>Roztworuj 15 ml soli fizjologicznej, aż płyn spływający z wyrostka robaczkowego usznego stanie się czysty i przezroczysty.</li>
	<li>Odetnij głowę myszy i rozetnij skórę głowy, aby całkowicie odsłonić czaszkę za pomocą nożyczek. Włóż końcówkę nożyczek 2 mm lekko przed szew koronowy czaszki, aby ją podważyć.</li>
	<li>Użyj pęsety, aby usunąć nienaruszoną tkankę mózgową myszy.</li>
	<li>Umieść tkankę mózgową w matrycy mózgu gryzonia i pokrój ją na 2 mm plastry koronalne.</li>
	<li>Przenieść plastry na płytkę 24-dołkową i inkubować je w 2% roztworze TTC w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie skanujące i ustaw ustawienia parametrów na rozdzielczość 1200 dpi i format JPG do analizy obrazu.</li>
	<li>Wytnij skrawki tkanki z płytki 24-dołkowej za pomocą zakrzywionych kleszczyków i ułóż skrawki na szklanej płytce skanującej.</li>
	<li>Zeskanuj skrawki tkanki, a następnie wyeksportuj obrazy do analizy pomiarów.</li>
	<li>Zmierz obszar zawału, korygując obrzęk tkanek. Odejmij obszar bez zawału po stronie ipsilateralnej od obszaru po stronie przeciwległej za pomocą oprogramowania ImageJ15. Oceń rozmiar zawału jako procent przeciwległej półkuli. Aby uzyskać dodatkowe informacje na temat analizy obszaru zawału, zapoznaj się z Friedländer et al.16.</li>
</ol>
8. Obserwacja Grossa
<ol>
	<li>Powtórz kroki 7.1–7.8.</li>
	<li>Wytnij skrawki tkanki z matrycy mózgu za pomocą zakrzywionych kleszczy i ułóż skrawki na szklanej płytce skanującej.</li>
	<li>Zeskanuj sekcje koronalne mózgu zgodnie z opisem w krokach 7.10 i 7.12.</li>
</ol>
9. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)
<ol>
	<li>Powtórz kroki 7.1–7.4. Powoli przetopić 15 ml soli fizjologicznej, a następnie perfuzję około 15 ml paraformaldehydu (PFA).</li>
	<li>Powtórz kroki 7.6–7.7. Utrwal tkankę mózgową za pomocą 4% PFA przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść utrwaloną tkankę mózgową w automatycznym odwadniaczu tkanek w celu odwodnienia, witryfikacji i zanurzenia w wosku.</li>
	<li>Osadź tkankę w wosku parafinowym i pokrój tkankę mózgową na plastry koronalne o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu.</li>
	<li>Odwoskuj plaster, zanurzając go trzykrotnie w ksylenie, przy czym każde zanurzenie trwa 8 minut. Następnie stopniowo zanurzaj plaster w roztworach etanolu o malejących stężeniach (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), a następnie w wodzie destylowanej, przy czym każdy krok trwa 5 minut.</li>
	<li>Plamić plasterek roztworem hematoksyliny przez 3 minuty. Następnie rozróżnicuj go, zanurzając go w 5% alkoholu kwasu solnego na 5 s.</li>
	<li>Inkubuj plasterek z roztworem eozyny przez 1 minutę, a następnie odwodnij i hialinizuj go gradientowym roztworem etanolu (90%, 95%, 100%) i ksylenem.</li>
	<li>Zamontuj sekcję za pomocą żywic neutralnych.</li>
	<li>Uchwyć obrazy barwionych H&E wycinków mózgu w jasnym polu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>
10. Oznaczanie leku Evans Blue (EB)
UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tej procedury, zapoznaj się z Wang et al.17.
<ol>
	<li>Wstrzyknąć 2% (w/v) roztwór Evans Blue (EB) (2 ml/kg) przez żyłę ogonową 23 godziny po MCAO.</li>
	<li>Powtórz kroki 7.1–7.7 godzinę po wstrzyknięciu EB i zrób zdjęcie całego mózgu.</li>
	<li>Umieść mózg w matrycy mózgu gryzonia i pokrój go koronalnie na plastry o średnicy 2 mm. Zeskanuj odcinki korony mózgu zgodnie z opisem w krokach 7.10–7.12, aby zaobserwować przeciek EB.</li>
	<li>Podziel plastry na prawą i lewą część i włóż każdą z nich do probówki wirówkowej.</li>
	<li>Homogenizuj każdy wycinek tkanki mózgowej w 50% kwasie trichlorooctowym, w proporcji 100 mg tkanki mózgowej do 0,4 ml kwasu trójchlorooctowego.</li>
	<li>Po inkubacji w temperaturze 4 °C przez noc odwirowywać homogenat przez 30 minut w temperaturze 10 000 x g (w temperaturze 4 °C).</li>
	<li>Przenieść ciecz sklarowaną nad osadem do innej probówki wirówkowej i rozcieńczyć ją czterokrotnie etanolem.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję cieczy sklarowanej nad osadem przy długości fali 620 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Przelicz wartości absorbancji na stężenie EB przy użyciu wzorcowej krzywej EB w etanolu (np. przy 31,25, 62,5, 125 i 250 ug/ml). 
	UWAGA: Wynik jest przedstawiony jako mikrogram EB na gram tkanki mózgowej.</li>
</ol>
11. Oznaczanie wycieku FITC-Dekstranu
<ol>
	<li>Wstrzyknąć FITC-Dekstran (10 KDa, 6 mg / ml, rozcieńczony w 0,01 M PBS; 4 ml / kg) do żyły ogonowej 24 godziny po MCAO, pozwalając mu krążyć we krwi przez 10 minut.</li>
	<li>Powtórz kroki 7.1–7.7, aby przeprowadzić perfuzję i usunąć nienaruszoną tkankę mózgową.</li>
	<li>Utrwal tkankę mózgową w 4% PFA przez 24 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przenieś utrwaloną tkankę mózgową do roztworu sacharozy o gradientowych stężeniach 10%, 20% i 30% (rozcieńczonych w 0,01 M PBS) w celu odwodnienia.</li>
	<li>Osadź tkankę mózgową za pomocą związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i pokrój na odcinki tkanki mózgowej o grubości 30 μm. Przenieś skrawki na szkiełko mikroskopowe za pomocą pętli zaszczepiającej i upewnij się, że przylegają do powierzchni szkiełka.</li>
	<li>Zamontuj skrawki tkanki mózgowej za pomocą pożywki montażowej zawierającej 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI).</li>
	<li>Uruchom laserową mikroskopię konfokalną i jej oprogramowanie sterujące.</li>
	<li>Zamocuj szkiełko mikroskopu na stoliku obiektowym i zlokalizuj obszar zawału pod okularem 200x.</li>
	<li>Ustaw rozdzielczość na 1024 x 1024 i dostosuj wartość wzmocnienia oraz czas ekspozycji, aby uzyskać jak najwyraźniejszy obraz.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy barwionego FITC-Dekstranem obszaru zawału mózgu pod długością fali wzbudzenia 488 nm.</li>
</ol>

Hyperglycemia-Enhanced Hemorrhagic Transformation in tMCAO-Induced Stroke

<ol><li>Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperacute+management+of+ischemic+strokes%3A+JACC+focus+seminar%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Hyperacute management of ischemic strokes: JACC focus seminar.</a> J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).</li>
<li>Goncalves, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombolytic+tPA-induced+hemorrhagic+transformation+of+ischemic+stroke+is+mediated+by+PKC%CE%B2+phosphorylation+of+occludin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombolytic tPA-induced hemorrhagic transformation of ischemic stroke is mediated by PKCβ phosphorylation of occludin.</a> Blood. 140 (4), 388-400 (2022).</li>
<li>Adebayo, O. D., Culpan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+accuracy+of+computed+tomography+perfusion+in+the+prediction+of+hemorrhagic+transformation+and+patient+outcome+in+acute+ischaemic+stroke%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Stroke+J%22%5BJournal%5D)">Diagnostic accuracy of computed tomography perfusion in the prediction of hemorrhagic transformation and patient outcome in acute ischaemic stroke: A systematic review and meta-analysis.</a> Eur Stroke J. 5 (1), 4-16 (2020).</li>
<li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Des+Devel+Ther%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li>
<li>Knight, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+impending+hemorrhagic+transformation+in+ischemic+stroke+using+magnetic+resonance+imaging+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Prediction of impending hemorrhagic transformation in ischemic stroke using magnetic resonance imaging in rats.</a> Stroke. 29 (1), 144-151 (1998).</li>
<li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+treatment+with+U0126+and+rt-PA+prevents+adverse+effects+of+the+delayed+rt-PA+treatment+after+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Combination treatment with U0126 and rt-PA prevents adverse effects of the delayed rt-PA treatment after acute ischemic stroke.</a> Sci Rep. 11 (1), 11993(2021).</li>
<li>Kwon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemorrhagic+transformation+after+large+cerebral+infarction+in+rats+pretreated+with+dabigatran+or+warfarin%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Hemorrhagic transformation after large cerebral infarction in rats pretreated with dabigatran or warfarin.</a> Stroke. 48 (10), 2865-2871 (2017).</li>
<li>Mi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+hyperglycemia+with+mortality+after+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Adv+Neurol+Disord%22%5BJournal%5D)">Correlation of hyperglycemia with mortality after acute ischemic stroke.</a> Ther Adv Neurol Disord. 11, 1756285617731686(2018).</li>
<li>Seners, P., Turc, G., Oppenheim, C., Baron, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence%2C+causes+and+predictors+of+neurological+deterioration+occurring+within+24+following+acute+ischaemic+stroke%3A+A+systematic+review+with+pathophysiological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Incidence, causes and predictors of neurological deterioration occurring within 24 following acute ischaemic stroke: A systematic review with pathophysiological implications.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 86 (1), 87-94 (2015).</li>
<li>Reshi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+in+acute+ischemic+stroke%3A+Is+it+time+to+re-evaluate+our+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia in acute ischemic stroke: Is it time to re-evaluate our understanding.</a> Med Hypotheses. 107, 78-80 (2017).</li>
<li>Graham, M. L., Schuurman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+animal+models+of+type+1+diabetes%2C+and+strategies+to+enhance+their+utility+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Validity of animal models of type 1 diabetes, and strategies to enhance their utility in translational research.</a> Eur J Pharmacol. 759, 221-230 (2015).</li>
<li>Rehni, A. K., Liu, A., Perez-Pinzon, M. A., Dave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+aggravation+of+stroke+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Diabetic aggravation of stroke and animal models.</a> Exp Neurol. 292, 63-79 (2017).</li>
<li>Chiang, T., Messing, R. O., Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse model of middle cerebral artery occlusion.</a> J Vis Exp. 48, e2761(2011).</li>
<li>Ma, F., Sun, P., Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium-targeted+deletion+of+the+miR-15a%2F16-1+cluster+ameliorates+blood-brain+barrier+dysfunction+in+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Endothelium-targeted deletion of the miR-15a/16-1 cluster ameliorates blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke.</a> Sci Signal. 13 (621), eaay5686(2020).</li>
<li>Wanson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semiautomated+method+for+measuring+brain+infarct+volume%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">A semiautomated method for measuring brain infarct volume.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 10 (2), 290-293 (1990).</li>
<li>Friedländer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+infarct+volumetry%3A+Its+relevance+and+the+improvement+by+a+software-assisted+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Reliability of infarct volumetry: Its relevance and the improvement by a software-assisted approach.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 37 (8), 3015-3026 (2017).</li>
<li>Wang, H. L., Lai, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Evans+blue+quantitation+in+limited+rat+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples.</a> Sci Rep. 4, 6588(2014).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+red+blood+cell+distribution+width+and+hemorrhagic+transformation+in+acute+ischemic+stroke+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebrovasc+Dis%22%5BJournal%5D)">Association between red blood cell distribution width and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke patients.</a> Cerebrovasc Dis. 48 (3-6), 193-199 (2019).</li>
<li>Zhu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+hyperglycemia+and+outcome+of+non-diabetic+patients+after+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Stress hyperglycemia and outcome of non-diabetic patients after acute ischemic stroke.</a> Front Neurol. 10, 1003(2019).</li>
<li>Won, S. J., Tang, X. N., Suh, S. W., Yenari, M. A., Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+promotes+tissue+plasminogen+activator-induced+hemorrhage+by+increasing+superoxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia promotes tissue plasminogen activator-induced hemorrhage by increasing superoxide production.</a> Ann Neurol. 70 (4), 583-590 (2011).</li>
<li>Zhang, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosiglitazone+attenuates+hyperglycemia-enhanced+hemorrhagic+transformation+after+transient+focal+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rosiglitazone attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient focal ischemia in rats.</a> Neuroscience. 250, 651-657 (2013).</li>
<li>Soejima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperbaric+oxygen+preconditioning+attenuates+hyperglycemia-enhanced+hemorrhagic+transformation+after+transient+MCAO+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Gas+Res%22%5BJournal%5D)">Hyperbaric oxygen preconditioning attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient MCAO in rats.</a> Med Gas Res. 2 (1), 9(2012).</li>
<li>Chen, C., Ostrowski, R. P., Zhou, C., Tang, J., Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+its+downstream+genes+reduces+acute+hyperglycemia-enhanced+hemorrhagic+transformation+in+a+rat+model+of+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Suppression of hypoxia-inducible factor-1alpha and its downstream genes reduces acute hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation in a rat model of cerebral ischemia.</a> J Neurosci Res. 88 (9), 2046-2055 (2010).</li>
<li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docosahexaenoic+acid+attenuates+hyperglycemia-enhanced+hemorrhagic+transformation+after+transient+focal+cerebral+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Docosahexaenoic acid attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient focal cerebral ischemia in rats.</a> Neuroscience. 301, 471-479 (2015).</li>
<li>MacDougal, E. L., Herman, W. H., Wing, J. J., Morgenstern, L. B., Lisabeth, L. D. Diabetes and ischaemic stroke outcome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMacDougal%2C+EL+%22Diabet+Med%22">Diabet Med</a>. 35 (9), 1249-1257 (2018).</li>
<li>Yang, C., Hawkins, K. E., Doré, S., Candelario-Jalil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammatory+mechanisms+of+blood-brain+barrier+damage+in+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 316 (2), C135-C153 (2019).</li>
<li>Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+isothiocyanate+%28FITC%29-dextran+extravasation+as+a+measure+of+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability.</a> Curr Protoc Neurosci. 79, 9.58.1-9.58.15 (2017).</li>
<li>Ahishali, B., Kaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+blood-brain+barrier+integrity+using+vascular+permeability+markers%3A+Evans+Blue%2C+Sodium+Fluorescein%2C+Albumin-Alexa+Fluor+conjugates%2C+and+Horseradish+Peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of blood-brain barrier integrity using vascular permeability markers: Evans Blue, Sodium Fluorescein, Albumin-Alexa Fluor conjugates, and Horseradish Peroxidase.</a> Methods Mol Biol. 2367, 87-103 (2021).</li>
<li>Kovács, K. B., Bencs, V., Hudák, L., Oláh, L., Csiba, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemorrhagic+transformation+of+ischemic+strokes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Hemorrhagic transformation of ischemic strokes.</a> Int J Mol Sci. 24 (18), 14067(2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.

Obecny protokół ma na celu stworzenie wiarygodnego zwierzęcego modelu transformacji krwotocznej po udarze niedokrwiennym, który może replikować szkodliwe skutki rewaskularyzacji naczyń w warunkach hiperglikemii. Wśród różnych czynników ryzyka udaru niedokrwiennego poziom glukozy we krwi w ciągu 24 godzin od wystąpienia udaru jest dodatnio skorelowany z zaostrzeniem uszkodzenia mózgu i zwiększoną śmiertelnością 3,18. Liczne badania kliniczne wykazały również, że hiperglikemia poudarowa jest jednym z najważniejszych czynników ryzyka HT i gorszych wyników neurologicznych19. W niniejszym protokole 19 z 20 myszy zostało pomyślnie indukowanych do HT w przypadku ostrej hiperglikemii, co dało udany współczynnik modelowania wynoszący około 95%. Niestety, cztery myszy zmarły z powodu ciężkiego krwiaka mózgu w ciągu 24 godzin po operacji MCAO i dlatego zostały wykluczone z dalszej analizy.
Modele zwierzęce HT wywołane hiperglikemią zostały wykorzystane w ostatnich badaniach przedklinicznych. Won i wsp. wykazali, że hiperglikemia sprzyjała HT w szczurzym modelu leczenia udaru tPA20. Jednak czynniki chorobotwórcze w modelu HT Wona były bardziej złożone, ponieważ tPA samo w sobie może zwiększać ryzyko HT. W przeciwieństwie do tego, obecny protokół wykorzystywał ostrą hiperglikemię w połączeniu z MCAO i osiągnął znaczny wskaźnik sukcesu HT u myszy. Warto zauważyć, że istnieje zmienność między modelami HT indukowanymi hiperglikemią pod względem stężenia glukozy, czasu trwania niedokrwienia, wiarygodności modelu i występowania HT 21,22,23,24. W niektórych badaniach stosowano 50% wstrzyknięcie glukozy w celu wywołania znacznie wyższego poziomu glukozy we krwi (20-28 mmol/l), przekraczając typowy zakres obserwowany u pacjentów po udarze. Wskaźnik HT w tych eksperymentach waha się od 70% do 73,3%, przy czym śmiertelność odnotowano na poziomie 37,5% w jednym modelu eksperymentalnym. W przeciwieństwie do tego, obecne procedury eksperymentalne polegały na użyciu 30% wstrzyknięcia glukozy w celu wywołania ostrej hiperglikemii utrzymującej się między 14,3 mmol/L a 20,3 mmol/l, lepiej dostosowując się do zakresu wartości glukozy we krwi występujących u pacjentów. Ponadto procedury te wymagały okresu postu dla myszy eksperymentalnych przed operacją, aby uregulować ich przedoperacyjny wyjściowy poziom glukozy we krwi do około 5 mmol / l; Niezastosowanie się do tego może skutkować podwyższonym wyjściowym poziomem we krwi wynoszącym około 10 mmol/l, co w konsekwencji prowadzi do nadmiernie wysokiego poziomu glukozy we krwi, a ostatecznie do wyższej śmiertelności wśród myszy.
W niedawnym badaniu MacDougall i in. odkryli, że hiperglikemia prowadzi do wzrostu wielkości zawału, szczególnie w modelu cukrzycy typu 125. Obecne wyniki wskazują, że grupa, której podawano glukozę, wykazywała większy rozmiar zawału po 60 minutach niedokrwienia w porównaniu z grupą w warunkach soli fizjologicznej. Wynik ten jest zgodny z poprzednim eksperymentem, który wykazał szkodliwy wpływ wysokiego poziomu glukozy na progresję zawału w obszarze półcienia18. W tym protokole przedoperacyjne wstrzyknięcie 30% glukozy spowodowało wylew krwi do mózgu po 24 godzinach od MCAO. Zgodnie z wynikami makroskopowej gradacji, analiza histologiczna z użyciem barwienia H&E wykazała znaczną infiltrację komórek krwi do niedokrwionego prążkowia i kory mózgowej u myszy z ostrą hiperglikemią. Oczywiście dostępne są inne metody oceny HT, takie jak pomiar hemoglobiny za pomocą testu ELISA lub rezonansu magnetycznego (MRI). Chociaż patofizjologiczny mechanizm leżący u podstaw HT pozostaje nieuchwytny, zaburzenie BBB jest uważane za jego główną przyczynę po niedokrwieniu mózgu26. W związku z tym zaburzenie bariery krew-mózg może pośrednio odzwierciedlać nasilenie HT. W protokole tym wykorzystano barwienie EB w celu zbadania przepuszczalności BBB. Wycinki mózgu zabarwione EB wizualnie pokazują zmiany przepuszczalności BBB i pozwalają na ilościowy pomiar zawartości barwnika EB, który przeniknął do tkanki mózgowej. W ostatnich latach inne znaczniki, takie jak fluoresceina sodowa i FITC-dekstran, były szeroko wykorzystywane do oceny przepuszczalności BBB w zwierzęcych modelach chorób neurologicznych27,28. Dlatego przeprowadziliśmy również eksperyment barwienia dekstranem, aby bardziej szczegółowo określić lokalizację i zakres uszkodzenia śródbłonka naczyń krwionośnych, obserwując stopień nieszczelności FITC-Dextran.
Obecny protokół ma kilka ograniczeń, których nie można przeoczyć. Po pierwsze, operacja MCAO wymaga od operatora wysokiego poziomu biegłości. Kluczowe znaczenie ma zapewnienie terminowego dostarczenia nici zatorowej do MCA oraz dokładne umiejscowienie i głębokość okluzji. Spełnienie tych wymagań wymaga intensywnego szkolenia dla operatora eksperymentu. Po drugie, ze względu na możliwość pogorszenia uszkodzenia mózgu przez HT, opieka pooperacyjna jest niezbędna do poprawy wskaźników przeżywalności zwierząt doświadczalnych. Wreszcie, ważne jest, aby przyznać, że pacjenci kliniczni po udarze często mają wiele czynników ryzyka HT, takich jak cukrzyca, wysokie ciśnienie krwi, migotanie przedsionków i wiek29 lat. W związku z tym obecny model zwierzęcy nie jest w stanie w pełni odtworzyć złożonych mechanizmów związanych z tymi czynnikami ryzyka.
Podsumowując, protokół ten skutecznie replikował HT wywołany ostrą hiperglikemią w mysim modelu niedokrwienia mózgu i reperfuzji. Model ten wykazuje dobrą powtarzalność, wysoką stabilność i wysoki wskaźnik przeżywalności zwierząt, dzięki czemu nadaje się do szerokiego stosowania w badaniach przedklinicznych HT.

<a href="https://app.jove.com/t/6615">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/67371">10.3791/67371</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/67371">A Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: A Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia

Zawał mózgu jest główną przyczyną niepełnosprawności i drugą najczęstszą przyczyną zgonów u dorosłych na całym świecie1. Ostra faza odgrywa kluczową rolę w postępie zawału mózgu, służąc jako kluczowy punkt czasowy w leczeniu choroby. Wczesne i terminowe przywrócenie przepływu krwi w obszarze półcienia jest niezbędne, aby zapobiec dalszej śmierci komórek mózgowych, przy czym tromboliza i terapia interwencyjna stanowią podstawę leczenia ostrego zawału mózgu (ACI). Jednak transformacja krwotoczna (HT) stanowi poważne powikłanie po trombolizie i terapii interwencyjnej, występujące u 15%-30% pacjentów z udarem niedokrwiennym, co w pewnym stopniu ogranicza ich stosowanie2,3. Występowanie HT istotnie zwiększa ryzyko śmiertelności i niepełnosprawności, wpływając na rokowanie w ACI. W związku z tym ogromne znaczenie kliniczne ma badanie patologicznych mechanizmów HT i identyfikacja skutecznych celów terapeutycznych.
Obecnie, niedrożność tętnicy środkowej mózgu wywołana zatorowością nitkową (MCAO) jest często wykorzystywana jako model HT u gryzoni4. Długotrwała niedrożność może spowodować masywny zawał mózgu obejmujący korę mózgową i prążkowie, potencjalnie prowadzący do wtórnego HT. Nici MCAO nie wymagają kraniotomii, są wysoce powtarzalne i powodują ogniskowe uszkodzenie mózgu i HT podobne do ludzkiego udaru. Jednak ten model mechaniczny ma pewne wyraźne wady, w tym wysokie wskaźniki wczesnej śmiertelności i niskie wskaźniki długoterminowego przeżycia5. Innym często stosowanym modelem HT jest model trombolizy, w którym tworzenie się skrzepów krwi jest indukowane najpierw w naczyniu docelowym, a następnie stosuje się leki trombolityczne (np. rt-PA, warfarynę) w celu rozpuszczenia skrzepu, naśladując proces kliniczny HT w udarze niedokrwiennym6,7. Pomimo odtworzenia w dużym stopniu patologicznego procesu klinicznej terapii trombolitycznej, modele zwierzęce HT indukowane przez rt-PA lub warfarynę są skomplikowane do wdrożenia i wiążą się z wysoką śmiertelnością zwierząt, a także zmienną częstością występowania i lokalizacją krwawienia. Aby posunąć naprzód podstawowe i kliniczne badania translacyjne nad HT po zawale mózgu, konieczne jest stworzenie powtarzalnego modelu zwierzęcego HT, który jest łatwy w obsłudze i oferuje wysoką stabilność.
Hiperglikemia jest znaczącym czynnikiem przyczyniającym się do HT po niedokrwieniu mózgu/reperfuzji (I/R)8. W kilku badaniach retrospektywnych przeanalizowano dane kliniczne pacjentów poddawanych trombektomii mechanicznej, ujawniając, że podwyższony poziom glukozy we krwi po przyjęciu wiąże się z większą częstością występowania spontanicznego HT3. U pacjentów z udarem cukrzycowym hiperglikemia znacznie zwiększa ryzyko HT i prowadzi do poważniejszych deficytów neurologicznych9,10. Naukowcy opracowali modele HT poprzez indukcję mózgowego I/R w modelach zwierzęcych z cukrzycą za pomocą MCAO. Jednak model cukrzyca-MCAO ma długi czas trwania eksperymentu, złożoną procedurę i wysokie koszty11,12. Wiarygodny model HT można ustalić poprzez wywołanie ostrej hiperglikemii poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie glukozy i zintegrowanie jej z mózgowym modelem I/R wygenerowanym techniką szwów. Metoda ta jest łatwa do wykonania przy stałym ułożeniu krwawienia i skutecznie imituje kliniczne cechy hiperglikemii poudarowej. Istnieją jednak znaczne różnice w kluczowych stanach, takich jak czas niedokrwienia i stężenie glukozy; ponadto stabilność modelu i częstość występowania HT są niespójne w różnych literaturach.
Nasza grupa badawcza szeroko wykorzystała metodę ostrej hiperglikemii-MCAO do stworzenia modelu HT. Ponadto przeprowadziliśmy obszerną serię eksperymentów, aby zbadać związek między czasem niedokrwiennym, stężeniem glukozy we krwi, częstością występowania HT i śmiertelnością zwierząt. Eksperymenty te ostatecznie doprowadziły do zidentyfikowania optymalnych warunków do stworzenia modelu HT po zawale mózgu. W pracy przedstawiono szczegółowy protokół ustalania ostrego modelu HT wywołanego hiperglikemią za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 30% glukozy w połączeniu z zatorowym MCAO.

<table><tbody><tr><td>Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108380</td><td>Barwnik do barwienia</td></tr><tr><td>TTC 24-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Corning Incorporated</td><td>CLS3527</td><td>Naczynie do barwienia TTC</td></tr><tr><td>30% wstrzyknięcie glukozy</td><td>Kelun Pharmaceutical</td><td>H42021188</td><td>Ostra indukcja hiperglikemii</td></tr><tr><td>4% paraformaldehydu</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. </td><td>G1101</td><td>Utrwalanie tkanek</td></tr><tr><td>5.0 Wchłanialny szew kwasu poliglikolowego</td><td>Jinhuan Medical Co., Ltd</td><td>KCR531</td><td>Sprzęt do chirurgii</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Corning Incorporated</td><td>CLS3596</td><td>Maszyna do pomiaru zawartości EB</td></tr><tr><td>Znieczulenie</td><td>Midmark Corporation</td><td>VMR</td><td>Znieczulenie dla zwierząt</td></tr><tr><td>Środek montażowy zapobiegający blaknięciu z DAPI</td><td>Beyotime Biotech</td><td>P0131</td><td>Uchwyt do sekcji tkanek</td></tr><tr><td>Automatyzacja-odwadnianie tkanek&nbsp; Maszyna </td><td>Leica Biosystems</td><td>TP1020</td><td>Odwadnianie tkanek</td></tr><tr><td>Mikroskopia konfokalna</td><td>Leica Biosystems</td><td>STELLARIS 5</td><td>Akwizycja obrazu</td></tr><tr><td>Żel sodowy diklofenaku</td><td>MaYinglong Farmaceutyczny</td><td>H10950214</td><td>Analgezja dla zwierząt</td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia eozyny</td><td>Servicebio Technology</td><td>G1001</td><td>Barwnik do H& Barwienie E</td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Aladdin</td><td>E104208</td><td>barwienie EB</td></tr><tr><td>Żel do oczu</td><td>Guangzhou Pharmaceutical</td><td>H44023098</td><td>Materiał do operacji</td></tr><tr><td>Fitc-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60842-46-8</td><td>Ocena przepuszczalności BBB</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td>Akwizycja obrazu</td></tr><tr><td>Zamrożony mikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1900</td><td>Zastosowanie do zamrożonych skrawków</td></tr><tr><td>Glukometr</td><td>YuWell</td><td>580</td><td>Pomiar stężenia glukozy we krwi</td></tr><tr><td>Barwienie hematoksyliną Roztwór</td><td>Servicebio</td><td>G1004</td><td>Barwnik do H& E barwienie</td></tr><tr><td></td><td>Jod Lircon</td><td>20020059</td><td>Materiał do operacji</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Rwd Life Science</td><td>R510-22-10</td><td>Znieczulenie dla zwierząt</td></tr><tr><td>Laserowy dopplerowski miernik przepływu krwi</td><td>Moor Instruments</td><td>moorVMS</td><td>Monitorowanie przepływu krwi</td></tr><tr><td>MCAO Szwy</td><td>Rwd Life Science</td><td>907-00023-01</td><td>Materiał do operacji</td></tr><tr><td>Meloksykam</td><td>Boehringer-Ingelheim</td><td>J20160020</td><td>Analgezja dla zwierząt</td></tr><tr><td>Zestaw narzędzi mikrochirurgicznych</td><td>Rwd Life Science</td><td>SP0003-M</td><td>Sprzęt do chirurgii</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HM325</td><td>Produkcja przekrojów tkanek</td></tr><tr><td>Ostrze mikrotomu</td><td>Leica Biosystems</td><td>819</td><td>Produkcja przekrojów tkanek</td></tr><tr><td>Maść mupirocyna</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>H10930064</td><td>Środek przeciw infekcjom dla zwierząt</td></tr><tr><td>Neutralny balsam</td><td>Absin Bioscience</td><td>abs9177</td><td>Pieczęć dla H& Barwienie E</td></tr><tr><td>Centrum zatapiania parafiny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC 350</td><td>Wyprodukuj bloki parafinowe</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>Eutanazja dla zwierząt</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Beyotime Biotech</td><td>C0221A</td><td>Płukanie sekcji tkanek</td></tr><tr><td>Skaner</td><td>EPSON</td><td>V330</td><td>Golarka</td></tr> <tr><td></td><td>do skanowania tkanekShenzhen Codos Urządzenia elektryczne Co., Ltd.</td><td>CP-9200</td><td>Sprzęt do chirurgii</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1510-02362</td><td>EB pomiar zawartości</td></tr><tr><td>roztworu sacharozy</td><td>Shanghai Macklin Biochemiczny</td><td>57-50-1</td><td>Odwodnienie tkanek</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Podłoże do zatapiania tkanek</td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6399</td><td>EB Pomiar zawartości</td></tr></tbody></table>

mysi model transformacji krwotocznej wywołanej ostrą hiperglikemią w połączeniu z przejściowym ogniskowym niedokrwieniem

A Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia

Transformacja krwotoczna (HT) jest poważnym powikłaniem, które może wystąpić w wyniku terapii trombolitycznej po udarze niedokrwiennym (IS) i stanowi znaczące ograniczenia w klinicznym zastosowaniu rekombinowanego tkankowego aktywatora plazminogenu (rt-PA). Niestety, obecnie w praktyce klinicznej nie ma skutecznych interwencji w HT. W związku z tym istnieje pilna potrzeba stworzenia stabilnych i wiarygodnych eksperymentalnych modeli zwierzęcych, które wyjaśnią patogenezę HT i opracują skuteczne strategie interwencyjne. W badaniu tym przedstawiono protokół tworzenia mysiego modelu HT indukowanego przez ostrą hiperglikemię połączoną z przemijającym ogniskowym niedokrwieniem (tMCAO). Samcom myszy C57BL / 6J wstrzyknięto 30% glukozy w celu wywołania hiperglikemii, a następnie poddano 60-minutowemu tMCAO z reperfuzją. Objętość zawału, integralność bariery krew-mózg (BBB) i stopień krwotoku śródczaszkowego oceniano po 24 godzinach od MCAO. Wyniki wykazały, że wstrzyknięcie glukozy prowadziło do przejściowej hiperglikemii (14,3-20,3 mmol/L), która znacznie zwiększyła zarówno objętość zawału, jak i częstość występowania HT. Zabarwienie hematoksyliną-eozyną (H&E) wykazało znaczne zmiany krwotoczne w strefie zawału u myszy z hiperglikemią. Ponadto myszy z hiperglikemią wykazywały nasilone zakłócenie BBB, o czym świadczy poważniejszy wyciek błękitu Evansa (EB) i dekstranu FITC. Podsumowując, ostra hiperglikemia niezawodnie i konsekwentnie skutkowała makroskopowym HT w mysim modelu tMCAO. Ten powtarzalny model stanowi cenne narzędzie do badania patologicznych mechanizmów HT i opracowywania odpowiednich interwencji terapeutycznych.

Procedura eksperymentalna niniejszego badania została przedstawiona na Rysunku 1. W skrócie, myszy poddano MCAO indukowanej okluzją nicią przez 60 min, a następnie reperfuzji. Glukozę (30% w soli fizjologicznej, 7,2 mL/kg masy ciała) podano dożylnie 15 min przed MCAO. Poziomy glukozy we krwi mierzono w punkcie wyjściowym (przed wstrzyknięciem glukozy), bezpośrednio po MCAO oraz w momencie reperfuzji. Po 24 h reperfuzji myszy uśpiono, a tkanki mózgowe pobrano w celu analizy objętości zawału, nieszczelności bariery krew-mózg oraz badania histopatologicznego. Jak przedstawiono na Rysunku 2, we wszystkich czterech grupach odnotowano podobne wyjściowe poziomy glukozy we krwi. Jednakże u myszy, które otrzymały wstrzyknięcia glukozy, stwierdzono znacznie podwyższone poziomy glukozy we krwi w porównaniu z grupami otrzymującymi sól fizjologiczną. 
Jak przedstawiono na Rysunku 3A, na przekrojach mózgu w grupie Sham + saline oraz Sham + glucose nie zaobserwowano widocznego zawału, podczas gdy barwienie TTC na przekrojach mózgu z obu grup MCAO wyraźnie ujawniło znaczny zawał mózgu. Co więcej, myszy, którym wstrzyknięto glukozę, wykazały większą objętość zawału w porównaniu do myszy, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną w różnych grupach MCAO. Zgodnie z analizą statystyczną, objętość zawału wynosiła odpowiednio 20,8% ± 0,8% w grupie MCAO + saline oraz 45,1% ± 1,6% w grupie MCAO + glucose (Rysunek 3B).
Obserwacje makroskopowe nie wykazały krwawień w lewej półkuli mózgu ani w grupie MCAO + saline, ani w grupie Sham + saline/glucose. W przeciwieństwie do nich, w izschemicznej półkuli mózgu grupy MCAO + glucose zaobserwowano liczne krwawienia punktowe (Ryc. 4A). Obrazy skanowania kolejnych koronalnych przekrojów mózgu wykazały, że krwawienia w grupie MCAO + glucose były rozmieszczone w obrębie obszarów zawału kory i prążkowia (Ryc. 4A). Dodatkowo analiza histologiczna z zastosowaniem barwienia H&amp;E wykazała znaczną infiltrację komórek krwi do obszarów zawału kory i prążkowia w grupie MCAO+glucose (Ryc. 4B). Odwrotnie, nie zaobserwowano infiltracji komórek krwi ani w grupie MCAO+saline, ani w grupie Sham + saline/glucose.
Jak przedstawiono na Rysunku 5A, w przekrojach mózgu grupy Sham + glukoza nie zaobserwowano wycieku EB. Jednak w obu grupach MCAO widoczne było wyraźne niebieskie barwienie wynikające z wycieku EB. Dodatkowo, w porównaniu z myszami wstrzykniętym solą fizjologiczną, myszy, którym podano glukozę, wykazały zwiększoną przepuszczalność EB 24 h po MCAO. W porównaniu z grupą Sham + sól fizjologiczna, grupa MCAO + sól fizjologiczna wykazała znaczący wzrost zawartości EB (4,2 µg/g ± 1,8 µg/g vs. 28 µg/g ± 0,7 µg/g, p &lt; 0,01), który był jeszcze wyższy w grupie MCAO + glukoza (28 µg/g ± 0,7 µg/g vs. 65,5 µg/g ± 6,0 µg/g, p &lt; 0,01) (Rysunek 5B). Jak pokazano na Rysunku 5C, wyciek FITC-Dekstranu był bardziej intensywny w niedokrwionej korze mózgu i prążkowiu grupy MCAO + glukoza w porównaniu z grupą MCAO + sól fizjologiczna.
<img alt="Oś czasu eksperymentu MCAO, pomiar poziomu glukozy, barwienie TTC i EvansBlue, analiza mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67371/67371fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat procedury eksperymentalnej. Myszom przed operacją MCAO podano domięśniowo 30% glukozę lub sól fizjologiczną, monitorując poziom glukozy we krwi podczas zabiegu. 24 h po reperfuzji myszy zostały uśpione w celu przeprowadzenia analizy patologicznej i histologicznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67371/67371fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres poziomów glukozy we krwi, wyniki eksperymentu MCAO, wpływ czasu po MCAO na stężenia glukozy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67371/67371fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Zmiany poziomów glukozy we krwi w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu 30% glukozy. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. N = 10-20. ***p &lt; 0.001 w porównaniu z grupą Sham + sól fizjologiczna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67371/67371fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza zawału mózgu szczura, porównanie barwienia TTC, modele MCAO, wykres słupkowy wyników objętości zawału." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67371/67371fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Hiperglikemia nasiliła niedokrwienne uszkodzenie mózgu 24 h po reperfuzji. (A) Reprezentatywne obrazy czołowych przekrojów barwionych TTC, gdzie prawidłowa tkanka mózgowa ma kolor różowoczerwony, a obszary zawału niedokrwiennego kolor szarobiały. Pasek skali = 5 mm. (B) Analiza statystyczna objętości zawału. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. N = 3. ***p &lt; 0.001 w porównaniu z grupą Sham + sól fizjologiczna, ##p &lt; 0.01 w porównaniu z grupą MCAO + sól fizjologiczna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67371/67371fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza przekrojów mózgu; porównanie uszkodzeń niedokrwiennych; model MCAO; efekt glukozy; obrazy histologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67371/67371fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Hiperglikemia zwiększyła ryzyko HT w 24 h po reperfuzji. (A) Reprezentatywne obrazy z obserwacji makroskopowej oraz przekrojów czołowych. Gwiazdka wskazuje widoczne ogniska krwotoczne. Pasek skali = 5 mm. (B) Reprezentatywne obrazy połówek mózgu barwione H&amp;E (góra) oraz powiększone obrazy (dół). Pasek skali = 200 µm dla obrazów połówek mózgu; pasek skali = 20 µm dla obrazów powiększonych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67371/67371fig04large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Badanie przekroju mózgu MCAO-glukoza; panele fotograficzne i wykres; obrazowanie immunofluorescencyjne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67371/67371fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Hiperglikemia nasiliła przerwanie bariery krew-mózg (BBB) 24 h po reperfuzji. (A) Reprezentatywne obrazy wycieku błękitu Ewansa. Pasek skali = 5 mm. (B) Analiza statystyczna wycieku błękitu Ewansa w półkulach niedokrwiennych. Dane przedstawiono jako średnia ± SD, N = 3, **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0.001 w porównaniu z grupą Sham+soline, ##p &lt; 0.01 w porównaniu z grupą MCAO + saline. (C) Reprezentatywne obrazy niedokrwiennej kory mózgowej i prążka barwionych FITC-Dekstranem. Pasek skali = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67371/67371fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

To badanie przedstawia protokół tworzenia wysoce powtarzalnego zwierzęcego modelu transformacji krwotocznej (HT) przy użyciu okluzji/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu (MCAO/R) u myszy C57BL/6 z ostrą hiperglikemią.

Mysi model transformacji krwotocznej wywołanej ostrą hiperglikemią w połączeniu z przejściowym ogniskowym niedokrwieniem

Hemorrhagic transformation (HT) is a serious complication that can occur as a result of thrombolytic therapy following ischemic stroke (IS), and it poses ...

W obecnych badaniach mamy na celu zapewnienie kompleksowego i szczegółowego protokołu do ustanowienia wysoce powtarzalnego zwierzęcego modelu transformacji rodników człowieka przy użyciu reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu u myszy C57BL / 6 z ostrą hiperglikemią.W porównaniu z innymi technikami, nasz protokół wykazuje dobrą powtarzalność, wysoką stabilność i niską śmiertelność zwierząt, dzięki czemu nadaje się do powszechnego stosowania w badaniach przedklinicznych nad transformacją krwotoczną.W przyszłości skupimy się na zbadaniu wpływu transformacji krwotocznej na neurologię i zbadaniu mechanizmu leżącego u jej podstaw.[Instruktor] Aby rozpocząć, przetrzyj platformę chirurgiczną i otaczające ją miejsce pracy 75% etanolem. Włącz włącznik ogrzewania i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza. Przenieś znieczuloną mysz na platformę chirurgiczną w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz jej kończyny za pomocą taśmy klejącej. Następnie, 15 minut przed zabiegiem chirurgicznym, dootrzewnowo podaj myszom 30% glukozy lub normalną sól fizjologiczną. Za pomocą skalpela wykonaj poziome nacięcie z otworem 1,5 centymetra wzdłuż linii środkowej szyi. Wykonaj rozwarstwienie w obszarze odwróconego trójkąta, aby zidentyfikować i oddzielić lewą tętnicę szyjną wspólną. Za pomocą kleszczy okulistycznych wypreparuj nerw błędny przylegający do wspólnej tętnicy szyjnej i tkankę śluzówkową otaczającą naczynia krwionośne. Za pomocą nici wchłanialnego kwasu poliglikolowego 5-0 wykonaj dzwonek na tętnicy szyjnej wspólnej, utrzymując szew nienapięty. Następnie oddziel w górę wzdłuż wspólnej tętnicy szyjnej. Teraz oddziel rozwidlenie, aby w pełni odsłonić tętnicę szyjną zewnętrzną i wewnętrzną. Zapętlić i mocno zawiązać wchłanialny szew kwasu poliglikolowego 5-0 wokół tętnicy szyjnej zewnętrznej dystalnie od rozwidlenia. Następnie, za pomocą dwóch lekkich zacisków mikro tętnicy zębatkowej, tymczasowo zaciśnij zarówno tętnicę szyjną wspólną, jak i tętnicę szyjną wewnętrzną, aby zablokować przepływ krwi. Następnie rozciągnij szwy na dystalnej tętnicy szyjnej zewnętrznej i tętnicy szyjnej wspólnej, aby wyprostować odcinek tętnicy szyjnej zewnętrznej. Teraz użyj mikronożyczek, aby wykonać małe nacięcie między dwoma mocowaniami szwów na tętnicy szyjnej zewnętrznej. Włóż 30-milimetrowy szew monofilamentowy pokryty silikonem do tętnicy szyjnej zewnętrznej. Zapętlić i lekko zawiązać drugi szew wchłanialny kwasu poliglikolowego 5-0 na zewnętrznej tętnicy szyjnej w pobliżu rozwidlenia, aby zapobiec cofaniu się szwu monofilamentowego. Następnie należy całkowicie przeciąć tętnicę szyjną zewnętrzną dystalnie do podwiązania stałego i usunąć zacisk kleszczyków tętniczych z tętnicy szyjnej wewnętrznej. Następnie wycofaj szew do rozwidlenia tętnicy szyjnej wspólnej. Ostrożnie wsuń i obróć kikut tętnicy szyjnej zewnętrznej. Dostosuj kierunek szwu i włóż go 9 do 10 milimetrów od rozwidlenia tętnicy szyjnej wspólnej do tętnicy szyjnej wewnętrznej, aby zablokować tętnicę środkową mózgu. Następnie zaciśnij drugi szew wchłanialny kwasu poliglikolowego wokół tętnicy szyjnej zewnętrznej i usuń zacisk tętnicy z tętnicy szyjnej wspólnej. Po ponownym znieczuleniu myszy, za pomocą zacisku tętnicy mikroklipsowej, zaciśnij tętnicę szyjną wspólną. Częściowo wycofaj żyłkę z tętnicy szyjnej wewnętrznej, aż końcówka pokryta silikonem stanie się widoczna przez tętnicę szyjną wewnętrzną. Następnie umieść kolejny zacisk tętnicy z mikroklipsem na tętnicy szyjnej wewnętrznej powyżej końcówki pokrytej silikonem. Całkowicie wycofaj żyłkę i mocno przyciśnij kikut tętnicy szyjnej zewnętrznej. Na koniec usuń zacisk tętnicy mikroklipsowej odpowiednio z tętnicy szyjnej wewnętrznej i tętnicy szyjnej wspólnej. Na początek przetrzyj ogon myszy wacikiem nasączonym alkoholem, aby żyła ogonowa była całkowicie przekrwiona. Za pomocą nożyczek chirurgicznych odetnij końcówkę ogona o jeden do dwóch milimetrów. Delikatnie ściśnij wzdłuż nasady ogona do końca, aby ułatwić przepływ krwi z nacięcia. Następnie umieść zbiornik absorpcyjny próbki bibułki testowej na krawędzi kropli krwi. Odczytaj odczyt glukometru i zapisz wynik. W celu pomiaru przepływu krwi w mózgu należy trzymać końcówkę laserowej sondy dopplerowskiej prostopadle do powierzchni lewej czaszki ciemieniowej, aż zostanie odczytany stabilny strumień i zapisać tę wartość. Po usunięciu mózgu uśpionej myszy MCAO, umieść tkankę mózgową w matrycy mózgowej gryzonia i pokrój ją na dwumilimetrowe plasterki koronalne. Przenieś plastry na płytkę 24-dołkową i inkubuj je z 2% roztworem chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie wytnij skrawki tkanki z 24-dołkowej płytki za pomocą zakrzywionych kleszczyków i ułóż je na szklanej płytce skanującej. Barwić utrwalony wycinek mózgu roztworem hematoksyliny przez trzy minuty. Odróżnij go, zanurzając plasterek w 5% alkoholu kwasu solnego na pięć sekund. Następnie odwodnić i hialinizować plasterek za pomocą gradientowych roztworów etanolu i ksylenu. Zamontuj sekcję za pomocą żywic neutralnych. 23 godziny po MCAO wstrzyknij 2% roztwór Evans Blue myszowi i zbierz mózg. Po homogenizacji i odwirowaniu tkanki przenieść ciecz sklarowaną nad osadem do innej probówki wirówkowej i rozcieńczyć ją czterokrotnie etanolem. Zmierzyć absorbancję cieczy sklarowanej nad osadem przy 620 nanometrach za pomocą spektrofotometru. Wstrzyknąć FITC-dekstran do żyły ogonowej 24 godziny po MCAO i pozwolić mu krążyć we krwi przez 10 minut. Po utrwaleniu tkanki mózgowej osadź tkankę mózgową za pomocą związku o optymalnej temperaturze cięcia i pokrój ją na odcinki o grubości 30 mikrometrów. Przenieś skrawki na szkiełko mikroskopowe za pomocą pętli zaszczepiającej, upewniając się, że przylegają do powierzchni szkiełka. Zamontuj skrawki tkanki mózgowej za pomocą pożywki montażowej zawierającej 4',6-diamidino-2-fenyloindol. Poziom glukozy we krwi znacznie wzrósł po MCAO u myszy, którym wstrzyknięto glukozę w porównaniu z grupami z solą fizjologiczną. Nie zaobserwowano widocznego zawału na wycinkach mózgu w grupie pozorowanej z solą fizjologiczną lub pozorowanej z glukozą. Grupa MCAO z glukozą wykazała znacznie większą objętość zawału mózgu w porównaniu z grupą MCAO z solą fizjologiczną. W półkuli niedokrwiennej MCAO z grupą glukozy obserwowano wielokrotne krwotoki punktowe, których nie było w pozostałych grupach. Stwierdzono znaczny naciek komórek krwi w obszarach zawału kory i prążkowia w grupie MCAO z glukozą. Przepuszczalność Evans Blue i wyciek FITC-dekstranu były znacznie wyższe w grupie MCAO z glukozą w porównaniu z grupą MCAO z solą fizjologiczną.

a-mouse-model-hemorrhagic-transformation-induced-acute-hyperglycemia

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film przedstawia procedurę replikacji udaru zakrzepowego w modelu mysim poprzez zablokowanie prawej tętnicy szyjnej wspólnej i wystawienie myszy na działanie środowiska o niskiej zawartości tlenu. Proces ten zmniejsza przepływ krwi i tlenu do mózgu, powodując tworzenie się skrzepów krwi i uszkodzenie mózgu.

Wywoływanie udaru zakrzepowego poprzez niedotlenienie i niedokrwienie w modelu mysim

Opisano standaryzowany mysi model krwotoku podpajęczynówkowego za pomocą wewnątrzświetlnego koła perforacji Willisa. Perforacja naczynia i krwawienie podpajęczynówkowe są monitorowane za pomocą monitorowania ciśnienia śródczaszkowego. Ponadto rejestrowane i kontrolowane są różne parametry życiowe w celu utrzymania warunków fizjologicznych.

Mysi model krwotoku podpajęczynówkowego

Różne mysie modele zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) są szeroko stosowane w eksperymentalnych badaniach mózgu. W tym miejscu demonstrujemy model przezczaszkowego stałego dystalnego MCAO, który powoduje konsekwentny zawał kory mózgowej o wielkości odpowiadającej uszkodzeniom spowodowanym przez większość udarów niedokrwiennych u ludzi.

Modelowanie udaru u myszy: trwała koagulacja dalszej tętnicy środkowej mózgu

Modele udaru zakrzepowo-zatorowego są kluczowymi narzędziami do optymalizacji terapii rekanalizacyjnej. W tym miejscu przedstawiamy mysi model udaru zakrzepowego oparty na przejściowym niedotlenieniu niedotlenienia i niedokrwieniu mózgu (tHI), które wywołuje zakrzepicę i zawał oraz pozytywnie reaguje na fibrynolizację za pośrednictwem tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA) w oknie terapeutycznym podobnym do tych u pacjentów po udarze.

Model udaru zakrzepowego oparty na przejściowym niedotlenieniu-niedokrwieniu mózgu

Opisujemy mysi model udaru wywołanego przez zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej za pomocą szwu pokrytego silikonem. Protokół może być stosowany w celu wywołania trwałej okluzji lub tymczasowego niedokrwienia, a następnie reperfuzji.

Indukcja udaru niedokrwiennego i reperfuzji niedokrwiennej u myszy przy użyciu techniki niedrożności tętnicy środkowej i wizualizacji obszaru zawału

Wśród przeszczepów narządów litych w jamie brzusznej, przeszczepy trzustki są podatne na poważne uszkodzenia przeszczepu związane z reperfuzją niedokrwienną, co ostatecznie prowadzi do wczesnej utraty przeszczepu. Protokół ten opisuje model przeszczepu trzustki u myszy przy użyciu techniki mankietu bez szwów, idealnie nadającej się do analizy tych wczesnych, szkodliwych uszkodzeń.

Mysi model do przeszczepu trzustki przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietowej

Niekontrolowany krwotok, ważna przyczyna śmiertelności wśród pacjentów po urazach, może być modelowany za pomocą standardowego uszkodzenia wątroby w modelu mysim. Model ten skutkuje konsekwentną utratą krwi, przeżywalnością i pozwala na testowanie środków hemostatycznych. Ten artykuł zawiera krok po kroku proces wykonywania tego cennego modelu.

Niekontrolowany wstrząs krwotoczny modelowany za pomocą uszkodzenia wątroby u myszy z monitorowaniem hemodynamicznym w czasie rzeczywistym

Mysi model niedokrwienia i reperfuzji mózgu został stworzony w celu zbadania patofizjologii udaru. Podwiązujemy dystalnie prawą środkową tętnicę mózgową i prawą tętnicę szyjną wspólną i przywracamy przepływ krwi po 10 lub 40 minutach niedokrwienia.

Mysi model zamknięcia dwóch naczyń niedokrwienia mózgu-reperfuzji

Tutaj opisujemy mysi model niedokrwienia siatkówki poprzez przejściowe obustronne zamknięcie tętnicy szyjnej za pomocą prostych szwów i zacisku. Model ten może być przydatny do zrozumienia patologicznych mechanizmów niedokrwienia siatkówki spowodowanego nieprawidłowościami sercowo-naczyniowymi.

Mysi model niedokrwiennego uszkodzenia siatkówki wywołanego przejściowym obustronnym zamknięciem tętnicy szyjnej wspólnej

Tutaj prezentujemy protokół do ustalenia modelu dystalnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu (dMCAO) poprzez przezczaszkową elektrokoagulację u myszy C57BL/6J i oceny późniejszego zachowania neurologicznego i cech histopatologicznych.

Indukcja ostrego udaru niedokrwiennego u myszy przy użyciu techniki niedrożności dystalnej tętnicy środkowej

Poznaj protokół modelu krwotocznej transformacji u myszy C57BL/6 z ostrą hiperglikemią przy użyciu techniki MCAO/R. Metoda zapewnia wysoką powtarzalność, stabilność i niską śmiertelność zwierząt.

Mysi model transformacji krwotocznej wywołanej ostrą hiperglikemią w połączeniu z przejściowym ogniskowym niedokrwieniem

Przeglądaj więcej filmów