Mysi model transformacji krwotocznej wywołanej ostrą hiperglikemią w połączeniu z przejściowym ogniskowym niedokrwieniem
15 listopada 2024
To badanie przedstawia protokół tworzenia wysoce powtarzalnego zwierzęcego modelu transformacji krwotocznej (HT) przy użyciu okluzji/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu (MCAO/R) u myszy C57BL/6 z ostrą hiperglikemią.
W obecnych badaniach mamy na celu zapewnienie kompleksowego i szczegółowego protokołu do ustanowienia wysoce powtarzalnego zwierzęcego modelu transformacji rodników człowieka przy użyciu reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu u myszy C57BL / 6 z ostrą hiperglikemią.
W porównaniu z innymi technikami, nasz protokół wykazuje dobrą powtarzalność, wysoką stabilność i niską śmiertelność zwierząt, dzięki czemu nadaje się do powszechnego stosowania w badaniach przedklinicznych nad transformacją krwotoczną.
W przyszłości skupimy się na zbadaniu wpływu transformacji krwotocznej na neurologię i zbadaniu mechanizmu leżącego u jej podstaw.
[Instruktor] Aby rozpocząć, przetrzyj platformę chirurgiczną i otaczające ją miejsce pracy 75% etanolem. Włącz włącznik ogrzewania i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza. Przenieś znieczuloną mysz na platformę chirurgiczną w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz jej kończyny za pomocą taśmy klejącej. Następnie, 15 minut przed zabiegiem chirurgicznym, dootrzewnowo podaj myszom 30% glukozy lub normalną sól fizjologiczną. Za pomocą skalpela wykonaj poziome nacięcie z otworem 1,5 centymetra wzdłuż linii środkowej szyi. Wykonaj rozwarstwienie w obszarze odwróconego trójkąta, aby zidentyfikować i oddzielić lewą tętnicę szyjną wspólną. Za pomocą kleszczy okulistycznych wypreparuj nerw błędny przylegający do wspólnej tętnicy szyjnej i tkankę śluzówkową otaczającą naczynia krwionośne. Za pomocą nici wchłanialnego kwasu poliglikolowego 5-0 wykonaj dzwonek na tętnicy szyjnej wspólnej, utrzymując szew nienapięty. Następnie oddziel w górę wzdłuż wspólnej tętnicy szyjnej. Teraz oddziel rozwidlenie, aby w pełni odsłonić tętnicę szyjną zewnętrzną i wewnętrzną. Zapętlić i mocno zawiązać wchłanialny szew kwasu poliglikolowego 5-0 wokół tętnicy szyjnej zewnętrznej dystalnie od rozwidlenia. Następnie, za pomocą dwóch lekkich zacisków mikro tętnicy zębatkowej, tymczasowo zaciśnij zarówno tętnicę szyjną wspólną, jak i tętnicę szyjną wewnętrzną, aby zablokować przepływ krwi. Następnie rozciągnij szwy na dystalnej tętnicy szyjnej zewnętrznej i tętnicy szyjnej wspólnej, aby wyprostować odcinek tętnicy szyjnej zewnętrznej. Teraz użyj mikronożyczek, aby wykonać małe nacięcie między dwoma mocowaniami szwów na tętnicy szyjnej zewnętrznej. Włóż 30-milimetrowy szew monofilamentowy pokryty silikonem do tętnicy szyjnej zewnętrznej. Zapętlić i lekko zawiązać drugi szew wchłanialny kwasu poliglikolowego 5-0 na zewnętrznej tętnicy szyjnej w pobliżu rozwidlenia, aby zapobiec cofaniu się szwu monofilamentowego. Następnie należy całkowicie przeciąć tętnicę szyjną zewnętrzną dystalnie do podwiązania stałego i usunąć zacisk kleszczyków tętniczych z tętnicy szyjnej wewnętrznej. Następnie wycofaj szew do rozwidlenia tętnicy szyjnej wspólnej. Ostrożnie wsuń i obróć kikut tętnicy szyjnej zewnętrznej. Dostosuj kierunek szwu i włóż go 9 do 10 milimetrów od rozwidlenia tętnicy szyjnej wspólnej do tętnicy szyjnej wewnętrznej, aby zablokować tętnicę środkową mózgu. Następnie zaciśnij drugi szew wchłanialny kwasu poliglikolowego wokół tętnicy szyjnej zewnętrznej i usuń zacisk tętnicy z tętnicy szyjnej wspólnej. Po ponownym znieczuleniu myszy, za pomocą zacisku tętnicy mikroklipsowej, zaciśnij tętnicę szyjną wspólną. Częściowo wycofaj żyłkę z tętnicy szyjnej wewnętrznej, aż końcówka pokryta silikonem stanie się widoczna przez tętnicę szyjną wewnętrzną. Następnie umieść kolejny zacisk tętnicy z mikroklipsem na tętnicy szyjnej wewnętrznej powyżej końcówki pokrytej silikonem. Całkowicie wycofaj żyłkę i mocno przyciśnij kikut tętnicy szyjnej zewnętrznej. Na koniec usuń zacisk tętnicy mikroklipsowej odpowiednio z tętnicy szyjnej wewnętrznej i tętnicy szyjnej wspólnej. Na początek przetrzyj ogon myszy wacikiem nasączonym alkoholem, aby żyła ogonowa była całkowicie przekrwiona. Za pomocą nożyczek chirurgicznych odetnij końcówkę ogona o jeden do dwóch milimetrów. Delikatnie ściśnij wzdłuż nasady ogona do końca, aby ułatwić przepływ krwi z nacięcia. Następnie umieść zbiornik absorpcyjny próbki bibułki testowej na krawędzi kropli krwi. Odczytaj odczyt glukometru i zapisz wynik. W celu pomiaru przepływu krwi w mózgu należy trzymać końcówkę laserowej sondy dopplerowskiej prostopadle do powierzchni lewej czaszki ciemieniowej, aż zostanie odczytany stabilny strumień i zapisać tę wartość. Po usunięciu mózgu uśpionej myszy MCAO, umieść tkankę mózgową w matrycy mózgowej gryzonia i pokrój ją na dwumilimetrowe plasterki koronalne. Przenieś plastry na płytkę 24-dołkową i inkubuj je z 2% roztworem chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie wytnij skrawki tkanki z 24-dołkowej płytki za pomocą zakrzywionych kleszczyków i ułóż je na szklanej płytce skanującej. Barwić utrwalony wycinek mózgu roztworem hematoksyliny przez trzy minuty. Odróżnij go, zanurzając plasterek w 5% alkoholu kwasu solnego na pięć sekund. Następnie odwodnić i hialinizować plasterek za pomocą gradientowych roztworów etanolu i ksylenu. Zamontuj sekcję za pomocą żywic neutralnych. 23 godziny po MCAO wstrzyknij 2% roztwór Evans Blue myszowi i zbierz mózg. Po homogenizacji i odwirowaniu tkanki przenieść ciecz sklarowaną nad osadem do innej probówki wirówkowej i rozcieńczyć ją czterokrotnie etanolem. Zmierzyć absorbancję cieczy sklarowanej nad osadem przy 620 nanometrach za pomocą spektrofotometru. Wstrzyknąć FITC-dekstran do żyły ogonowej 24 godziny po MCAO i pozwolić mu krążyć we krwi przez 10 minut. Po utrwaleniu tkanki mózgowej osadź tkankę mózgową za pomocą związku o optymalnej temperaturze cięcia i pokrój ją na odcinki o grubości 30 mikrometrów. Przenieś skrawki na szkiełko mikroskopowe za pomocą pętli zaszczepiającej, upewniając się, że przylegają do powierzchni szkiełka. Zamontuj skrawki tkanki mózgowej za pomocą pożywki montażowej zawierającej 4',6-diamidino-2-fenyloindol. Poziom glukozy we krwi znacznie wzrósł po MCAO u myszy, którym wstrzyknięto glukozę w porównaniu z grupami z solą fizjologiczną. Nie zaobserwowano widocznego zawału na wycinkach mózgu w grupie pozorowanej z solą fizjologiczną lub pozorowanej z glukozą. Grupa MCAO z glukozą wykazała znacznie większą objętość zawału mózgu w porównaniu z grupą MCAO z solą fizjologiczną. W półkuli niedokrwiennej MCAO z grupą glukozy obserwowano wielokrotne krwotoki punktowe, których nie było w pozostałych grupach. Stwierdzono znaczny naciek komórek krwi w obszarach zawału kory i prążkowia w grupie MCAO z glukozą. Przepuszczalność Evans Blue i wyciek FITC-dekstranu były znacznie wyższe w grupie MCAO z glukozą w porównaniu z grupą MCAO z solą fizjologiczną.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół ustanowienia wysoce powtarzalnego modelu zwierzęcego transformacji krwotocznej (HT) z wykorzystaniem okluzji i reperfuzji środkowej tętnicy mózgowej (MCAO/R) u myszy C57BL/6 z ostrą hiperglikemią. Protokół wykazuje dobrą powtarzalność, wysoką stabilność oraz niską śmiertelność zwierząt, co czyni go odpowiednim do badań przedklinicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Badania przedkliniczne
- Modele zwierzęce
Wstęp
- Przemiana krwotoczna jest istotnym powikłaniem w badaniach nad udarem.
- Zatorowo-reperfuzyjny model niedokrwienia tętnicy środkowej mózgu (MCAO/R) jest powszechną metodą badania tego stanu.
- Ostra hiperglikemia może wpływać na wyniki w modelach udaru.
- Opracowanie wiarygodnych modeli zwierzęcych jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów przemiany krwotocznej.
Cel badania
- Dostarczenie kompleksowego protokołu MCAO/R u myszy C57BL/6.
- Zapewnienie powtarzalności i stabilności wyników eksperymentalnych.
- Ograniczenie śmiertelności zwierząt podczas przeprowadzania eksperymentów.
Zastosowane metody
- Technika zamykania i reperfuzji tętnicy środkowej mózgu (MCAO/R).
- Wykorzystanie myszy C57BL/6 jako modelu eksperymentalnego.
- Indukcja ostrej hiperglikemii przed zabiegiem.
- Ocena wyników związanych z transformacją krwotoczną.
Główne wyniki
- Protokół wykazał wysoką powtarzalność w wielu próbach.
- W grupie doświadczalnej zaobserwowano niską śmiertelność.
- Stabilność wyników potwierdzono za pomocą różnych ocen.
- Model uznano za odpowiedni do dalszych badań przedklinicznych.
Wnioski
- Ustanowiony protokół jest skuteczny w badaniu transformacji krwotocznej.
- Stanowi on wiarygodne ramy dla przyszłych badań nad udarem mózgu.
- Dalsza walidacja modelu może przyczynić się do lepszego zrozumienia podstawowych mechanizmów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodne modele przedkliniczne transformacji krwotocznej (HT) są niezbędne do ograniczania ryzyka związanych ze strategiami terapeutycznymi ukierunkowanymi na powikłania udaru niedokrwiennego. Ten model mysi, łączący ostrą hiperglikemię z przejściowym niedokrwieniem ogniskowym, umożliwia rzetelną analizę mechanizmów HT i zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej. Jego powtarzalność oraz ilościowe wyniki sprawiają, że jest on krytycznym narzędziem w procesie selekcji projektów oraz ograniczania ryzyka mechanistycznego w rozwoju leków przeciwmiażdżycowych i naczyniowych mózgu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną ocenę patogenezy HT w kontrolowanych warunkach metabolicznych i niedokrwiennych.
- Wspiera walidację funkcjonalną potencjalnych celów terapeutycznych zaangażowanych w rozszczelnienie bariery krew-mózg oraz ryzyko krwotoku.
- Ułatwia redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez wyizolowanie wpływu hiperglikemii na skutki uszkodzeń niedokrwiennych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia powtarzalną platformę in vivo do przesiewania interwencji mających na celu zmniejszenie częstości występowania lub nasilenia HT.
- Dostarcza ilościowych odczytów, takich jak objętość zawału, integralność BBB oraz stopień krwotoku, w celu standaryzacji analizy.
- Umożliwia porównywalność między badaniami i skalowalność oceny związków w wskazaniach naczyniowo-mózgowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgadza się z punktami końcowymi istotnymi dla choroby poprzez modelowanie klinicznie obserwowanych czynników ryzyka nadciśnienia tętniczego.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych po przedkliniczną ocenę skuteczności i bezpieczeństwa.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju portfeli związanych z udarem i chorobami naczyniowymi układu nerwowego w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Model ten integruje proces od odkrycia do fazy przedklinicznej w opracowywaniu leków przeciwsmózgowiakowych, łącząc wczesne badania mechanistyczne z walidacją translacyjną.
- Biologia odkryć: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących współzależności między stanem metabolicznym a uszkodzeniem niedokrwiennym.
- Przesiewy: Zapewniają standaryzowane, ilościowe punkty końcowe do oceny interwencji.
- Analityka: Wspiera statystyczne porównanie wielkości zawału, przepuszczalności BBB oraz wyników krwawiennych w różnych grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Modelują istotne klinicznie czynniki ryzyka w celu zwiększenia wartości prognostycznej dla powikłań udaru u ludzi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zwalidowaną, wielokrotnego użytku platformę dla różnorodnych badań mechanistycznych i terapeutycznych w dziedzinie badań naczyniowo-nerwowych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz badaniach mechanistycznych HT.
- Wartość operacyjna: Zapewnia wysoką powtarzalność, stabilność oraz niską śmiertelność zwierząt, co umożliwia skalowanie przedklinicznych przepływów pracy.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go i redukuje ryzyko biologiczne na późniejszych etapach w portfolio badań nad udarem.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów celujących w HT i powiązane powikłania naczyniowo-mózgowe z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagane jest doświadczenie w technikach mikrochirurgicznych oraz w modelowaniu naczyniowo-mózgowym in vivo.
- Konieczny jest dostęp do specjalistycznej aparatury do pomiaru przepływu krwi i ilościowej analizy histologicznej.
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów chirurgicznych i analitycznych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych szczepów myszy lub modeli chorób współistniejących może wymagać optymalizacji protokołu.
- Ograniczenia obejmują specyficzność modelu dla ostrej hiperglikemii i przejściowego niedokrwienia jako czynników ryzyka HT.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:08
Establishing a Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia
5:13
Assessing the Infract Volume, Integrity of the Blood-Brain Barrier, and Degree of Intracranial Hemorrhage in Animal Model of Hemorrhagic Transformation
8:31
Representative Results
