Skuteczny knockdown genu w wątrobie poprzez wstrzyknięcie do śledziony małego RNA dostarczonego przez serotyp 8 (AAV8) wirusa związanego z adenowirusem
1 listopada 2024
Ten protokół opisuje, w jaki sposób dośledzionowa iniekcja małego RNA spinki do włosów dostarczanego przez AAV8 osiąga taką samą skuteczność knockdownu genu w wątrobie jak iniekcja do żyły wrotnej, co stanowi prostszą procedurę ze znacznie niższą śmiertelnością i powikłaniami okołooperacyjnymi i pooperacyjnymi.
Nasze badania koncentrują się na pogłębieniu wiedzy na temat progresji złożonych zaburzeń przy użyciu metod obliczeniowych i eksperymentalnych. Koncentrujemy się na opracowaniu strategii spowolnienia lub odwrócenia postępu złożonych chorób, takich jak zaburzenia metaboliczne, starzenie się i nowotwory. Kluczowym pytaniem, na które staramy się tutaj odpowiedzieć, jest to, dlaczego niektóre zmiany przedrakowe przekształcają się w raka, dlaczego niektóre dorosłe tkanki mogą osiągnąć regenerację po urazie i co napędza proces starzenia. Technologie te obejmują sekwencjonowanie całego genomu, sekwencjonowanie pojedynczych komórek, solidny algorytm obliczeniowy i uczenie maszynowe, modelowanie sztucznej inteligencji oraz eksperymentalne modele zwierzęce, które są istotne dla chorób ludzkich. Protokół ten opisuje metodę nokautu genów in vivo przy użyciu zastrzyków dośledzionowych AAV8, dostarczanych z krótkimi spinkami do włosów RNA ukierunkowanym na jądro macierzyste. Jądrowe pnianie jest czynnikiem samoodnawiania się komórek macierzystych, który odgrywa ważną rolę w rozwoju embrionalnym, rozwoju raka i regeneracji dorosłych tkanek. Wykazaliśmy, że podczas przesadzania zastrzyki AAV8 dostarczają krótkie RNA spinki do włosów, osiągając taką samą skuteczność nokautu. Zestaw iniekcji AAV8 do żyły wrotnej dostarcza konstrukcję, ale wiąże się to ze znacznie mniejszymi komplikacjami, a procedura jest znacznie prostsza.
[Instruktor] Rozpoczęcie przenoszenia znieczulonych myszy na aseptyczne pole chirurgiczne w prawej bocznej pozycji leżącej. Za pomocą ostrza chirurgicznego wykonaj 15-milimetrowe nacięcie na lewej górnej ścianie brzucha, a następnie 10-milimetrowe nacięcie na otrzewnej. Za pomocą kleszczy delikatnie odsłoń śledzionę i umieść pod nią kawałek mokrej gazy, aby utrzymać ją na miejscu. Następnie, za pomocą igły o rozmiarze 30, wstrzyknij 50 mikrolitrów wirusów AAV8 do śledziony na głębokości trzech milimetrów pod powierzchnią w ciągu 30 sekund. Następnie przykryj miejsce bawełnianym wacikiem i ściskaj je przez minutę. Następnie zszyj ścianę brzucha za pomocą szwu wchłanialnego 4-0. Następnie zamknij skórę za pomocą niewchłanialnego szwu 4-0. Po znieczuleniu myszy wykonują laparotomię, wykonując nacięcie w linii środkowej na skórze, a następnie w otrzewnej. Umieść sterylną gazikę nasączoną sterylną solą fizjologiczną po lewej stronie myszy. Za pomocą sterylnego wacika delikatnie wyciągnij jelito grube i cienkie. Umieść jelita na mokrej gaziku i przykryj je, aby zapobiec wysuszeniu lub kontaktowi ze skórą. Następnie za pomocą sterylnej igły o rozmiarze 32 wstrzyknij 50 mikrolitrów wirusa AAV8 do żyły wrotnej pod kątem mniejszym niż pięć stopni. Włóż igłę na trzy do pięciu milimetrów do żyły wrotnej i pozwól, aby krew przepływała przez igłę przez pięć sekund, aby zapobiec cofaniu się. Następnie należy przyłożyć sterylny bawełniany wacik do miejsca wstrzyknięcia i delikatnie uciskać, aż żyła zostanie całkowicie zamknięta i nie wystąpi krwawienie. Następnie delikatnie włóż narządy wewnętrzne z powrotem do jamy brzusznej. Następnie zamknij ścianę brzucha za pomocą szwu wchłanialnego 4-0, a skórę za pomocą szwu niewchłanialnego 4-0. Iniekcje dośledzioniczne i do żyły wrotnej wykazały statystycznie równoważną skuteczność mRNA w dół bez istotnych różnic między obiema metodami.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę wyciszania genów in vivo za pomocą wewnątrzśledzionowych iniekcji krótkich cząsteczek rybaczowych RNA (shRNA) dostarczanych przez AAV8. Podejście to pozwala na osiągnięcie wydajności wyciszania genów w wątrobie zbliżonej do tej uzyskanej przy iniekcji do żyły wrotnej, będąc jednocześnie prostszą metodą i wiążącą się z mniejszą liczbą powikłań.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Terapia genowa
- Neuronauka
- Medycyna regeneracyjna
Wprowadzenie
- Zrozumienie technik wyciszania genów jest kluczowe dla badania złożonych chorób.
- AAV8 to wektor wirusowy wykorzystywany do dostarczania materiału genetycznego.
- Czynniki stemowania jądrowego są ważne w różnych procesach biologicznych.
- Minimalizacja powikłań chirurgicznych jest niezbędna dla poprawy wyników eksperymentalnych.
Cel badania
- Porównanie skuteczności iniekcji wewnątrzśledzionowych i dożylnych (do żyły wrotnej) w kontekście wyciszania genów.
- Uproszczenie procedury przy zachowaniu jej efektywności.
- Zmniejszenie liczby powikłań okołoperacyjnych i pooperacyjnych.
Zastosowane metody
- Wewnątrzśledzionowe wstrzyknięcie shRNA dostarczonego za pomocą AAV8.
- Wstrzyknięcie AAV8 do żyły wrotnej jako metoda porównawcza.
- Wykorzystanie znieczulonych myszy do procedur chirurgicznych.
- Analiza statystyczna w celu porównania wydajności wyciszania genu.
Główne wyniki
- Obie metody wstrzykiwania pozwoliły na osiągnięcie statystycznie równoważnej wydajności wyciszania genów.
- Wstrzykiwanie dospleniczne wiązało się z mniejszą liczbą powikłań.
- Procedura była prostsza w porównaniu do wstrzykiwania do żyły wrotnej.
- Wyniki potwierdzają, że wstrzykiwanie dospleniczne stanowi praktyczną alternatywę.
Wnioski
- Wewnątrzśledzionowe wstrzykiwanie AAV8 jest skuteczną metodą wyciszania genów.
- Metoda ta może wspomóc badania w dziedzinie terapii genowej i medycyny regeneracyjnej.
- Dalsze badania mogą służyć do analizy długofalowych efektów tej techniki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wydajne i małoinwazyjne wyciszanie genów w wątrobie ma kluczowe znaczenie dla walidacji celów oraz oceny ryzyka mechanistycznego w badaniach nad metabolizmem, regeneracją i onkologią. Protokół dostarczania AAV8-shRNA drogą wewnątrzśledzionową umożliwia skuteczny silencing genów przy zmniejszonym ryzyku proceduralnym, wspierając wysoką wiarygodność genomiki funkcjonalnej w modelach istotnych dla przebiegu chorób. Podejście to usprawnia wczesne etapy odkrywania oraz procesy przedkliniczne poprzez minimalizację barier technicznych i powikłań okołoperacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę genów docelowych w patofizjologii wątroby z wykorzystaniem modeli in vivo.
- Wspiera weryfikację mechanistyczną poprzez zapewnienie niezawodnego wyciszania genów z minimalnymi efektami poza celowymi.
- Ułatwia szybkie testowanie hipotez dotyczących funkcji genów w szlakach metabolicznych i regeneracyjnych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowany system generowania modeli z wyciszeniem genu, odpowiednich do późniejszego screeningu związków.
- Gwarantuje powtarzalną i ilościową redukcję ekspresji genu, co wspiera standaryzację testów.
- Ogranicza zmienność proceduralną, zwiększając skalowalność i możliwość ponownego wykorzystania platformy dla wielu celów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z systemami in vivo istotnymi dla danej choroby, co sprzyja translacyjnemu odkrywaniu biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez umożliwienie spójnej modulacji genów.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju dostosowane do ryzyka dzięki minimalizacji technicznych i biologicznych czynników zakłócających.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wewnątrzśledzionowego podawania AAV8-shRNA wpisuje się w ciąg procesów od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając efektywną walidację celu oraz generowanie modeli do identyfikacji wiodących cząsteczek i badań translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Przyspiesza weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie szybkiego wyciszania genów in vivo.
- Screening: Zapewnia powtarzalne wyciszanie genów, wspierając przygotowanie testów i generowanie ilościowych wyników.
- Analityka: Dostarcza statystycznie wiarygodnych pomiarów redukcji ekspresji genów do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Zapewnia modulację genów istotnych dla choroby w modelach przedklinicznych, wspierając dopasowanie biomarkerów.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zstandaryzowany protokół o niskim stopniu skomplikowania, który można dostosować do różnych genów docelowych i modeli chorób.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, standaryzację i bezpieczeństwo procedur w procesach wyciszania genów.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez zmniejszenie wskaźnika awarii technicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz wprowadzanie zwalidowanych celów do etapów przedklinicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie chirurgii małych zwierząt oraz obchodzenia się z wektorami wirusowymi.
- Wymagany jest dostęp do platform produkcji AAV8 oraz analizy ilościowej ekspresji genów.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie wykonania protokołu i interpretacji danych.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych genów docelowych, lecz może wymagać optymalizacji dla różnych modeli chorobowych.
- Potencjalne ograniczenia obejmują immunogenność wektora oraz ograniczenia proceduralne specyficzne dla danego modelu.
