Name: Korelacyjne metodologie obrazowania spektroskopii optycznej i spektrometrii mas w celu wizualizacji dystrybucji leku w skrawku tkanek miękkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Poznaj korelacyjne metody obrazowania spektroskopii optycznej i spektrometrii mas w celu wizualizacji dystrybucji leków w skórze. Ta technika umożliwia szybką, bezpłatkową analizę z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czułością chemiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Haleon CH SARL. Wkłady NAB i RHG były częściowo wspierane przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych (HHS) poprzez przyznanie pomocy finansowej (1-U01-FD006533). Prace te zostały sfinansowane przez brytyjski Departament Biznesu, Energii i Strategii Przemysłowej w ramach projektów NMS/ID74 i NMS/ST18 brytyjskiego Krajowego Systemu Pomiarów. Treść tego artykułu jest treścią autorów i niekoniecznie reprezentuje oficjalne poglądy ani nie jest popierana przez FDA/HHS lub rząd Stanów Zjednoczonych. NAB jest wdzięczny za wsparcie ze strony Community for Analytical Measurement Science w ramach nagrody CAMS Fellowship Award 2020 ufundowanej przez Fundusz Powierniczy Chemii Analitycznej.

Oświadczenie etyczne: Próbki ludzkiej skóry zostały pobrane z Tissue Solutions Ltd, Glasgow, UK, przez Charles River Laboratories (CRL) w Edynburgu, Wielka Brytania. Wszystkie anonimowe próbki zostały pobrane zgodnie z normami prawnymi i etycznymi kraju pobierania, za etyczną zgodą i świadomą zgodą dawców lub ich najbliższych krewnych.
1. Podział skóry
Kriostat został użyty do wytworzenia fragmentów tkanek skóry.
<ol>
	<li>Wytransportować leczone krążki skóry z zamrażarki w temperaturze -20 °C i odciąć mały kawałek (~1,0 cm x 1,0 cm) od środka dysku.</li>
	<li>Zamontuj próbkę na uchwycie w kriostacie nad zamrożoną kroplą wody. Nie używaj związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) ani innych mediów do zatapiania.</li>
	<li>Ustawić temperaturę ostrza i próbki odpowiednio na -20 °C i -16 °C.</li>
	<li>Przekrój o grubości 30 μm na szklanym szkiełku nakrywkowym (#1.5, Fisher Scientific).</li>
	<li>Natychmiast wykonać SRS i ToF-SIMS lub alternatywnie, próbka może być pakowana próżniowo w celu przechowywania w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Osuszać przez 20 minut przed użyciem.</li>
</ol>
2. Obrazowanie SRS
Mikroskopia SRS, SHG i TPEF została wykonana przy użyciu koherentnego mikroskopu Ramana. Dwa pikosekundowe impulsy laserowe zostały wygenerowane przez wiązkę Stokesa o długości fali 1031,2 nm, nałożoną przestrzennie i czasowo na przestrajalną wiązkę pompy. Wiązka Stokesa, modulowana na częstotliwości 20 MHz, ułatwiała detekcję wymuszonych sygnałów strat ramanowskich poprzez transmisję. Do wykrywania sygnału wykorzystano detektor na bazie krzemu, sprzężony ze wzmacniaczem typu lock-in. Inny kanał został wykorzystany do zbierania sygnałów drugiej harmonicznej i emitowanych sygnałów fluorescencyjnych, wykorzystując do detekcji fotopowielacz.
<ol>
	<li>Zainstaluj odpowiednie soczewki obiektywowe i kondensatory do obrazowania tkanek wielofotonowych, w tym przypadku soczewkę z 40-krotnym powiększeniem zanurzenia w wodzie (1,1 NA) w połączeniu z soczewką skraplacza powietrza o niewielkiej odległości roboczej (0,9 NA).</li>
	<li>Umieść zamontowany wycinek tkanki na stoliku na próbkę mikroskopu SRS tak, aby tkanka znajdowała się na tej samej powierzchni szkiełka mikroskopowego, co soczewka kondensatora. Skoncentruj soczewkę obiektywu na przekroju tkanki, a następnie zoptymalizuj wysokość kondensatora.</li>
	<li>Ustaw moc lasera na odpowiednie wartości, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu bez uszkadzania tkanki. W tym przykładzie na próbce zastosowano około 10 mW dla belki pompy i 30 mW dla wiązki Stokesa. Zapoznaj się z Tsikritsis i wsp., aby zapoznać się z praktycznymi rozważaniami dotyczącymi pomiarów SRS4.</li>
	<li>Uzyskaj mozaikowy obraz całego przekroju o rozdzielczości 512 x 512 pikseli odpowiadającej 290 μm x 290 μm przy powiększeniu X1 z prędkością obrazowania 400 Hz i średnią liniową 1 przy 2850 cm-1 odpowiadającą rozciąganiuCH2</li>.
	<li>Na mozaikowym obrazie całej sekcji wybierz obszar zainteresowania (ROI), biorąc pod uwagę następujące kwestie: (i) jest on umieszczony pośrodku, omijając najbardziej zewnętrzne 20 % obwodu próbki, gdzie może znajdować się niedozowana skóra, która została zaciśnięta w aparacie komórek Franza; (ii) jest wystarczająco płaska, aby można ją było badać na tym samym poziomie głębokości optycznej; (iii) posiada wyraźne cechy strukturalne, które ułatwiłyby jego identyfikację wizualną po przeniesieniu próbki do ToF-SIMS.</li>
	<li>Zastosuj spójne ustawienia wzmocnienia w całym badaniu dla detektorów SRS i SHG/fluorescencji oraz uzyskaj obrazy w (i) obszarze rozciągania C-H (przy 2945 cm-1, 2850 cm-1 i 2650 cm-1 odpowiadających odpowiednio CH3, CH2 i kontroli poza rezonansem); (ii) obszar odcisku palca (na wysokości 1666 cm-1 i 1723 cm-1, co odpowiada odpowiednio amidowi I i kontroli rezonansu); (iii) liczbę falową odpowiadającą rezonansowi włączania i wyłączania odnoszącemu się do zastosowanego narkotyku; w tym przykładzie przy 1586 cm-1 i 1530 cm-1 odpowiadających odpowiednio C=C i rezonansowi off-sonance.</li>
</ol>
Po zobrazowaniu SRS, natychmiast przenieś próbkę do konfiguracji ToF-SIMS w celu analizy.
3. Obrazowanie ToF-SIMS
Obrazowanie spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu zostało wykonane przy użyciu wiązki jonów pierwotnych Bi3+ o natężeniu 30 keV i prądzie 0,2 pA.
<ol>
	<li>Wybierz odpowiednie ustawienia akwizycji; w tym przykładzie użyto polaryzacji jonów ujemnych, z czasem cyklu pracy 100 ms, zakresem mas m/z 0-900 i średnicą wiązki 5 μm. Do kompensacji ładunku użyto pistoletu do zalewu elektronami o napięciu 20 eV przy natężeniu 5 μA.</li>
	<li>Uzyskaj ogólny obraz w trybie makro rastrowym stołu montażowego, aby odwzorować cały przekrój tkanki z polem widzenia w zależności od wymiarów tkanki (w naszym przypadku użyliśmy 2,5 do 3,0 mm x 8,5 do 9,0 mm). Ten ogólny obraz składa się z mozaiki mniejszych obrazów. W tym przykładzie każdy z nich miał pole widzenia 0,5 mm x 0,5 mm (256 x 256 pikseli) przy 1 wiązce jonów na piksel, co dawało dawkę jonów 8,18 x 108 jonów/cm2.</li>
	<li>Wykorzystaj tę samą metodę do przechwytywania obrazów ROI, wybierając odpowiednie pole widzenia; w tym przypadku było to 1,0 mm x 0,5 mm, z 4 ujęciami na piksel na klatkę i 10 klatkami na łatkę, co odpowiada dawce jonów 1,31 x 1011 jonów/cm2.</li>
	<li>Aby zapewnić kontrolę jakości, należy przeanalizować próbki homogenatu tkankowego bezpośrednio przed i po zbadaniu każdego odcinka skóry. Użyj pola widzenia 0,5 mm x 0,5 mm (256 x 256 pikseli) z 1 zdjęciem na piksel i 1 klatką na skan, wykonując łącznie 15 skanów. Ten układ odpowiada gęstości dawki jonów 3,27 x10 10 jonów/cm2.</li>
	<li>Po akwizycji uzyskane widma masowe można skalibrować za pomocą jonów H−, C−, C− i C3−.</li>
	<li>Akwizycja i ekstrakcja danych została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania Surface Lab 7.1.</li>
</ol>
4. Rejestracja obrazu i analiza danych za pomocą MATLAB
<ol>
	<li>Zredukuj obrazy SIMS i SRS do 3 wymiarów, z których każdy wykorzystuje nieujemną faktoryzację macierzy, aby były wizualizowane jako kanały kolorów czerwonego, zielonego i niebieskiego.</li>
	<li>Wybierz pasujące cechy między tymi dwoma obrazami faktoryzacji bez macierzy, wybierając narzędzie do zaznaczania punktów kontrolnych Matlab "cpselect" (Matlab, Mathworks, 2019b i Image Processing Toolbox).</li>
	<li>Użyj funkcji "cp2tform" i "imtransform", aby przeprowadzić rejestrację, stosując transformację afiniczną z danymi SIMS jako stałymi obrazami i danymi spektroskopii optycznej jako ruchomymi obrazami.</li>
	<li>W przypadku wykrycia wielu pików w danych ToF-SIMS dla leku będącego przedmiotem zainteresowania, należy zsumować intensywność tych pików, aby uzyskać łączną intensywność jonów leku.</li>
	<li>Wyodrębnić średnią całkowitą liczbę jonów z dwóch zestawów danych homogenatów (przed i po) dla każdej odpowiedniej próbki tkanki skórnej. Korzystając z tej odpowiedniej wartości, znormalizuj intensywność w danych ToF-SIMS jonu leku na każdym obrazie skóry.</li>
	<li>Po rejestracji utwórz nakładkę danych ze spektroskopii optycznej i SIMS, przypisując odpowiednie obrazy do kanałów RGB: czerwony (obraz SRS dla CH2), zielony (obraz SHG dla kolagenu) i niebieski (obraz SIMS dla diklofenaku, w tym sygnały z różnych jonów o m/z 214.04, 216.04, 250.02, 252.02, 294.01 i 296.01).</li>
</ol>

<ol><li>Belsey, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualisation+of+drug+distribution+in+skin+using+correlative+optical+spectroscopy+and+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Visualisation of drug distribution in skin using correlative optical spectroscopy and mass spectrometry imaging.</a> J Control Release. 364, 79-89 (2023).</li>
<li>Pudlas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy%3A+A+noninvasive+analysis+tool+for+the+discrimination+of+human+skin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy: A noninvasive analysis tool for the discrimination of human skin cells.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (10), 1027-1040 (2011).</li>
<li>Raman, C. V., Krishnan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+type+of+secondary+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new type of secondary radiation.</a> Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).</li>
<li>Tsikritsis, D., Legge, E. J., Belsey, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+quantitative+and+reproducible+measurements+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for quantitative and reproducible measurements with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Analyst. 147 (21), 4642-4656 (2022).</li>
<li>Sarri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+histology%3A+One+to+one+comparison+with+standard+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman histology: One to one comparison with standard hematoxylin and eosin staining.</a> Biomed Opt Express. 10 (10), 5378-5384 (2019).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+use+of+stimulated+Raman+scattering+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the use of stimulated Raman scattering in histopathology.</a> Analyst. 146 (3), 789-802 (2021).</li>
<li>Mansfield, J., Moger, J., Green, E., Moger, C., Winlove, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+specific+imaging+and+in-situ+chemical+analysis+of+articular+cartilage+with+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Chemically specific imaging and in-situ chemical analysis of articular cartilage with stimulated Raman scattering.</a> J Biophotonics. 6 (10), 803-814 (2013).</li>
<li>Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+stimulated+Raman+scattering+imaging+for+tissues+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Quant+Imaging+Med+Surg%22%5BJournal%5D)">Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals.</a> Quant Imaging Med Surg. 11 (3), 1078-1101 (2021).</li>
<li>Brzozowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+scattering+microscopy+in+chemistry+and+life+science+-+development%2C+innovation%2C+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science - development, innovation, perspectives.</a> Biotechnol Adv. 60, 108003(2022).</li>
<li>Buchberger, A. R., Delaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%3A+A+review+of+emerging+advancements+and+future+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging: A review of emerging advancements and future insights.</a> Anal Chem. 90 (1), 240-265 (2018).</li>
<li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+proteins+in+tissues+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).</li>
<li>Vanbellingen, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry+imaging+of+biological+samples+with+delayed+extraction+for+high+mass+and+high+spatial+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Time-of-flight secondary ion mass spectrometry imaging of biological samples with delayed extraction for high mass and high spatial resolutions.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (13), 1187-1195 (2015).</li>
<li>Singh, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToF-SIMS+3D+imaging+unveils+important+insights+on+the+cellular+microenvironment+during+biomineralization+of+gold+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">ToF-SIMS 3D imaging unveils important insights on the cellular microenvironment during biomineralization of gold nanostructures.</a> Sci Rep. 10 (1), 261(2020).</li>
<li>Yoon, S., Lee, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+tissue+sample+preparation+for+time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry+%28ToF-SIMS%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Converg%22%5BJournal%5D)">Biological tissue sample preparation for time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) imaging.</a> Nano Converg. 5 (1), 24(2018).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ToF-SIMS+methodology+for+analyzing+inter-tissue+lipid+distribution+variations+and+intra-tissue+multilevel+mass+spectrometry+imaging+within+a+single+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem+J%22%5BJournal%5D)">A ToF-SIMS methodology for analyzing inter-tissue lipid distribution variations and intra-tissue multilevel mass spectrometry imaging within a single rat.</a> Microchem J. 200, 110235(2024).</li>
<li>Louw, E. -V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+the+topical+and+transdermal+delivery+of+diclofenac+incorporated+in+nano-emulsions%2C+nano-emulgels%2C+and+a+colloidal+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative study on the topical and transdermal delivery of diclofenac incorporated in nano-emulsions, nano-emulgels, and a colloidal suspension.</a> Drug Deliv Transl Res. 13 (5), 1372-1389 (2023).</li>
<li>Hummer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+topical+formulations+using+a+combination+of+in+vitro+methods+to+quantify+the+transdermal+passive+diffusion+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Optimization of topical formulations using a combination of in vitro methods to quantify the transdermal passive diffusion of drugs.</a> Int J Pharm. 620, 121737(2022).</li>
<li>Sjövall, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+distribution+of+skin+lipids+and+topically+applied+compounds+in+human+skin+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging the distribution of skin lipids and topically applied compounds in human skin using mass spectrometry.</a> Sci Rep. 8 (1), 16683(2018).</li>
<li>Delvaux, X., Noël, C., Poumay, Y., Houssiau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+human+epidermis+by+combining+tof-sims+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Probing the human epidermis by combining tof-sims and multivariate analysis.</a> Biointerphases. 18 (1), 011002(2023).</li>
<li>Kolenc, O. I., Quinn, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell+metabolism+through+autofluorescence+imaging+of+nad+%28p%29+h+and+fad%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of nad (p) h and fad.</a> Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).</li>
<li>Hanson, K. M., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+and+quantification+of+ultraviolet-induced+reactive+oxygen+species+in+ex+vivo+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Observation and quantification of ultraviolet-induced reactive oxygen species in ex vivo human skin.</a> Photochem Photobiol. 76 (1), 57-63 (2002).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+skin+imaging+assessment+of+human+stress+during+head-down+bed+rest+using+a+portable+handheld+two-photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Non-invasive skin imaging assessment of human stress during head-down bed rest using a portable handheld two-photon microscope.</a> Front Physiol. 13, 899830(2022).</li>
<li>Brunetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+morphologic+and+functional+imaging+for+diagnosis%2C+staging+and+follow+up+in+aids%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Correlative morphologic and functional imaging for diagnosis, staging and follow up in aids: An overview.</a> Q J Nucl Med. 39 (3), 201-211 (1995).</li>
<li>Van Zyl, T., Van Rensburg, L. J., Naidoo, K., Merven, M., Opperman, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+imaging+and+histopathology+of+a+complicated+sinonasal+teratocarcinosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22SA+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Correlative imaging and histopathology of a complicated sinonasal teratocarcinosarcoma.</a> SA J Radiol. 27 (1), 2548(2023).</li>
<li>Huber, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+of+MALDI+drug+imaging%2C+immunohistochemistry%2C+and+digital+image+analysis+for+drug+distribution+studies+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel approach of MALDI drug imaging, immunohistochemistry, and digital image analysis for drug distribution studies in tissues.</a> Anal Chem. 86 (21), 10568-10575 (2014).</li>
</ol>

MBB jest pracownikiem Haleon CH SARL, instytucji finansującej badanie.

Metoda ta umożliwia obrazowanie korelacyjne za pomocą nieliniowej spektroskopii optycznej i obrazowania spektrometrii mas w celu wykrycia dystrybucji leku w tkankach miękkich z submikronową rozdzielczością przestrzenną i wysoką czułością. Co ważne, obrazowanie odbywa się bez użycia potencjalnie zakłócających znaczników, które byłyby wymagane w przypadku mikroskopii fluorescencyjnych. Dalsza walidacja przebiegu pracy obejmowała konwencjonalne barwienie wycinka tkanki hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu wyjaśnienia struktu...

Zrozumienie szybkości, zakresu i czynników wpływających na dystrybucję aktywnych składników farmaceutycznych w miękkich tkankach biologicznych po ich miejscowym lub systemowym zastosowaniu jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw tkankowo specyficznego dla danej metody wchłaniania, metabolizmu i klirensu (tj. głębszego zrozumienia farmakokinetyki leków). W tym miejscu prezentujemy nowatorską metodę obrazowania korelacyjnego integrującą nieliniową spektroskopię optyczną i obrazowanie spektroskopią mas w celu bezznacznikowej wizualizacji struktury tkanki i dystrybucji leków miejscowych w tej samej próbce tkanki1.
Spektroskopia Ramana (RS) stała się cennym narzędziem do mapowania dystrybucji leków w komórkach i tkankach o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i specyficzności molekularnej2. RS opiera się na nieelastycznym rozpraszaniu światła3 przez badaną próbkę, co pozwala na szczegółową charakterystykę chemiczną za pomocą charakterystycznych trybów drgań zawartych w niej cząsteczek, bez potrzeby stosowania zewnętrznych znaczników. Jednak długi czas akwizycji w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości może potencjalnie zagrozić integralności wrażliwych próbek biologicznych. Dodatkowo, podczas sondowania głębszych warstw tkanki, rozpraszanie i absorpcja światła przez tkankę może tłumić sygnał Ramana, dodatkowo ograniczając jego czułość. Mikroskopia wymuszonego rozpraszania Ramana (SRS) stanowi znaczący postęp w stosunku do konwencjonalnego RS, wykorzystując impulsowe wzbudzenie laserowe i wykrywanie wymuszonego sygnału Ramana4. Mikroskopia SRS umożliwia szybką akwizycję obrazów 2D i 3D o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, a w połączeniu z generacją drugiej harmonicznej (SHG) i dwiema mikroskopiami fluorescencji wzbudzonej fotonami (TPEF) może dostarczyć kompleksowy obraz tkanek łącznych, kolagenu i elastyny1,5,6,7,8,9. Mikroskopia SHG to nieliniowa technika optyczna, która opiera się na interakcji światła z niecentrycznymi strukturami w próbce, generując sygnał o połowie długości fali padającego światła. Jest to szczególnie przydatne do obrazowania uporządkowanych struktur, takich jak kolagen w tkankach biologicznych. TPEF to kolejna technika mikroskopii nieliniowej, w której dwa fotony o niższej energii jednocześnie wzbudzają fluorofor, powodując jego emisję fluorescencji. TPEF umożliwia głębokie obrazowanie tkanek ze zmniejszonymi fotouszkodzeniami, ponieważ światło wzbudzające znajduje się w zakresie bliskiej podczerwieni, która wnika głębiej w próbki biologiczne.
Obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) to potężna technika analityczna, która łączy możliwości spektrometrii mas z informacją przestrzenną, umożliwiając bezznacznikową identyfikację szerokiego zakresu molekuł10,11,12. Spektrometria mas jonów wtórnych czasu przelotu (ToF-SIMS) działa poprzez bombardowanie powierzchni próbki wysokoenergetycznymi jonami pierwotnymi, powodując wyrzucanie jonów wtórnych z powierzchni. Te jony wtórne są następnie przyspieszane w kierunku analizatora czasu przelotu, gdzie określa się ich stosunek masy do ładunku. Analiza ta pozwala na identyfikację fragmentów molekularnych i zmian izotopowych z wysoką czułością i rozdzielczością. Cenne zastosowania ToF-SIMS zostały wykazane w badaniach biologicznych i farmaceutycznych do badania substancji chemicznych i biomolekuł w komórkach13, tissues14,15, oraz organs15.
Zarówno SRS, jak i ToF-SIMS były używane niezależnie do badania dystrybucji leków w różnych modelach skóry. Jednak najbardziej wartościowe jest stosowanie tych technik w połączeniu, aby czerpać korzyści z ich komplementarności. W tym badaniu opisujemy przebieg pracy polegający na połączeniu mikroskopii optycznej (SRS, TPEF i SHG) z ToF-SIMS w celu uzyskania obrazów morfologii skóry z submikronową rozdzielczością przestrzenną (zapewnianą przez metody optyczne) z nałożonym sygnałem leku wykrytym z większą czułością (zapewnianym przez ToF-SIMS). Podejście to wykorzystano do rozwiązania trudnego przykładu, jakim jest wizualizacja dystrybucji diklofenaku w wyciętych tkankach skóry poddanych działaniu komercyjnego preparatu do stosowania miejscowego (żel Voltaren). Kryteriami sukcesu były: wysoka czułość chemiczna w wykrywaniu diklofenaku w jego stężeniu terapeutycznym oraz rozdzielczość przestrzenna wystarczająca do rozróżnienia struktury skóry. Chociaż zawartość diklofenaku w różnych warstwach skóry można określić ilościowo po leczeniu miejscowym za pomocą pracochłonnych i wymagających technicznie metod, takich jak usuwanie taśmy, a następnie oznaczanie ilościowe16, lub za pomocą mikroperfuzji o otwartym przepływie17, podejścia te nie są w stanie wyjaśnić zależnego od substancji pomocniczej podziału, penetracji, zatrzymywania i dystrybucji głębokości diklofenaku w poszczególnych warstwach skóry, które są podstawowymi czynnikami wspomagającymi rozwój produktu faza.
Przed metodologią pomiaru opisaną poniżej, żel Voltaren Forte (zawierający 2,32 % diklofenaku dietyloamonowego) lub odpowiadający mu żel placebo (dostarczony przez Haleon CH SARL) był nakładany na powierzchnię skóry na różne okresy (4, 12, 16 lub 24 godziny). Po usunięciu wszelkich pozostałości preparatu przeprowadzono pomiary SRS i ToF-SIMS na tych samych próbkach skóry; Szczegółowe informacje na temat metodologii znajdują się w oryginalnym manuskrypcie1.

<table><tbody><tr><td>Koherentny mikroskop Ramana&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/</td><td></td></tr> <tr><td>Próbki ludzkiej skóry&nbsp;</td><td>Tissue Solutions Ltd, Glasgow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kriostat Leica CM 1850&nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>https://www.leicabiosystems.com/en-fr/histology-equipment/cryostats/leica-cm1850/</td> <td>Wycofany</td></tr><tr><td>z produkcji system laserowy PicoEmerald-S</td><td>APE Berlin</td><td>https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/</td><td></td></tr> <tr><td>ToF SIMS 5</td><td>IONToF GmbH</td><td>https://spectral.se/products/tof-sims-5</td><td></td></tr></tbody></table>

korelacyjne metodologie obrazowania spektroskopii optycznej i spektrometrii mas w celu wizualizacji dystrybucji leku w skrawku tkanek miękkich

Correlative Optical Spectroscopy and Mass Spectrometry Imaging Methodology to Visualise Drug Distribution in a Soft Tissue Section

Nowa metodologia obrazowania korelacyjnego łącząca submikronową rozdzielczość przestrzenną z czułym wykrywaniem leków za pomocą spektroskopii optycznej i obrazowania spektrometrii mas została opracowana w celu wizualizacji rozkładu chemicznego po zastosowaniu leku w tkankach miękkich. W tym przykładzie metoda została przetestowana na wyciętej tkance skórnej po miejscowym zastosowaniu in vitro komercyjnego niesteroidowego leku przeciwzapalnego przez 16 godzin. Nieniszczące metody spektroskopowej optyki, w tym wymuszone rozpraszanie Ramana, generowanie drugiej harmonicznej i mikroskopia fluorescencyjna dwufotonowa, zostały po raz pierwszy wykorzystane do mapowania struktury i morfologii skóry. Następnie te same próbki tkanki skórnej poddano analizie za pomocą spektrometrii mas jonów wtórnych w czasie przelotu (ToF-SIMS), co umożliwiło zwiększenie czułości wykrywania diklofenaku w najbardziej zewnętrznych warstwach skóry - naskórku i skórze właściwej. Opracowano metody rejestracji obrazów w celu zintegrowania danych optycznych i spektrometrycznych mas. Podejście to łączy bezznacznikową wizualizację struktury tkanki w wysokiej rozdzielczości z czułą detekcją chemiczną i stanowi cenne narzędzie do badania dystrybucji leków w skórze i potencjalnie w innych miękkich tkankach biologicznych.

Rysunek 1 przedstawia wyniki rejestracji obrazów opartej na cechach, ukazując nałożone na siebie obrazy zarejestrowane metodami SRS, SHG i SIMS dla dwóch próbek skóry – jednej traktowanej placebo (Rysunek 1a) oraz pozostałych żelem Voltaren przez 4 godziny (Rysunek 1b) i 16 godzin (Rysunek 1c). Na obrazie zsumowany sygnał intensywności leku (z pomiarów ToF-SIMS) przedsta...

To badanie przedstawia metodę korelacyjnego obrazowania leków w tkankach miękkich za pomocą nieliniowej spektroskopii optycznej i obrazowania spektrometrii mas. Połączenie obrazowania skóry w wysokiej rozdzielczości z czułym wykrywaniem leków stanowi cenne podejście do badania dystrybucji leków w skórze, co ma kluczowe znaczenie dla opracowania doskonałych produktów do stosowania miejscowego.

Korelacyjne metodologie obrazowania spektroskopii optycznej i spektrometrii mas w celu wizualizacji dystrybucji leku w skrawku tkanek miękkich

A new correlative imaging methodology combining sub-micron spatial resolution with sensitive drug detection by optical spectroscopy and mass spectrometry ...

Opracowujemy metody obrazowania spektroskopowego korelacyjnego, aby lepiej zrozumieć miejscowe podawanie leków. Celem jest uzyskanie nowych mechanistycznych informacji na temat przenikania leków i ich biodostępności w warstwach skóry. Informacje te będą cenne dla ulepszenia formułowania, projektowania i schematu dawkowania produktów farmaceutycznych.Badania te dotyczą obecnego braku metod w zakresie jednoczesnego tworzenia się na strukturze skóry i dystrybucji w niej leków. Podążanie za aplikacją miejscową o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i wysokiej czułości. Dostęp do takich informacji jest niezbędny do opracowania najwyższej jakości produktów do stosowania miejscowego. Protokół ten oferuje szybką wizualizację dystrybucji leku w skórze w wysokiej rozdzielczości o wysokiej czułości chemicznej w porównaniu z istniejącymi tradycyjnymi technikami. Wszystkie te informacje można wydobyć z tego samego wycinka tkanki.Odkrycia te przyczyniają się do postępu w obrazowaniu korelacyjnym, prezentując niezawodną metodę, która łączy spektroskopię optyczną ze spektrometrią mas. Opracowane techniki rejestracji obrazów zapewniają precyzyjne dopasowanie zbiorów danych, umożliwiając szczegółową analizę dystrybucji leków w tkankach. Postęp ten przyczynia się do udoskonalenia systemów miejscowego dostarczania leków i głębszego wglądu w interakcje biologiczne między tkankami.Badania stawiają naukowe pytanie o to, w jaki sposób substancja pomocnicza preparatu wpływa na transport leków, czynnik wpływający na przenikanie leku przez typy skóry, kinetykę długoterminowego uwalniania i klirensu leków oraz szerokie zastosowanie obrazowania korelacyjnego Ramana i MSI do badania innych leków miejscowych i innych substancji w tkankach miękkich.[Narrator] Do wymuszonego rozpraszania Ramana lub mikroskopii SRS należy użyć soczewki o 40-krotnym powiększeniu zanurzonej w wodzie w połączeniu z soczewką skraplacza powietrza o niewielkiej odległości roboczej. Umieść zamontowany wycinek tkanki skórnej na stoliku na próbkę mikroskopu SRS, upewniając się, że tkanka znajduje się na tej samej powierzchni szkiełka mikroskopowego, co soczewka kondensatora. Skoncentruj soczewkę obiektywu na przekroju tkanki, a następnie zoptymalizuj wysokość skraplacza. Ustaw moc lasera na odpowiednie wartości, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu bez uszkadzania tkanki. Następnie uzyskaj mozaikowy obraz całego odcinka tkanki odpowiadającego taśmie rozciągającej CH2. Następnie wybierz obszar zainteresowania i ustaw parametr obrazowania na rozdzielczość 512 x 512 pikseli, pokrywającą obszar 290 x 290 mikrometrów. Użyj szybkości obrazowania 400 Hz X1 Zoom i średniej liniowej wynoszącej jeden. Teraz zastosuj spójne ustawienia wzmocnienia dla detektorów fluorescencji SRS i SHG. Uzyskuj obrazy w obszarze rozciągania CH na głębokości 2 850 centymetrów odpowiadającej CH2. Następnie uchwyć obrazy w obszarze odcisków palców na głębokości 1 666 centymetrów odpowiadającej amidowi 1. Po zobrazowaniu SRS natychmiast przenieś próbkę skóry do konfiguracji ToF-SIMS. Ustaw polaryzację jonów ujemnych z czasem cyklu pracy wynoszącym 100 milisekund, zakresem masy od 0 do 900 masy do naładowania i średnicą wiązki wynoszącą pięć mikrometrów. Użyj pistoletu do powodzi elektronów o natężeniu 20 elektronowoltów o natężeniu 25 mikroamperów do kompensacji ładunku. Uzyskaj ogólny obraz w trybie rastrowym makra stołu montażowego, odwzorowując cały przekrój tkanki z polem widzenia w zależności od wymiarów tkanki. Następnie używając pola widzenia 1 na 0,5 milimetra z czterema ujęciami na piksel na klatkę i 10 klatkami na łatkę, co odpowiada dawce jonów 1,31 razy 10 do potęgi 11 jonów na centymetr kwadratowy. Uchwyć obrazy obszaru zainteresowania, wybierając odpowiednie pole widzenia. Ustaw pole widzenia 0,5 x 0,5 milimetra z rozdzielczością 256 x 256 pikseli. Uzyskaj jedno zdjęcie na piksel z jedną klatką na skan, co daje w sumie 15 skanów odpowiadających gęstości dawki jonów 3,27 razy 10 do mocy 10 jonów na centymetr kwadratowy w celu kontroli jakości próbek homogenatu tkankowego. Po akwizycji należy skalibrować otrzymane widma masowe za pomocą jonów H, C, C2 i C3. Korzystając z oprogramowania Surface Lab 7.1, wykonaj akwizycję i ekstrakcję danych. W celu rejestracji obrazu zredukuj obrazy SIMS i SRS do trzech wymiarów przy użyciu nieujemnej faktoryzacji macierzy i zwizualizuj je jako kanały kolorów czerwonego, zielonego i niebieskiego. Korzystając z narzędzia do zaznaczania punktów kontrolnych MATLAB CP Select, wybierz pasujące cechy między dwoma obrazami faktoryzacji niemacierzowymi. Rejestrację należy przeprowadzić za pomocą funkcji formularza CP2 T i transformacji IM. Zastosuj w precyzyjnej transformacji, używając danych SIMS jako stałego obrazu i danych spektroskopii optycznej jako ruchomego obrazu. W przypadku leku będącego przedmiotem zainteresowania, w przypadku którego w danych ToF-SIMS wykryto wiele pików, należy zsumować intensywność tych pików, aby uzyskać łączną intensywność jonów leku. Wyodrębnić średnią całkowitą liczbę jonów z dwóch zestawów danych homogenatu dla każdej próbki tkanki skórnej. Korzystając z tej odpowiedniej wartości, znormalizuj intensywność jonów leku ToF-SIMS na każdym obrazie skóry. Po rejestracji nałóż na siebie dane spektroskopii optycznej i SIMS, przypisując odpowiednie obrazy do kanałów RGB. W niniejszym badaniu po czterech godzinach od aplikacji żelu Voltaren wykryto zwiększony sygnał leku w górnym obszarze skóry o grubości około 50 mikrometrów w porównaniu z próbką leczoną placebo. Po 16 godzinach od aplikacji żelu Voltaren sygnał leku rozszerzył się na głębsze warstwy skóry, wskazując na zwiększoną penetrację tkanek.

correlative-optical-spectroscopy-mass-spectrometry-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano metodę obrazowania preparatów z resekcji płuc ex vivo za pomocą obrazowania w dziedzinie częstotliwości optycznych (OFDI) oraz uzyskiwania precyzyjnej korelacji z histologią, co jest niezbędne do opracowania specyficznych kryteriów interpretacji OFDI w patologii płuc. Metoda ta może być zastosowana w przypadku innych typów tkanek i technik obrazowania w celu uzyskania precyzyjnej korelacji obrazowania z histologią dla dokładnej interpretacji i oceny obrazów. Kryteria obrazowania...

Obrazowanie w optycznej domenie częstotliwości próbek resekcji płuc ex vivo: uzyskanie korelacji obrazu z histopatologią w stosunku jeden do jednego

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-on) został wcześniej zgłoszony jako matryca MALDI do obrazowania tkanek małych cząsteczek; protokoły użycia DT do obrazowania MALDI endogennych lipidów na powierzchni skrawków tkanek za pomocą dodatniego jonu MALDI-MS na ultrawysokiej rozdzielczości instrument kwadrupol-FTICR są dostępne tutaj.

Dithranol jako matryca do obrazowania desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą na spektrometrze mas z cyklotronem z transformacją Fouriera

Źródło obrazowania spektrometrią mas (MSI) działające pod ciśnieniem atmosferycznym zostało opracowane przez sprzężenie desorpcji laserowej w średniej podczerwieni i post-jonizacji elektrorozpylania. Egzogenna matryca lodowa została wykorzystana jako matryca pochłaniająca energię, aby ułatwić rezonansową desorpcję materiału związanego z tkanką. Ten manuskrypt zawiera protokół krok po kroku do wykonywania IR-MALDESI MSI u noworodków całego ciała.

Obrazowanie spektrometrii mas całego ciała za pomocą jonizacji elektronatryskowej z desorpcją laserową wspomaganą matrycą w podczerwieni (IR-MALDESI)

Opisano montaż i użycie multimodalnego mikroendoskopu, który może rejestrować dane obrazu tkanek powierzchownych z parametrami fizjologicznymi tkanek, w tym stężeniem hemoglobiny, stężeniem melaniny i nasyceniem tlenem. Technika ta może być przydatna do oceny struktury tkanki i perfuzji oraz może być zoptymalizowana pod kątem indywidualnych potrzeb badacza.

Multimodalna platforma obrazowania i spektroskopii mikroendoskopii z wiązkami włókien do nieinwazyjnej analizy tkanek in vivo

Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący mikrodysekcję laserową w połączeniu z analizą LC/MS do przestrzennego ilościowego określania dystrybucji leków w ziarniniakach gruźlicy płuc. Podejście to ma szerokie zastosowanie w ilościowym określaniu stężeń leków w tkankach przy dużej szczegółowości przestrzennej.

Kwantyfikacja przestrzenna leków w zmianach gruźlicy płuc za pomocą mikrodysekcji laserowej Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LCM-LC/MS)

Nowatorska metoda przygotowania próbki została opracowana w celu dostosowania kokultury komórek i tkanek do wykrywania wymiany małych cząsteczek za pomocą obrazowania spektrometrii mas.

Uchwycenie komunikacji małych cząsteczek między tkankami a komórkami za pomocą obrazowej spektrometrii mas

W erze immunoterapii nowotworów, zainteresowanie wyjaśnieniem dynamiki mikrośrodowiska guza znacznie wzrosło. Protokół ten szczegółowo opisuje technikę obrazowania spektrometrii mas w odniesieniu do etapów barwienia i obrazowania, które pozwalają na wysoce zmultipleksowaną analizę przestrzenną.

Poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie

Nowatorska metoda przygotowania próbek została zademonstrowana do analizy makrokolonii bakteryjnych na bazie agaru za pomocą matrycowej desorpcji/jonizacji laserowej spektrometrii mas.

Badanie współpracy mikrobiologicznej poprzez obrazową analizę spektrometrii mas kolonii bakteryjnych hodowanych na agarze i w tkance podczas infekcji

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Farmakoterapia polegająca na zastępowaniu dopaminy za pomocą L-DOPA jest najczęściej stosowanym leczeniem objawowym choroby Parkinsona, jednak wiąże się z efektami ubocznymi, w tym z mimowolnymi, nieprawidłowymi ruchami, określanymi mianem dyskinezy 1. W niniejszym materiale przedstawiono protokół obrazowania metodą spektrometrii mas MALDI, który pozwala wykryć zmiany w poziomach neuropeptydów w mózgu szczura związane z dyskinezą.

Obrazowanie spektrometrią mas MALDI neuropeptydów w chorobie Parkinsona

Poznaj korelacyjne metody obrazowania spektroskopii optycznej i spektrometrii mas w celu wizualizacji dystrybucji leków w skórze. Ta technika umożliwia szybką, bezpłatkową analizę z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czułością chemiczną.

Korelacyjne metodologie obrazowania spektroskopii optycznej i spektrometrii mas w celu wizualizacji dystrybucji leku w skrawku tkanek miękkich (Wideo) | JoVE Journal

Korelacyjne metodologie obrazowania spektroskopii optycznej i spektrometrii mas w celu wizualizacji dystrybucji leku w skrawku tkanek miękkich

Przeglądaj więcej filmów