Name: Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster w ich naturalnej niszy. Technika ta umożliwia szczegółowe obserwacje dynamiki spektrosomów przez cały cykl komórkowy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Acaimo González Reyes i Maríi Olmedo López za pomocne komentarze do manuskryptu. Badanie to było wspierane przez PID2021-125480NB-I00 (H. S-G), "Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor" z Junta de Andalucía (J. G-M), "Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos" z VI i VII PPIT-Sevilla University (P. R-R) oraz "Contrato de Acceso de I+D+i" z VI PPIT-Seville University (P. R-R). Składamy podziękowania firmie Company of Biologists Ltd za uprzejme udzielenie praw do udostępniania zdjęć zaadaptowanych z oryginalnej publikacji (doi:10.1242/DEV.199716).

UWAGA: Krok 1.4 musi być wykonany co najmniej 2 dni wcześniej. Kroki 2.1 i 2.2 można wykonać 1 dzień wcześniej.
1. Konfiguracja przedeksperymentalna I
<ol>
	<li>Przygotować 100 μl porcji mieszaniny antybiotyków streptomycyny i penicyliny (10 000 j./ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny) i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Przygotować 15 ml następujących roztworów przy użyciu autoklawowanej czystej wody, przechowywać je w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu miesiąca: Wodorowęglan sodu (NaHCO3) 0,1 M pH 8,0 i 0,1% Tween 20.</li>
	<li>Przygotuj następującą pożywkę hodowlaną i roztwór w okapie z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia. Używaj wysterylizowanych końcówek i rurek filtra.
	<ol>
		<li>Przygotować 2 ml porcji nierozcieńczonej płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia w warunkach aseptycznych.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę Schneider's Drosophila uzupełnioną mieszanką antybiotyków 15% FBS i 0,6% streptomycyny i penicyliny. Przygotować 7 ml porcji i przechowywać w temperaturze 4 °C. Jedna porcja wystarcza na dwie płytki MatTek (patrz punkt 2).
		<ol>
			<li>Przygotować roztwór Ringera (128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 35,5 mM Sacharozy, 5 mM Hepes w autoklawowanej czystej wodzie; pH 6,9). Przygotować 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz 1-2 jednodniowe muchy wyrażające konstytutywnie i wszechobecnie białko Par-1 połączone z linią GFP (linia poli Ubiquitin-mGFP6::p ar-1) do nowej probówki z pokarmem dla much uzupełnionym proszkiem drożdżowym. Hodować je przez 2 dni w temperaturze 25 °C w inkubatorze przed rozbieraniem. 
	UWAGA: Ten krok można wykonać z dowolnym interesującym Cię reporterem oznaczonym fluorescencyjnie.</li>
</ol>
2. Powlekanie i przygotowanie płyty szklanej
<ol>
	<li>Umieść 3 μl kropli specjalnego kleju Cell-Tak (zwanego dalej klejem komórkowym i tkankowym) na środku szkiełka nakrywkowego 35-milimetrowej płytki pokrytej poli-D-lizyną (naczynie ze szklanym dnem, patrz Tabela materiałów) bez ręcznego rozprowadzania. Używaj sterylnych końcówek. 
	UWAGA: Klej do komórek i tkanek należy przechowywać w temperaturze 4 °C. W przypadku eksperymentów z dwoma chorobami genetycznymi (zazwyczaj kontrolnymi i zmutowanymi), umieść dwie pojedyncze, dobrze oddzielone krople kleju w tej samej szklanej płytce dolnej. Zapewni to, że oba tła genetyczne zostaną zobrazowane w tych samych warunkach.</li>
	<li>Natychmiast po tym należy ostrożnie dodać równą objętość (3 μl w tym układzie protokołu) 0,1 M NaHCO3 pH 8,0 do 3 μl kleju kropli zgodnie z zaleceniami producenta i wymieszać pipetując.</li>
	<li>W celu całkowitego odparowania należy inkubować płytkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc do użycia następnego dnia. Alternatywnie, inkubować przygotowaną płytkę w temperaturze 37 °C przez 25 minut, aż do całkowitego odparowania i przejść bezpośrednio do następnego etapu. W obu przypadkach należy utrzymać płytę wraz z jej pokrywą. Używaj sterylnych końcówek.</li>
	<li>Pozwól, aby przygotowane naczynie ze szklanym dnem osiągnęło RT, umieszczając je na stole na 15-20 minut przed użyciem.</li>
	<li>Dokładnie umyj 3 razy przygotowaną płytę. Unikaj dotykania i naruszania warstwy kleju. W każdym praniu dodaj 6 μl autoklawizowanej czystej wody, a następnie usuń wodę za pomocą czystej końcówki dla każdego z trzech płukań, aby usunąć pozostałości roztworu NaHCO3.</li>
	<li>Pozwól na całkowite odparowanie wody, umieszczając czystą i przygotowaną płytkę w temperaturze pokojowej podczas preparowania przez 5-10 minut pod przykryciem, aby uniknąć cząstek kurzu.</li>
</ol>
3. Rozwarstwienie jajnika Drosophila oraz izolacja i montaż jajnika
UWAGA: Sekcja jajnika jest przeprowadzana w roztworze Ringera (zamiast w pożywce Schneidera) bez FBS, aby zapobiec obecności białek, które mogłyby przeszkadzać w przywieraniu tkanki próbki do kleju.
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem wyczyść trzydołkowe naczynie preparacyjne, kleszcze i igły do rozwarstwiania 70% etanolem.</li>
	<li>Dodać odpowiednią objętość (~200 μl) roztworu Ringera do każdej z trzech studzienek.</li>
	<li>Wypreparuj jajniki 5 samic karmionych drożdżami w 200 μl roztworu Ringera w pierwszej studzience za pomocą dwóch par kleszczy zgodnie ze standardowymi procedurami10,11. Chwyć samicę Drosophila na skrzyżowaniu klatki piersiowej i brzucha jednym z kleszczy. Następnie delikatnie oderwij naskórek w tylnej części brzucha i pociągnij naskórek brzucha, aż oba jajniki zostaną odsłonięte.</li>
	<li>Przenieś wypreparowane jajniki do drugiej studzienki, aby zmniejszyć zanieczyszczenie resztkami innych tkanek lub resztkami powstałymi w wyniku sekcji.</li>
	<li>Usuń osłonkę mięśniową 15-20 jajników za pomocą mikroskopu stereoskopowego (zoom 8X-13,5X) z oświetleniem diodą elektroluminescencyjną (LED) i precyzyjnymi kleszczami. Użyj jednej pary kleszczy, aby zakotwiczyć całe ciało jajnika, a drugiej użyj drugiej, aby płynnie chwycić komorę jajową w późnym stadium i delikatnie rozciągnąć, aż mięsień pęknie i pozostanie w tyle. 
	UWAGA: Istotne jest, aby uniknąć uszkodzenia zarodków tylko poprzez zmniejszenie kontaktu z tą częścią jajników. Usuń komory jaj starsze niż etapy 8-9.</li>
	<li>Przenieś kolejno 15-20 jajników wolnych od osłonek mięśniowych za pomocą kleszczy do trzeciego dołka zawierającego 200 μl pożywki Ringera.</li>
	<li>Wstępnie zwilż końcówkę o pojemności 20-200 μl z 0,1% Tween 20 przez pipetowanie. Zapobiega to przyleganiu jajników do plastikowych ścianek końcówki.</li>
	<li>Przenieść 6 μl roztworu Ringera zawierającego jajniki wolne od osłonek mięśniowych za pomocą wstępnie zwilżonej końcówki na przygotowaną płytkę adhezyjną (utrzymywaną w temperaturze RT). 
	UWAGA: Unikaj wszelkiego kontaktu końcówki z warstwą kleju, aby zapobiec oderwaniu się kiełków po osadzeniu jajnika (następny krok). Około 30% german nie przylega zgodnie z oczekiwaniami.</li>
	<li>Aby upewnić się, że przeniesione jajniki przylegają do powierzchni kleju, ostrożnie dociśnij je do dna kropli Ringera, aż zetkną się z powierzchnią kleju za pomocą igły do wypreparowania lub kleszczy. 
	UWAGA: Nie próbuj przestawiać jajników, gdy już się usiądą.</li>
	<li>Ostrożnie napełnij płytkę MatTek 3 ml pożywki Schneidera uzupełnionej 15% FBS i 0,6% mieszaniną antybiotyków streptomycyny/penicyliny (krok 1.3). Aby zapobiec odklejaniu się jajników, należy powoli dodawać po 1 ml wokół zewnętrznej krawędzi płytki.</li>
	<li>Przetransportować płytkę zawierającą jajniki wolne od osłonek mięśniowych na płaskiej powierzchni do stacji mikroskopowej.</li>
</ol>
4. Obrazowanie na żywo za pomocą mikroskopu konfokalnego
<ol>
	<li>Umieść płytkę na obiektywie 63x mikroskopu z wirującym dyskiem lub mikroskopu konfokalnego (można użyć podobnego sprzętu) i ustaw ostrość próbki. Wybierz środkową płaszczyznę z dla każdego germarium.</li>
	<li>Skonfiguruj następujące parametry eksperymentalne: typ przechwytywania: poklatkowy 3D, dostosuj moc lasera 70/100, długość fali wzbudzenia: 488 nm, zasięg stosu z: 30 μm i odległość między stosami Z: 1,2 μm, czas trwania: 17 godzin, odstęp między punktami czasowymi: co 10 minut.</li>
	<li>Jeśli to możliwe, korzystając z opcji wielopozycyjnej, ponownie zdefiniuj współrzędne XY próbek i wybierz płaszczyznę Z w środku każdego germarium, ponieważ stosy z zostaną wyśrodkowane w tej pozycji. Rozpocznij pobieranie. 
	UWAGA: Ponieważ normalna szerokość germarium wynosi 30 μm, każdy stos Z będzie miał ~25-27 sekcji. W zależności od konfokalu w odstępach 10-minutowych można zobrazować co najmniej 25 germarii. Zwykle używane są obiektywy 40x/1,30 NA lub 63x/1,40 NA z korekcją planapo.</li>
	<li>Analizuj obrazy w czasie i osi Z, aby zobrazować określone zmiany w morfologii spektrosomu za pomocą oprogramowania Imaris lub ImageJ (Fiji)12,13. Wyświetlane są konkretne czasy ich obserwacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B'). Aby zamontować filmy, ręcznie wybierz najlepszą płaszczyznę Z w każdym punkcie czasowym.</li>
</ol>

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

<ol><li>Li, L., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+niche%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cell niche: structure and function.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 605-631 (2005).</li>
<li>Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+physiological+control+of+germline+stem+cell+lineages+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Local and physiological control of germline stem cell lineages in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 213 (1), e234(2019).</li>
<li>Eliazer, S., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+niche%3A+studies+from+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., Guerrero, I., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+delivery+of+Hedgehog+regulates+the+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+to+maintain+germline+stem+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated delivery of Hedgehog regulates the expression of bone morphogenetic proteins to maintain germline stem cells in Drosophila.</a> PLoS Biol. 10 (4), e1001298(2012).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+plasticity+of+stem+cell+niches%3A+a+general+property+behind+tissue+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the plasticity of stem cell niches: a general property behind tissue homeostasis and repair.</a> Stem Cells. 32 (4), 852-859 (2014).</li>
<li>Deng, W., Lin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrosomes+and+fusomes+anchor+mitotic+spindles+during+asymmetric+germ+cell+divisions+and+facilitate+the+formation+of+a+polarized+microtubule+array+for+oocyte+specification+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Spectrosomes and fusomes anchor mitotic spindles during asymmetric germ cell divisions and facilitate the formation of a polarized microtubule array for oocyte specification in Drosophila.</a> Dev Biol. 189 (1), 79-94 (1997).</li>
<li>Huynh, J. R., Shulman, J. M., Benton, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-1+is+required+for+the+maintenance+of+oocyte+fate+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-1 is required for the maintenance of oocyte fate in Drosophila.</a> Development. 128 (7), 1201-1210 (2001).</li>
<li>Villa-Fombuena, G., Lobo-Pecellín, M., Marín-Menguiano, M., Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+ovarian+niche+shows+spectrosome+and+centrosome+dynamics+during+asymmetric+germline+stem+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila ovarian niche shows spectrosome and centrosome dynamics during asymmetric germline stem cell division.</a> Development (Cambridge). 148 (18), dev199716(2021).</li>
<li>De Cuevas, M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+Drosophila+fusome+and+its+implications+for+oocyte+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the Drosophila fusome and its implications for oocyte specification.</a> Development. 125 (15), 2781-2789 (1998).</li>
<li>Wong Li, C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila ovaries.</a> J Vis Exp. (1), 52(2006).</li>
<li>Merkle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+fixation%2C+and+standard+staining+of+adult+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissection, fixation, and standard staining of adult Drosophila ovaries.</a> Methods Mol Biol. 2626, 49-68 (2023).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Res. 9, 95(2020).</li>
<li>Duan, T., Cupp, R., Geyer, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+female+germline+stem+cells+undergo+mitosis+without+nuclear+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila female germline stem cells undergo mitosis without nuclear breakdown.</a> Curr Biol. 31 (7), 1602-1610 (2021).</li>
<li>Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+imaginal+disc+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila imaginal disc development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (32), 14217-14222 (2010).</li>
<li>Dye, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods Mol Biol. 2540, 275-285 (2022).</li>
<li>Sohr, A., Du, L., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Drosophila+wing+imaginal+disc+culture+and+furin+inhibitor+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Drosophila wing imaginal disc culture and furin inhibitor assay.</a> Bio Protoc. 9 (16), e3336(2019).</li>
<li>Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+reveals+hub+cell+assembly+and+compaction+dynamics+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+testis+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche.</a> Dev Biol. 446 (1), 25-34 (2019).</li>
<li>Gärthner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts%3A+dissection%2C+imaging%2C+and+pharmacological+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> J Vis Exp. 91, e51868(2014).</li>
<li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Dev Cell. 50 (3), 296-310 (2019).</li>
<li>Jackson, J. A., Imran Alsous, J., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+nurse+cell+behavior+in+late+stages+of+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of nurse cell behavior in late stages of Drosophila oogenesis.</a> Methods Mol Biol. 2626, 191-206 (2023).</li>
<li>Díaz de la Loza, M. C., Díaz-Torres, A., Zurita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+levels+regulate+tissue+migration+and+anterior-posterior+polarity+during+egg+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Laminin levels regulate tissue migration and anterior-posterior polarity during egg morphogenesis in Drosophila.</a> Cell Rep. 20 (1), 121-133 (2017).</li>
<li>Christophorou, N., Rubin, T., Bonnet, I., Piolot, T., Arnaud, M., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-driven+nuclear+rotations+promote+meiotic+chromosome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-driven nuclear rotations promote meiotic chromosome dynamics.</a> Nat Cell Biol. 17 (11), 1388-1398 (2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
<li>Zielke, N., Korzelius, J., van Straaten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly-FUCCI%3A+a+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Fly-FUCCI: a versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Rep. 7 (2), 588-598 (2014).</li>
<li>Hinnant, T. D., Alvarez, A. A., Ables, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+remodeling+of+the+cell+cycle+accompanies+differentiation+in+the+Drosophila+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal remodeling of the cell cycle accompanies differentiation in the Drosophila germline.</a> Dev Biol. 429 (1), 118-131 (2017).</li>
<li>Hsu, H. J., LaFever, L., Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+controls+normal+and+tumorous+germline+stem+cells+via+insulin-dependent+and+-independent+mechanisms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Diet controls normal and tumorous germline stem cells via insulin-dependent and -independent mechanisms in Drosophila.</a> Dev Biol. 313 (2), 700-712 (2008).</li>
<li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development (Cambridge). 143 (8), 1375-1382 (2016).</li>
<li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Dev Biol. 314 (2), 360-372 (2008).</li>
<li>Ables, E. T., Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+E+controls+Drosophila+female+germline+stem+cell+maintenance+independently+of+its+role+in+proliferation+by+modulating+responsiveness+to+niche+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Cyclin E controls Drosophila female germline stem cell maintenance independently of its role in proliferation by modulating responsiveness to niche signals.</a> Development (Cambridge). 140, 4267-4276 (2013).</li>
<li>Lin, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cell+division+and+egg+chamber+development+in+transplanted+Drosophila+germaria%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cell division and egg chamber development in transplanted Drosophila germaria.</a> Dev Biol. 159 (1), 140-152 (1993).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Tutaj przedstawiamy protokół monitorowania niszy GSC Drosophila melanogaster przez dłuższy czas, do 16 godzin. Większość protokołów filmowania procesów biologicznych Drosophila ex vivo koncentruje się na krótszych oknach czasowych, a wiele przykładów można znaleźć dla wyimaginowanych krążków skrzydeł 15,16,17, gonad zarodków 18,19 lub jajników 20,21,22,23. Z pewnością czas pozyskiwania obrazu zależy od badanego procesu rozwojowego. Podczas gdy zdarzenia przejściowe mogą występować w zakresie, który może wahać się od milisekund do sekund w zależności od typu komórki i warunków fizjologicznych24, inne procesy, takie jak podział komórki, mogą wymagać godzin lub dni filmowania, aby były obserwowalne. W szczególności cykl komórkowy samic Drosophila GSC trwa około 12-14 godzin25. W Villa-Fombuena i in. (2021)8 oszacowanie czasu trwania pełnego cyklu wynosiło 15,5 godziny, jak określono na podstawie badania zmian w morfologii spektrosomu. Połączenie tej metody obrazowania z markerami chromatyny i/lub technologią Fly-FUCCI26 wykazało, że GSC zwykle dzieli się co 15,5 godziny i że średni czas trwania faz cyklu komórkowego wynosił: M (okrągły kształt, 22 min), G1 (okrągły G1, kształt wtyczki i pręta, 3,45 h), S (kształt utrwalający, 43 min) i G2 (fuzyjny, Wykrzyknik i Kształty okrągłe, 10,5 godz.). Surowe dane dotyczące czasu trwania faz cyklu komórkowego przedstawiono w Villa-Fombuena i wsp.8. Obserwacje te były zgodne z wcześniejszymi badaniami, w których wykorzystano stałe obrazowanie do analizy cyklu komórkowego GSC i morfologii dyosomów 25,27,28. Co więcej, ta metoda in vivo może pomóc w rozszyfrowaniu dalszych konsekwencji nieprawidłowego podziału GSC i/lub dynamiki spektrosomów w dalszej selekcji oocytów, ponieważ dyom odgrywa główną rolę w tych zdarzeniach. Ponadto protokół ten może być stosowany do analizy szybkości podziału GSC w istniejących lub nowych mutantach.
Ciągła akwizycja obrazów przez długie godziny pociąga za sobą szereg krytycznych kwestii, które należy wziąć pod uwagę, głównie utrzymanie integralności tkanki i jej funkcjonalności oraz zachowanie fluorescencji próbki. Utrzymanie odpowiednich warunków środowiskowych komórek niszowych jest niezbędne, aby uniknąć nieprawidłowego działania, stresów, zatrzymania cyklu komórkowego lub śmierci komórki. W warunkach przedstawionych w tym badaniu GSC mogą wejść w mitozę, krytyczny krok wskazujący na zdrowie tkanek, nawet po 12 godzinach lub więcej podczas filmowania. W związku z tym przypuszczamy, że hodowane germary zachowują swoją integralność i funkcjonalność przez większość czasu obrazowania. Podobnie, ze względu na nową produkcję materiału GFP:Par-1 (patrz Villa-Fombuena i in. 2021)8 w całym cyklu komórkowym, a także dlatego, że ograniczamy akwizycję obrazu do zaledwie raz na 10 minut, nawet punkty czasowe bliżej końca filmów zachowują wystarczający sygnał, aby umożliwić ich analizę. W każdym razie wybielanie próbek można potencjalnie skorygować za pomocą wtyczek, takich jak Bleach Correction13.
Aby naśladować właściwe środowisko ex vivo, tkanki owadów mogą być utrzymywane przy użyciu pożywki Schneidera przez określoną liczbę godzin podczas filmowania ze specjalną suplementacją. Co ważne, w protokole tym nie stosuje się czynników wzrostu ani ekstraktu z much innych niż FBS. Poprzednie badanie wykazało, że wiele GSC jest zwykle zatrzymywanych w G2 i wchodzi w fazę M przez wysoki poziom insuliny25. W związku z tym nie dodajemy insuliny do warunków hodowli, aby uniknąć tej nieprawidłowej stymulacji cyklu komórkowego GSC. Dodanie FBS do podłoża preparacyjnego może również zmniejszyć ryzyko przyklejenia się komór jajowych do końcówki pipety lub szklanego naczynia podczas transferu jajników21. Wreszcie, stosowanie antybiotyków jest odpowiednie w przypadku dłuższych filmów, aby uniknąć namnażania się bakterii i/lub grzybów. Nadmierny wzrost mikroorganizmów w szalkach hodowlanych może zmienić homeostazę tkanki, a tym samym wpłynąć na podział komórek. W tym protokole pożywka zawiera mieszaninę antybiotyków (zwykle suplementowanych w dawce 1% (100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny). Podobnie, długie inkubacje mogą wpływać na skuteczność antybiotyków, a wymiana pożywki może być rozważana w celu zapobieżenia rozkładowi antybiotyków.
Drosophila germaria są otoczone rurkową osłonką mięśniową, którą należy usunąć, aby zapobiec ruchom perystaltycznym, rotacyjnym i kurczącym się typowym dla tej tkanki29,30. W ten sposób usunięcie tej osłonki mięśniowej poprawia obserwację sygnałów reporterowych, umożliwia stosowanie konfiguracji ustawień konfokalnych w celu zminimalizowania blaknięcia sygnału i fotouszkodzeń oraz umożliwia obrazy o wysokiej rozdzielczości czasowej. Z drugiej strony, wkład osłonki mięśniowej w homeostazę tkanki jest nadal nieznany. W związku z tym jego usunięcie może w jakiś sposób wpłynąć na normalne funkcjonowanie niszy GSC. Kolejną wadą systemu jest to, że germaria może oderwać się od kleju podczas filmowania i dryfować w otaczającym podłożu. W związku z tym obrazy mogą przesuwać się w obrębie punktów czasowych lub nawet podczas akwizycji danej serii z. W takim przypadku można użyć różnych wtyczek do skorygowania ruchu próbki w ImageJ, takich jak metody rejestracji12.
Podsumowując, opracowaliśmy metodę pozyskiwania rozszerzonych filmów z żywymi germariami. Chociaż metoda ta pozwoliła na szczegółowe zdefiniowanie cyklu komórkowego GSC i tego, jak dynamika spektrosomu koreluje z różnymi fazami cyklu komórkowego GSC, zdajemy sobie sprawę z pewnych ograniczeń nieodłącznie związanych z naszym protokołem. Przede wszystkim akwizycja obrazu odbywa się w sztucznym ośrodku, w którym warunki środowiskowe nie do końca odzwierciedlają warunki in vivo . Ponieważ jednak uzyskaliśmy podobne wyniki dotyczące morfologii spektrosomów podczas różnych faz cyklu komórkowego niż te zgłoszone przez innych autorów przy użyciu utrwalonej tkanki31, uważamy, że ten protokół w dużej mierze podsumowuje warunki in vivo . Po drugie, chociaż integralność i funkcjonalność tkanek wydaje się nienaruszona przez 16-godzinne hodowle, nie oceniliśmy tego dokładnie. Idealnie byłoby, gdyby można było przeszczepić sfilmowaną germarię z powrotem do żeńskiego brzucha i ocenić, czy może ona wytworzyć nowe komory jajowe, tak jak germaria kontrolna do32. Metoda obrazowania na żywo zastosowana w tym badaniu jest cennym narzędziem do analizy asymetrycznego podziału GSC, szczególnie w odniesieniu do biologii jajników Drosophila w ogóle. Ponadto podejście to jest szczególnie przydatne w badaniach farmakologicznych związków chemicznych, czynników wzrostu lub składników odżywczych, ponieważ mogą one być bezpośrednio uzupełniane w pożywkach hodowlanych. Co więcej, możemy umieścić próbki eksperymentalne i kontrolne na tej samej płytce, minimalizując różnice techniczne w ramach eksperymentów.

Obrazowanie procesów biologicznych na żywo jest kluczowe w uzyskiwaniu bezpośrednich dowodów eksperymentalnych. Połączenie zaawansowanej mikroskopii konfokalnej i optymalizacji metodologii pozwala na eksplorację wielu zdarzeń biologicznych z dużą precyzją. Optymalizacja etapów protokołów, takich jak manipulacja i sekcja tkanek, przygotowanie i konserwacja próbek oraz ustawienia pozyskiwania mikroskopii, ma kluczowe znaczenie dla maksymalizacji wiarygodności i odporności uzyskanych wyników. W tym miejscu przedstawiamy protokół monitorowania próbek do rozszerzonego obrazowania, który jest szczególnie skoncentrowany na jajnikach Drosophila melanogaster. Jajnik Drosophila melanogaster jest doskonałym systemem modelowym do analizy szerokiego zakresu procesów rozwojowych. Ten narząd rozrodczy muszki owocowej Drosophila melanogaster zawiera między innymi bardzo dobrze zdefiniowaną niszę dorosłych komórek macierzystych. Ta nisza GSC podtrzymuje rozwój gamet żeńskich w wieku dorosłym. Jajniki Drosophila składają się z około 18 jajników, w których w germarium rozwijają się komory jajowe. W końcówce każdego germarium 2-4 GSC są utrzymywane w somatycznej niszy komórkowej utworzonej głównie przez końcowe włókno 8-10 komórek, rozetę 5-8 komórek czapeczki i 2-3 przednie komórki eskortowe (<silna klasa = "xfig" >Figura 1A). Ta nisza somatyczna zapewnia GSC niezbędne sygnały i fizyczne wsparcie, aby utrzymać ich macierzystość, kontrolować proliferację i zapobiegać różnicowaniu1,2,3,4,5.
GSC zwykle dzielą się asymetrycznie, aby wytworzyć nową komórkę macierzystą, która utrzymuje kontakt z niszą somatyczną i komórką potomną, cystoblastem (CB), który traci bezpośredni kontakt z komórkami czapeczki somatycznej i różnicuje się. GSC i CB zawierają wysoce dynamiczne i cytoplazmatyczne organelle, spektrosom, którego główną funkcją jest prawidłowa orientacja wrzeciona mitotycznego podczas mitozy6. CB dzieli się 4 razy z niepełną cytokinezą, aby wytworzyć torbiele 16-komórkowe, w których jedna z komórek linii rozrodczej określa się w oocycie, a pozostałe 15 komórek staje się komórkami pielęgniarskimi. Spektrosom CB rozrasta się w rozgałęzioną strukturę zwaną dymem, która łączy 16-komórkowe połączone ze sobą komórki linii rozrodczej. Spektrosom jest wzbogacony w małe pęcherzyki i białka szkieletowe, takie jak kinaza serynowo-treoninowa Par-1 i składnik błonowy Hu-li tai shao (Hts)7. Podczas cyklu komórkowego GSC spektrosom rośnie przez dodanie nowego materiału i zmienia swój kształt, co pozwala na identyfikację faz G1, S, G2 i M (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)8,9.
Niedawno wdrożyliśmy metodę hodowli ex vivo germarium Drosophila, która pozwala na obrazowanie żywych GSC przez okres do 16 godzin. Ponieważ komórki te dzielą się średnio raz na 15,5 godziny8, metoda ta pozwala na filmowanie dużych fragmentów cyklu komórkowego GSC. Tak więc, w połączeniu z innymi narzędziami, nasza metoda hodowli pozwoliła na opisanie morfologii spektrosomów podczas cyklu komórkowego GSC oraz analizę czasu trwania różnych faz cyklu komórkowego in vivo8 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół tej rozszerzonej metody obrazowania na żywo, poparty filmem instruktażowym krok po kroku, który opisuje metodologię (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).

<table><tbody><tr><td>9-dołkowa szklana płyta</td><td>Corning&nbsp;</td><td>7220-85</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td>CaCl2&middot; 2H2O; Aby przygotować roztwór Ringera</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354240</td><td>Klej do komórek i tkanek Służy do mocowania komórek lub skrawków tkanek do wielu rodzajów powierzchni, w tym plastiku, szkła, metalu, polimeru FEP i materiałów biologicznych.</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5&nbsp;</td><td>Kleszcze Finescience</td><td>11252-20</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Dumont #55&nbsp;</td><td>Finescience</td><td>11255-20</td><td>Wymiary 0,05 mm x 0,02 mm i długość 11 cm</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>10500-064</td><td>Kwalifikowany, inaktywowany termicznie, zatwierdzony przez UE, pochodzenie z Ameryki Południowej&nbsp;</td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>Talerz 35 mm, nr 1.5 Szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 10 mm,&nbsp; Poli-D-lizyna</td></tr><tr><td>powlekana HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>Do przygotowania roztworu Ringera</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td>MgCl2; Aby przygotować roztwór Ringera</td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>RS-6061</td><td>Lekki, pusty uchwyt ze stali nierdzewnej; 4 3/4" długości.</td></tr><tr><td>Lornetka Nikon SMZ18&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>https://www.microscope. healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10 000 U/ml</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>KCl; Aby przygotować roztwór Ringera</td></tr><tr><td>Schneider's Drosophila Medium</td><td>Biowest&nbsp;</td><td>L0207</td><td>Pożywka komórkowa do hodowli komórek owadów</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8875&nbsp;</td><td>NaHCO3; &ge; 99,5%, proszek</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl; Aby przygotować roztwór Ringera,</td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>&ge; 99,5% (GC); Aby przygotować roztwór Ringera</td></tr><tr><td>Igła do rozwarstwiania wolframu</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>RS-6064</td><td>0,25 mm, Ultra Fine, końcówka 1 mikrona (Pk 10)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>do biologii molekularnej, lepka ciecz</td></tr><tr><td>Drożdże w proszku</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej drosophila melanogaster

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Metody obrazowania na żywo pozwalają na szczegółową analizę dynamicznych procesów komórkowych w czasie rzeczywistym. Jajnik Drosophila stanowi doskonały model do badania dynamiki niezliczonych procesów rozwojowych, takich jak podział komórek, łodyga, różnicowanie, migracja, apoptoza, autofagia, adhezja komórkowa itp., w czasie. W ostatnim czasie przeprowadziliśmy rozszerzoną hodowlę ex vivo i obrazowanie na żywo niszy samic Drosophila GSC. Wykorzystując na przykład linię Drosophila zawierającą transgen GFP::P ar-1, metoda ta pozwala na wizualizację asymetrycznego podziału GSC w ich niszy i opis zmian w morfologii spektrosomu wzdłuż cyklu komórkowego. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli ex vivo Drosophila germaria, umożliwiający przedłużoną wizualizację żeńskiej niszy GSC. Co ważne, protokół ten ma szerokie zastosowanie do obrazowania na żywo GSC z wieloma fluorescencyjnie znakowanymi białkami, które są dostępne w ośrodkach i/lub w społeczności badawczej Drosophila.

Dzięki temu rozszerzonemu protokołowi obrazowania na żywo możemy rejestrować asymetryczną mitozę żeńskich GSC w ich niszy bez widocznych zakłóceń biologicznych. W tym celu wykorzystujemy germaria wykazujące powszechną ekspresję białka GFP::Par-1, które pozwala rozróżnić pięć odrębnych morfologii spektrosomów w cyklu komórkowym GSC: okrągłą (Round), korkową (Plug), pręcikową (Bar), zlewającą się (Fusing) oraz w kształcie wykrzyknika (Exclamation point) (Ryc. 1B,C). W bardziej szczegółowym opisie zaobserwowaliśmy, że silny sygnał GFP:Par1 spektrosomu okrągłego w fazie G2 (Ryc. 1C, panel a) jest gwałtownie redukowany podczas faz G2-M-G1. Co ważne, zastosowanie tej linii transgenicznej umożliwia również wizualizację wejścia GSC w mitozę, ponieważ większość białka GFP::Par-1 opuszcza spektrosom i wypełnia cytoplazmę podczas wczesnej profazy (Ryc. 1C, panel b). Ponadto cytoplazmatyczne GFP::Par-1 pozwala na precyzyjne wykrycie etapu przepuszczalności otoczki jądrowej (NEP)8,14, ponieważ sygnał GFP wnika do nukleoplazmy dokładnie w tym momencie (Ryc. 1C, panel b). Po mitozie i reformacji otoczki jądrowej sygnał GFP:Par1 jest stopniowo odzyskiwany w spektrosomie okrągłym w fazie G1 (Ryc. 1C, panel c). Dodawanie materiału GFP:Par1 de novo do spektrosomu okrągłego w fazie G1 sprzyja formowaniu się morfologii spektrosomów korkowych (Plug) (Ryc. 1C, panel d), pręcikowych (Bar) (Ryc. 1C, panel e) oraz zlewających się (Fusing) (Ryc. 1C, panel f). Na koniec marker GFP:Par1 umożliwia wizualizację spektrosomu w kształcie wykrzyknika (Ryc. 1C, panel e), co jest konsekwencją powstania ciała środkowego (midbody) – bogatej w mikrotubule struktury białkowej formowanej podczas cytokinezy obok kurczliwego pierścienia aktynomyzynowego.
<img alt="Fazy różnicowania komórek macierzystych linii zarodkowej; morfologia spektrosomu; schemat faz cyklu; mikroskopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Dynamika cyklu spektrosomu w żywych GSCs.(A) Schematyczny diagram niszy komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) składającej się z komórek włókien końcowych (TFCs, na niebiesko), komórki przejścia (TC, na czerwono), komórek czapki (CpCs, na fioletowo) oraz komórek eskortujących (ECs, na szaro). GSCs (na żółto) zawierają charakterystyczną organellę zwaną spektrosomem (na zielono). W cyklu komórkowym GSC spektrosom przechodzi z kształtu sferycznego w wydłużony, a następnie ponownie w sferyczny. GSC dzieli się, tworząc komórkę potomną, cystoblast (CB, na pomarańczowo), która traci kontakt z niszą i również zawiera sferyczny spektrosom. CB dzieli się czterokrotnie w sposób następujący i synchroniczny z niepełną cytokinezą, tworząc cysty 2-, 4-, 8- i 16-komórkowe połączone fuzomem. (B) Diagram przedstawiający różne kształty spektrosomu powstające w trakcie cyklu komórkowego. (B') Przewidywany czas obserwacji poszczególnych morfologii spektrosomu. (C) Obrazy z poszczególnych punktów czasowych z 17-godzinnego filmu pokazującego sygnał GFP::Par-1 w niszy GSC. Czas 0 min (0') odpowiada permeabilizacji otoczki jądrowej (NEP). Panel ilustruje pięć różnych morfologii spektrosomu (białe i zielone groty strzałek): Okrągły (zarówno w G2, jak i G1; panel a i c), Korek (panel d), Pręt (panel e), Zlewający się (panel f) oraz Wykrzyknik (panel e, zielony grot strzałki). Ta ostatnia morfologia spektrosomu należy do drugiej GSC (zielona linia przerywana) pokazanej w 70'. GSCs są ograniczone żółtymi i zielonymi liniami przerywanymi. Powstałe CB po podziale GSC są ograniczone pomarańczowymi liniami przerywanymi. Pasek skali: 10 µm. Panele A i B zostały zaadaptowane za zgodą Villa-Fombuena i wsp.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat izolacji owarioli Drosophila; kroki: przygotowanie MatTek, sekcja, obrazowanie; metoda biologiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Metoda montażu z użyciem kleju Cell-Tak do przedłużonego obrazowania na żywo germariów Drosophila . (1) Proces krok po kroku przygotowania szalki z szklanym dnem z klejem. (2) Przegląd sekcji jajnika Drosophila w roztworze Ringera i przygotowania poszczególnych owarioli pozbawionych mięśni. (3) Przeniesienie owarioli bez pochewki mięśniowej do szalki z szklanym dnem. (4) Wypełnienie szalki z szklanym dnem uzupełnionym medium Schneidera. (5) Obrazowanie germariów przez okres od 10 h do 16 h przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego. Rysunek został zaadaptowany za zgodą Villa-Fombuena i wsp.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Jesteśmy zainteresowani odkrywaniem nowych mechanizmów komórkowych i molekularnych kontrolujących macierzystość komórek. Naszym głównym celem jest rozszyfrowanie, w jaki sposób komórki macierzyste unikają różnicowania się w niszach. Ponieważ pracujemy w warunkach eksperymentalnych, konieczne jest zachowanie integralności tkanek, aby zapewnić, że GSC otrzymują fizjologiczne zachowanie.Nasz protokół utrzymuje zdrową i funkcjonalną niszę GSC, umożliwiając monitorowanie dzielących się GSC tak, jak byłoby to w warunkach in vivo. Zastosowanie obrazowania o przedłużonym życiu pozwala nam badać cały cykl komórkowy GSC i dynamikę spektrosomów. W szczególności udało nam się scharakteryzować zmiany spektrosomu w całym cyklu komórkowym, co wcześniej było trudne do osiągnięcia przy stałych obrazach lub krótszych okresach obrazowania.Wiedza o tym, jak przeprowadzać głównie eksperymenty bez wpływu na ich dynamikę, pozwala nam zbadać, w jaki sposób komunikują się komórki niszowe. Chcemy zbadać mechanizmy regulacyjne ekspresji genów i metabolizmu komórkowego, w których pośredniczy bezpośrednia interakcja między mRNA, enzymami metabolicznymi w biologii komórek macierzystych. Na początek przygotuj 100 mikrolitrów podwielokrotności mieszaniny antybiotyków penicyliny streptomycyny w stężeniu 10 000 jednostek na mililitr.Przygotuj wszystkie inne wymagane odczynniki do zabiegu i przechowuj je w odpowiedni sposób. Zbierz jedno- lub dwudniowe muchy wyrażające wszechobecny i konstytutywnie wyrażony par jeden połączony z GFP do nowej probówki. Hoduj muchy przez dwa dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza w inkubatorze przed preparacją.Umieść trzy mikrolitry kropli specjalnego kleju Cell-Tak na środku szkiełka nakrywkowego 35-milimetrowej płytki pokrytej poli-D-lycyną. Natychmiast dodaj równą objętość 0,1 molowego wodorowęglanu sodu o pH ośmiu do trzymikrolitrowej kropli kleju. Wymieszać roztwór za pomocą pipety.Aby uzyskać całkowite odparowanie, inkubować płytkę pod przykryciem w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie przechowuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po rozmrożeniu płytki następnego dnia umyj ją trzykrotnie sześcioma mikrolitrami czystej wody w autoklawie, ostrożnie, nie dotykając i nie naruszając warstwy kleju.Pozwól wodzie całkowicie odparować w temperaturze pokojowej przez pięć do 10 minut. Na początek zahoduj muchy i przygotuj szklaną płytę dolną z powłoką. Następnie wyczyść trzydołkowe naczynie preparacyjne, kleszcze i igły preparacyjne 70% etanolem.Dodać około 200 mikrolitrów roztworu Ringera do każdego z trzech dołków naczynia rozwarstwiającego. Za pomocą kleszczy chwyć samicę Drosophila na skrzyżowaniu klatki piersiowej i brzucha. Delikatnie oderwij naskórek w tylnej części brzucha i odciągnij go do tyłu, aby odsłonić jajniki.Po wypreparowaniu jajników przenieś je do następnej studzienki, aby zmniejszyć zanieczyszczenie resztkami tkanek lub resztkami z sekcji. Pod mikroskopem stereoskopowym z oświetleniem LED użyj jednej pary cienkich kleszczy, aby zakotwiczyć cały jajnik, a drugiej pary, aby chwycić komorę jajową w późnym stadium. Delikatnie rozciągaj, aż pochewka mięśniowa pęknie i pozostanie w tyle.Za pomocą kleszczy przenieś 15 do 20 jajników pozbawionych osłonek mięśniowych jeden po drugim do trzeciej studzienki zawierającej 200 mikrolitrów pożywki pierścieniowej. Wstępnie zwilż końcówkę o pojemności 200 mikrolitrów za pomocą 0,1% Tween 20, aby zapobiec przywieraniu jajników do ścianki końcówki. Przenieś sześć mikrolitrów roztworu Ringera zawierającego jajniki pozbawione osłonki mięśniowej za pomocą wstępnie zwilżonej końcówki na przygotowaną płytkę adhezyjną w temperaturze pokojowej.Za pomocą igły do rozwarstwiania lub kleszczy ostrożnie dociśnij jajniki do dolnej części kropli dzwonka, aby zapewnić kontakt z powierzchnią klejącą. Następnie dodaj trzy mililitry pożywki Schneidera, uzupełnionej mieszanką antybiotyków 15% FBS i 0,6% penicyliny streptomycyny do płytki MatTek. Przetransportować płytkę zawierającą jajniki pozbawione osłonki mięśniowej na płaskiej powierzchni do stacji mikroskopowej.Umieść płytkę na obiektywie 63x mikroskopu z wirującą tarczą lub mikroskopu konfokalnego. Skoncentruj próbkę i wybierz środkową płaszczyznę Z dla każdego germanu. Aby skonfigurować parametry eksperymentalne, ustaw typ przechwytywania na Upływ czasu 3D.Dostosuj moc lasera do 70% wartości maksymalnej. Ustaw długość fali wzbudzenia na 488 nanometrów. Zakres stosu Z wynosi do 30 mikrometrów, a odległość między stosami Z do 1,2 mikrometra.Ustaw interwał między punktami czasu co 10 minut, a czas trwania na 17 godzin. Jeśli jest dostępna, użyj opcji wielopozycyjnej, aby ponownie zdefiniować XY próbek. Wybierz płaszczyznę Z w środku każdego germarium, tak aby stosy Z zostały wyśrodkowane w tej pozycji i rozpocznij akwizycję.Analizuj obrazy w czasie i wzdłuż osi Z, aby zobrazować zmiany w morfologii spektrosomu za pomocą oprogramowania Imaris lub Image J. Aby utworzyć filmy, ręcznie wybierz najlepszą płaszczyznę Z w każdym punkcie czasowym. Silny sygnał GFP par one okrągłej strefy spektrometrycznej G2 został znacznie zmniejszony podczas faz G2 MG1.Podczas wczesnej profazy GFP par jeden opuścił spektrosom i wypełnił cytoplazmę, wskazując na wejście komórek macierzystych linii zarodkowej w mitozę. Po mitozie i reformacji otoczki jądrowej, sygnał GFP par jeden stopniowo odzyskiwał się w okrągłym cyklu spektro G1. Edycja Denovo GFP par jeden z okrągłym spektrosomem G1 doprowadziła do powstania morfologii spektrosomów korkowych, prętowych i fuzujących.

extended-live-imaging-female-drosophila-melanogaster-germline-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Komora jajowa Drosophila stanowi doskonały model do badania mechanizmów lokalizacji mRNA. Aby uchwycić dynamiczne zdarzenia leżące u podstaw procesów lokalizacji, wymagane jest szybkie obrazowanie tkanek żywych w wysokiej rozdzielczości. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół preparatyki i obrazowania żywych próbek przy minimalnej ingerencji w ich strukturę.

Przygotowanie pojedynczych komór jajeczkowych Drosophila do obrazowania na żywo

Opisano protokół obrazowania na żywo białek lub struktur autofluorescencyjnych oznaczonych GFP w pojedynczych oocytach Drosophila.

Obrazowanie na żywo białek znakowanych GFP w oocytach Drosophila

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Ten protokół opisuje szczegółową metodę długoterminowej hodowli ex vivo i obrazowania na żywo wyobrażonego dysku Drosophila. Pokazuje różnicowanie fotoreceptorów i rotację ommatidialną w ciągu 10 godzin obrazowania na żywo tarczy oka. Protokół jest prosty i nie wymaga kosztownej konfiguracji.

Długoterminowe obrazowanie na żywo dysku oka Drosophila

Udostępniamy protokół obrazowania wewnątrzkomórkowego pH linii nabłonkowych komórek macierzystych w żywej tkance jajnika Drosophila. Opisujemy metody generowania transgenicznych muszek wykazujących ekspresję biosensora pH, mCherry::p Hluorin, obrazowania biosensora za pomocą ilościowego obrazowania fluorescencyjnego, generowania krzywych standardowych i konwersji wartości intensywności fluorescencji na wartości pH.

Metody obrazowania wewnątrzkomórkowego pH linii komórek macierzystych pęcherzyka w żywej tkance jajnika Drosophila

Tutaj udostępniamy protokół sekcji wymagany do zobrazowania na żywo późnej embrionalnej męskiej gonady Drosophila. Protokół ten pozwoli na obserwację dynamicznych procesów komórkowych w normalnych warunkach lub po manipulacji transgenicznej lub farmakologicznej.

Sekcja i obrazowanie na żywo późnej embrionalnej gonady Drosophila

Tutaj omawiamy proces przygotowania, sekcji, montażu i obrazowania żywych mózgów eksplantatów z larw trzeciego stadium rozwojowego Drosophila melanogaster, aby obserwować dynamikę komórkową i subkomórkową w warunkach fizjologicznych.

Obrazowanie żywymi komórkami mózgów larwalnych Drosophila melanogaster

Poznaj metodę obrazowania na żywo komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster w ich naturalnej niszy. Technika ta umożliwia szczegółowe obserwacje dynamiki spektrosomów przez cały cykl komórkowy.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów