Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

W ciągu ostatnich kilku dekad eksplozja odkryć genów zidentyfikowała setki genów, które powodują padaczkę lub są z nią związane. Jednak mechanizmy chorobotwórcze nie są tak dobrze zbadane. Nasze laboratorium bada, w jaki sposób zmiany genetyczne wpływają na wczesny rozwój mózgu i skutkują wadami rozwojowymi mózgu oraz padaczką, wyniszczającą chorobą charakteryzującą się przewlekłymi napadami padaczkowymi.

Padaczki genetyczne były zwykle badane przy użyciu modeli zwierzęcych, w tym myszy, danio pręgowanego i królików. Ludzkie komórki macierzyste zostały ostatnio wykorzystane do modelowania padaczki genetycznej, ponieważ techniki różnicowania komórek macierzystych w tkankę nerwową posunęły się naprzód. Wraz z pojawieniem się organoidów mózgowych można podsumować aspekty strukturalne rozwoju mózgu.

Pomiar aktywności elektrofizjologicznej i określenie biomarkerów aktywności związanej z padaczką na podstawie organoidów i asembloidów mózgowych jest wyzwaniem. Częściowo technika ta jest ograniczona, ponieważ organoidy mózgowe nie mogą mieć napadów, tak jak może to mieć nienaruszone zwierzę. Niemniej jednak znalezienie różnic elektrofizjologicznych w tym modelu in vitro i odpowiedzi na leczenie farmakologiczne może pomóc w określeniu mechanizmów patologicznych i odpowiedzi terapeutycznych w padaczce genetycznej.

Aktywność elektrofizjologiczną można ocenić za pomocą tradycyjnych nagrań wspinaczki punktowej, lokalnych zapisów terenowych za pomocą elektrod oraz technik optycznych, takich jak obrazowanie napięcia wapniowego i pamięciowego. Korzystanie z nagrań z matrycą wieloelektrodową ma tę zaletę, że można wykonywać nagrania z lampy startowej w czasie i nagrywać z wielu miejsc asembloidu jednocześnie. Na początek wygeneruj wirusa oznaczonego jako asembloidy za pomocą organoidów mózgowych specyficznych dla losu.

Aby przygotować odczynniki do wstępnej obróbki powierzchni MEA, rozpuść 0,5 grama proszku enzymatycznego detergentu w 50 mililitrach wody dejonizowanej. Dokładnie zmieszaj mieszaninę, aż proszek całkowicie się rozpuści, a następnie wysterylizuj roztwór za pomocą sterylnego filtra próżniowego w górnej rurce wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego. Rozcieńczyć 500 mikrolitrów 7% roztworu podstawowego polietylenu lub PEI w 49,5 mililitrach jednego buforu Xbore 8.

Aby przygotować 0,07% roztwór PEI. Aby wysterylizować roztwór, przefiltruj go przez filtr o średnicy 0,22 mikrometra wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego. Następnie dozuj jeden mililitr 1% roztworu enzymatycznego detergentu do każdej studzienki sterylnej płytki MEA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Następnie usuń roztwór enzymu detergentu z każdej studzienki i umyj studzienki pięć razy 1,5 mililitra sterylnej wody dejonizowanej na studzienkę. Napełnij każdą studzienkę jednym mililitrem pożywki hodowlanej w celu wstępnego kondycjonowania. Umieść płytki MEA z powrotem w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwa dni.

Po inkubacji wyjmij pożywkę hodowlaną z dołków i dodaj 50 mikrolitrów 0,07% roztworu PEI, aby pokryć elektrody MEA do wstępnego powlekania. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie całkowicie odessać roztwór PEI z każdej studzienki.

Umyj każdą studzienkę trzy razy jednym mililitrem sterylnej wody dejonizowanej. Po zassaniu wody suszyć płytki w temperaturze pokojowej przez 15 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego z otwartą pokrywą. Teraz przykryj obszar elektrody w każdej studzience 50 mikrolitrami od jednej do 20 objętości do objętości matrycy membrany podstawnej rozcieńczonej w pożywce hodowlanej w celu wtórnego powlekania.

Umieść płytki MEA z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc. Następnego dnia odessaj rozcieńczony roztwór matrycy, pozostawiając cienką warstwę na powierzchni. Jeśli tworzy się gruba warstwa, spryskaj mocno obszar styku elektrody pożywką hodowlaną za pomocą końcówki do pipet AP 1 000.

Następnie za pomocą końcówki AP 1,000 z szerokim nacięciem zbierz assembloid z naczynia i ostrożnie umieść go na elektrodach w studzience, przenosząc jak najmniej mediów. Umieść płytkę pod mikroskopem preparacyjnym w okapie z przepływem laminarnym i za pomocą sterylnej końcówki P20 ostrożnie popchnij zespół w żądane miejsce. Użyj końcówki P20, aby usunąć nadmiar płynu wokół zespołu.

Po inkubacji wyjąć płytkę z inkubatora. Następnie, obserwując pod mikroskopem preparacyjnym, nałóż dwie do trzech małych kropli od jednej do 50 macierzy błony podstawnej rozcieńczonej w pożywce hodowlanej na wierzch asembloidów i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na kolejne 30 minut. Następnie ostrożnie dodaj trzy krople pożywki hodowlanej w pobliżu asembloidów za pomocą mikroskopu preparacyjnego.

Następnego dnia sprawdź, czy asembloidy osiadły i ustabilizowały się pod mikroskopem preparacyjnym. Dodaj 750 mikrolitrów pożywki hodowlanej, aby doprowadzić całkowitą objętość do jednego mililitra na studzienkę i pozostaw płytkę w nienaruszonym stanie przez co najmniej dwa dni w inkubatorze. Co tydzień ostrożnie usuwaj 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej z każdej studzienki i wprowadzaj świeże 700 mikrolitrów neurofizjologicznych pożywek podstawowych do każdej studzienki.

Wydłużony czas trwania pękania sieci zaobserwowano w 92 dniu w porównaniu z dniem 78, prawdopodobnie z powodu dojrzewania neuronów. Aktywność komórkowa i sieciowa powoli zanikała do 125 dnia.