Name: Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:57:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Poznaj metodę wieloelektrodowej platformy matrycowej do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten manuskrypt był wspierany przez R01NS127829 NIH/NINDS (LTD). Rysunek 1 został wygenerowany przy użyciu biorender.com.

Recording Network Activity in Brain Assembloids: Multi-Electrode Array Approach

<ol><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+analyses+of+single-cell+transcriptomes+from+multiple+brain+organoids+and+fetal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Synthetic analyses of single-cell transcriptomes from multiple brain organoids and fetal brain.</a> Cell Rep. 30 (6), 1682-1689.e3 (2020).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembloid+CRISPR+screens+reveal+impact+of+disease+genes+in+human+neurodevelopment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment.</a> Nature. 622 (7982), 359-366 (2023).</li>
<li>Samarasinghe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+oscillations+and+epileptiform+changes+in+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of neural oscillations and epileptiform changes in human brain organoids.</a> Nat Neurosci. 24 (10), 1488-1500 (2021).</li>
<li>Saleem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+hyperexcitability+in+human+cerebral+cortical+organoids%3A+Oxygen%2Fglucose+deprivation+most+effective+stimulant%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Modelling hyperexcitability in human cerebral cortical organoids: Oxygen/glucose deprivation most effective stimulant.</a> Heliyon. 9 (4), e14999(2023).</li>
<li>Saberi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+engineered+human+cerebral+tissues+mimic+pathological+circuit+disturbances+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">In-vitro engineered human cerebral tissues mimic pathological circuit disturbances in 3D.</a> Commun Biol. 5 (1), 1-9 (2022).</li>
<li>Bagley, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fused+dorsal-ventral+cerebral+organoids+model+complex+interactions+between+diverse+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fused dorsal-ventral cerebral organoids model complex interactions between diverse brain regions.</a> Nat Methods. 14 (7), 743-751 (2017).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+functionally+integrated+human+forebrain+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids.</a> Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).</li>
<li>Sloan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nat Protoc. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+regionally-specified+hPSC-derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fusion of regionally-specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398.e7 (2017).</li>
<li>VanDersarl, J. J., Renaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+surface+patterning+for+long-term+transmembrane+access%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Biomimetic surface patterning for long-term transmembrane access.</a> Sci Rep. 6 (1), 32485(2016).</li>
<li>Sandoval, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+in+human+brain+organoid+research%3A+Where+we+are+and+where+we+need+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility in human brain organoid research: Where we are and where we need to go.</a> Stem Cell Rep. 19 (6), 796-816 (2024).</li>
<li>Hartmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characterization+of+different+brainsphere+models+for+use+in+neurotoxicity+testing+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characterization of different brainsphere models for use in neurotoxicity testing on microelectrode arrays.</a> Cells. 12 (9), 1270(2023).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+advanced+cerebellar+organoids+for+neurogenesis+and+neuronal+network+development%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Generation of advanced cerebellar organoids for neurogenesis and neuronal network development.</a> Hum Mol Genet. 32 (18), 2832-2841 (2023).</li>
<li>Fair, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+maturation+of+cerebral+organoids+correlates+with+dynamic+morphological+and+cellular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological maturation of cerebral organoids correlates with dynamic morphological and cellular development.</a> Stem Cell Rep. 15 (4), 855-868 (2020).</li>
<li>Muzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-derived+cortical+neurospheroids+coupled+to+passive%2C+high-density+and+3D+MEAs%3A+A+valid+platform+for+functional+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng.+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Human-derived cortical neurospheroids coupled to passive, high-density and 3D MEAs: A valid platform for functional tests.</a> Bioeng. (Basel). 10 (4), 449(2023).</li>
<li>Hruska-Plochan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+human+neural+networks+reveals+NPTX2+pathology+in+ALS+and+FTLD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A model of human neural networks reveals NPTX2 pathology in ALS and FTLD.</a> Nature. 626 (8001), 1073-1083 (2024).</li>
<li>Reumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+the+human+dopaminergic+system+using+spatially+arranged+ventral+midbrain-striatum-cortex+assembloids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of the human dopaminergic system using spatially arranged ventral midbrain-striatum-cortex assembloids.</a> Nat Methods. 20 (12), 2034-2047 (2023).</li>
<li>Fenton, T. A., et al. Hyperexcitability and translational phenotypes in a preclinical model of SYNGAP1 mutations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFenton%2C+TA+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2023).</li>
<li>Huang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shell+microelectrode+arrays+%28MEAs%29+for+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Shell microelectrode arrays (MEAs) for brain organoids.</a> Sci Adv. 8 (33), eabq5031(2022).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+organoids+establish+subcortical+projections+in+the+mouse+brain+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Human cerebral organoids establish subcortical projections in the mouse brain after transplantation.</a> Mol Psychiatry. 26 (7), 2964-2976 (2021).</li>
<li>Patton, M. H., et al. Synaptic plasticity in human thalamocortical assembloids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatton%2C+MH+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Osaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+activity+and+short-term+plasticity+of+human+cerebral+organoids+reciprocally+connected+with+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Complex activity and short-term plasticity of human cerebral organoids reciprocally connected with axons.</a> Nat Commun. 15 (1), 2945(2024).</li>
<li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569.e7 (2019).</li>
<li>Schröter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+brain+organoids+using+high-density+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of brain organoids using high-density microelectrode arrays.</a> MRS Bull. 47 (6), 530-544 (2022).</li>
<li>Nieto-Estevez, V., et al. Dual effects of ARX poly-alanine mutations in human cortical and interneuron development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieto-Estevez%2C+V+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Ciarpella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cerebral+organoids+develop+network+of+functional+neurons+and+hippocampal+brain+region+identity%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Murine cerebral organoids develop network of functional neurons and hippocampal brain region identity.</a> iScience. 24 (12), 103438(2021).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+brain+region-specific+organoids+for+investigating+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Development and application of brain region-specific organoids for investigating psychiatric disorders.</a> Biol Psychiatry. 93 (7), 594-605 (2023).</li>
<li>Andersen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+3D+cortico-motor+assembloids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human 3D cortico-motor assembloids.</a> Cell. 183 (7), 1913-1929.e26 (2020).</li>
<li>Atamian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebellar+organoids+with+functional+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human cerebellar organoids with functional Purkinje cells.</a> Cell Stem Cell. 31 (1), 39-51.e6 (2024).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych istotnych informacji.

Metody oparte na MEA do elektrofizjologicznych zapisów aktywności sieci w asembloidach pochodzących z iPSC zostały wykorzystane do modelowania padaczki in vitro 22,23. Proponowana platforma integrująca pobudzające i hamujące połączenia synaptyczne może potencjalnie zająć się mechanizmami nadpobudliwości neuronów i rolą interneuronów korowych w procesie epileptogenezy. Dodatkowo platforma ta pozwala na stabilizację asembloidów i zbieranie podłużnych danych elektrofizjologicznych przez około 50 dni in vitro, nawet w przypadku zaburzeń farmakologicznych, zapewniając w ten sposób podejście do testowania związków o potencjalnych celach terapeutycznych.
Stabilizacja dojrzałych, stosunkowo dużych asembloidów na hydrofobowej powierzchni przez długi czas in vitro była wyzwaniem technicznym. Aby pokonać tę przeszkodę, stosuje się strategię dwukrotnego powlekania odwrotnie naładowanymi substancjami chemicznymi, aby ułatwić krótko- i długoterminowe przyleganie organoidów do powierzchni elektrody. Protokół ten optymalizuje poprzednio stosowaną metodę24 poprzez zamianę odczynników do powlekania płytek z poli-L-ornityny (PLO)/lamininy na PEI/BMM, uzyskując stałe przyleganie o wysokich wskaźnikach sukcesu i niskiej toksyczności. Co więcej, ten ustabilizowany, długoterminowy system hodowli ma potencjał, aby dostarczyć danych o wysokiej przepustowości. Na przykład wstępne znakowanie za pomocą podwójnych wirusów może uzupełniać sortowanie impulsów za pomocą pojedynczych elektrod w celu zlokalizowania i porównania aktywności z różnych regionów. Proponowana platforma zapewnia również stabilne narzędzie do rejestrowania lokalnych potencjałów pola, co ma duże znaczenie dla funkcji interneuronów bez naruszania nienaruszonej struktury asembloidów25. Głównym ograniczeniem tego protokołu jest to, że asembloidy są spłaszczane po poszyciu, co budzi obawy o to, czy początkowe struktury 3D są zachowane, czy nie. Hodowanie organoidów wokół elektrod przy użyciu bardziej zaawansowanych platform MEA, które otaczają organoid elektrodami26 , może potencjalnie przezwyciężyć to ograniczenie. 
Jedną z głównych przeszkód w metodach elektrofizjologicznego zapisu organoidów opartych na MEA jest zmienność i odtwarzalność wyników eksperymentalnych w różnych protokołach różnicowania, a nawet w partiach różnicowania. Wcześniejsze badania pokazują, że aktywność sieciowa neuronów mierzona za pomocą MEA zależy od stanu dojrzewania neuronów zarówno organoidów grzbietowych, jak i brzusznych27. Nagrywanie z asembloidów w późniejszym punkcie czasowym ze stosunkowo dojrzałymi neuronami i obwodami jest jednym ze sposobów na poprawę spójności. Co więcej, wybór wielodołkowych systemów MEA generujących dane o wysokiej przepustowości pozwoli na porównania statystyczne w świetle zmienności eksperymentalnej. Jeśli aktywność elektrofizjologiczna hodowli jest niezgodna z tym, czego oczekuje się w danym punkcie czasowym, ważne i pomocne będzie pobranie nienaruszonej kultury z platformy funkcjonalnej w celu przeprowadzenia kontroli jakości, w tym analizy immunocytochemicznej i transkryptomicznej.
Kluczowe znaczenie dla proponowanej platformy ma funkcjonalna integracja regionalnie określonych pobudzających neuronów korowych po stronie grzbietowej i interneuronów hamujących po stronie brzusznej. Protokoły generowania organoidów specyficznych dla regionu mózgu znalezione w literaturze różnią się znacznie w odniesieniu do warunków pożywki, czasu hodowli, profilu plonu i dojrzewania, a także innych czynników28. Chociaż protokół ten jest specyficzny dla kory mózgowej i zwojów pod względem zdolności do generowania neuronów pobudzających i interneuronów GABA-ergicznych, dobrze ugruntowane techniki różnicowania można wykorzystać do generowania neuronów pochodzących z iPSC wykazujących inne tożsamości, takie jak neurony ruchowe29 i komórki Purkinjego30. W związku z tym proponowana platforma ma potencjał do modelowania obwodów neuronalnych między korą mózgową a rdzeniem kręgowym/móżdżkiem. Po pewnej optymalizacji związanej z czasem posiewu i wizualizacji typów komórek za pomocą znakowania wirusowego, metodę tę można przełożyć na inne modele chorób poza padaczką, takie jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS)17.

Organoidy mózgowe pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) są przestrzennie samoorganizującymi się strukturami 3D, odzwierciedlającymi architekturę tkanek i trajektorie rozwoju in vivo. Składają się z wielu typów komórek, w tym komórek progenitorowych (komórki neuronabłonkowe, glej promieniowy, progenitory neuronalne, progenitory glejowe), neurony (neurony pobudzające podobne do kory mózgowej i interneurony hamujące) oraz komórki glejowe (astrocyty i oligodendrocyty)1,2. Assembloidy reprezentują następną generację organoidów mózgowych, zdolnych do integracji wielu regionów mózgu i/lub linii komórkowych w kulturze 3D. Stanowią one użyteczne narzędzie do modelowania połączeń między różnymi regionami mózgu przypominającymi ich odpowiedniki in vivo, rejestrowania interakcji między neuronami i astrocytami w celu lepszego naśladowania dojrzałych i złożonych sieci neuronowych oraz badania montażu obwodów neuronowych. W związku z tym asembloidy stają się szeroko stosowanym narzędziem do podsumowania cech charakterystycznych patofizjologii padaczki, w której niezbędne są środki funkcjonalne do zbadania nieprawidłowych sieci neuronowych, które mogą leżeć u podstaw przyczyny choroby3,4,5,6.
Aby modelować interakcje między neuronami glutaminergicznymi kory mózgowej a interneuronami GABA-ergicznymi, kilka grup rozwinęło oddzielne organoidy przypominające grzbietowy i brzuszny mózg, a następnie połączyło je razem w wieloregionalny assembloid7,8,9,10. W tym przypadku zastosowano wcześniej opisany protokół hodowli asembloidów z regionalnie specyficznymi podtypami neuronalnymi9. Jednak istotną barierą jest brak powtarzalnych testów funkcjonalnych do monitorowania aktywności sieci neuronowych podczas rozwoju neurologicznego. Wiele testów funkcjonalnych sieci w organoidach daje wyniki, które wykazują dużą zmienność między partiami różnicowania i liniami komórkowymi. Techniki, które polegają na krojeniu lub dysocjacji organoidów, zmieniają ich nieodłączne sieci poprzez zerwanie połączeń synaptycznych8.
Matryce wieloelektrodowe (MEA) zapewniają duży wgląd w aktywność sieci w czasie z wysoką rozdzielczością czasową, aby scharakteryzować właściwości elektrofizjologiczne organoidów bez zakłócania warunków hodowli lub integralności błony komórkowej11. W porównaniu z elektrofizjologią patch clamp, MEA umożliwia wysokoprzepustowe pozyskiwanie danych w oparciu o duże populacje neuronów, a nie pojedyncze komórki. Platformy MEA różnią się gęstością elektrod, zaspokajając różne potrzeby w badaniach nad organoidami mózgu12. Powszechnie stosowane systemy, jak pokazano w tym protokole, rejestrują od 8 do 64 elektrod na studzienkę13,14,15. MEA o dużej gęstości z maksymalnie 26 400 elektrodami na odwiert umożliwiają zwiększenie rozdzielczości przestrzennej i czasowej, kwantyfikację szybkości propagacji potencjału czynnościowego oraz połączenie ze stymulacją optogenetyczną14,16,17. Dlatego MEA służy jako potężne narzędzie do modelowania padaczki in vitro i paradygmat translacyjny do badań przesiewowych leków przeciwpadaczkowych.
Jednym z głównych wyzwań jest ustabilizowanie dużych asembloidów na hydrofobowej powierzchni metalowej dla długotrwałych zapisów. Protokół ten przedstawia szczegółową metodologię powlekania nienaruszonych asembloidów na płytkach MEA w celu długoterminowego zapisu podłużnego wraz z testami farmakologicznymi. Unikalne zalety protokołu obejmują stabilne przyleganie asembloidów do powierzchni elektrody bez utraty aktywności elektrycznej, wykorzystanie dostępnych na rynku neurofizjologicznych pożywek podstawowych w celu przyspieszenia dojrzewania sieci funkcjonalnej po posiewaniu, możliwość przeprowadzania dalszych testów funkcjonalnych, takich jak leczenie farmakologiczne, oraz szerokie zastosowanie do organoidów generowanych za pomocą innych protokołów specyficznych dla regionu.
Celem jest dostarczenie funkcjonalnego testu o wysokiej rozdzielczości czasowej do badania aktywności sieci, badania zmian specyficznych dla choroby i testowania leków o potencjale terapeutycznym w padaczce. Instrukcje wideo są dostępne dla najtrudniejszych etapów tego protokołu, pokazując techniki powlekania asembloidów na płytach MEA, a także reprezentatywne nagrania z tych kultur.

<table><tbody><tr><td>10 cm Corning Naczynia hodowlane bez TC</td><td>Corning</td><td>08-772-32</td><td>Do hodowli zawiesinowej na wytrząsarce</td></tr><tr><td>100 ml Zlewka&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB100100</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184-4L</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (&beta;-ME)</td><td>Thermo Fisher</td><td>21985023</td><td>Stężenie robocze 100 &mu; M</td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-140</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 800</td><td>Fisher Scientific</td><td>501974754</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem Allegra X-14R</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>BE-AX14R</td><td></td></tr><tr><td>Allopregnanolone</td><td>Cayman</td><td>16930</td><td>Zawieszone 5 mg w DMSO, aby uzyskać 1 mM roztwór podstawowy. Podwielokrotność i zamrozić na &minus; 80 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 000 do użycia. Stężenie robocze 100 nM.</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Axion CytoView MEA płytki 6-dołkowe&nbsp;</td><td>Axion Biosystems</td><td>M384-tMEA-6B</td><td></td></tr><tr><td>Platforma Axion Maestro MEA</td><td>Axion Biosystems</td><td>Maestro</td><td>Z tymczasową kontrolą środowiska</td></tr><tr><td>Suplement B-27 (zwykły, z witaminą A)</td><td>Suplement Thermo Fisher</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>B-27 (bez witaminy A)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Matryca membrany podstawnej - Geltrex</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>Wanna z koralikami</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-876-001</td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td> laboratoryjny <td>Olympus</td><td>CKX53</td><td>Utrzymywany w przepływie laminarnym czysta ławka</td></tr><tr><td>Bicuculline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14340</td><td>Stężenie robocze 10 &mu; M</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>CLOROX</td><td>67619-26</td><td></td></tr><tr><td>Bufor boranowy 20x</td><td>Thermo Fisher</td><td>28341</td><td>Stężenie robocze przy 1x</td></tr><tr><td>BrainPhys media</td><td>StemCell Technologies</td><td>5790</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do dysocjacji komórek (StemPro Accutase)</td><td></td>Wytrząsarka orbitalna <td>Thermo Fisher</td> A1110501 <td></td></tr><tr><td>Celltron</td><td>HT-Infors</td><td>&nbsp; I69222&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Detergent/enzym (Terg-A-Zyme)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273287</td><td>Stężenie robocze 1% m/v</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher</td><td>113300</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67685</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5499</td><td>Rozpuść 5 mg w DMSO, aby uzyskać 10 mM roztworu podstawowego. Podwielokrotność i zamrozić na &minus; 20 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:2000 do użycia. (stężenie robocze 5 &mu; M)</td></tr><tr><td>D-PBS bez wapnia lub magnezu</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Neurotroficzny (GDNF) pochodzenia komórek glejowych (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Rozpuścić 100 &mu; g w 1 ml PBS do 100 &mu; g/ml. Podwielokrotność i zamrozić na &minus; 20 &st. C. Rozcieńczyć w stosunku 1:5000 do użycia. (stężenie robocze 20 ng/ml).</td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Mikroskopia Wyborcza Nauki</td><td>63510-20</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Heraguard ECO Clean Bench</td><td>Termo Fisher</td><td>51029692</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych z kontrolowaną wilgotnością</td><td>Thermo Fisher</td><td>370</td><td>ustawiony na 37 & deg; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Selleckchem</td><td>S7085</td><td>Podwielokrotność i zamrozić przy &minus; 80 stopni Celsjusza. Wytrąca się, jeśli zostanie rozmrożony w temperaturze pokojowej. Zamrożone podwielokrotności należy umieścić bezpośrednio w 37 °; C przed użyciem.</td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy nokautującej (KOSR)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>mTeSRplus (pożywka + suplementy)</td><td>StemCell Technologies</td><td>100-0276</td><td>cGMP, stabilizowana pożywka bez podawania dla ludzkich komórek iPSC</td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>NT3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td>Rozpuścić 100 &mu; g w 1 ml PBS do 100 &mu; g/ml. Podwielokrotność i zamrozić na &minus; 20 &st. C. Rozcieńczyć w stosunku 1:5000 do użycia. (stężenie robocze 20 ng/ml).</td></tr><tr><td>NuFF Ludzkie fibroblasty napletka noworodków</td><td>MTI-GlobalStem</td><td>GSC-3002</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta do penicyny/streptomycyny</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>(P10, P200, P1000)</td><td>Eppendorf</td><td>EP4926000034</td><td>Autoklawizowane końcówki P1000 do pobierania organoidów</td></tr><tr><td>Poly (etylenimina) (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td>Rozcieńczyć materiał w sterylnym buforze boranowym. Stężenie robocze 0,07%. Zobacz szczegóły w rękopisie.</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG-200</td><td>zawieszony w PBS. Podwielokrotność i zamrozić w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu fibroblastów (FGF)-basic&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>zawieszony w PBS. Podwielokrotność i zamrozić w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>Rekombinowany czynnik neurotroficzny pochodzenia ludzkiego i mózgu (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>Wirować na krótko przed rozpuszczeniem. Rozpuścić 100 &mu; g w 1 ml PBS do 100 &mu; g/ml. Podwielokrotność i zamrozić na &minus; 20 &st. C. Rozcieńczyć w stosunku 1:5000 do użycia. (stężenie robocze 20 ng/ml).</td></tr><tr><td>Kwas retinowy (RA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>Rozpuść 100 mg w 3,3 ml DMSO, aby uzyskać 100 mM roztworu podstawowego. Porcja zapasu 100 &mu; L / probówkę i zamrozić przy &minus; 80 stopni Celsjusza. Weź 200 &mu; L 100 mM zapasu i rozcieńczyć 10x (dodać 1,8 ml DMSO), aby uzyskać 10 mM zapasu. Podwielokrotność 50 &mu; L/tubę i przechowywać w temperaturze &minus; 80 &deg;C. Rozcieńczyć w stosunku 1:100 000 do użycia. (stężenie robocze 100 nM).</td></tr><tr><td>Inhibitor ROCK Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>1:200 z 10 mM zapas</td></tr><tr><td>SAG (wygładzony agonista)</td><td>Selleckchem</td><td>S7779</td><td>Podwielokrotność i zamrozić przy &minus; 80 &deg;C. Koncentracja zapasów 1mM. Stosować w rozcieńczeniu 1:10 000 (stężenie robocze 100 nM).</td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td>Rozpuść 5 mg w 1,3 ml DMSO, aby uzyskać 10 mM roztworu podstawowego. Podwielokrotność i zamrozić na &minus; 80 &st. C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 10 &mu; M)</td></tr> <tr><td>Serologiczny napełniacz pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-387-166</td><td></td></tr><tr><td>Filtr górny rurki próżniowej Steriflip</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne kaptury do hodowli komórkowych</td><td>Baker Company</td><td>SG-600</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy zmiennoogniskowy</td><td>Olympus</td><td>SZ61/SZ51</td><td>Utrzymywany w czystej ławce z przepływem laminarnym</td></tr></tbody></table>

wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

A Multi-Electrode Array Platform for Modeling Epilepsy Using Human Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Assembloids

Organoidy ludzkiego mózgu to trójwymiarowe (3D) struktury pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), które rekapitulują aspekty rozwoju mózgu płodu. Fuzja organoidów mózgowych grzbietowych z brzusznymi określonymi regionalnie in vitro generuje asembloidy, które mają funkcjonalnie zintegrowane mikroobwody z neuronami pobudzającymi i hamującymi. Ze względu na swoją złożoność strukturalną i zróżnicowaną populację neuronów, asembloidy stały się użytecznym narzędziem in vitro do badania nieprawidłowej aktywności sieci. Zapisy z matrycą wieloelektrodową (MEA) służą jako metoda wychwytywania potencjałów pola elektrycznego, skoków i dynamiki sieci podłużnej z populacji neuronów bez naruszania integralności błony komórkowej. Jednak przyklejanie asembloidów do elektrod w celu długotrwałych nagrań może być trudne ze względu na ich duży rozmiar i ograniczoną powierzchnię styku z elektrodami. W tym miejscu demonstrujemy metodę umieszczania asembloidów na płytkach MEA w celu rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej w okresie 2 miesięcy. Chociaż obecny protokół wykorzystuje organoidy ludzkiej kory mózgowej, można go w dużym stopniu dostosować do organoidów zróżnicowanych w celu modelowania innych obszarów mózgu. Protokół ten ustanawia solidny, podłużny, elektrofizjologiczny test do badania rozwoju sieci neuronalnej, a platforma ta ma potencjał do wykorzystania w badaniach przesiewowych leków w celu opracowania terapii padaczki.

Ludzkie assembloidy grzbietowo-brzuszne wysiano na 6-dołkową płytkę MEA (n = 6 na jedną różnicowanie, 3 różnicowania), przy czym każda dołkowanie zawierało 64 elektrody (Ryc. 2A). Dziewięć z dziesięciu assembloidów przeznaczonych do pomiarów podłużnych pozostawało trwale przytwierdzone do elektrod przez ponad 50 dni in vitro (Ryc. 2D). 6 z 8 assembloidów przeznaczonych do testów farmakologicznych pomyślnie przeszło fazę wypłukiwania, wykazując aktywność sieciową odpowiednią dla etapu rozwoju (Ryc. 2E). Przedstawiono obrazy z kontrastu fazowego i fluorescencyjne z jednej reprezentatywnej dołki (Ryc. 2B), na których łatwo rozróżnić organoidy grzbietowe znakowane AAV-CAG-tdTomato oraz organoidy brzuszne znakowane AAV-mDLX-GFP7,9.
Aktywność neuronów na MEA można analizować za pomocą różnych parametrów w celu oceny ogólnej pobudliwości komórkowej i aktywności sieci. Ogólne częstotliwości wyładowań w całej kulturze dostarczają informacji o pobudliwości komórkowej i sieciowej, natomiast częstotliwość zsynchronizowanych serii wyładowań (bursts) na wielu elektrodach wskazuje na zakres synaptycznie aktywnych sieci neuronów. Wielokrotne, powtarzające się impulsy występujące na przestrzennie rozdzielnych elektrodach w krótkim odstępie czasu (serie wyładowań sieciowych) mogą służyć jako biologiczny korelat aktywności przypominającej napady drgawek, choć assembloidy na MEA pozostają ograniczone w porównaniu z całym organizmem, który może doświadczać rzeczywistych napadów bona fide. Rysunek 2C przedstawia wzorce serii wyładowań sieciowych assembloidów hodowanych w komercyjnie dostępnych podstawowych pożywkach neurofizjologicznych w 84. i 91. dniu, przy czym zwiększony czas trwania serii w późniejszym punkcie czasowym wynika prawdopodobnie z funkcjonalnego dojrzewania neuronów. W tym przypadku aktywność komórkowa i sieciowa stopniowo wzrasta od dnia wysiewu assembloidów, zazwyczaj osiągając szczyt w 92. dniu i niemal całkowicie zanikając w 125. dniu (Rysunek 2D). Zwiększone dojrzewanie na późniejszym etapie prawdopodobnie przyczynia się do wydłużenia czasu trwania zsynchronizowanych serii wyładowań w późniejszym punkcie pomiarowym.
Bikukullina, antagonista receptorów GABAA, nasila zsynchronizowaną aktywność sieciową assembloidów, co przejawia się znacząco wyższymi częstotliwościami wyładowań oraz częstotliwościami serii (bursts) sieciowych po dodaniu leku w 108. dniu (Rycina 2E). Wyniki te są zbieżne z danymi uzyskanymi wcześniej w rejestracjach elektrofizjologicznych z pojedynczych komórek21. Analiza mocy dla testu farmakologicznego została przeprowadzona przy użyciu programu G*Power3 w oparciu o wielkość efektu 0,94 oraz poziom istotności alfa wynoszący 0,05. Aby osiągnąć moc 0,8, wymagana była całkowita próba 15 assembloidów podzielonych na trzy równoliczne grupy po n = 5 (Rycina 2E). W badaniu uwzględniono kontrolę nośnika (vehicle control), aby potwierdzić, że odpowiedź jest rzeczywistym zdarzeniem sygnałowym, a nie jedynie zmianą intensywności sygnału, która mogłaby wynikać z dodania niewielkiej ilości pożywki (Rycina 2E).
<img alt="Schemat osi czasu procesu różnicowania neuronalnego; hodowla komórkowa, wymiany medium, znakowanie wirusowe, pomiary MEA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67396/67396fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd badania. Protokół generowania i wysiewania podwójnie znakowanych assembloidów na MEA; oś czasu protokołu różnicowania z wyszczególnieniem krytycznych etapów i odpowiadających im suplementów z małych cząsteczek (dodatkowe informacje o składzie znajdują się w Tabeli 1 oraz Tabeli materiałów). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67396/67396fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schematy pomiaru aktywności neuronalnej i wykresy pokazujące średnie częstotliwości wyładowań; układ macierzy mikroelektrod." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67396/67396fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Rejestracja MEA assembloidów. (A) Mapa ciepła średniej aktywności wyładowań z jednej płytki MEA (n = 6 studzienek) w dniu 82, tj. w 10. dniu po wysianiu. Wszystkie studzienki reprezentują kultury o tym samym stanie i genotypie. (B) Reprezentatywne obrazy assembloidu w kontraście fazowym i konfokalne, gdzie assembloid grzbietowy jest znakowany kolorem czerwonym, a brzuszny zielonym. Białe groty strzałek wskazują zmigrowane interneurony GABAergiczne ze strony brzusznej na grzbietową. Pasek skali = 500 µm. (C) Reprezentatywne wykresy rastrowe z 120 s czasu rejestracji z jednej studzienki. Wybuchy sieciowe (network bursts) są zaznaczone fioletową ramką. Przedstawiono dwa oddzielne punkty czasowe: dzień 78 (1 tydzień po wysianiu, początkowy dzień rejestracji) oraz dzień 92 (3 tygodnie po wysianiu, gdy aktywność osiąga szczyt). (D) Ilościowe oznaczenie średnich częstotliwości wyładowań, częstotliwości wybuchów oraz częstotliwości wybuchów sieciowych od dnia 78 do dnia 127 (n = 3 różnicowania, 3 assembloidy/różnicowanie). Każda krzywa wskazuje pojedynczy assembloid, zestawiony z 3 różnicowań (oznaczone kolorami). Czerwona krzywa przedstawia wartość średnią. (E) Ilościowe oznaczenie wyników testu z bikukuliną (n = 6 assembloidów/warunek). Wykres słupkowy przedstawiono jako średnia ± SEM. Każda kropka reprezentuje jeden assembloid, zestawiony z 3 serii różnicowania (oznaczone kolorami). Przeprowadzono nieparametryczny test Friedmana. **p &lt; 0,01; ns, brak istotności. MEA, macierze wieloelektrodowe. Mapa ciepła i wykresy rastrowe zostały wygenerowane przy użyciu oprogramowania analitycznego Neural Metric Tool. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67396/67396fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Skład pożywek na różnych etapach różnicowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67396/67396_Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Human brain organoids are three-dimensional (3D) structures derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) that recapitulate&#160;aspects of fetal ...

W ciągu ostatnich kilku dekad eksplozja odkryć genów zidentyfikowała setki genów, które powodują padaczkę lub są z nią związane. Jednak mechanizmy chorobotwórcze nie są tak dobrze zbadane. Nasze laboratorium bada, w jaki sposób zmiany genetyczne wpływają na wczesny rozwój mózgu i skutkują wadami rozwojowymi mózgu oraz padaczką, wyniszczającą chorobą charakteryzującą się przewlekłymi napadami padaczkowymi.Padaczki genetyczne były zwykle badane przy użyciu modeli zwierzęcych, w tym myszy, danio pręgowanego i królików. Ludzkie komórki macierzyste zostały ostatnio wykorzystane do modelowania padaczki genetycznej, ponieważ techniki różnicowania komórek macierzystych w tkankę nerwową posunęły się naprzód. Wraz z pojawieniem się organoidów mózgowych można podsumować aspekty strukturalne rozwoju mózgu.Pomiar aktywności elektrofizjologicznej i określenie biomarkerów aktywności związanej z padaczką na podstawie organoidów i asembloidów mózgowych jest wyzwaniem. Częściowo technika ta jest ograniczona, ponieważ organoidy mózgowe nie mogą mieć napadów, tak jak może to mieć nienaruszone zwierzę. Niemniej jednak znalezienie różnic elektrofizjologicznych w tym modelu in vitro i odpowiedzi na leczenie farmakologiczne może pomóc w określeniu mechanizmów patologicznych i odpowiedzi terapeutycznych w padaczce genetycznej.Aktywność elektrofizjologiczną można ocenić za pomocą tradycyjnych nagrań wspinaczki punktowej, lokalnych zapisów terenowych za pomocą elektrod oraz technik optycznych, takich jak obrazowanie napięcia wapniowego i pamięciowego. Korzystanie z nagrań z matrycą wieloelektrodową ma tę zaletę, że można wykonywać nagrania z lampy startowej w czasie i nagrywać z wielu miejsc asembloidu jednocześnie. Na początek wygeneruj wirusa oznaczonego jako asembloidy za pomocą organoidów mózgowych specyficznych dla losu.Aby przygotować odczynniki do wstępnej obróbki powierzchni MEA, rozpuść 0,5 grama proszku enzymatycznego detergentu w 50 mililitrach wody dejonizowanej. Dokładnie zmieszaj mieszaninę, aż proszek całkowicie się rozpuści, a następnie wysterylizuj roztwór za pomocą sterylnego filtra próżniowego w górnej rurce wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego. Rozcieńczyć 500 mikrolitrów 7% roztworu podstawowego polietylenu lub PEI w 49,5 mililitrach jednego buforu Xbore 8.Aby przygotować 0,07% roztwór PEI. Aby wysterylizować roztwór, przefiltruj go przez filtr o średnicy 0,22 mikrometra wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego. Następnie dozuj jeden mililitr 1% roztworu enzymatycznego detergentu do każdej studzienki sterylnej płytki MEA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.Następnie usuń roztwór enzymu detergentu z każdej studzienki i umyj studzienki pięć razy 1,5 mililitra sterylnej wody dejonizowanej na studzienkę. Napełnij każdą studzienkę jednym mililitrem pożywki hodowlanej w celu wstępnego kondycjonowania. Umieść płytki MEA z powrotem w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwa dni.Po inkubacji wyjmij pożywkę hodowlaną z dołków i dodaj 50 mikrolitrów 0,07% roztworu PEI, aby pokryć elektrody MEA do wstępnego powlekania. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie całkowicie odessać roztwór PEI z każdej studzienki.Umyj każdą studzienkę trzy razy jednym mililitrem sterylnej wody dejonizowanej. Po zassaniu wody suszyć płytki w temperaturze pokojowej przez 15 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego z otwartą pokrywą. Teraz przykryj obszar elektrody w każdej studzience 50 mikrolitrami od jednej do 20 objętości do objętości matrycy membrany podstawnej rozcieńczonej w pożywce hodowlanej w celu wtórnego powlekania.Umieść płytki MEA z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc. Następnego dnia odessaj rozcieńczony roztwór matrycy, pozostawiając cienką warstwę na powierzchni. Jeśli tworzy się gruba warstwa, spryskaj mocno obszar styku elektrody pożywką hodowlaną za pomocą końcówki do pipet AP 1 000.Następnie za pomocą końcówki AP 1,000 z szerokim nacięciem zbierz assembloid z naczynia i ostrożnie umieść go na elektrodach w studzience, przenosząc jak najmniej mediów. Umieść płytkę pod mikroskopem preparacyjnym w okapie z przepływem laminarnym i za pomocą sterylnej końcówki P20 ostrożnie popchnij zespół w żądane miejsce. Użyj końcówki P20, aby usunąć nadmiar płynu wokół zespołu.Po inkubacji wyjąć płytkę z inkubatora. Następnie, obserwując pod mikroskopem preparacyjnym, nałóż dwie do trzech małych kropli od jednej do 50 macierzy błony podstawnej rozcieńczonej w pożywce hodowlanej na wierzch asembloidów i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na kolejne 30 minut. Następnie ostrożnie dodaj trzy krople pożywki hodowlanej w pobliżu asembloidów za pomocą mikroskopu preparacyjnego.Następnego dnia sprawdź, czy asembloidy osiadły i ustabilizowały się pod mikroskopem preparacyjnym. Dodaj 750 mikrolitrów pożywki hodowlanej, aby doprowadzić całkowitą objętość do jednego mililitra na studzienkę i pozostaw płytkę w nienaruszonym stanie przez co najmniej dwa dni w inkubatorze. Co tydzień ostrożnie usuwaj 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej z każdej studzienki i wprowadzaj świeże 700 mikrolitrów neurofizjologicznych pożywek podstawowych do każdej studzienki.Wydłużony czas trwania pękania sieci zaobserwowano w 92 dniu w porównaniu z dniem 78, prawdopodobnie z powodu dojrzewania neuronów. Aktywność komórkowa i sieciowa powoli zanikała do 125 dnia.

a-multi-electrode-array-platform-for-modeling-epilepsy-using-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wideo pokazuje, jak używać zestawu mikroelektrod (MEA) do rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej neuronów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Aktywność elektrofizjologiczna z wielodołkowego MEA zawierającego kokulturę neuronów i astrocytów jest rejestrowana w celu wykrycia potencjałów czynnościowych z wielu neuronów w sieci, potwierdzając pomyślne różnicowanie hiPSC w neurony.

Pomiar aktywności elektrofizjologicznej sieci neuronalnych za pomocą układów mikroelektrod

Ten film demonstruje procedurę użycia matrycy wieloelektrodowej (MEA) do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D. Metoda ta pozwala zrozumieć dynamikę sieci neuronowych i aktywność impulsów sieci synaptycznych w sferach 3D.

Wykorzystanie matryc wieloelektrodowych do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D

Ten protokół polega na użyciu układu mikroelektrod (MEA) do rejestrowania aktywności elektrycznej w wycinku mózgu wystawionym na działanie leku wywołującego drgawki. Procedura obejmuje umieszczenie wycinka mózgu w komorze rejestracyjnej MEA, zastosowanie stymulacji elektrycznej w celu wywołania sztucznych napadów i analizę uzyskanych sygnałów.

Monitorowanie aktywności elektrycznej neuronów wywołanej napadami padaczkowymi w wycinkach mózgu za pomocą układów mikroelektrod

Tutaj opisujemy, jak wykonywać zapisy wieloelektrodowe tkanki ludzkiej kory padaczkowej. Szczegółowo zademonstrowano resekcję tkanki padaczkowej, przygotowanie plastrów i zapisy wieloelektrodowe zdarzeń międzynapadowych i ictalowych.

Wieloelektrodowe zapisy pooperacyjnej tkanki korowej ludzkiego epilepsji

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Zaprojektowaliśmy procedurę, w której utrwalone formaldehydem ludzkie zwłoki są używane do pomocy neurochirurgom w szkoleniu do wszczepiania układów mikroelektrod do kory nowej ludzkiego mózgu.

Szkolenie chirurgiczne w zakresie implantacji układów mikroelektrod kory nowej przy użyciu modelu zwłok ludzkich utrwalonych formaldehydem

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy przygotowanie organicznych plastrów kory nosa i hipokampa. Przy stopniowym i kontrolowanym pozbawianiu surowicy, plastry te przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczki i mogą być uważane za model epileptogenezy ex vivo. System ten stanowi doskonałe narzędzie do monitorowania dynamiki spontanicznej aktywności, a także do oceny progresji cech neurozapalnych w całym przebiegu epileptogenezy.

Model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj używamy HD-MEA, aby zagłębić się w dynamikę obliczeniową dużych zespołów neuronalnych, szczególnie w hipokampie, obwodach opuszki węchowej i ludzkich sieciach neuronowych. Uchwycenie aktywności czasoprzestrzennej w połączeniu z narzędziami obliczeniowymi zapewnia wgląd w złożoność zespołu neuronalnego. Metoda ta pomaga lepiej zrozumieć funkcje mózgu, potencjalnie identyfikując biomarkery i metody leczenia zaburzeń neurologicznych.

Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości

Poznaj metodę wieloelektrodowej platformy matrycowej do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów