Barwienie żywe/martwe w celu ilościowego określenia żywych, ale nienadających się do hodowli komórek w bakteriach powodujących rany traktowanych miodem manuka

Ten projekt badawczy ma na celu zbadanie wpływu miodu Manuka na fizjologię bakterii. Ostatnie badania dostarczyły dalszych informacji na temat przeciwdrobnoustrojowego wpływu miodu Manuka na fizjologię bakterii. Nasze wstępne wyniki wskazują, że bakterie miodu Manuka wchodzą w stan spoczynku opornego na antybiotyki, żywotnego, ale nie nadającego się do hodowli, ale w mniejszym stopniu niż te leczone konwencjonalnymi antybiotykami.

Opierając się na naszych eksperymentach, interesujące byłoby porównanie profili ekspresji miodu Manuka i konwencjonalnych VBNC indukowanych antybiotykami. Na początek weź fiolki zawierające zamrożone szczepy bakterii. Otwórz każdy z nich po kolei i za pomocą sterylnego patyczka zeskrob niewielką ilość zamrożonych bakterii na odpowiednio oznakowaną płytkę agarową Luria-Bertani lub LB.

Założyć nakrętkę fiolki i szybko umieścić ją w zamrażarce. Inkubuj kultury bakteryjne przez 18 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia za pomocą pipety serologicznej przenieś dwa mililitry bulionu LB do dwóch sterylnych probówek.

Wysterylizuj pętlę zaszczepiającą w płomieniu palnika Bunsena. Następnie przenieś ćwiartkę bakterii z płytki agarowej LB do odpowiednio oznakowanej probówki zawierającej bulion LB. Inkubować probówkę w warunkach tlenowych w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością około 250 obr./min w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin.

W celu przygotowania miodu Manuka i leczenia bakteriami antybiotykami, dodaj 10 mikrolitrów kultury bakteryjnej do 10 mililitrów bulionu Muellera Hintona, aby uzyskać rozcieńczenie kultury bakteryjnej w stosunku 1:1 000, które ma około 10 do szóstych jednostek tworzących kolonię na mililitr. Użyć rozcieńczonych kultur do przygotowania trzech próbek dla każdego gatunku bakterii, kontroli niepoddanej działaniu substancji, próbki poddanej działaniu miodu Manuka i próbki poddanej działaniu antybiotyku. Dodaj miód Manuka i antybiotyk do odpowiednich tubek.

Przenieś 0,1 mililitra i 0,5 mililitra niepoddanej obróbce próbki do sterylnych mikroprobówek wirówkowych w celu uzyskania żywotnej liczby płytek i barwienia żywych/martwych dla próbek T równa się zero. Następnie inkubować niepoddane działaniu substancji kontrolnej, próbki potraktowane miodem Manuka i poddane działaniu antybiotyku w warunkach tlenowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem przy 250 obr./min przez 24 godziny. Przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie próbki T równej zeru próbce niepoddanej działaniu substancji w bulionie LB, aby uzyskać policzalną liczbę komórek do zliczenia żywotnych płytek.

Rozprowadzić 50 mikrolitrów każdej rozcieńczonej próbki na jednej połowie płytki agarowej LB. Inkubować płytki agarowe w warunkach tlenowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia wyjmij płytki agarowe LB z inkubatora.

Zidentyfikować płytkę rozcieńczającą zawierającą około 25 do 150 kolonii i policzyć dokładną liczbę kolonii. Użyj wzoru na jednostkę tworzącą kolonię, aby określić liczbę komórek nadających się do hodowli na mililitr. Trzeciego dnia dodaj 0,5 mililitra 0,85% chlorku sodu do 0,5 mililitra T, co równa się zerowej nietraktowanej żywej/martwej próbie kontrolnej barwienia.

Połącz 1,5 mikrolitra SYTO 9 i 1,5 mikrolitra jodku propidyny na próbkę. Następnie dodaj trzy mikrolitry mieszaniny do każdej próbki. Próbki należy inkubować w temperaturze 21 stopni Celsjusza w ciemności przez 15 minut.

Przenieś sześć mikrolitrów barwionej, delikatnie wymieszanej próbki do jednorazowego hemocytometru i obejrzyj pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu izotiocyjanianu fluoresceiny lub filtra FITC i soczewki obiektywu 40X. Uchwyć obraz przedstawiający zarówno linie siatki hemocytometru, jak i zielone komórki. Policz zielone komórki w sześciu polach na próbkę, zwracając uwagę na wymiary siatki, aby obliczyć liczbę zielonych komórek na objętość.

Na koniec oblicz liczbę komórek zdolnych do życia, ale nie nadających się do hodowli, odejmując liczbę komórek zdolnych do hodowli na mililitr uzyskanych przy użyciu liczby żywotnych płytek od liczby żywych komórek na mililitr uzyskanych przy barwieniu żywych/martwych. Czwartego dnia, po usunięciu z inkubatora kultur bakteryjnych poddanych działaniu miodu Manuka i potraktowanych antybiotykiem, należy zebrać 0,1 mililitra i 0,5 mililitra każdej próbki do mikroprobówek wirówkowych w celu zliczenia żywotnych płytek i barwienia żywych/martwych. Rysunek ten przedstawia liczbę komórek zdolnych do hodowli i żywotnych oznaczonych przy użyciu liczby żywotnych płytek i barwienia żywych/martwych dla kultur S.aureus i P.aeruginosa.

Wyniki pokazują, że liczba żywotnych i nadających się do hodowli komórek wykrytych w kulturach niepoddanych działaniu miodu Manuka i w kulturach poddanych działaniu miodu Manuka nie różniła się znacząco. Hodowle S.aureus traktowane tobramycyną miały mniej komórek zdolnych do hodowli niż komórek żywotnych, ale różnica ta nie była znacząca. Tylko P.aeruginosa leczona meropenemem wykazała statystycznie istotne zmniejszenie liczby komórek zdolnych do hodowli w porównaniu z komórkami żywotnymi.