Name: Barwienie żywe/martwe w celu ilościowego określenia żywych, ale nienadających się do hodowli komórek w bakteriach powodujących rany traktowanych miodem manuka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Poznaj metodę barwienia żywe/martwe do ilościowego określania komórek VBNC w bakteriach traktowanych miodem manuka. Technika ta pozwala porównać wpływ miodu i antybiotyków na fizjologię drobnoustrojów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z dwóch grantów Eastern Washington University, Faculty Research and Creative Works Grant dla A.R.C oraz Undergraduate Research & Creative Activities Grant dla L.T.B. Bill i Connie Cross przekazali fundusze na rzecz EWU na zakup odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego Leica DMIL z kamerą cyfrową.

Ponieważ P. aeruginosa (ATCC9721) i S. aureus (ATCC29213) są klasyfikowane jako czynniki poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2, pomieszczenia, w których prowadzone są prace, muszą mieć ograniczony dostęp i być wyposażone w komorę bezpieczeństwa biologicznego do manipulacji, które mogłyby powodować rozpryski lub aerozole, takich jak mieszanie i wirowanie kultur. Na wszystkich etapach tego protokołu należy nosić środki ochrony osobistej (PPE), w tym fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice. Wszystkie odczynniki i sprzęt używany w eksperymentach są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie sterylnego bulionu i pożywki do hodowli agarowych
<ol>
	<li>Przygotuj Luria Bertani i Mueller Hinton, NaCl (0,85%), antybiotyki i szkło.
	<ol>
		<li>Przygotuj podłoże bulionowe zgodnie z instrukcjami producenta, dodając proszek agarowy do 1,5% na podłoże agarowe. Dodaj 0,85 g NaCl do 100 ml dH20, aby przygotować 0,85% NaCl. Na naczynia nałożyć taśmę autoklawową, umieścić je w pojemniku bezpiecznym dla autoklawu i autoklawować w cyklu płynnym odpowiednim do użytych objętości.</li>
		<li>Po zakończeniu cyklu autoklawu schłodzić agar do temperatury około 60 °C przed przelaniem go do sterylnych szalek Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 100 μg/ml roztworów podstawowych antybiotyków tobramycyny i meropenemu w dH2O do rozcieńczenia i leczenia bakterii. Wysterylizuj zapasy antybiotyków za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml podłączonej do sterylnego filtra 0,2 μm.
	<ol>
		<li>Wysterylizowane zapasy antybiotyków należy przechowywać w temperaturze -20 °C w wielu małych porcjach, aby zapobiec utracie aktywności z powodu wielu cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie archiwalnych szczepów Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa z -80 °C (Dzień 1)
<ol>
	<li>Zebrać materiał do naniesienia niewielkiej porcji zamrożonych szczepów bakteryjnych z ich fiolek zamrażarki o temperaturze 80 °C na agar Luria Bertani (LB). Obejmuje to wiele sterylnych drewnianych patyczków i płytkę agarową LB oznaczoną organizmem i datą.</li>
	<li>Otwórz zamrażarkę w temperaturze -80 °C, szybko wyjmij interesujące Cię fiolki i zamknij drzwiczki zamrażarki. Otwórz kolejno każdą fiolkę i za pomocą sterylnego patyczka zeskrob niewielką ilość zamrożonych bakterii na odpowiednio oznakowaną płytkę agarową LB. Założyć nakrętkę fiolki i szybko umieścić ją z powrotem w zamrażarce w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Inkubować zaszczepione płytki agarowe LB, stroną agarową do góry, w temperaturze 37 °C w warunkach tlenowych (atmosferycznych) przez 18-24 godziny. Po okresie inkubacji zapieczętować zaszczepione płytki agarowe LB taśmą do szczepienia i przechowywać je w temperaturze 4 °C nie dłużej niż jeden tydzień. W razie potrzeby należy co tydzień zaszczepiać świeże kultury bakterii z zamrożonego wywaru w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie S. aureus i P. aeruginosa do leczenia miodem Manuka (MH) i antybiotykiem (Dzień 2)
<ol>
	<li>Zbierz materiały potrzebne do rozpoczęcia hodowli bulionu LB dla każdego szczepu, w tym małe sterylne probówki, pipety serologiczne o pojemności 5 ml, sterylny bulion LB i pętlę zaszczepiającą. Zaopatrz się również w pipet ręczny lub elektryczny do użytku z pipetami serologicznymi, palnikiem Bunsena i inkubatorem do wytrząsania.</li>
	<li>Pracując obok płomienia palnika Bunsena, za pomocą pipety serologicznej przenieś 2 ml bulionu LB do dwóch sterylnych probówek. Wysterylizuj pętlę zaszczepiającą w płomieniu palnika Bunsena, a następnie przenieś ćwiartkę pętli pełnej bakterii z płytek agarowych LB do odpowiednio oznakowanej probówki z bulionem LB.
	<ol>
		<li>Probówkę należy inkubować w warunkach tlenowych w inkubatorze z wytrząsaniem (~250 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 18-24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie MH i przygotowanie MH oraz leczenie antybiotykami S. aureus i P. aeruginosa (T = 0) (Dzień 3)
<ol>
	<li>Zbierz materiały potrzebne do eksperymentu, w tym bulion Muellera Hintona i płytki agarowe, kultury bakterii bulionu LB z dnia 2, sterylne probówki, wywary antybiotykowe na lodzie, pipety (P20, P200 i P1000) i końcówki, probówki 15 ml, pipety serologiczne i pipetor oraz probówki do mikrofuge.
	<ol>
		<li>Przygotuj 25% i 50% roztwory podstawowe MH świeże w dniu założenia eksperymentu. W oparciu o gęstość MH (1,47 g/ml) zważyć odpowiednią ilość MH w sterylnej probówce o pojemności 15 ml i dodać odpowiednią ilość sterylnego bulionu Mueller Hinton. Ponownie zawieś MH, umieszczając rurki w ciepłej wodzie i odwracając je w razie potrzeby.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenie w stosunku 1:1000 (około 106 jtk/ml) nocnych kultur bakteryjnych w sterylnych probówkach o pojemności 15 ml, dodając 10 μl kultury bakteryjnej do 10 ml bulionu Muellera Hintona.
	<ol>
		<li>Użyć rozcieńczonych kultur do przygotowania trzech próbek dla każdego gatunku bakterii: próbki kontrolnej niepoddanej działaniu substancji, próbki poddanej działaniu MH (przy minimalnym stężeniu hamującym, MIC) i próbki poddanej działaniu antybiotyku (tobramycyna dla S. aureus lub meropenem dla P. aeruginosa, w MIC).</li>
		<li>Dodać rozcieńczoną kulturę bakteryjną, MH i odpowiedni antybiotyk do próbek w objętościach wskazanych w Tabeli 1 i Tabeli 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść 0,1 ml i 0,5 ml próbki niepoddanej działaniu substancji do sterylnych probówek mikrowirówek w celu zliczenia żywych płytek (etap 5) i barwienia żywych/martwych (etap 6) odpowiednio dla próbek T = 0.
	<ol>
		<li>Próbki kontrolne niepoddane działaniu substancji poddanej działaniu MH i poddane działaniu antybiotyków (tobramycyna lub meropenem) należy inkubować w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem (250 obr./min) przez 24 godziny. Przeprowadzić techniki liczenia żywotnych płytek (etap 5) i barwienia żywych/martwych (etap 6) na próbkach niepoddanych działaniu środka T= 0.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Określanie komórek nadających się do hodowli w próbkach przy użyciu metody liczenia żywych płytek (Dzień 3 - 5)
<ol>
	<li>W dniu 4, po 24-godzinnej inkubacji próbki, zebrać 0,1 ml i 0,5 ml każdej próbki w probówkach do mikrowirówek, aby uzyskać odpowiednio liczbę żywotnych płytek i barwienie żywych/martwych (etap 6). Będą to próbki T = 24 h.</li>
	<li>Przeprowadzić liczenie żywotnych płytek na próbkach T = 0 i T = 24 h w dniu ich pobrania, przygotowując 10-krotne rozcieńczenia żywych próbek liczby płytek w bulionie LB w celu uzyskania policzalnej liczby komórek (~25-150).
	<ol>
		<li>Rozprowadzić 50 μl każdej rozcieńczonej próbki na 1/2 płytki agarowej LB. Inkubować płytki agarowe LB w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego dnia wyjmij płytki agarowe LB z inkubatora i zidentyfikuj płytkę rozcieńczającą, która ma ~ 25-150 kolonii. Policz dokładną liczbę kolonii na płytce i użyj wzoru na jednostki tworzące kolonie (CFU) (jtk/ml= # zliczone kolonie/ (objętość platerowana, ml) (użyte rozcieńczenie)) w celu określenia liczby komórek nadających się do hodowli na ml. 
	UWAGA: Próbka T = 0 zostanie posiana w dniu 3 i poddana analizie w dniu 4; próbki T = 24 h zostaną posiane w dniu 4 i poddane analizie w dniu 5.</li>
</ol>
6. Określanie żywotnych komórek w próbkach za pomocą barwienia żywych/martwych i mikroskopii fluorescencyjnej (Dzień 3 lub 4)
<ol>
	<li>Zbierz materiały potrzebne do barwienia żywych/martwych, w tym 0,85% sterylnego NaCl, aby utrzymać korzystne środowisko osmotyczne dla komórek, pipety (P20, P200 i P1000) oraz sterylne końcówki pipet, zestaw do barwienia żywych/martwych bakterii oraz jednorazowy hemocytometr. Uzyskaj dostęp do mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) w celu wykrycia barwnika SYTO 9, który barwi żywe komórki.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml 0,85% NaCl do 0,5 ml każdej z następujących żywych/martwych próbek: wszystkie nierozcieńczone próbki T = 0, nierozcieńczone T = 24 h MH i próbki poddane działaniu antybiotyku oraz rozcieńczenie 1:1000 T = 24 h niepoddanej działaniu substancji próbki kontrolnej.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że końcowa liczba żywych komórek we wszystkich próbkach została pomnożona przez dwa i rozcieńczoną kontrolę T = 24 godziny bez poddawania działaniu substancji należy pomnożyć przez 1000. Połączyć 1,5 μl SYTO 9 i 1,5 μl jodku propidyny na próbkę, a następnie dodać 3 μl mieszaniny do każdej próbki. Próbki inkubować w temperaturze 21 °C w ciemności przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś 6 μl każdej barwionej, delikatnie wymieszanej próbki do jednorazowego hemocytometru i obejrzyj ją za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem FITC i soczewką obiektywu 40x. Zrób zdjęcie, na którym widać zarówno linie siatki hemocytometru, jak i żywe zielone komórki.
	<ol>
		<li>Policz zielone komórki w sześciu polach na próbkę, zwracając uwagę na wymiary siatki, aby można było obliczyć liczbę zielonych komórek na objętość. 
		UWAGA: Wymiary pola w obecnych eksperymentach to 1,05 mm x 0,6 mm x 0,1 mm, co odpowiada 0,063 mm3 lub 6,3 x 10-5 mL. Aby uzyskać liczbę żywotnych komórek na ml, podziel liczbę żywych komórek policzoną przez 6,3 x 10-5 ml, a następnie pomnóż je przez dwa (lub 2000, jeśli jest to kontrola T = 24 godziny bez leczenia).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Określanie liczby żywotnych, ale nienadających się do hodowli komórek (VBNC)
UWAGA: Użyj liczby komórek hodowlanych uzyskanych z liczby żywych płytek i liczby żywych komórek uzyskanych z barwienia żywych/martwych, aby określić liczbę VBNC.
<ol>
	<li>Oblicz VBNC/ml, odejmując liczbę komórek zdolnych do hodowli/ml od liczby żywotnych komórek na ml.</li>
	<li>Użyj testu Wilcoxona z dopasowanymi parami, aby porównać VBNC / ml lub komórki hodowlane / ml z komórkami żywotnymi / ml dla każdego leczenia.</li>
</ol>

<ol><li>Spoering, A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms+and+planktonic+cells+of+Pseudomonas+aeruginosa+have+similar+resistance+to+killing+by+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials.</a> J Bacteriol. 183 (23), 6746-6751 (2001).</li>
<li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+strains+producing+high+levels+of+persister+cells+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis.</a> J Bacteriol. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li>
<li>Li, L., Mendis, N., Trigui, H., Oliver, J. D., Faucher, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+viable+but+non-culturable+state+in+human+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22F+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The importance of the viable but non-culturable state in human bacterial pathogens.</a> F Microbiol. 5, 00258(2014).</li>
<li>Reygaert, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+antimicrobial+resistance+mechanisms+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An overview of the antimicrobial resistance mechanisms of bacteria.</a> AIMS Microbiol. 4 (3), 482-450 (2018).</li>
<li>Ayrapetyan, M., Williams, T. C., Baxter, R., Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+but+nonculturable+and+persister+cells+coexist+stochastically+and+are+induced+by+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Viable but nonculturable and persister cells coexist stochastically and are induced by human serum.</a> Infect Immun. 83 (11), 4194-4203 (2015).</li>
<li>Cabral, D. J., Wurster, J. I., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+persistence+as+a+metabolic+adaptation%3A+Stress%2C+metabolism%2C+the+host%2C+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22PHARH2%22%5BJournal%5D)">Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions.</a> PHARH2. 11 (1), 11010014(2018).</li>
<li>Heidelberg, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aerosolization+on+culturability+and+viability+of+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of aerosolization on culturability and viability of gram-negative bacteria.</a> Appl Environ Microbiol. 63 (9), 3585-3588 (1997).</li>
<li>Cook, K. L., Bolster, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+Campylobacter+jejuni+and+Escherichia+coli+in+groundwater+during+prolonged+starvation+at+low+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Survival of Campylobacter jejuni and Escherichia coli in groundwater during prolonged starvation at low temperatures.</a> J Appl Microbiol. 103 (3), 573-583 (2007).</li>
<li>Xu, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+viability+of+nonculturable+Escherichia+coli+and+Vibrio+cholerae+in+the+estuarine+and+marine+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbl+Ecol%22%5BJournal%5D)">Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment.</a> Microbl Ecol. 8 (4), 313-323 (1982).</li>
<li>Qi, Z., Huang, Z., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+differences+of+biofilm+and+planktonic+Pseudomonas+aeruginosa+in+viable+but+nonculturable+state+induced+by+chlorine+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Metabolism differences of biofilm and planktonic Pseudomonas aeruginosa in viable but nonculturable state induced by chlorine stress.</a> Sci Total Environ. 821, 153374(2022).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+the+Viable+but+Non-culturable+%28VBNC%29+state+formation+of+staphylococcus+aureus+and+its+control+in+food+system%5BTitle%5D)+AND+%22F+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Study on the Viable but Non-culturable (VBNC) state formation of staphylococcus aureus and its control in food system.</a> F Microbiol. 11, 599739(2020).</li>
<li>Oryan, A., Alemzadeh, E., Moshiri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+and+therapeutic+activities+of+honey+in+wound+healing%3A+A+narrative+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Viability%22%5BJournal%5D)">Biological properties and therapeutic activities of honey in wound healing: A narrative review and meta-analysis.</a> J Tissue Viability. 25 (2), 98-118 (2016).</li>
<li>Lusby, P. E., Coombes, A. L., Wilkinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+Activity+of+different+honeys+against+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Bactericidal Activity of different honeys against pathogenic bacteria.</a> Arch Med Res. 36 (5), 464-467 (2005).</li>
<li>Mandal, M. D., Mandal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey%3A+Its+medicinal+property+and+antibacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pac+J+Trop.+Biomed%22%5BJournal%5D)">Honey: Its medicinal property and antibacterial activity.</a> Asian Pac J Trop. Biomed. 1 (2), 154-160 (2011).</li>
<li>Carter, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Manuka+Honey%3A+No+longer+so+alternative%5BTitle%5D)+AND+%22F+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Manuka Honey: No longer so alternative.</a> F Microbiol. 7, 00569(2016).</li>
<li>Cooper, R. A., Molan, P. C., Harding, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensitivity+to+honey+of+Gram-positive+cocci+of+clinical+significance+isolated+from+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The sensitivity to honey of Gram-positive cocci of clinical significance isolated from wounds.</a> J Appl Microbiol. 93 (5), 857-863 (2002).</li>
<li>George Narelle May, C., Keith, F. Antibacterial Honey: In-vitro activity against clinical isolates of MRSA, VRE, and other multiresistant Gram-negative organisms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeorge+Narelle+May%2C+C+%22HMP+Global+Learning+Network%22">HMP Global Learning Network</a>. , https://www.hmpgloballearningnetwork.com/site/wounds/article/7751 (2007).</li>
<li>Blair, S. E., Cokcetin, N. N., Harry, E. J., Carter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unusual+antibacterial+activity+of+medical-grade+Leptospermum+honey%3A+Antibacterial+spectrum%2C+resistance+and+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Soc+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The unusual antibacterial activity of medical-grade Leptospermum honey: Antibacterial spectrum, resistance and transcriptome analysis.</a> Eur Soc Clin Microbiol. 28 (10), 1199-1208 (2009).</li>
<li>Cooper, R. A., Jenkins, L., Henriques, A. F. M., Duggan, R. S., Burton, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+bacterial+resistance+to+medical-grade+manuka+honey%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Soc+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Absence of bacterial resistance to medical-grade manuka honey.</a> Eur Soc Clin Microbiol. 29 (10), 1237-1241 (2010).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+can+inhibit+and+eliminate+biofilms+produced+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Honey can inhibit and eliminate biofilms produced by Pseudomonas aeruginosa.</a> Sci Rep. 9 (1), 18160(2019).</li>
<li>Bischofberger, A. M., Pfrunder Cardozo, K. R., Baumgartner, M., Hall, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+honey+resistance+in+experimental+populations+of+bacteria+depends+on+the+type+of+honey+and+has+no+major+side+effects+for+antibiotic+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Appl%22%5BJournal%5D)">Evolution of honey resistance in experimental populations of bacteria depends on the type of honey and has no major side effects for antibiotic susceptibility.</a> Evol Appl. 14 (5), 1314-1327 (2021).</li>
<li>Cunningham, E., O'Byrne, C., Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+weak+acids+on+Listeria+monocytogenes+survival%3A+Evidence+for+a+viable+but+nonculturable+state+in+response+to+low+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Effect of weak acids on Listeria monocytogenes survival: Evidence for a viable but nonculturable state in response to low pH.</a> Food Control. 20 (12), 1141-1144 (2009).</li>
<li>Kogure, K., Simidu, U., Taga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tentative+direct+microscopic+method+for+counting+living+marine+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria.</a> Can J Microbiol. 25 (3), 415-420 (1979).</li>
<li>Albertini, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+multiparameter+analysis+for+Vibrio+alginolyticus+viable+but+nonculturable+state+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+J+Int+Soc+Anal+Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of multiparameter analysis for Vibrio alginolyticus viable but nonculturable state determination.</a> Cytom J Int Soc Anal Cytol. 69 (4), 260-265 (2006).</li>
<li>Nocker, A., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approaches+toward+preferential+detection+of+viable+cells+using+nucleic+acid+amplification+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques.</a> FEMS Microbiol Lett. 291 (2), 137-142 (2009).</li>
<li>Trevors, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+but+non-culturable+%28VBNC%29+bacteria%3A+Gene+expression+in+planktonic+and+biofilm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Viable but non-culturable (VBNC) bacteria: Gene expression in planktonic and biofilm cells.</a> J Microbiol Methods. 86 (2), 266-273 (2011).</li>
<li>Ankley, L. M., Monteiro, M. P., Camp, K. M., O'Quinn, R., Castillo, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manuka+honey+chelates+iron+and+impacts+iron+regulation+in+key+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+App+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Manuka honey chelates iron and impacts iron regulation in key bacterial pathogens.</a> J App Microbiol. 128 (4), 1015-1024 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Opisany tutaj protokół pozwala na wykrycie populacji komórek VBNC u bakterii powodujących rany leczonych minimalnymi stężeniami hamującymi (MIC) MH i konwencjonalnymi antybiotykami. Krytyczne kroki w protokole obejmowały przygotowanie rozcieńczeń MH w dniu eksperymentu, zapobieganie utracie próbki podczas barwienia żywych/martwych oraz prawidłowe obliczenie analizowanej objętości. W tym i innych badaniach eksperymentalnie określono wartości MIC MH dla S. aureus i P. aeruginosa 27...

Bakterie w stanie spoczynku żywotnego, ale nie kulturowego (VBNC) przeżywają leczenie antybiotykami i powodują nawracające, a czasem śmiertelne choroby zakaźne1,2,3. Bardziej znana jest nam oporność na antybiotyki, która występuje w wyniku dziedzicznej zmiany genetycznej4. Zmiana genetyczna zapewnia oporność na określony antybiotyk poprzez kilka mechanizmów, w tym ograniczenie wchłaniania antybiotyku, zwiększenie wypływu antybiotyku, modyfikację celu antybiotyku lub dezaktywację antybiotyku4. Z kolei bakterie w stanie uśpienia wykazują szerszą i niedziedziczną tolerancję na antybiotyki poprzez zmniejszenie ich metabolizmu2,3. Antybiotyki są ukierunkowane na określone procesy metaboliczne, w tym replikację DNA i syntezę ściany komórkowej, i są nieskuteczne przeciwko metabolicznie nieaktywnym komórkom VBNC4. Komórki VBNC istnieją stochastycznie w niewielkiej liczbie wraz ze swoim genetycznie identycznym rodzeństwem podatnym na antybiotyki w większości populacji bakterii5. Jednak stresory środowiskowe, w tym ekspozycja na antybiotyki, indukują wrażliwe komórki bakteryjne do wejścia w stan tolerancyjny na antybiotyki VBNC3,6. Antybiotykoterapia zabije wrażliwe na antybiotyki komórki w populacji, podczas gdy uśpione komórki VBNC pozostają. Jak sama nazwa wskazuje, komórki VBNC nie nadają się do hodowli na pożywkach odpowiednich do wzrostu ich metabolicznie aktywnego rodzeństwa. Jednak ich błony i materiał genetyczny są nieuszkodzone i mogą się rozmnażać7,8. Po usunięciu antybiotyków wymagane są określone bodźce, takie jak składniki odżywcze, temperatura lub czynniki gospodarza, aby obudzić komórki VBNC ze stanu uśpienia i przywrócić wzrost3,9. Komórki VBNC zostały udokumentowane u wielu patogennych gatunków bakterii, w tym P. aeruginosa i S. aureus, głównych czynników etiologicznych zakażeń ran10,11.
Miód od dawna jest używany w zastosowaniach medycznych, w tym w leczeniu ran, ze względu na swoje właściwości antybakteryjne12. Miód Manuka (MH), pozyskiwany z kwiatów krzewu Manuka (Leptospermum scoparium), został zauważony ze swojego szerokiego spektrum działania bakteriobójczego (recenzja w13,14,15). Skutecznie zabija większość badanych bakterii wywołujących infekcje u ludzi, w tym szczepy bakteryjne, takie jak Staphylococcus aureus oporny na metycylinę i Enterococcus oporny na wankomycynę, które wykazują dziedziczną oporność na tradycyjne antybiotyki16,17. Dodatkowo, indukowana oporność bakterii na MH jest rzadka, wykrywana tylko w biofilmach P. aeruginosa narażonych na kontakt z miodem i Escherichia coli hodowanych w rosnących stężeniach podzbioru badanego miodu18,19,20,21. Sugeruje to, że mechanizmy przeciwdrobnoustrojowe MH różnią się od konwencjonalnych antybiotyków i mogą indukować mniej komórek VBNC lub nie powodować ich braku. Hipoteza ta została przetestowana poprzez określenie, w jaki sposób MH wpływa na populacje VBNC w porównaniu z konwencjonalnymi antybiotykami.
Komórki VBNC muszą być odróżniane od ich metabolicznie aktywnego rodzeństwa hodowlanego i martwych komórek. Komórki zdolne do hodowli są liczone przy użyciu techniki liczenia żywotnych płytek, w której komórki są przenoszone do rutynowych pożywek hodowlanych i inkubowane przez okres wystarczający do wystarczającej liczby podziałów komórkowych, aby uzyskać obserwowalne kolonie. Opracowano kilka metod odróżniania komórek VBNC od martwych komórek w oparciu o ich nienaruszone błony i transkrypcję niskiego poziomu. Absorpcja substratu i barwnika fluorescencyjnego, w połączeniu z mikroskopią lub cytometrią przepływową, pozwala na bezpośrednie zliczanie komórek za pomocą mikroskopii lub cytometrii przepływowej z kolorem wskazującym nienaruszone błony22,23. Testy oddychania, które wymagają, aby łańcuch transportu elektronów był obecny w nienaruszonej błonie komórkowej, zostały również wykorzystane do rozróżnienia między komórkami żywymi i martwymi24. Opracowano również ilościowe metody PCR (qPCR) w połączeniu z barwnikami modyfikującymi DNA, które zapobiegają amplifikacji; amplifikowane zostanie tylko DNA z żywotnych komórek, ponieważ nienaruszone błony wykluczają klasę barwnika<sup="xref">25. Chociaż komórki VBNC są uśpione, nadal transkrybują geny na niskim poziomie, co można również wykorzystać do odróżnienia ich od martwych komórek za pomocą odwrotnej transkrypcji PCR26.
W tej pracy opracowano test do ilościowego oznaczania komórek VBNC u dwóch patogennych bakterii powodujących rany, S. aureus i P. aeruginosa, leczonych MH. Opisano w nim leczenie bakterii za pomocą MH i konwencjonalnych antybiotyków oraz zastosowanie liczby żywotnych płytek i barwienia żywych/martwych w celu wykrycia komórek zdolnych do hodowli i zdolnych do życia. Ten prosty i niedrogi protokół pozwoli na analizę zdolności MH do indukowania opornych na antybiotyki komórek VBNC w wielu patogenach bakteryjnych.

<table><tbody><tr><td>Rosół Mueller Hinton</td><td>Bioodczynniki</td><td>Fisher B12322</td><td></td></tr><tr><td>Rosół Luria Bertani (LB)&nbsp;</td><td>Fisher Bioodczynniki</td><td>BP142602</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0812-07-1</td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S3014-500g</td><td></td></tr><tr><td>meropenem</td><td>TargetMol</td><td>T0224</td><td></td></tr><tr><td>tobramycyna</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2514</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;</td><td></td><td>ATCC ATCC29213</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Pseudomonas aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>ATCC9721</td><td></td></tr><tr><td>inkubator z wytrząsaniem</td><td>Eppendorf</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>inkubator</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H2200-H&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Manukaguard Miód Manuka Amazon</td><td></td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DMIL odwrócony mikroskop fluorescencyjny&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>11521265</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>12730522</td><td></td></tr><tr><td>probówki sokoła 15 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-103</td><td></td></tr><tr><td>pipety serologiczne</td><td>Diagnocine</td><td>DP-LB0100005, DP-LB010010</td><td></td></tr><tr><td>Pipetor wspomagający pipety</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Palnik Bunsena</td><td>Fisher Naukowe</td> pipety <td>S48108</td><td></td></tr><tr><td>Rainin</td><td>Pipette.com</td><td>waga L-20, L-200, L-1000</td><td></td></tr><tr><td>Płytka</td><td></td> 96-dołkowa Falcon <td>XS603S</td><td></td></tr><tr><td>Pętla inokulacyjna</td><td>Falcon</td> 351172 <td></td> Fisher Scientific 13-104-5 <td></td></tr><tr><td></td><td>Szkło Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> rozsiewacz</td><td>domowej roboty</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia żywych trupów dla bakterii</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>probówki do mikrofuge</td><td>Firma badawcza Biologix SKU</td><td>80-1500/P80-1500</td><td></td></tr><tr><td>folia aluminiowa</td><td>Costco</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do tworzenia figur</td><td>GraphPad</td><td>NA</td><td>GraphPad Prism służył do tworzenia figur i przeprowadzania analiz statystycznych.</td></tr></tbody></table>

barwienie żywe/martwe w celu ilościowego określenia żywych, ale nienadających się do hodowli komórek w bakteriach powodujących rany traktowanych miodem manuka

Live/Dead Staining for Quantifying Viable but Not Culturable Cells in Manuka Honey-Treated Wound-Causing Bacteria

Oporność na antybiotyki i tolerancja wśród bakterii stanowią poważne zagrożenie dla globalnego zdrowia. Mechanizmy przyczyniające się do oporności i tolerancji na antybiotyki obejmują odpowiednio mutacje genetyczne i nabywanie genów oporności oraz przejście do żywotnych, ale nie kulturowych (VBNC) i innych stanów uśpienia. Chociaż genetycznie identyczne z ich odpowiednikami nietolerującymi antybiotyków, komórki VBNC unikają działania antybiotyków, pozostając metabolicznie nieaktywne. Antybiotyki są skuteczne tylko wtedy, gdy aktywne są ich docelowe procesy, takie jak replikacja DNA lub transkrypcja. Ponieważ stresory środowiskowe, w szczególności antybiotyki, mogą prowadzić bakterie do stanu uśpienia, potrzebne są alternatywne środki przeciwdrobnoustrojowe, aby zminimalizować lub zapobiec tej reakcji. Przeciwdrobnoustrojowy miód Manuka (MH) jest skuteczny przeciwko wielu bakteriom, z rzadkim rozwojem oporności. Jego wieloaspektowe mechanizmy przeciwdrobnoustrojowe sprawiają, że jest cennym środkiem w leczeniu infekcji bakteryjnych. W ramach tego badania zbadano oporność MH na rozwój oporności na antybiotyki, testując hipotezę, że MH indukuje mniej komórek VBNC niż konwencjonalne antybiotyki. Aby to zbadać, opracowano protokół leczenia bakterii powodujących rany Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa za pomocą minimalnych hamujących stężeń MH lub konwencjonalnych antybiotyków tobramycyny lub meropenemu, w którym następnie wykorzystano liczbę żywotnych bakterii do identyfikacji metabolicznie aktywnych komórek hodowlanych oraz barwienie żywe/martwe w celu zidentyfikowania wszystkich żywych komórek. Liczba komórek VBNC była równa liczbie komórek zdolnych do przeżycia pomniejszonej o liczbę komórek zdolnych do hodowli. W niektórych eksperymentach liczba komórek zdolnych do hodowli była wyższa niż liczba komórek zdolnych do życia, co dawało ujemną liczbę komórek VBNC; w związku z tym numery komórek VBNC nie zostały bezpośrednio porównane. Zamiast tego porównano liczbę komórek zdolnych do hodowli i żywotnych dla każdego leczenia. Tylko P. aeruginosa leczony tobramycyną miał znacznie mniej komórek zdolnych do hodowli niż komórki żywotne, co wskazuje na większą liczbę komórek VBNC. Protokół ten jest szybki i łatwy i może być stosowany do oceny indukcji MH komórek VBNC w innych bakteriach chorobotwórczych.

Formy bakteryjne żywe, ale niezdolne do hodowli (VBNC), są indukowane przez stresory, w tym leczenie antybiotykami, i powodują nawracające infekcje ze względu na swoją tolerancję na antybiotyki. Ponieważ MH jest środkiem przeciwdrobniczym o szerokim spektrum działania, wobec którego rzadko wykrywano oporność, postawiono hipotezę, że MH indukuje mniej komórek VBNC niż konwencjonalne antybiotyki. Opisana tutaj metoda została wykorzystana do ilościowego oznaczenia komórek VBNC tworzonych przez dwie bakterie wywołujące rany,...

Prezentowany protokół opisuje procedurę ilościowego oznaczania komórek zdolnych do życia, ale nie hodowanych (VBNC) w kulturach bakteryjnych traktowanych miodem Manuka.

Barwienie żywe/martwe w celu ilościowego określenia żywych, ale nienadających się do hodowli komórek w bakteriach powodujących rany traktowanych miodem manuka

Antibiotic resistance and tolerance among bacteria pose a significant threat to global health. Mechanisms contributing to antibiotic resistance and ...

Ten projekt badawczy ma na celu zbadanie wpływu miodu Manuka na fizjologię bakterii. Ostatnie badania dostarczyły dalszych informacji na temat przeciwdrobnoustrojowego wpływu miodu Manuka na fizjologię bakterii. Nasze wstępne wyniki wskazują, że bakterie miodu Manuka wchodzą w stan spoczynku opornego na antybiotyki, żywotnego, ale nie nadającego się do hodowli, ale w mniejszym stopniu niż te leczone konwencjonalnymi antybiotykami.Opierając się na naszych eksperymentach, interesujące byłoby porównanie profili ekspresji miodu Manuka i konwencjonalnych VBNC indukowanych antybiotykami. Na początek weź fiolki zawierające zamrożone szczepy bakterii. Otwórz każdy z nich po kolei i za pomocą sterylnego patyczka zeskrob niewielką ilość zamrożonych bakterii na odpowiednio oznakowaną płytkę agarową Luria-Bertani lub LB.Założyć nakrętkę fiolki i szybko umieścić ją w zamrażarce. Inkubuj kultury bakteryjne przez 18 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia za pomocą pipety serologicznej przenieś dwa mililitry bulionu LB do dwóch sterylnych probówek.Wysterylizuj pętlę zaszczepiającą w płomieniu palnika Bunsena. Następnie przenieś ćwiartkę bakterii z płytki agarowej LB do odpowiednio oznakowanej probówki zawierającej bulion LB. Inkubować probówkę w warunkach tlenowych w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością około 250 obr./min w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin.W celu przygotowania miodu Manuka i leczenia bakteriami antybiotykami, dodaj 10 mikrolitrów kultury bakteryjnej do 10 mililitrów bulionu Muellera Hintona, aby uzyskać rozcieńczenie kultury bakteryjnej w stosunku 1:1 000, które ma około 10 do szóstych jednostek tworzących kolonię na mililitr. Użyć rozcieńczonych kultur do przygotowania trzech próbek dla każdego gatunku bakterii, kontroli niepoddanej działaniu substancji, próbki poddanej działaniu miodu Manuka i próbki poddanej działaniu antybiotyku. Dodaj miód Manuka i antybiotyk do odpowiednich tubek.Przenieś 0,1 mililitra i 0,5 mililitra niepoddanej obróbce próbki do sterylnych mikroprobówek wirówkowych w celu uzyskania żywotnej liczby płytek i barwienia żywych/martwych dla próbek T równa się zero. Następnie inkubować niepoddane działaniu substancji kontrolnej, próbki potraktowane miodem Manuka i poddane działaniu antybiotyku w warunkach tlenowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem przy 250 obr./min przez 24 godziny. Przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie próbki T równej zeru próbce niepoddanej działaniu substancji w bulionie LB, aby uzyskać policzalną liczbę komórek do zliczenia żywotnych płytek.Rozprowadzić 50 mikrolitrów każdej rozcieńczonej próbki na jednej połowie płytki agarowej LB. Inkubować płytki agarowe w warunkach tlenowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia wyjmij płytki agarowe LB z inkubatora.Zidentyfikować płytkę rozcieńczającą zawierającą około 25 do 150 kolonii i policzyć dokładną liczbę kolonii. Użyj wzoru na jednostkę tworzącą kolonię, aby określić liczbę komórek nadających się do hodowli na mililitr. Trzeciego dnia dodaj 0,5 mililitra 0,85% chlorku sodu do 0,5 mililitra T, co równa się zerowej nietraktowanej żywej/martwej próbie kontrolnej barwienia.Połącz 1,5 mikrolitra SYTO 9 i 1,5 mikrolitra jodku propidyny na próbkę. Następnie dodaj trzy mikrolitry mieszaniny do każdej próbki. Próbki należy inkubować w temperaturze 21 stopni Celsjusza w ciemności przez 15 minut.Przenieś sześć mikrolitrów barwionej, delikatnie wymieszanej próbki do jednorazowego hemocytometru i obejrzyj pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu izotiocyjanianu fluoresceiny lub filtra FITC i soczewki obiektywu 40X. Uchwyć obraz przedstawiający zarówno linie siatki hemocytometru, jak i zielone komórki. Policz zielone komórki w sześciu polach na próbkę, zwracając uwagę na wymiary siatki, aby obliczyć liczbę zielonych komórek na objętość.Na koniec oblicz liczbę komórek zdolnych do życia, ale nie nadających się do hodowli, odejmując liczbę komórek zdolnych do hodowli na mililitr uzyskanych przy użyciu liczby żywotnych płytek od liczby żywych komórek na mililitr uzyskanych przy barwieniu żywych/martwych. Czwartego dnia, po usunięciu z inkubatora kultur bakteryjnych poddanych działaniu miodu Manuka i potraktowanych antybiotykiem, należy zebrać 0,1 mililitra i 0,5 mililitra każdej próbki do mikroprobówek wirówkowych w celu zliczenia żywotnych płytek i barwienia żywych/martwych. Rysunek ten przedstawia liczbę komórek zdolnych do hodowli i żywotnych oznaczonych przy użyciu liczby żywotnych płytek i barwienia żywych/martwych dla kultur S.aureus i P.aeruginosa.Wyniki pokazują, że liczba żywotnych i nadających się do hodowli komórek wykrytych w kulturach niepoddanych działaniu miodu Manuka i w kulturach poddanych działaniu miodu Manuka nie różniła się znacząco. Hodowle S.aureus traktowane tobramycyną miały mniej komórek zdolnych do hodowli niż komórek żywotnych, ale różnica ta nie była znacząca. Tylko P.aeruginosa leczona meropenemem wykazała statystycznie istotne zmniejszenie liczby komórek zdolnych do hodowli w porównaniu z komórkami żywotnymi.

livedead-staining-for-quantifying-viable-but-not-culturable-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy film opisuje metodę oczyszczania Wolbachia pipientis z linii komórkowej Anopheles gambiae, a następnie hodowli tego endosymbionta w medium bezkomórkowym. Przedstawiono również test żywotności bakterii.

Utrzymywanie Wolbachia w medium bezkomórkowym

Źródło: Anderson, Q. L., et al. Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)Film przedstawia test na bazie cieczy, w którym genetycznie zmodyfikowane larwy C. elegans są narażone na działanie bakterii chorobotwórczych na mikropłytce. Toksyny bakteryjne wydzielane do pożywki wywołują stres i śmierć gospodarza. Barwnik fluorescencyjny barwi martwe robaki, umożliwiając ilościowe określenie śmiertelności na podstawie obrazowania w celu oceny...

Ocena śmiertelności larw C. elegans wywołanej przez bakterie chorobotwórcze

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a method to evaluate the viability of anaerobic oral bacteria using fluorescent dyes and flow cytometry. It begins with culturing bacteria in oxygen-free broth, followed by resuspending a single colony from a blood agar plate. After incubation and dilution, the culture is stained with membrane-permeable and...

Fluorescence-Based Viability Assessment of Oral Anaerobic Bacteria

Wideo pokazuje test zabijania in vitro opsonofagocytarnego przy użyciu kohodowli ludzkich neutrofili ze Streptococcus pneumoniae. Przeciwciała i białka dopełniacza ułatwiają opsonizację bakterii, umożliwiając neutrofilom rozpoznawanie i zabijanie bakterii, wykazując skuteczną aktywność opsonofagocytarną neutrofili.

Ocena zabijającej aktywność opsonofagocytarną wobec patogenów bakteryjnych

Ten film demonstruje test do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Hydrożele poliakrylamidowe o różnej sztywności, pokryte kolagenem, są ułożone warstwami w płytce wielodołkowej, aby naśladować sztywność fizjologicznego ECM. Po nałożeniu ludzkich komórek śródbłonka na hydrożele i zakażeniu komórek bakteriami Listeria monocytogenes zmodyfikowanymi do ekspresji białka fluorescencyjnego po wejściu do komórki, cytometria...

Test do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną

Kluczowe dla dziedziny patogenezy bakteryjnej jest możliwość określenia, czy i jak mikroby przeżywają po ekspozycji na komórki eukariotyczne.  W tym artykule przedstawiono protokoły stosowania barwników fluorescencyjnych, które ujawniają żywotność poszczególnych bakterii znajdujących się wewnątrz komórek gospodarza i związanych z nimi.

Metody mikroskopii fluorescencyjnej do określania żywotności bakterii w połączeniu z komórkami ssaków

Infekcje biofilmowe wykazują wysoką tolerancję na chemioterapię. Żaden pojedynczy test nie oddaje złożoności biofilmów. Zamiast tego potrzebne są testy uzupełniające. Przedstawiamy platformę przesiewową (opracowaną dla S. aureus), która łączy testy żywotności, biomasy i matrycy biofilmu. Pozwala to na odkrywanie leków przeciwbiofilmowych, w tym ocenę długoterminowych efektów chemioterapeutycznych.

Platforma testów antybiofilmowych dostosowana do eksploracji bibliotek związków naturalnych

Prosty test pomiaru ATP i metoda barwienia żywych/martwych zostały użyte do ilościowego określenia i wizualizacji przeżycia Neisseria gonorrhoeae po leczeniu ceftriaksonem. Protokół ten może zostać rozszerzony w celu zbadania działania przeciwdrobnoustrojowego dowolnego antybiotyku i może być wykorzystany do określenia minimalnego stężenia hamującego antybiotyków w biofilmach bakteryjnych.

Ilościowe badanie wrażliwości na antybiotyki agregatów Neisseria gonorrhoeae przy użyciu komercyjnych testów wykorzystania ATP i barwienia żywych/martwych

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Protokół opisuje krok po kroku metodę tworzenia ex vivo modelu zranionej skóry owcy zakażonej Staphylococcus aureus. Ten wysokowydajny model lepiej symuluje infekcje in vivo w porównaniu z konwencjonalnymi technikami mikrobiologicznymi i stanowi dla naukowców fizjologicznie istotną platformę do testowania skuteczności nowo pojawiających się środków przeciwdrobnoustrojowych.

Nowy, wysokowydajny model ran skóry owiec ex vivo do testowania nowych antybiotyków

Przedstawiamy tutaj protokół mającycy mierzenie przeżycia po stresie w próbkach drożdży. Test wykorzystuje dwa barwniki fluorescencyjne, SYTO 9 i jodek propidiu (PI), do ilościowego określenia integralności błony plazmatycznej. Wykorzystuje cytometrię przepływową do dostarczania ilościowych i powtarzalnych szacunków ułamków żywych, martwych i uszkodzonych komórek dla próbek po stresie utlencyjnym.

Zoptymalizowany test ŻYWY/MARTWY połączony z cytometrią przepływową do ilościowego przeżycia po stresie w komórkach drożdży

Poznaj metodę barwienia żywe/martwe do ilościowego określania komórek VBNC w bakteriach traktowanych miodem manuka. Technika ta pozwala porównać wpływ miodu i antybiotyków na fizjologię drobnoustrojów.

Barwienie żywe/martwe w celu ilościowego określenia żywych, ale nienadających się do hodowli komórek w bakteriach powodujących rany traktowanych miodem manuka (Wideo) | JoVE Journal

Barwienie żywe/martwe w celu ilościowego określenia żywych, ale nienadających się do hodowli komórek w bakteriach powodujących rany traktowanych miodem manuka

Przeglądaj więcej filmów