Name: Charakterystyka biologicznych widm absorpcyjnych obejmujących zakres od światła widzialnego do krótkofalowej podczerwieni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj metodę charakteryzacji widm absorpcyjnych VIS-SWIR biologicznych absorberów przy użyciu spektroskopii optycznej. Protokół ten umożliwia rozwój narzędzi diagnostycznych w zdrowiu matczynym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez granty z National Institutes of Health (NIH) R00HD103954 i R21EB035823. Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez UL1TR002345 grantowy Instytutu Nauk Klinicznych i Translacyjnych Uniwersytetu Waszyngtońskiego z National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) z National Institutes of Health (NIH). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne stanowisko NIH. Autorzy pragną podziękować za pomoc członkom O'Brien Lab, Michaelowi Vaheyowi i jego członkom laboratorium oraz Huanzhu Jiangowi.

1. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki wody
	<ol>
		<li>Aby przygotować próbkę, napełnij czysty pojemnik ultraczystą wodą i przefiltruj go za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Upewnij się, że wyjście strzykawki jest skierowane do czystej szklanej lub kwarcowej kuwety w celu wykonania pomiarów spektroskopii absorpcyjnej próbki.</li>
		<li>Aby przygotować odniesienie, napełnij czysty pojemnik deuterowaną wodą i przefiltruj go za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Upewnij się, że wyjście strzykawki jest skierowane do identycznej czystej szklanej lub kwarcowej kuwety jak próbka kuweta, która służy jako odniesienie. 
		UWAGA: Etap filtrowania zminimalizuje rozpraszanie optyczne od próbki poprzez odfiltrowanie małych cząstek w wodzie, które mają silny wpływ na obszar widzialny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki melaniny
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór melaniny o stężeniu 1,7 mg/ml, dodając sproszkowaną melaninę do probówki wirówkowej wypełnionej 3,5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Aby rozpocząć, pomiary należy rozpocząć od długości fal o najniższej oczekiwanej absorpcji, gdzie wymagane jest najwyższe stężenie melaniny. Rozpocznij pomiary melaniny od około 1,7 mg / ml dla SWIR i rozcieńcz go DMSO później do 10-krotnego rozcieńczenia (około 0,17 mg / mL) dla regionów VIS / NIR.</li>
		<li>Sonikuj probówkę przez 10 minut, aby upewnić się, że sproszkowana melanina rozpuści się w DMSO i przenieś roztwór do czystej szklanej lub kwarcowej kuwety w celu pomiarów spektroskopowych.</li>
		<li>Pozostać w liniowym zakresie absorbancji spektrometru i zapewnić wysokie pomiary SNR, zmieniając stężenie i/lub długość ścieżki (np. przełączając się z krótkiej długości ścieżki (1 lub 2 mm) na kuwetę o długości ścieżki 10 mm). Absorpcja melaniny ma szeroki zakres, od VIS do SWIR. W przypadku VIS należy użyć kuwety melaniny o najniższym stężeniu i/lub długości drogi ze względu na jej wysoki współczynnik ekstynkcji molowej; w przypadku SWIR należy użyć najwyższego stężenia melaniny i/lub kuwety o długości ścieżki, aby uzyskać jakościowo czysty pomiar spektroskopowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki oleju kukurydzianego
	<ol>
		<li>Dodaj olej kukurydziany do czystej szklanki lub kuwety kwarcowej do pomiarów spektroskopowych.</li>
		<li>Użyj otwartego powietrza jako odniesienia. Żadna kuweta ani roztwór nie będą używane jako odniesienie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie natlenionej próbki hemoglobiny z pełną heparyną ludzką krwią 
	UWAGA: Cała heparynizowana krew ludzka została zakupiona i pobrana w licencjonowanych przez FDA centrach pobierania próbek zlokalizowanych w Stanach Zjednoczonych.
	<ol>
		<li>Aby wyizolować hemoglobinę z czerwonych krwinek (RBC) i usunąć jak najwięcej wody z krwi, najpierw należy pobrać pipetę 1800 μl pełnej heparynizowanej krwi ludzkiej do probówek mikrowirówkowych i odwirować przy 9,6 × g przez 10 min. 
		UWAGA: Zalecane jest około 4-6 probówek do mikrowirówek</li>
		<li>Po odwirowaniu wyjmij probówki z mikrowirówki, a następnie wyjmij i wyrzuć supernatant (będzie to około 850 μl) z odwirowanej próbki krwi bez naruszania osadu (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2). Supernatant składa się z cieczy (głównie osocza i płytek krwi) znajdującej się powyżej osadu krwinek czerwonych. Poszukaj osadu czerwonych krwinek na dnie probówki do mikrowirówki.</li>
		<li>Każdą osadkę należy rozpuścić w takiej samej objętości zdeuterowanej wody, jak objętość supernatantu, który został wyrzucony. Ponownie odwirować przy 9,6 × g przez 10 minut.</li>
		<li>Wyjąć probówki z wirówki, a następnie wyrzucić supernatant bez naruszania osadu.</li>
		<li>Rozpuść osad w tej samej objętości zdeuterowanej wody, co objętość supernatantu, który został odrzucony. Ponownie odwirować przy 9,6 × g przez 10 min.</li>
		<li>Wyjmij probówki z wirówki, a następnie usuń supernatant za pomocą pipety i wyrzuć go.</li>
		<li>Liza czerwonych krwinek (RBC): Rozpuść granulki krwinek czerwonych w dużej objętości (4,5 ml) deuterowanej wody, co spowoduje hipotoniczny wybuch. Jeśli granulka przykleja się do tuby, spłucz ją odmierzonymi 4,5 ml deuterowanej wody, aby ją poluzować. 
		UWAGA: Objętość supernatantu będzie się zwiększać po każdym etapie wirowania. Ta objętość supernatantu może wynosić od 800 μl do 1 600 μl. Objętość deuterowanej wody do lizy może się zmieniać w zależności od pożądanego stężenia próbki, ale musi być wystarczająco wysoka, aby spowodować hipotoniczny.</li>
		<li>Usunąć zlizowany roztwór krwi z probówki za pomocą igły i strzykawki, a następnie ostrożnie wyjąć igłę strzykawki z końcówką i wyrzucić ją do pojemnika na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne. Podłączyć strzykawkę do filtra strzykawkowego 0,22 μm i przepchnąć zawartość strzykawki przez filtr do 10-milimetrowej kuwety szklanej lub kwarcowej o długości 10 mm, 3,5 mL. 
		UWAGA: Etap filtrowania zminimalizuje rozpraszanie optyczne od próbki poprzez odfiltrowanie organelli komórkowych i błon w roztworze. Jeśli próbka jest bardzo skoncentrowana, a filtr strzykawkowy staje się trudny do wepchnięcia, należy użyć wielu filtrów strzykawkowych.</li>
		<li>Zabezpiecz kuwetę hermetycznym korkiem nad kuwetą, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbki przez parę wodną z powietrza. Foliuj zewnętrzną stronę korka, aby dodatkowo zapobiec zanieczyszczeniu i zapewnić hermetyczne uszczelnienie. 
		UWAGA: W przypadku pomiarów od 600 nm do 1,600 nm, około 1,200-1,600 μl osadu rozpuszczonego w 4,5 ml deuterowanej wody da jakościowo czyste pomiary. 
		UWAGA: W przypadku obszarów widmowych o wysokiej oczekiwanej absorbancji (od 400 nm do 600 nm) próbki będą musiały zostać rozcieńczone przy użyciu wody deuterowanej, aby uzyskać nienasycone wartości absorbancji i upewnić się, że wartości absorbancji mieszczą się w zakresie liniowym detektora. Ponadto próbki i odniesienie należy umieścić w kuwetach o krótkiej długości drogi (1 lub 2 mm). Dla widm pokazanych w niniejszym dokumencie, próbki rozcieńczono 10-krotnie dla 400-500 nm i 5-krotnie dla 500-600 nm i zmierzono w kuwetach o długości ścieżki 2 mm. 
		Krótsza ścieżka (1 lub 2 mm) pozwoli na mniejszą absorpcję światła w przypadku wysoce absorbujących długości fal, pomagając zapewnić, że niektóre fotony przejdą do detektora i pozostaną w liniowym zakresie detekcji.</li>
		<li>Zaopatrzyć się w czystą kuwetę o tej samej długości i objętości drogi, co kuweta na próbkę zawierającą przefiltrowany roztwór krwi i napełnić ją deuterowaną wodą do pomiarów podstawowych i referencyjnych. W przypadku zmiany długości ścieżek kuwety dla różnych zakresów spektralnych, należy zarejestrować nowe widmo odniesienia dla każdej długości ścieżki kuwety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie odtlenionej próbki hemoglobiny z pełną heparyną ludzką krwią
	<ol>
		<li>Wykonaj kroki 1.4.1-1.4.8.</li>
		<li>Dodaj ditionian sodu do roztworu krwi w kuwecie i delikatnie wymieszaj. Zabezpiecz kuwetę hermetycznym korkiem nad kuwetą, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbki przez parę wodną z powietrza. Foliuj zewnętrzną stronę korka, aby jeszcze bardziej zapobiec zanieczyszczeniu i zapewnić hermetyczne uszczelnienie. Ostrożnie przechyl kuwetę na boki, aby upewnić się, że ditionian sodu rozpuści się w roztworze; Roztwór krwi zmieni kolor z czerwonego na ciemniejszy fioletowo-czerwony. 
		UWAGA: Aby całkowicie odtlenić hemoglobinę, masa ditionianu sodu, która jest wymagana, wynosi około 0,007 g na ml roztworu krwi. Według Briley-Sӕbø i Bjørneruda, do pełnego odtlenienia krwi potrzeba co najmniej 2,5 mg ditionitu sodu/g krwi18. Jednak w badaniach tutaj stwierdzono, że stężenie to jest niewystarczające. Stwierdzono, że stężenie około 3,4 mg/g krwi pełnej całkowicie odtlenia roztwór krwi bez wprowadzania rozpraszania optycznego. W przypadku pomiarów od 400 do 600 nm roztwór krwi należy rozcieńczyć wodą deuterowaną. Obliczyć wymaganą masę ditionianu sodu na podstawie objętości użytego roztworu bood, a nie objętości po rozcieńczeniu. W przypadku pomiarów od 600 nm do 1,600 nm, około 1,200-1,600 μl osadu rozpuszczonego w 4,5 ml deuterowanej wody da wysokie pomiary SNR. 
		Kuweta o krótszej długości ścieżki (1 lub 2 mm) pozwoli na mniejszą absorpcję światła w wysoce absorbujących długościach fal, pomagając zapewnić, że niektóre fotony przejdą do detektora i pozostaną w liniowym zakresie detekcji.</li>
		<li>Napełnij inną kuwetę o pasującej długości ścieżki, podobnie jak kuwetę, przefiltrowanym roztworem krwi z deuterowaną wodą do pomiarów podstawowych i referencyjnych. W przypadku zmiany długości ścieżek kuwety dla różnych zakresów spektralnych, należy zarejestrować nowe widmo odniesienia dla każdej długości ścieżki kuwety.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Uzyskiwanie wysokiej jakości pomiarów absorpcji
<ol>
	<li>Przygotować próbki i odniesienie zgodnie z opisem w sekcji 1 i umieścić je w szklanych lub kwarcowych kuwetach do pomiarów VIS NIR-SWIR. Włącz lampę spektrometru i detektory i pozwól systemowi rozgrzać się przez co najmniej 5-20 minut, w zależności od systemu spektrometru i źródła światła. 
	UWAGA: Pięć minut zapewniło wystarczające chłodzenie detektora i stabilność wyjściową lampy dla widm zebranych w niniejszym dokumencie, ale powinno to być scharakteryzowane dla każdego systemu przed wykonaniem pomiarów absorbancji. 
	W tym okresie pobierania należy mieć pod ręką próbkę i odniesienie. Upewnij się, że pokrywki kuwet są dobrze zabezpieczone. Przestrzeń pomiarowa powinna być jak najciemniejsza, aby zapobiec zniekształceniu pomiarów absorpcji przez światło otoczenia.</li>
	<li>Powtórz następujące kroki dla różnych obszarów widma ze względu na dużą wariancję absorpcji w VIS-SWIR.
	<ol>
		<li>W przypadku korzystania z konfiguracji dwuwiązkowej (dwa oddzielne detektory dla próbki i odniesienia), upewnij się, że system jest oparty na linii bazowej. Uzyskać linię podstawową, umieszczając identyczne próbki referencyjne zawierające rozpuszczalnik przed każdym detektorem i pobrać pomiar absorbancji, stosując dokładne parametry akwizycji, które mają być wykorzystane do zbierania widma absorbancji próbki. Chociaż detektory teoretycznie powinny wykazywać zerową absorpcję, zwykle nie jest ona idealna. Odejmij wynikowe widmo absorbancji od wszystkich widm absorbancji próbki, które są uzyskiwane przy użyciu tych samych ustawień. 
		UWAGA: Linię bazową należy powtarzać za każdym razem, gdy ustawienia akwizycji do zbierania danych są zmieniane.</li>
		<li>Umieść próbkę w spektrometrze i wybierz detektor, który jest odpowiedni dla mierzonego obszaru (VIS-NIR = krzem lub UV-VIS PMT, SWIR = InGaAs) i view absorbancja w trybie Live, w którym pomiar jest stale aktualizowany w miarę dostrajania parametrów pomiaru.</li>
		<li>Zaczynając od domyślnych parametrów spektrometru, dostosuj moc padającego światła i czas ekspozycji, aż do uzyskania jakościowo czystego widma absorpcyjnego bez nasycenia.
		<ol>
			<li>Jeśli dostrojenie parametrów nie daje uzyskania jakościowo czystych widm, zmodyfikuj parametry, takie jak moc padającego światła, czas ekspozycji, długość ścieżki i stężenie próbki. Najpierw spróbuj dostosować moc i czas ekspozycji. Jeśli dostrojenie tych parametrów nie spowoduje uzyskania wysokiego widma SNR, zmień stężenie próbki lub długość ścieżki próbki i odniesienie. 
			UWAGA: Domyślne parametry użyte w zbiorze widm przedstawionych w niniejszym dokumencie to moc światła padającego 15 nW przy 400 nm i 20 nW przy 1000 nm, czas ekspozycji 30 ms, długość drogi kuwety 10 mm oraz stężenia specyficzne dla próbki: 100% woda, melanina 1,7 mg/ml, 100% olej kukurydziany, hemoglobina utleniona (15,9 g/dl), i hemoglobina odtleniona (15,9 g/dl).</li>
			<li>Aby zwiększyć SNR, zwiększ liczbę odczytów danych uśrednionych na punkt danych. Im wyższa liczba odczytów danych jest uśredniona, tym dłuższy jest czas na pomiar.</li>
			<li>Aby zwiększyć rozdzielczość spektralną, zmniejsz rozmiar kroku (nm) pomiaru do limitu rozdzielczości spektrometru. Wydłuży to czas na pomiar. Dodatkowo zmniejsz pasmo mocy światła padającego do 1/10części pełnej szerokości najwęższego piku przy połowie maksimum19.</li>
			<li>Po zoptymalizowaniu ustawień pomiaru dla próbki należy udokumentować ustawienia dla każdego uzyskanego widma.</li>
			<li>Aby uzyskać widmo, użyj zoptymalizowanych ustawień, aby wykonać pomiar tylko odniesienia. Następnie zastąp kuwetę referencyjną kuwetą sample i wykonaj kolejny pomiar. Upewnij się, że zarówno pomiary referencyjne, jak i sample są zapisywane oddzielnie. 
			UWAGA: Konieczne jest, aby pomiar referencyjny nie uległ nasyceniu. Jeśli tak, zmniejsz moc padającego światła i/lub czas ekspozycji, aż nie będzie nasycenia. Wszystkie parametry systemu powinny być takie same między pomiarami odniesienia i próbki; Jeśli jeden będzie musiał zostać zmieniony, drugi również będzie musiał zostać powtórzony, aby go dopasować.</li>
			<li>Dla każdego parzystego zestawu pomiarów odniesienia i próbki należy obliczyć absorbancję A (Równanie 1), traktując pomiar odniesienia jakoIo, a pomiar próbki jako I.</li>
			<li>Aby zszyć ze sobą różne obszary, które wymagały różnic w stężeniu próbki lub długości ścieżki, zastosuj współczynnik mnożenia do jednego z obszarów spektralnych. Na przykład w przypadku pierwszego regionu, który miał 1/10 stężenia i identyczną długość ścieżki jak drugi region, pomnóż pierwszy region widmowy przez 10, aby odpowiednio przeskalować oba regiony razem. 
			UWAGA: Współczynnikiem mnożenia powinna być różnica w stężeniu i/lub długości ścieżki między regionami.</li>
			<li>Po skorygowaniu widm o różnice w długości ścieżki lub stężeniu, wybierz nakładającą się długość fali w dwóch obszarach spektralnych, aby zszyć te dwa obszary razem.</li>
			<li>Skróć dwa widma tak, aby kończyły się na nakładającej się długości fali; wybierz jedno widmo, aby uwzględnić jego przejściową wartość widmową. Połącz dwa obcięte widma, aby utworzyć jedno wynikowe widmo o szerszym zakresie długości fali.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Optimizing VIS-SWIR Spectroscopy for Biological Molecules

<ol><li>Cao, Q., Zhegalova, N. G., Wang, S. T., Akers, W. J., Berezin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+in+the+extended+near-infrared+window+based+on+endogenous+chromophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging in the extended near-infrared window based on endogenous chromophores.</a> J Biomed Opt. 18 (10), 101318(2013).</li>
<li>Yao, J., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photoacoustics%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of photoacoustic microscopy.</a> Photoacoustics. 2 (2), 87-101 (2014).</li>
<li>Jacques, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+properties+of+biological+tissues%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical properties of biological tissues: a review.</a> Phys Med Biol. 58 (11), R37(2013).</li>
<li>Prahl, S. A. Optical absorption of hemoglobin. , 
 <a target="_blank" href="https://omlc.org/spectra/hemoglobin/">https://omlc.org/spectra/hemoglobin/</a> (1999).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+depth+of+photons+in+biological+tissues+from+hyperspectral+imaging+in+shortwave+infrared+in+transmission+and+reflection+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Penetration depth of photons in biological tissues from hyperspectral imaging in shortwave infrared in transmission and reflection geometries.</a> J Biomed Opt. 21 (12), 126006(2016).</li>
<li>Du, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+imaging+and+characterization+of+allergic+contact+dermatitis+in+the+short-wave+infrared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral imaging and characterization of allergic contact dermatitis in the short-wave infrared.</a> J Biophotonics. 13 (9), e202000040(2020).</li>
<li>Roggan, A., Friebel, M., Dörschel, K., Hahn, A., Mueller, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+properties+of+circulating+human+blood+in+the+wavelength+range+400-2500+nm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm.</a> J Biomed Opt. 4 (1), 36-46 (1999).</li>
<li>Kuenstner, J. T., Norris, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometry+of+human+hemoglobin+in+the+near+infrared+region+from+1000+to+2500+nm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Near+Infrared+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometry of human hemoglobin in the near infrared region from 1000 to 2500 nm.</a> J Near Infrared Spectrosc. 2 (2), 59-65 (1994).</li>
<li>Smith, B. C. Spectral subtraction. , 
 <a target="_blank" href="https://www.spectroscopyonline.com/view/spectral-subtraction ">https://www.spectroscopyonline.com/view/spectral-subtraction </a> (2021).</li>
<li>Sjoding, M. W., Dickson, R. P., Iwashyna, T. J., Gay, S. E., Valley, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial+bias+in+pulse+oximetry+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Racial bias in pulse oximetry measurement.</a> N Engl J Med. 383 (25), 2477-2478 (2020).</li>
<li>Fawzy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial+and+ethnic+discrepancy+in+pulse+oximetry+and+delayed+identification+of+treatment+eligibility+among+patients+with+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Racial and ethnic discrepancy in pulse oximetry and delayed identification of treatment eligibility among patients with COVID-19.</a> JAMA Intern Med. 182 (7), 730-738 (2022).</li>
<li>Sudat, S. E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial+disparities+in+pulse+oximeter+device+inaccuracy+and+estimated+clinical+impact+on+COVID-19+treatment+course%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Racial disparities in pulse oximeter device inaccuracy and estimated clinical impact on COVID-19 treatment course.</a> Am J Epidemiol. 192 (5), 703-713 (2023).</li>
<li>Keller, M. D., Harrison-Smith, B., Patil, C., Arefin, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+colour+affects+the+accuracy+of+medical+oxygen+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skin colour affects the accuracy of medical oxygen sensors.</a> Nature. 610 (7932), 449-451 (2022).</li>
<li>Butler, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption+spectroscopy+of+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Absorption spectroscopy of biological materials.</a> Methods Enzymol. 24, 3-25 (1972).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+extinction+cross+sections+and+molar+attenuation+coefficient+of+small+gold+nanoparticles+and+experimental+observation+of+their+UV-vis+spectral+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochim+Acta+A+Mol+Biomol+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Calculation extinction cross sections and molar attenuation coefficient of small gold nanoparticles and experimental observation of their UV-vis spectral properties.</a> Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 191, 513-520 (2018).</li>
<li>Rossman, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Mineral+Geochem%22%5BJournal%5D)">Optical spectroscopy.</a> Rev Mineral Geochem. 78 (1), 371-398 (2014).</li>
<li>Thimsen, E., Sadtler, B., Berezin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shortwave-infrared+%28SWIR%29+emitters+for+biological+imaging%3A+a+review+of+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nanophotonics%22%5BJournal%5D)">Shortwave-infrared (SWIR) emitters for biological imaging: a review of challenges and opportunities.</a> Nanophotonics. 6 (5), 1043-1054 (2017).</li>
<li>Briely-Sabo, K., Bjornerud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+de-oxygenation+of+ex-vivo+whole+blood+using+sodium+dithionite%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Intl+Sot+Mag+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Accurate de-oxygenation of ex-vivo whole blood using sodium dithionite.</a> Proc Intl Sot Mag Reson Med. 8, 2025(2020).</li>
<li>Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Principles of instrumental analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkoog%2C+DA+%22Cengage+Leaning%22">Cengage Leaning</a>. , (2019).</li>
<li>Hale, G. M., Querry, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+constants+of+water+in+the+200-nm+to+200-microm+wavelength+region%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Optical constants of water in the 200-nm to 200-microm wavelength region.</a> Appl Opt. 12 (3), 555-563 (1973).</li>
<li>Sarna, T., Sealy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinduced+oxygen+consumption+in+melanin+systems.+Action+spectra+and+quantum+yields+for+eumelanin+and+synthetic+melanin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photoinduced oxygen consumption in melanin systems. Action spectra and quantum yields for eumelanin and synthetic melanin.</a> Photochem Photobiol. 39 (1), 69-74 (1984).</li>
<li>Nordlund, J. J., et al. The physical properties of melanins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSarna%2C+T+%22The+pigmentary+system%3A+Physiology+and+pathophysiology%22">The pigmentary system: Physiology and pathophysiology</a>. , Blackwell Publishing Ltd. 311-341 (2006).</li>
<li>Crippa, P., Cristofoletti, V., Romeo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+band+model+for+melanin+deduced+from+optical+absorption+and+photoconductivity+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A band model for melanin deduced from optical absorption and photoconductivity experiments.</a> Biochim Biophys Acta. 538 (1), 164-170 (1978).</li>
<li>van Veen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+visible+near-IR+absorption+coefficients+of+mammalian+fat+using+time-+and+spatially+resolved+diffuse+reflectance+and+transmission+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Determination of visible near-IR absorption coefficients of mammalian fat using time- and spatially resolved diffuse reflectance and transmission spectroscopy.</a> J Biomed Opt. 10 (5), 054004(2005).</li>
</ol>

Christine O'Brien i Leonid Shmuylovich mają udziały finansowe w Armor Medical Inc. i mogą odnieść korzyści finansowe, jeśli firma odniesie sukces w marketingu swoich produktów, które są związane z tymi badaniami.

Protokoły opisane w tym artykule mogą być wykorzystane do uzyskania widm absorpcyjnych VIS-SWIR absorberów biologicznych i środków kontrastowych. W tym miejscu pokazujemy konkretne kroki, aby uzyskać widma wody, melaniny, oleju kukurydzianego, utlenionej hemoglobiny i odtlenionej hemoglobiny o długości od 400 nm do 1,600 nm. Poniższa dyskusja obejmuje kluczowe kroki, wskazówki dotyczące optymalizacji pomiarów, ograniczenia metody i zastosowania tego protokołu w biomedycynie.
Chociaż wszystkie kroki protokołu są ważne, należy wykonać kilka krytycznych kroków, aby uzyskać dokładne widma za pomocą tego protokołu. Po pierwsze, próbka musi być nierozproszona; Na przykład, uzyskując natlenioną i odtlenioną hemoglobinę z krwi, rozpraszacze w próbce muszą zostać odfiltrowane (tutaj zastosowano filtr strzykawkowy 0,22 μm). Podczas przygotowywania odtlenionej hemoglobiny ilość dodanego ditionianu sodu nie powinna przekraczać podanej masy, ponieważ spowoduje to zmętnienie próbki przy wyższych procentach wagowych i unieważni wymagania prawa Beera-Lamberta.
Po drugie, woda deuterowana musi być używana jako rozpuszczalnik próbki i odniesienie dla rozpuszczalnych w wodzie substancji rozpuszczonych, takich jak hemoglobina. W SWIR absorpcja wody jest silna i może maskować inne absorbery. Po trzecie, pomiary muszą być wykonywane w zakresie liniowym detektora, zdefiniowanym jako obszar, w którym zmiana fotonów docierających do detektora powoduje liniową zmianę sygnału detektora. Jeśli absorpcja jest minimalna, detektor może zarejestrować absorbancję równą zeru, nawet jeśli występuje absorbancja. Dzieje się tak, gdy próbka jest zbyt rozcieńczona, czas ekspozycji jest zbyt krótki i/lub długość drogi kuwety jest zbyt krótka, ale można temu zaradzić poprzez zwiększenie stężenia próbki, długości ścieżki kuwety i/lub czasu ekspozycji. Podobnie, jeśli występuje wysoka absorpcja, detektor może nie zarejestrować żadnych fotonów i uzyskać płaską linię zwaną "nasyceniem", która nie jest wrażliwa na zmiany absorbancji. Dzieje się tak, gdy próbka jest zbyt zagęszczona, czas ekspozycji jest zbyt krótki i/lub długość ścieżki jest zbyt długa, ale można ją ustalić poprzez zwiększenie stężenia próbki, wydłużenie czasu ekspozycji i/lub zmniejszenie długości ścieżki kuwety.
Po czwarte, stosowane detektory muszą być liniowe. W przypadku niepewności, czy detektor wykazuje liniową odpowiedź na liczbę fotonów docierających do detektora, można zmierzyć różne rozcieńczenia próbki przy tych samych ustawieniach akwizycji, aby sprawdzić, czy ich wartości absorbancji pokazują oczekiwany trend liniowy między absorbancją a stężeniem. Alternatywnie można zmierzyć pojedynczą próbkę i wydłużyć czas ekspozycji, aby sprawdzić, czy następuje liniowy wzrost intensywności detektora. Oba testy powinny dać zależność liniową, jeśli użytkownik działa w granicach liniowych (patrz trzeci punkt krytyczny powyżej).
Po piąte, aby pozostać w liniowym zakresie detektora dla całego zakresu spektralnego VIS-SHIR, stężenie próbki, czas ekspozycji detektora i/lub długość ścieżki kuwety będą musiały zostać zmienione dla różnych obszarów spektralnych o znacznie wyższej lub niższej absorbancji od początkowego obszaru spektralnego.
Po szóste, widma uzyskane przy użyciu różnych stężeń próbek lub długości ścieżek dla różnych obszarów spektralnych muszą być zszyte razem przez liniowe skalowanie jednego regionu w oparciu o znane zmiany stężenia lub długości ścieżki. Po przeskalowaniu widma powinny zostać zszyte ze sobą na nakładającej się długości fali między dwoma obszarami. Jeśli pomiar będzie obejmował pomiary z różnych detektorów, powinny istnieć nakładające się widma absorbancji, które zawierają pożądaną długość fali przejścia detektora (800 nm jest powszechnie używane podczas łączenia obszarów UV-VIS i SWIR). Każde widmo jest obcinane na długości fali przejścia detektora, a jedno widmo jest wybierane tak, aby zawierało oryginalną wartość absorbancji przejścia detektora. Następnie dwa obcięte widma są łączone, aby utworzyć jedno wydłużone widmo.
Dodatkowe wskazówki dotyczące uzyskiwania wysokiej jakości widm absorpcyjnych obejmują wykorzystanie wcześniej opublikowanego widma próbki będącej przedmiotem zainteresowania, nawet jeśli nie obejmuje ono pełnego zakresu widma, który ma być mierzony, w celu pokierowania pomiarami. Znając a priori zakres długości fal o najniższej absorbancji, pomiary można rozpocząć w tym obszarze od próbki o najwyższym stężeniu, a następnie dostosować i rozcieńczyć stamtąd. Może to pomóc w ustaleniu, ile oddzielnych regionów będzie musiało zostać zmierzonych w oparciu o oczekiwaną wielkość zmian absorbancji. Może również dać pewność, że oczekiwane widmo zostało uzyskane, jeśli pasuje do opublikowanych widm lub jeśli nie pasuje do opublikowanych widm, metoda przygotowania próbki może zostać ponownie zbadana wraz z kwestiami, które mogą zniekształcać widmo.
Widma absorpcyjne mogą wymagać obróbki końcowej. Na przykład cyfrowy filtr średniej ruchomej może być używany do wygładzania pomiarów absorpcji, a punkty znanego błędu mogą być usuwane za pomocą naprawy zestawu danych, w której błędne punkty są usuwane, a interpolacja jest wykonywana między niebłędnymi punktami.
Do ograniczeń tej metody należy nieprecyzja w przypadku próbek z rozpraszaniem optycznym, takich jak krew pełna. Aby dokładnie zmierzyć hemoglobinę, próbka krwi jest poddawana lizie, a następnie filtrowana strzykawką w celu usunięcia większości innych resztkowych składników komórkowych, które powodują rozpraszanie optyczne. Podobnie metoda ta nie jest stosowana in vivo ze względu na rozpraszanie tkanek. Chociaż pomiary absorbancji oparte na prawie Beera-Lamberta mogą być żmudne, a czasem trudne do wykonania, jest to złoty standard dla pomiarów czystej absorpcji optycznej. Ponadto niektóre rozpuszczalniki sprawiają, że uzyskanie czystego spektrum absorpcji niektórych substancji rozpuszczonych jest szczególnie trudne. Na przykład naturalnym rozpuszczalnikiem natlenionej i odtlenionej hemoglobiny jest woda, ale absorpcja wody jest silna w SWIR, dominując nad absorpcją natlenionej hemoglobiny. Dlatego staramy się usunąć wodę z krwi poprzez wielokrotne wirowanie, usunięcie supernatantu i ponowne rozpuszczenie w wodzie deuterowanej, która ma słabszą absorpcję SWIR. Podejrzewa się, że powstałe widma hemoglobiny natlenionej i odtlenionej z pełnej heparynizowanej krwi ludzkiej zawierają niewielką absorpcję resztkową z powodu absorpcji wody od około 1,300 nm do 1,600 nm, jak pokazano na rysunku 3. Chociaż prawdopodobnie nie jest to idealne rozplątanie wody z natlenionej i odtlenionej hemoglobiny, obserwujemy ścisłe dopasowanie do często cytowanych opublikowanych widm natlenionej i odtlenionej hemoglobiny od 400 nm do 1000 nm i rozszerzamy widmo o kilkaset nanometrów 2,3.
Opisane w niniejszym dokumencie protokoły pomogą naukowcom rozszerzyć biblioteki widm absorpcyjnych o widma VIS-SWIR wielu składników biologicznych i środków kontrastowych. Wiedza ta może być wykorzystana do lepszego zrozumienia podstaw biologii i fizjologii poprzez nieinwazyjne obrazowanie biomedyczne i wykrywanie na głębszych długościach fal niż większość obecnie działających systemów. Dodanie długości fal SWIR poszerza zakres składników tkanki, które mogą być monitorowane w sposób nieinwazyjny i może przyczynić się do opracowania nowatorskiego monitorowania i diagnostyki. Co więcej, urządzenia działające w NIR i SWIR powinny pomóc zminimalizować stronniczość pigmentacji skóry, która została zgłoszona w przypadku urządzeń optycznych działających w zakresach VIS i NIR i jest obiecującą strategią tworzenia sprawiedliwych wyrobów medycznych.

Większość absorberów biologicznych została optycznie scharakteryzowana w zakresie widma widzialnym (VIS, ~400-700 nm) i bliskiej podczerwieni (NIR, ~700-1,000 nm), ale nie w krótkofalowej podczerwieni (SWIR, ~1,000-3,000 nm)1,2,3,4 (Rysunek 1). Dzieje się tak pomimo tego, że SWIR oferuje głębszą penetrację światła dzięki mniejszemu rozpraszaniu tkanek i zmniejszonej absorpcji melaniny, a także dodatkowemu kontrastowi biologicznemu bez znaczników dla wody, lipidów i białek1,5,6. Brak widm absorpcyjnych obejmujących VIS-SWIR stworzył lukę w wiedzy, która uniemożliwia rozwój biomedycznych urządzeń optycznych, które wykorzystują te zalety SWIR. Chociaż w przeszłości przedstawiono kilka prób scharakteryzowania widm, brakuje wysokiej jakości widm absorpcyjnych VIS-SWIR czystych składników bez znaczących artefaktów rozpuszczalnikowych1,7,8. Na przykład, substancje rozpuszczalne w wodzie, takie jak hemoglobina, zostały scharakteryzowane w SWIR przy użyciu wody jako rozpuszczalnika i odjęciu absorpcji czystej wody od wynikowego widma9. Jednak dokładność tego podejścia jest niejasna, ponieważ woda jest dominującym absorberem w tym regionie.
Praca w SWIR ma dodatkową zaletę polegającą na zmniejszeniu lub ewentualnym usunięciu odchylenia spowodowanego silną absorpcją melaniny w VIS podczas korzystania z diagnostyki optycznej in vivo. Liczne badania wykazały, że pulsoksymetry przeszacowują natlenienie u czarnych pacjentów, w związku z czym czarni pacjenci są bardziej narażeni na niebezpiecznie niski poziom tlenu, którego pulsoksymetry nie wykryły10. To uprzedzenie pigmentacji skóry spowodowało opóźnione i nieodpowiednie leczenie wielu pacjentów z niedotlenieniem osób czarnoskórych11,12 i skłoniło społeczności optyków i inżynierów do podjęcia działań w celu poprawy dokładności urządzeń optycznych dla wszystkich odcieni skóry13. Przejście z wysokich długości fal VIS pochłaniających melaninę na NIR i SWIR jest jedną z ekscytujących innowacji technicznych, które mogą zmniejszyć dysproporcje rasowe w krytycznie ważnych technologiach optyki biomedycznej.
Rejestrowanie widm absorpcyjnych biomolekuł jest niezbędne do zrozumienia właściwości optycznych próbek tkanek, które są wykorzystywane w różnych zastosowaniach inżynieryjnych i biomedycznych14. Spektroskopia absorpcyjna mierzy absorpcję światła specyficzną dla cząsteczki w funkcji długości fali. Złotym standardem metody uzyskiwania pomiarów absorpcji w roztworze jest skierowanie skolimowanego, monochromatycznego światła przez rozpuszczoną próbkę i zarejestrowanie przechodzącego światła za pomocą detektora umieszczonego po przeciwnej stronie próbki niż źródło światła. Absorpcja (A) próbki jest następnie definiowana przez równanie (1).
A = log10(I0/I) (1)
Gdzie Io to natężenie światła padającego na próbkę, a I to intensywność światła przepuszczanego przez próbkę, które trafia do detektora. Io uzyskuje się poprzez pomiar odniesienia, którym jest zazwyczaj rozpuszczalnik substancji rozpuszczonej będącej przedmiotem zainteresowania, przy użyciu tych samych ustawień akwizycji co I. Spektroskopia absorpcyjna zapewnia ilościowe właściwości absorpcyjne i podlega prawu Beera-Lamberta (równanie 2), które nie ma zastosowania do próbek z rozpraszaniem optycznym. Równanie to mówi, że absorpcja optyczna jest określana przez współczynnik absorpcji molowej próbki (ε, jednostki L·mol−1·cm−1) przy długości fali λ pomnożony przez jej stężenie molowe (C, jednostki mol∙L-1) i długość ścieżki (L, jednostki cm), która jest zdefiniowana jako odległość przebyta przez próbkę15: 
A(λ) = ε(λ)*L*C (2)
Co ważne, współczynnik absorpcji molowej jest unikalny dla każdego biologicznego absorbera i wskazuje, jak mocno próbka pochłania światło o określonej długości fali16.
Podczas wykonywania pomiarów spektroskopii absorpcyjnej od VIS do SWIR, wymagane są dostosowania sprzętu, przygotowania próbki i przetwarzania spektralnego poza standardowymi widmami VIS-NIR:
Hardware 
Pomiary VIS-NIR zazwyczaj wykorzystują detektor krzemowy lub lampy fotopowielacza (PMT) z fotokatodami wrażliwymi na fotony UV-VIS, podczas gdy absorbancja SWIR wymaga fotodetektora wrażliwego na fotony SWIR, takiego jak detektor z arsenku indu i galu (InGaAs) 17. Systemy VIS, NIR i SWIR zazwyczaj wymagają również elementów dyspersyjnych specyficznych dla długości fali, takich jak siatki optyczne, do dyspersji światła w tych zakresach optycznych. Ponadto absorpcja SWIR wymaga kuwet szklanych lub kwarcowych, które mają wyższą transmisję niż kuwety plastikowe w SWIR, co czyni je bardziej odpowiednimi dla widm VIS-SWIR. Należy wybrać źródło lub źródła światła o szerokiej i względnie jednolitej emisji obejmującej VIS-SWIR, takie jak lampa halogenowa wolframowa (stosowana w niniejszym protokole). Regulacja mocy padającego światła, czasu ekspozycji lub czasu, przez jaki fotodetektor jest wystawiony na działanie światła, może pomóc w optymalizacji pomiarów absorbancji.
Przygotowanie próbki 
Stężenie próbki lub długość drogi kuwety zmieni liniowo ilość absorpcji, która zachodzi, jak opisano powyżej w Korektorze (2), a zatem każda z nich może zostać zmieniona w celu osiągnięcia wysokiego stosunku sygnału do szumu (SNR, tutaj obliczany jako stosunek amplitudy piku do odchylenia standardowego odtrendowanego obszaru widma, zazwyczaj SNR > 30 jest uważany za wysokiej jakości) pomiary w różnych sekcjach widma o stosunkowo wysokiej lub niskiej absorbancji. Aby zoptymalizować pomiary SWIR w roztworze wodnym, zamiast wody (H2O) można użyć tlenku deuteru (D2O), zwanego również ciężką wodą lub wodą deuterowaną, ponieważ ma on znacznie niższe piki absorpcji w klasie SWIR<sup="xref">1. Pozwala to na scharakteryzowanie substancji rozpuszczonej bez ingerencji w dominującą absorpcję wody w SWIR.
Spectral postprocessing 
Przetwarzanie końcowe jest wymagane, ponieważ widma VIS-SWIR wymagają dwóch detektorów, jednego dla widzialnego NIR (zwykle PMT wrażliwego na krzem lub UV-VIS) i jednego dla SWIR (zwykle InGaAs), a widma muszą być zszyte razem, aby uzyskać pełne widmo VIS-SWIR. Gdy widma obejmują VIS-SWIR, absorpcja może się znacznie różnić w zależności od obszaru długości fali, a próbka może wymagać rozcieńczenia lub zmniejszenia długości ścieżki w niektórych obszarach, aby zapobiec nasyceniu. Widma muszą być skalowane liniowo, aby uwzględnić zmiany w stężeniu próbki lub długości ścieżki, a następnie zszyte razem, aby utworzyć pojedyncze widmo obejmujące dwa obszary długości fali.
Następujące protokoły szczegółowo opiszą przygotowanie i pomiar spektroskopowy od VIS do SWIR pięciu przykładowych absorberów biologicznych: woda (stanowi ~60% masy ciała), melanina (główny absorber pigmentacji skóry), olej kukurydziany (używany jako analog dla ludzkich lipidów, ponieważ ma niską zmienność między partiami, skład chemiczny zbliżony do lipidów ludzkich i zwierzęcych, i minimalne rozproszenie) oraz natleniona i odtleniona hemoglobina (główne absorbery we krwi).

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; średnica m strzykawka Filtry</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGPM33RS</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Pipeta</td><td>Millipore Sigma</td><td>EP3124000121</td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; L Pipeta</td><td>Millipore Sigma</td><td>EP3124000083</td><td></td></tr><tr><td>Rurki stożkowe</td><td>Avantor VWR</td><td>21008-089</td><td></td></tr><tr><td>Olej kukurydziany</td><td>Happy Belly</td><td>n/a</td><td>48 Fl Oz</td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td> Cambridge <td>Isotope Laboratories</td><td>DLM-4-100</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>Sulfotlenek dimetylu (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879-1L</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa strzykawka 1 ml</td><td>BH Supplies</td><td>BH1LL</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa igła</td><td>Atshuhut/Amazon</td><td>66941</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka (-80 &deg; C)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>IUE386FARK</td><td></td></tr><tr><td>Zlewki szklane</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS1000PACK</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety szklane lub kwarcowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z802875-1EA</td><td>700 i mikro; L objętość</td></tr><tr><td>Kuwety szklane lub kwarcowe</td><td>Thorlabs</td><td>CV10Q35EP</td><td>objętości 3500 ml</td></tr><tr><td>Heparynizowana ludzka krew</td><td>Lampire</td><td>7203710</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Costar</td><td>3213</td><td></td></tr><tr><td>- accuSpin Micro 17</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ Water</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZMQSP0D01</td><td></td></tr><tr><td>Żarówka halogenowa OSRAM FCS 64640 150 W 24 V HLX</td><td></td> Amazon <td>B0001221DG</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Millipore Sigma</td><td>HS234526B</td><td></td></tr><tr><td>końcówki do pipet</td><td>Eppendorf</td><td>22492055</td><td></td></tr><tr><td>sproszkowana syntetyczna melanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8049-97-6</td><td></td></tr><tr><td>Skala</td><td>Sartorius</td><td>UX-11976-09</td><td></td></tr><tr><td>Ditionit</td> <td>soduSigma-Aldrich</td><td>1065070500</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>CPX1800</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka&nbsp;</td><td>Aozita</td><td>000 00 0 1 2 3</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV/VIS/SWIR</td><td>Systemy przyrządów on-line</td><td>Olis Cary 14</td><td></td></tr><tr><td>Łodzie wagowe</td><td>Amazon</td><td>&nbsp; </td><td></td>B07M5RMNPF</tr></tbody></table>

charakterystyka biologicznych widm absorpcyjnych obejmujących zakres od światła widzialnego do krótkofalowej podczerwieni

Characterization of Biological Absorption Spectra Spanning the Visible to the Short-Wave Infrared

Dla nieinwazyjnego monitorowania fizjologicznego opartego na świetle, optymalne długości fal poszczególnych składników tkanki można określić za pomocą spektroskopii absorpcyjnej. Jednak ze względu na brak czułości sprzętu na dłuższych falach, spektroskopia absorpcyjna jest zwykle stosowana dla długości fal w zakresie widzialnym (VIS) i bliskiej podczerwieni (NIR) od 400 do 1000 nm. Postęp sprzętowy w zakresie krótkofalowej podczerwieni (SWIR) umożliwił badaczom zbadanie długości fal w zakresie od ~1000 nm do 3000 nm, w których występują charakterystyczne piki absorpcji lipidów, białek i wody. Cząsteczki te są trudne do wizualizacji w VIS-NIR i mogą stanowić wolne od znaczników źródła kontrastu biologicznego. Ponadto zaobserwowano niższe wchłanianie SWIR w przypadku melaniny, głównego chromoforu odpowiedzialnego za pigmentację skóry. Stwierdzono, że urządzenia optyczne in vivo, takie jak klinicznie standardowe pulsoksymetry, mają zmniejszoną dokładność u osób z ciemną pigmentacją skóry, prawdopodobnie z powodu silniejszej absorpcji melaniny w zakresie VIS. W ten sposób błąd związany z pigmentacją skóry można było zredukować poprzez zastosowanie urządzeń działających w SWIR. Projektowanie przyrządów optycznych jest ułatwione dzięki zrozumieniu właściwości absorpcyjnych podstawowych składników tkankowych z zakresu VIS do SWIR. W artykule opisano protokoły i oprzyrządowanie do uzyskiwania widm absorpcyjnych VIS-SWIR popularnych absorberów tkankowych: hemoglobiny utlenionej, hemoglobiny odtlenionej, melaniny, wody i lipidów.

Dane są dostępne za pośrednictwem Cyfrowego Repozytorium Materiałów Badawczych (DRMR) WUSTL doi: <a href="https://doi.org/10.7936/6RXS-108249">https://doi.org/10.7936/6RXS-108249 </a>
Charakterystyka spektralna wody 
Woda, jeden z najczęstszych biologicznych absorbentów, wykazuje charakterystyczne, silne piki absorpcji w zakresach NIR i SWIR. Piki te są na tyle intensywne, że podczas pomiaru absorbancji wody często musi ona zostać rozcieńczona wodą deuterowaną, aby zapobiec nasyceniu. Różnica w absorbancji między wodą a wodą deuterowaną została przedstawiona na Rysunku 3, co podkreśla wzrost absorbancji wody o ponad rząd wielkości w porównaniu z wodą deuterowaną. Silna absorpcja wody w zakresie SWIR utrudnia również uzyskanie widm absorpcyjnych innych absorbentów biologicznych, które zawierają wodę w próbce lub wykorzystują wodę jako rozpuszczalnik i referencję. Rozwiązaniem tego problemu może być zastosowanie wody deuterowanej zamiast zwykłej wody. Woda deuterowana działa w sposób podobny do wody, będąc jednocześnie znacznie słabszym absorbentem w zakresie SWIR, co czyni ją idealnym zamiennikiem wody w pomiarach spektroskopowych SWIR.
W celu pomiaru widma absorpcyjnego wody, jako próbkę wykorzystano wodę, a jako referencję wodę deuterowaną. Aby zapobiec nasyceniu w zakresie SWIR, próbkę w obszarze SWIR rozcieńczono wodą deuterowaną. Otrzymane widmo absorpcyjne wody wykazuje niską absorpcję w zakresie VIS, która wzrasta przy dłuższych długościach fal. Charakterystyczne piki absorpcyjne są widoczne przy około 750 nm, 970 nm, 1 200 nm oraz 1 450 nm (Rysunek 4). Uzyskane widmo wody posiada SNR wynoszący 3536,6 i zostało porównane z widmem absorpcyjnym wody opracowanym przez Hale'a i Querry'ego20, wykazując podobną krzywą absorpcji w zakresie od ~500 nm do 1 600 nm. Jednak w zakresie od 400 do 500 nm krzywe absorpcji różnią się, przy czym Hale i Querry wskazują wyższą wartość absorbancji przy krótszych długościach fal. Różnica ta może wynikać z obecności pozostałych drobnych cząstek w wodzie, które wykazują silniejsze rozpraszanie przy krótszych długościach fal w porównaniu do dłuższych3, co może podważać założenie o braku rozpraszania w pomiarach absorpcji opartych na prawie Beer-Lamberta.
Charakterystyka spektralna melaniny 
Melaninę, główny absorber optyczny skóry, scharakteryzowano spektralnie, wykorzystując jako próbkę melaninę w proszku oraz DMSO jako rozpuszczalnik i referencję. Otrzymane widmo charakteryzuje się stosunkiem sygnału do szumu (SNR) wynoszącym 172 i zostało porównane z danymi dla eumelaniny z publikacji Sarna et al.21,22 oraz Crippa et al.23 (Rysunek 5). Eumelanina jest głównym pigmentem odpowiedzialnym za kolor skóry i w związku z tym dostarcza najdokładniejszych danych na temat wpływu melaniny na urządzenia optyczne. Widmo zebrane zgodnie z opisanym tutaj protokołem wykazuje wysoką korelację z tymi wartościami literaturowymi.
Charakterystyka widmowa oleju kukurydzianego 
W celu zbadania widma absorpcyjnego lipidu wybrano olej kukurydziany ze względu na minimalne rozpraszanie optyczne w porównaniu z innymi lipidami oraz znane podobieństwo składu chemicznego do tłuszczów zwierzęcych1. Do pomiaru widma absorpcyjnego oleju kukurydzianego wykorzystano go jako próbkę, natomiast w roli referencji zastosowano powietrze. Jak pokazano na Rysunku 6, widmo oleju kukurydzianego zawiera charakterystyczne piki przy około 930 nm, 1 210 nm i 1 410 nm. Otrzymane widmo oleju kukurydzianego posiada SNR wynoszący 10363,1 i zostało nałożone na widmo oleju kukurydzianego opracowane przez Cao i wsp.1, co wykazało silną korelację.
Charakterystyka spektralna hemoglobiny utlenowanej i odtlenowanej 
Choć charakterystyka absorpcji hemoglobiny utlenowanej i odtlenowanej jest jednym z najważniejszych osiągnięć w optyce biomedycznej, ich widma absorpcyjne w zakresie od VIS do SWIR pozostają słabo poznane. Jednym z najtrudniejszych aspektów wyznaczania widma absorpcyjnego hemoglobiny utlenowanej i odtlenowanej w zakresie SWIR jest usunięcie wody z krwi, która dominuje nad stosunkowo niewielką absorpcją hemoglobiny. Aby rozdzielić absorbancję hemoglobiny i wody, hemoglobinę najpierw wyizolowano z pełnej krwi ludzkiej za pomocą wirowania, a nadsącz usunięto i zastąpiono wodą deuterowaną. Woda deuterowana została również wykorzystana jako referencja oraz rozpuszczalnik, w którym rekonstytuowano hemoglobinę w celu wywołania rozpadu hipotonicznego. Jak pokazano na Rysunku 3, woda deuterowana wykazuje znacznie niższą absorpcję optyczną niż woda, co czyni ją idealnym rozpuszczalnikiem i referencją dla pomiarów absorpcji w zakresie SWIR. Otrzymane widmo hemoglobiny utlenowanej obejmuje zakres od VIS do SWIR z SNR wynoszącym 23118.7 i bardzo ściśle pokrywa się z opublikowanym widmem hemoglobiny utlenowanej Prahl'a4 (Rysunek 7). W zakresie VIS widmo hemoglobiny utlenowanej wykazuje wysoką absorpcję z charakterystycznymi pikami absorpcyjnymi przy około 415 nm oraz podwójnym pikiem w zakresie od około 540 do 575 nm. W zakresie NIR widmo hemoglobiny utlenowanej wykazuje charakterystyczny pik obejmujący szerszy zakres długości fal, od około 800 nm do 1,100nm. W zakresie SWIR absorpcja hemoglobiny jest niska. Jednakże od około 1,400 nm do 1,600 nm widmo hemoglobiny wykazuje wyższą absorpcję z pikami, co prawdopodobnie wynika z obecności wody w hemoglobinie, której nie udało się całkowicie usunąć podczas procesu wirowania.
W celu otrzymania hemoglobiny odtlenowanej do roztworu hemoglobiny dodano ditionian sodu, aby wywołać dysocjacjętlenu z hemoglobiny utlenowanej i przekształcić próbkę w hemoglobinę odtlenowaną. Uzyskane widmo posiada SNR wynoszące 9813,9 i po porównaniu z widmem hemoglobiny odtlenowanej Prahl’a wykazuje bardzo silną korelację w zakresie od 400 nm do 1,000 nm4 (Rycina 8). Uzyskane widmo hemoglobiny odtlenowanej wykazuje charakterystyczne piki absorpcyjne przy około 430 nm, 560 nm oraz 760 nm. Następnie absorpcja hemoglobiny odtlenowanej spada, lecz występują mniejsze piki absorpcyjne w okolicach 1,200 nm oraz w zakresie od 1,400 nm do 1,600 nm. Absorbancja między 1,400 a 1,600 nm wynika prawdopodobnie z obecności wody, która nie została całkowicie usunięta z próbki hemoglobiny podczas procesu wirowania.
Porównanie absorberów biologicznych w zakresie VIS-SWIR 
Pełne widma VIS-SWIR dla wszystkich absorberów biologicznych opisanych w niniejszym protokole przedstawiono na Rysunku 9, przeskalowane na podstawie ich stężenia biologicznego w tkance2, co uwydatnia wyraźne różnice spektralne między absorberami biologicznymi. Na przykład melanina, hemoglobina utlenowana i hemoglobina odtlenowana wykazują silną, charakterystyczną absorpcję w zakresie VIS, która zazwyczaj maleje wraz ze wzrostem długości fali, podczas gdy woda i lipidy wykazują charakterystyczne piki w zakresach NIR i SWIR. W tkance biologicznej kombinacja spadku absorpcji melaniny i hemoglobiny, a także zmniejszenie rozpraszania optycznego, zapewnia zwiększoną głębokość penetracji optycznej w zakresach NIR i SWIR. Ponadto zredukowana absorpcja melaniny w zakresach NIR i SWIR umożliwia optyczne badanie hemoglobiny utlenowanej i odtlenowanej, lipidów oraz wody przy minimalnym wpływie pigmentacji skóry.
<img alt="Schemat widm absorbancji biologicznych chromoforów; melaniny, Hb, HbO2, lipidów, wody; długość fali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Wcześniej opublikowane widma powszechnie występujących biologicznych absorberów w zakresie od UV do SWIR. Widma hemoglobiny utlenowanej i odtlenowanej zostały wykreślone na podstawie danych z Prahl4. Widmo melaniny zostało wykreślone na podstawie danych z Sarna21 i Crippa23. Widmo lipidów zostało wykreślone na podstawie danych z van Veen24. Widmo wody zostało wykreślone na podstawie danych z Hale i Querry20. Skrót: SWIR = krótkofalowa podczerwień. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Próbka krwi w probówce do wirówki, analiza laboratoryjna, badania biomedyczne, diagnostyka medyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Zdjęcie nadkładu i osadu erytrocytów z odwirowanej krwi pełnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Widma absorbancji wody; wykresy logarytmiczne i liniowe; woda deuterowana i woda Milli-Q; analiza spektralna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Porównanie widm absorbancji wody i wody deuterowanej, zarejestrowanych przy identycznych ustawieniach akwizycji, w skali absorbancji logarytmicznej (lewo) i liniowej (prawo).<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres widma absorbancji wody Milli-Q; porównanie danych O'Briena i Hale'a, długość fali (nm)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Porównanie widma absorbancji wody uzyskanego metodami opisanymi w niniejszej pracy z wynikami Hale'a i Querry'ego20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres widma absorbancji melaniny; porównanie eumelaniny według OBriena z wynikami Sarny i Crippy w zakresie 400-1600 nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Porównanie widma absorbancji melaniny uzyskanego przy użyciu opisanych tutaj metod z wynikami Sarny i wsp.21,22 oraz Crippy i wsp.23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres widma absorbancji oleju kukurydzianego; długość fali vs absorbancja; porównanie analizy optycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Porównanie widma absorbancji oleju kukurydzianego uzyskanego przy użyciu opisanych tutaj metod z wynikami Cao i wsp.1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig06large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Widmo absorbancji utlenowanej hemoglobiny; wykres; długość fali vs absorbancja; analiza spektralna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Porównanie widma absorbancji utlenowanej hemoglobiny otrzymanego przy użyciu opisanych tutaj metod z wynikami Prahla4. Cechy spektralne w zakresie od 1 400 do 1 600 nm prawdopodobnie wynikają z obecności resztkowej wody w próbce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Widmo absorbancji hemoglobiny odtlenowanej, wykres, długość fali vs absorbancja, OBrien vs Prahl." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Porównanie widma absorbancji hemoglobiny odtlenowanej uzyskanego przy użyciu opisanych tutaj metod w stosunku do wyników Prahl4. Cechy widmowe w zakresie od 1,400 do 1,600 nm prawdopodobnie wynikają z obecności resztkowej wody w próbce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres widm absorbancji dla materiałów biologicznych; analiza danych właściwości optycznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67403/67403fig9v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9: Widma VIS-SWIR typowych absorberów biologicznych. Skrót: VIS-SWIR = widzialne i krótkofalowe podczerwone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67403/67403fig9v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Próbki biologiczne mają różne cechy optyczne w zakresie krótkofalowej podczerwieni (SWIR) w porównaniu do zakresu długości fal widzialnych (VIS) i bliskiej podczerwieni (NIR). Jednak rejestrowanie czystych widm absorpcyjnych SWIR jest trudne i rzadko przeprowadzane w przypadku cząsteczek biologicznych. W artykule przedstawiono metodę charakterystyki widm absorpcyjnych VIS-SWIR absorberów biologicznych.

Charakterystyka biologicznych widm absorpcyjnych obejmujących zakres od światła widzialnego do krótkofalowej podczerwieni

For noninvasive light-based physiological monitoring, optimal wavelengths of individual tissue components can be identified using absorption spectroscopy. ...

Nasze laboratorium opracowuje narzędzia oparte na świetle, które dostarczają informacji diagnostycznych do zastosowań związanych ze zdrowiem matek. Często korzystamy ze spektroskopii optycznej ze względu na mnóstwo informacji związanych ze zdrowiem, które może dostarczyć w sposób nieinwazyjny, takich jak monitorowanie natlenienia krwi i stężenia hemoglobiny, które są ważnymi parametrami fizjologicznymi, które należy monitorować w czasie ciąży. Niektóre rozpuszczalniki w cząstek stałych mają silną absorpcję, która może przyćmić interesujące nas substancje rozpuszczone.Co więcej, widma obejmujące obszar VIS-SWIR często mają duże różnice w absorpcji w różnych zakresach długości fal i musimy zmienić ustawienia eksperymentalne dla różnych regionów, aby uzyskać wysokie widma SNL. Trudności w pozyskiwaniu widm biologicznych VIS-SWIR przyczyniły się do ograniczonej liczby publikowanych widm absorpcji biologicznej, a my staramy się uprościć ten proces. Ponadto lepsze zrozumienie specyficznych cech spektralnych każdego składnika biologicznego pomoże wybrać zoptymalizowane długości fal, które mogą zminimalizować odchylenie pigmentacji skóry spowodowane silną absorpcją melaniny.Mamy nadzieję, że nasz protokół umożliwi naukowcom rozszerzenie obecnej biblioteki absorberów biologicznych VIS-SWIR. Wyniki te podkreślają również wpływ melaniny na urządzenia optyczne w funkcji długości fali i mogą być wykorzystane do projektowania systemów o minimalnym odchyleniu pigmentacji skóry, takich jak SWIR. Aby przygotować natlenioną próbkę hemoglobiny z pełną heparyną ludzką krwią, należy odpipetować 1,8 mililitra krwi do mikroprobówki wirówkowej.Odwirować probówkę o sile 9,6 g przez 10 minut i wyrzucić około 850 mikrolitrów supernatantu bez naruszania osadu. Rozpuść osad w około 850 mikrolitrach zdeuterowanej wody i ponownie odwiruj przy 9,6 g przez 10 minut. Po ostatnim odwirowaniu, w celu lizy czerwonych krwinek, rozpuść granulki czerwonych krwinek w 4,5 mililitra deuterowanej wody.Jeśli osad przylega do tuby, spłucz go porcją zdeuterowanej wody, aby go poluzować. Za pomocą końcówki igły i strzykawki usunąć zlizowany roztwór krwi z probówki. Następnie odłączyć igłę z końcówką od strzykawki i wyrzucić ją do pojemnika na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne.Następnie podłącz filtr strzykawkowy 0,22 mikrometra do strzykawki i przefiltruj zawartość do ścieżki o długości 10 milimetrów, szkła o pojemności 3,5 mililitra lub kuwety kwarcowej. Zabezpiecz kuwetę hermetycznym korkiem, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Owiń Parafilm wokół korka, aby zapewnić całkowicie szczelne zamknięcie.Przygotuj odniesienie, napełniając czystą kuwetę o tej samej ścieżce, długości i objętości wodą deuterowaną do pomiarów podstawowych i referencyjnych. Aby przygotować odtlenioną próbkę hemoglobiny, dodaj ditionian sodu do roztworu krwi w kuwecie. Zabezpiecz kuwetę hermetycznym korkiem i owiń Parafilm wokół korka, aby zapewnić hermetyczne zamknięcie.Ostrożnie przechylaj kuwetę z boku na bok, aż ditionian sodu całkowicie się rozpuści. Obserwuj zmianę koloru roztworu krwi z czerwonego na ciemniejszy fioletowoczerwony. Aby rozpocząć, włącz lampę spektrometru i detektory, pozwalając systemowi rozgrzać się przez 5 do 20 minut.Wyczyść kuwety etanolem za pomocą Kimwipe. W przypadku spektrometru dwuwiązkowego należy umieścić kuwety wypełnione deuterowaną wodą jako roztwór odniesienia zarówno w komorze próbki, jak i w komorze referencyjnej. Wybierz odpowiedni zakres długości fali i detektor w oparciu o mierzony obszar widma.Uzyskaj pomiary referencyjne przy użyciu parametrów domyślnych. Następnie zastąp kuwetę w komorze na próbkę kuwetą zawierającą natlenioną hemoglobinę. Przełącz na tryb Live, aby view absorbancja w sposób ciągły podczas dostrajania parametrów pomiaru.Zaczynając od domyślnych parametrów spektrometru, dostosuj odczyty na punkt odniesienia i szerokość pasma, aby uzyskać jakościowo czyste widmo absorpcyjne bez nasycenia. Jeśli modyfikacja mocy światła padającego, szerokości pasma, czasu ekspozycji i odczytów na odniesienie nie spowoduje uzyskania wysokiego stosunku sygnału do szumu, należy zmienić stężenie próbki, umieszczając kuwetę referencyjną w próbce lub komorze referencyjnej lub długość drogi próbki i odniesienie, aby uzyskać widmo o wysokim stosunku sygnału do szumu. Po zoptymalizowaniu ustawień dla próbki udokumentuj ustawienia dla każdego uzyskanego widma.Korzystając ze zoptymalizowanych ustawień, należy ponownie zmierzyć przy użyciu tych samych ustawień z roztworem referencyjnym w komorze referencyjnej i komorze na próbki, aby uzyskać zoptymalizowany pomiar referencyjny. Następnie zastąp kuwetę referencyjną w komorze na próbkę natlenionej próbki hemoglobiny i wykonaj zoptymalizowany pomiar próbki. Zapisz oddzielnie zarówno pomiary referencyjne, jak i sample pomiarowe.Korzystając z poniższego równania, oblicz absorbancję A, traktując pomiar referencyjny jako I0, a pomiar próbki jako I.Do przetwarzania końcowego otwórz oprogramowanie do analizy danych, takie jak MATLAB, i załaduj pomiary absorbancji uzyskane z różnych regionów widma. Zastosuj współczynnik mnożenia do jednego obszaru spektralnego, aby zszyć ze sobą różne obszary o różnych stężeniach próbki lub długościach ścieżek. Widmo hemoglobiny natlenionej wykazało silną korelację z widmem opublikowanym przez Prahla, z wyraźnymi pikami absorpcji na poziomie 415 nanometrów i dubletem między 540 a 575 nanometrami w obszarze widzialnym, wraz z szeroką cechą absorpcji między 800 a 1,100 nanometra w bliskiej podczerwieni.W obszarze podczerwieni krótkofalowej. Widmo hemoglobiny natlenionej wykazało niską absorpcję, prawdopodobnie z powodu resztkowej zawartości wody. Widmo hemoglobiny odtlenionej wykazywało silną korelację ze widmem Prahla, charakteryzując się wyraźnymi pikami o długości 430 nanometrów, 560 nanometrów i 760 nanometrach oraz mniejszymi pikami około 1200 nanometrów i od 1400 do 1600 nanometrów.

characterization-biological-absorption-spectra-spanning-visible-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

SOM leży u podstaw wielu funkcji i procesów glebowych, ale jego charakterystyka za pomocą spektroskopii FTIR jest często kwestionowana przez zakłócenia mineralne. Opisana metoda może zwiększyć użyteczność analizy SOM za pomocą spektroskopii FTIR poprzez odejmowanie zakłóceń mineralnych w widmach glebowych za pomocą empirycznie uzyskanych widm referencyjnych minerałów.

Poprawa charakterystyki materii organicznej gleby za pomocą spektroskopii w podczerwieni za pomocą odejmowania spektralnego

Niniejszym przedstawiamy przewodnik krok po kroku, prezentujący przeznaczenie, zasadę działania oraz reprezentatywne wyniki uzyskiwane za pomocą nowatorskiego spektrometru siły grawitacyjnej.

Demonstracja zastosowań nowatorskiego spektrometru sił grawitacyjnych do rozciągania i pomiaru białek włóknistych

Fluorescencyjne nanocząsteczki wytwarzane w naszym laboratorium są wykorzystywane do obrazowania stężeń jonów i strumieni jonowych w systemach biologicznych, takich jak komórki podczas sygnalizacji oraz płyn śródmiąższowy podczas homeostazy fizjologicznej.

Nanocząstki fluorescencyjne do pomiaru stężenia jonów w systemach biologicznych

Zaprojektowano cykliczny bioreaktor ciśnieniowy, który umożliwia poddawanie tkanki zastawek serca fizjologicznym oraz patologicznym warunkom ciśnieniowym. Program LabVIEW pozwala użytkownikom na kontrolowanie wartości, amplitudy oraz częstotliwości ciśnienia. Urządzenie to może być wykorzystywane do badania mechanobiologii tkanki zastawek serca lub izolowanych komórek.

Projekt cyklicznego bioreaktora ciśnieniowego do badań ex vivo zastawek tętniczych serca

Koloidy złota stabilizowane alkanotiolanami, znane jako klastry chronione monowarstwą (MPCs), są syntetyzowane, charakteryzowane i montowane w cienkie filmy służące jako interfejs adsorpcyjny dla elektrochemii monowarstw białkowych w przypadku prostych białek redoks, takich jak azuryna (AZ) z Pseudomonas aeruginosa oraz cytochrom c (cyt c).

Synteza, montaż i charakterystyka filmów z nanocząsteczek złota chronionych monowarstwą do elektrochemii monowarstw białek

Pomimo wyjątkowych właściwości mechanicznych i biochemicznych jedwabiu pająków, materiał ten nie może być pozyskiwany w dużych ilościach metodami konwencjonalnymi. W niniejszej pracy opisujemy efektywną strategię przędzenia sztucznych włókien jedwabiu pająka, co stanowi istotny proces dla badaczy analizujących produkcję jedwabiu pająków oraz jego zastosowanie jako biomateriałów nowej generacji.

Produkcja syntetycznego jedwabiu pajęczego w skali laboratoryjnej

Dwuwymiarowa metoda chromatografii gazowej z czasem przelotu jest opisana do charakterystyki wodnej frakcji bioropy powstałej w wyniku hydrotermalnego upłynniania glonów. Protokół ten może być również stosowany do analizy frakcji wodnej produktów ciekłych z szybkiej pirolizy, szybkiej pirolizy katalitycznej, katalitycznego odtleniania i hydrorafinacji.

Charakterystyka jakościowa frakcji wodnej z hydrotermalnego skraplania glonów przy użyciu chromatografii gazowej 2D ze spektrometrią mas czasu przelotu

Opisano protokół wytwarzania plastikowych urządzeń mikroprzepływowych z przezroczystymi otworami do obrazowania światłem widzialnym i podczerwonym.

Miękka procedura litograficzna do wytwarzania plastikowych urządzeń mikroprzepływowych z otworami widokowymi przezroczystymi dla światła widzialnego i podczerwonego

Wykrywanie endotoksyn w nanomateriałach inżynieryjnych stanowi jedno z największych wyzwań w dziedzinie nanomedycyny. W tym miejscu przedstawiamy studium przypadku, które opisuje ramy składające się z trzech różnych formatów LAL w celu oszacowania potencjalnego zanieczyszczenia endotoksynami w nanocząstkach.

Wykrywanie endotoksyn w nanopreparatach za pomocą testów lizatu amebocytów limulusa (LAL)

Opisana jest niezawodna i łatwo odtwarzalna metoda przygotowania funkcjonalnych, emitujących światło podczerwone fotoluminescencyjnych nanoklastrów złota i ich bezpośredniego wykrywania wewnątrz komórek HeLa za pomocą cytometrii przepływowej i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Synteza nanoklastrów złota emitujących promieniowanie bliskiej podczerwieni do zastosowań biologicznych

Poznaj metodę charakteryzacji widm absorpcyjnych VIS-SWIR biologicznych absorberów przy użyciu spektroskopii optycznej. Protokół ten umożliwia rozwój narzędzi diagnostycznych w zdrowiu matczynym.

Charakterystyka biologicznych widm absorpcyjnych obejmujących zakres od światła widzialnego do krótkofalowej podczerwieni

Przeglądaj więcej filmów