Charakterystyka biologicznych widm absorpcyjnych obejmujących zakres od światła widzialnego do krótkofalowej podczerwieni

Nasze laboratorium opracowuje narzędzia oparte na świetle, które dostarczają informacji diagnostycznych do zastosowań związanych ze zdrowiem matek. Często korzystamy ze spektroskopii optycznej ze względu na mnóstwo informacji związanych ze zdrowiem, które może dostarczyć w sposób nieinwazyjny, takich jak monitorowanie natlenienia krwi i stężenia hemoglobiny, które są ważnymi parametrami fizjologicznymi, które należy monitorować w czasie ciąży. Niektóre rozpuszczalniki w cząstek stałych mają silną absorpcję, która może przyćmić interesujące nas substancje rozpuszczone.

Co więcej, widma obejmujące obszar VIS-SWIR często mają duże różnice w absorpcji w różnych zakresach długości fal i musimy zmienić ustawienia eksperymentalne dla różnych regionów, aby uzyskać wysokie widma SNL. Trudności w pozyskiwaniu widm biologicznych VIS-SWIR przyczyniły się do ograniczonej liczby publikowanych widm absorpcji biologicznej, a my staramy się uprościć ten proces. Ponadto lepsze zrozumienie specyficznych cech spektralnych każdego składnika biologicznego pomoże wybrać zoptymalizowane długości fal, które mogą zminimalizować odchylenie pigmentacji skóry spowodowane silną absorpcją melaniny.

Mamy nadzieję, że nasz protokół umożliwi naukowcom rozszerzenie obecnej biblioteki absorberów biologicznych VIS-SWIR. Wyniki te podkreślają również wpływ melaniny na urządzenia optyczne w funkcji długości fali i mogą być wykorzystane do projektowania systemów o minimalnym odchyleniu pigmentacji skóry, takich jak SWIR. Aby przygotować natlenioną próbkę hemoglobiny z pełną heparyną ludzką krwią, należy odpipetować 1,8 mililitra krwi do mikroprobówki wirówkowej.

Odwirować probówkę o sile 9,6 g przez 10 minut i wyrzucić około 850 mikrolitrów supernatantu bez naruszania osadu. Rozpuść osad w około 850 mikrolitrach zdeuterowanej wody i ponownie odwiruj przy 9,6 g przez 10 minut. Po ostatnim odwirowaniu, w celu lizy czerwonych krwinek, rozpuść granulki czerwonych krwinek w 4,5 mililitra deuterowanej wody.

Jeśli osad przylega do tuby, spłucz go porcją zdeuterowanej wody, aby go poluzować. Za pomocą końcówki igły i strzykawki usunąć zlizowany roztwór krwi z probówki. Następnie odłączyć igłę z końcówką od strzykawki i wyrzucić ją do pojemnika na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne.

Następnie podłącz filtr strzykawkowy 0,22 mikrometra do strzykawki i przefiltruj zawartość do ścieżki o długości 10 milimetrów, szkła o pojemności 3,5 mililitra lub kuwety kwarcowej. Zabezpiecz kuwetę hermetycznym korkiem, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Owiń Parafilm wokół korka, aby zapewnić całkowicie szczelne zamknięcie.

Przygotuj odniesienie, napełniając czystą kuwetę o tej samej ścieżce, długości i objętości wodą deuterowaną do pomiarów podstawowych i referencyjnych. Aby przygotować odtlenioną próbkę hemoglobiny, dodaj ditionian sodu do roztworu krwi w kuwecie. Zabezpiecz kuwetę hermetycznym korkiem i owiń Parafilm wokół korka, aby zapewnić hermetyczne zamknięcie.

Ostrożnie przechylaj kuwetę z boku na bok, aż ditionian sodu całkowicie się rozpuści. Obserwuj zmianę koloru roztworu krwi z czerwonego na ciemniejszy fioletowoczerwony. Aby rozpocząć, włącz lampę spektrometru i detektory, pozwalając systemowi rozgrzać się przez 5 do 20 minut.

Wyczyść kuwety etanolem za pomocą Kimwipe. W przypadku spektrometru dwuwiązkowego należy umieścić kuwety wypełnione deuterowaną wodą jako roztwór odniesienia zarówno w komorze próbki, jak i w komorze referencyjnej. Wybierz odpowiedni zakres długości fali i detektor w oparciu o mierzony obszar widma.

Uzyskaj pomiary referencyjne przy użyciu parametrów domyślnych. Następnie zastąp kuwetę w komorze na próbkę kuwetą zawierającą natlenioną hemoglobinę. Przełącz na tryb Live, aby view absorbancja w sposób ciągły podczas dostrajania parametrów pomiaru.

Zaczynając od domyślnych parametrów spektrometru, dostosuj odczyty na punkt odniesienia i szerokość pasma, aby uzyskać jakościowo czyste widmo absorpcyjne bez nasycenia. Jeśli modyfikacja mocy światła padającego, szerokości pasma, czasu ekspozycji i odczytów na odniesienie nie spowoduje uzyskania wysokiego stosunku sygnału do szumu, należy zmienić stężenie próbki, umieszczając kuwetę referencyjną w próbce lub komorze referencyjnej lub długość drogi próbki i odniesienie, aby uzyskać widmo o wysokim stosunku sygnału do szumu. Po zoptymalizowaniu ustawień dla próbki udokumentuj ustawienia dla każdego uzyskanego widma.

Korzystając ze zoptymalizowanych ustawień, należy ponownie zmierzyć przy użyciu tych samych ustawień z roztworem referencyjnym w komorze referencyjnej i komorze na próbki, aby uzyskać zoptymalizowany pomiar referencyjny. Następnie zastąp kuwetę referencyjną w komorze na próbkę natlenionej próbki hemoglobiny i wykonaj zoptymalizowany pomiar próbki. Zapisz oddzielnie zarówno pomiary referencyjne, jak i sample pomiarowe.

Korzystając z poniższego równania, oblicz absorbancję A, traktując pomiar referencyjny jako I0, a pomiar próbki jako I.Do przetwarzania końcowego otwórz oprogramowanie do analizy danych, takie jak MATLAB, i załaduj pomiary absorbancji uzyskane z różnych regionów widma. Zastosuj współczynnik mnożenia do jednego obszaru spektralnego, aby zszyć ze sobą różne obszary o różnych stężeniach próbki lub długościach ścieżek. Widmo hemoglobiny natlenionej wykazało silną korelację z widmem opublikowanym przez Prahla, z wyraźnymi pikami absorpcji na poziomie 415 nanometrów i dubletem między 540 a 575 nanometrami w obszarze widzialnym, wraz z szeroką cechą absorpcji między 800 a 1,100 nanometra w bliskiej podczerwieni.

W obszarze podczerwieni krótkofalowej. Widmo hemoglobiny natlenionej wykazało niską absorpcję, prawdopodobnie z powodu resztkowej zawartości wody. Widmo hemoglobiny odtlenionej wykazywało silną korelację ze widmem Prahla, charakteryzując się wyraźnymi pikami o długości 430 nanometrów, 560 nanometrów i 760 nanometrach oraz mniejszymi pikami około 1200 nanometrów i od 1400 do 1600 nanometrów.