Name: Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj metodę glikoproteomiki sterowanej glikomiką do kompleksowego profilowania glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych. Ta technika umożliwia dokładną analizę struktur glikoprotein.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

THC jest wspierane przez Stypendium Międzynarodowego Programu Szkoleń Badawczych ufundowane przez rząd australijski. NB jest wspierany przez Międzynarodowe Stypendia Doskonałości Badawczej Uniwersytetu Macquarie ufundowane przez Uniwersytet Macquarie. AC jest wspierany przez stypendium Research Training Program ufundowane przez rząd australijski. RK był wspierany przez Instytut Raka Nowej Południowej Walii (ECF181259). MTA jest laureatem stypendium Australian Research Council Future Fellowship (FT210100455).

Profiling of Colorectal Cancer Tissues Using Glycomics-Guided Glycoproteomics

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Krytyczne kroki w protokole W tym artykule protokolarnym przedstawiliśmy krok po kroku metodę glikoproteomiki sterowanej glikoproteomem, która zapewnia kompleksowy wgląd w heterogeniczność i dynamikę glikoproteomu w kompleksie TME.
Krytycznym krokiem w protokole jest zapewnienie całkowitej proteolizy bez nadmiernego trawienia mieszanki białek. Niespecyficzne rozszczepienia białek z natury zwiększają przestrzeń wyszukiwania peptydów, co prowadzi do dłuższego czasu wyszukiw...

Glikozylacja białek jest powszechnym i złożonym rodzajem modyfikacji ko- i potranslacyjnych białek wytwarzanych przez gatunki na całym drzewie filogenetycznym życia1,2,3. Wiadomo, że glikany związane z białkami wpływają na szeroki zakres procesów biologicznych istotnych dla zdrowia ludzi, w tym na mediację i regulację oddziaływań komórkowych oraz zdarzeń komunikacyjnych4,5. Przypuszcza się, że aberracyjna glikozylacja białek jest przyczyną transformacji złośliwej, progresji i rozprzestrzeniania się nowotworów6,7,8. Wskazuje to na udział glikanów w kluczowych procesach tumorigennych w mikrośrodowisku guza (TME) i oferuje znaczny, w dużej mierze niewykorzystany potencjał w odkrywaniu biomarkerów opartych na glikanach oraz w zastosowaniach terapeutycznych. Glikobiologia zyskuje zatem coraz większą uwagę w badaniach nad rakiem oraz w naukach o życiu9.
Dzięki kluczowym osiągnięciom w dziedzinie glikoanalityki i informatyki z ostatniej dekady10,11,12,13,14,15,16,17, glikomika i glikoproteomika oparta na cieczowej chromatografii sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) stały się potężnymi narzędziami do systemowego profilowania uwolnionych glikanów i nienaruszonych glikopeptydów z kompleksowych mieszanin glikoprotein ekstrahowanych bezpośrednio z próbek biologicznych, takich jak różne rodzaje preparatów od pacjentów onkologicznych (np. tkanki nowotworowe, populacje komórek, płyny ustrojowe)3,13,18,19,20.
Glikomika dostarcza informacji o strukturze i ilości zestawu glikanów (glikomu), który jest dynamicznie wytwarzany przez komórki, tkanki, a nawet całe organizmy. Z drugiej strony, glikoproteomika dostarcza ilościowych informacji o białkach nośnikach i ich miejscach glikozylacji, stopniu zajętości tych miejsc (makro-heterogeniczność), składzie glikanów w konkretnych miejscach oraz wzorcu ich rozmieszczenia (mikro-heterogeniczność), przy ograniczonej informacji o strukturze glikanów (często ograniczonej do składu glikanów)15,16,21. Zatem glikomika i glikoproteomika są komplementarnymi podejściami do badania szczegółów biochemicznych glikoproteomu22.
W laboratoriach opracowano i zastosowano szereg projektów metodologicznych i strategii analitycznych w glikomice i glikoproteomice, w zależności od badanego glikoanalitu (np. wiązania N-/O-/C-, glikanu/glikopeptydu/glikoproteiny, znakowanego/nieznakowanego), charakteru próbki (np. komórki, tkanki, płyny ustrojowe), jej ilości (poziomy białka rzędu nanogramów/mikrogramów/miligramów) oraz dostępnego instrumentu analitycznego23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Pomimo uznanych korzyści wynikających z ich równoległego stosowania, glikomika i glikoproteomika nie są powszechnie stosowane wspólnie, lecz raczej&#160;jako odrębne podejścia w badaniach z zakresu glikobiologii i nowotworów, ze względu na wysokie wymagania dotyczące wiedzy analitycznej oraz specjalistycznej aparatury.
Dostrzegając tę lukę technologiczną, ponad dekadę temu wprowadziliśmy metodę glikoproteomiki wspomaganej glikomiką, która umożliwia integrację danych z glikomiki i glikoproteomiki uzyskanych ze złożonych próbek biologicznych33. W skrócie, technologia glikoproteomiki wspomaganej glikomiką (lub sterowanej glikomiką, jak w niniejszym protokole) profiluje N- i/lub O-glikany za pomocą uznanej metody LC-MS/MS z wykorzystaniem porowatego grafitowanego węgla (PGC)34,35, które są następnie wykorzystywane do analizy danych nienaruszonych N- i/lub O-glikopeptydów pozyskanych z tej samej próbki (próbek) poprzez zdefiniowanie granic przestrzeni przeszukiwania glikanów36. PGC-LC-MS/MS jest szczególnie potężną metodą glikomiczną, ponieważ zapewnia ilościowy wgląd w glikom z wysoką czułością i rozdzielczością strukturalną, dostarczając informacji o topologii (sekwencji monosacharydów i wzorcu rozgałęzień) oraz wiązaniach glikozydowych glikanów nawet w złożonych mieszaninach35,37,38. Przepływ pracy w glikoproteomice obejmuje generowanie peptydów, opcjonalne znakowanie peptydów, multipleksowanie i prefrakcjonowanie, a także wzbogacanie przed analizą LC-MS/MS w fazie odwróconej, w której idealnie stosuje się różne metody fragmentacji, w tym stopniową energię kolizyjną/dysocjację kolizyjną o wysokiej energii (sceHCD dla N-glikopeptydów) oraz transfer elektronów/dysocjację kolizyjną o wysokiej energii (EThcD dla O-glikopeptydów) w celu identyfikacji analitów. W przypadku analizy N-glikoproteomu, równoległa de-N-glikoproteomika może sterować analizą danych nienaruszonych N-glikopeptydów poprzez zdefiniowanie przestrzeni przeszukiwania białek/peptydów oraz dostarczenie szczegółowych informacji na temat zajętych miejsc N-glikozylacji i stopnia ich zajęcia, podczas gdy równoległa analiza peptydów niemodyfikowanych ujawnia wszelkie zmiany na poziomie białek pomiędzy badanymi warunkami.
Niniejsza praca przedstawia szczegółowy i łatwy do naśladowania protokół krok po kroku dla metody glikoproteomiki kierowanej glikomiką (przegląd schematu postępowania znajduje się na Rysunku 1). Protokół zawiera szczegóły eksperymentalne dotyczące etapów przygotowania próbek oraz eksperymentów glikomiki i glikoproteomiki opartych na LC-MS/MS, a także prezentuje reprezentatywne wyniki demonstrujące zastosowanie tej metody do przekrojów tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) z guzów wyciętych u pacjentów z rakiem jelita grubego (CRC), co pozwala na uzyskanie wglądu w glikobiologię TME w cennym typie próbek archiwizowanych w biobankach nowotworowych na całym świecie. Krótko omówiono również analizę i integrację danych glikomiki i glikoproteomiki.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67405/67405fig01v2.jpg" /> 
Rysunek 1:&#160;Przegląd metody glikoproteomiki kierowanej glikomiką. Schemat przedstawia szczegółowe kroki eksperymentalne w procesach glikomiki (po lewej) i glikoproteomiki (po prawej), wraz z zestawieniem uzyskanych informacji (pogrubione) oraz sposobem integracji obu podejść poprzez ulepszoną analizę i interpretację danych. Wstawka: Własnoręcznie wykonane mikrokolumny SPE użyte w procesach (i) glikomiki oraz (ii-iii) glikoproteomiki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67405/67405fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td><silny>Chemikalia</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>octan amonu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1542</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu, czystość &ge; 99.0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Bezwodny acetonitryl (ACN), klasa LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Płod bydlęcy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3004</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy, klasa LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>00940</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A6283</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1775</td><td>Dostępne</td></tr> <tr><td>alternatywyPeptydo-N-glikozydaza F (PNGaza F)</td><td>Promega</td><td>V4831</td><td>Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/&mu; L) rekombinacyjnie wyrażany w Escherichia coli&nbsp;</td></tr><tr><td>Poliwinylopirolidon 40 (PVP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PVP40</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484016</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Trypsyna wieprzowa do sekwencjonowania&nbsp;</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Borowodorek sodu (NaBH4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213462</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Wodorowęglan trietyloamonu (TEAB), klasa LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA), klasa LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td>Dostępne</td></tr> <tr><td>alternatywyNarzędzia/Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 dyski</td><td>Empore</td><td>66883-U</td><td></td></tr><tr><td>Dyski C8</td><td>Empore</td><td>66882-U</td><td></td></tr><tr><td>Płaskodenna płytka 96-dołkowa z polipropylenu płaskim&nbsp;</td><td>Membrana z</td> polifluorku winylidenu (PVDF) Corning <td>3364</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-PSQ</td><td>Milipory</td><td>IPVH20200</td><td>Wielkość porów: 0,45 &mu; m&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5452000069</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Adaptery do mikrowirówek&nbsp;</td><td>The Nest Group, Inc., Obroża</td> kolumny MA <td>SS18V</td><td>MiniSpin, jest dostarczana z żywicą Microspin Columns</td></tr><tr><td>Oligo R3</td><td>Thermo</td><td>1133903</td><td>Wielkość cząstek 30 i mu; m</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Probówki białkowe LoBind 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030108450</td><td></td></tr><tr><td>Probówki białkowe LoBind 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030108442</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Safe-lock 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Safe-lock 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>5382000066</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Dziurkacz jednootworowy</td><td>Swingline</td><td>74005</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator SpeedVac</td><td>Martin Christ</td><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>Dostępne alternatywy Żywica</td></tr><tr><td>Supelclean ENVI-Carb SPE</td><td>Supelco</td><td>57088</td><td>Wielkość cząstek 120-400 oczek. Żywica może być ręcznie ekstrahowana z wkładów i może być przechowywana przez długi czas w 50% (v/v) metanolu w wodzie MilliQ</td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z116866</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Inkubator z kontrolowaną temperaturą</td><td>Thermoline</td><td>E7.30</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa</td><td>Unisonics</td><td>FXP</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Żywica ZIC-HILIC</td><td>Merck</td><td>150455</td><td>Wielkość cząstek/porów, 5 &mu; m/200 &Aring;. Żywica może być ręcznie ekstrahowana z kolumny LC i może być przechowywana przez długi czas w 50% (v/v) metanolu w</td></tr><tr><td>mikrokolumnach MilliQ do ekstrakcji do fazy stałej (SPE) ZipTip C18&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>Alternatywnie, domowe mikrokolumny C18-SPE mogą zastąpić produkt komercyjny</td></tr> <tr><td>LC-MS/MS Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity Kapilarny system HPLC&nbsp;</td>Dostępne <td>alternatywy</td> <td>Agilent</td><td></td></tr><tr><td>Analityczna kolumna LC wstępnie wypełniona żywicą ReproSil-Pur C18 AQ</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Niemcy</td><td>r13.aq.s2570</td><td>Wielkość cząstek/porów: 3 i mu; m/120 &Aring;, długość/średnica wewnętrzna: 25 cm/75 &mu;m. Dostępne są również komercyjne kolumny C18 nano-LC/&nbsp;</td></tr><tr><td>System Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC&nbsp;</td>Dostępne <td>alternatywy</td> <td>termiczne</td><td></td></tr><tr><td>HiperCarb KAPPA PGC kapilarna kolumna LC&nbsp;</td><td>Przerwane termicznie</td><td></td><td>Wielkość cząstek/porów, 3 i mu; m/250 & Aring; długość kolumny, 30 mm; Średnica wewnętrzna, 0,180 mm. Większe geometrie kolumn HyperCarb PGC-LC, dające dane o podobnej jakości, są dostępne na rynku (np. Thermo #35003-031030). Kolumna SupelTMCarb LC firmy Merck o wielkości cząstek/porów, 2,7 &mu; Dostępne są również m/200 i o różnych długościach kolumn i średnicy wewnętrznej (np. Merck #59994-U).&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetonitryl klasy LCMS</td><td>LiChrosolv</td><td>100029</td><td>Dostępne alternatywy Liniowy</td></tr><tr><td>kwadrupol pułapkowy (LTQ) Spektrometr masowy z pułapką jonową Velos Pro (glikomy)&nbsp;</td>Dostępne <td>alternatywy</td> <td>termiczne</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (glikoproteomika)</td><td>Thermo</td><td></td><td>Dostępne są również inne systemy MS o wysokiej rozdzielczości z ETD lub bez (wymagane tylko dla O-glikoproteomiki) (np. Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker lub podobne wysokowydajne spektrometry masowe innych dostawców)</td></tr><tr><td>Fiolki z przezroczystą szklanką Total Recovery 0,9 ml</td><td>Thermo</td><td>THC11093563</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Fiolki z zakrętką Total Recovery Clear Glass pasujące nakrętki</td><td>Thermo</td><td>THC09150869</td><td>Dostępne alternatywy</td></tr><tr><td>Kolumna Trap LC pakowana we własnym zakresie z żywicą ReproSil-Pur C18 AQ&nbsp;</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Niemcy</td><td>r15.aq.s0202</td><td>Wielkość cząstek/porów: 5 &mu; m/120 &Aring;, długość/średnica wewnętrzna: 2 cm/100 &mu;m. Dostępne są również komercyjne kolumny LC z pułapką C18.&nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Byonic</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>w wersji 2.6.46 lub nowszej</td><td>Komercyjna wyszukiwarka glikopeptydów i PTM, akceptująca surowe dane LC-MS/MS od większości dostawców MS</td></tr><tr><td>Byos</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>w wersji 3.9-7 lub nowszej</td><td>Komercyjne oprogramowanie do ręcznej kontroli kandydatów na glikopeptydy i automatycznej adnotacji widm glikanów MS/MS</td></tr><tr><td>GlycoMod</td><td>Expasy</td><td></td><td>Oprogramowanie otwartego dostępu, wspomagające adnotację danych glikomiksowych (https://web.expasy.org/glycomod/)</td></tr><tr><td>GlycoWorkBench</td><td>EUROCarbDB</td><td>v2.1</td><td>Oprogramowanie o otwartym dostępie, wspomagające adnotację danych glikomiksowych i rysowanie kreskówek glikanowych</td></tr><tr><td>RawMeat</td><td>VAST Scientific</td><td>v2.1</td><td>Oprogramowanie o otwartym dostępie, wyodrębniające m/z jonów prekursorowych glikanów z surowych danych spektralnych</td></tr><tr><td>Skyline</td><td>Brendan X. MacLean</td><td>v21.2 lub nowszy</td><td>Otwarte oprogramowanie do względnego oznaczania ilościowego glikanów</td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>Thermo</td><td>v2.2 lub nowszy</td><td>Do przeglądania surowych danych LC-MS/MS</td></tr></tbody></table>

glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

Glikozylacja jest powszechną i strukturalnie zróżnicowaną modyfikacją białka, która wpływa na szeroki zakres procesów rakotwórczych. Glikomika i glikoproteomika sterowane spektrometrią mas okazały się potężnymi podejściami do analizy odpowiednio uwolnionych glikanów i nienaruszonych glikopeptydów, oferując głębsze zrozumienie heterogenicznego glikoproteomu w mikrośrodowisku guza (TME). Protokół ten szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną glikomikiem, zintegrowaną technologię omiczną, która po pierwsze wykorzystuje porowate grafityzowane glikomiki na bazie węgla LC-MS / MS w celu wyjaśnienia struktur glikanów i ich ilościowego rozmieszczenia w glikocie badanych tkanek nowotworowych, populacji komórek lub płynów ustrojowych. Pozwala to na porównawczą analizę glikomiczną w celu zidentyfikowania zmienionej glikozylacji w różnych grupach pacjentów, stadiach choroby lub stanach i, co ważne, służy usprawnieniu dalszej analizy glikoproteomicznej tej samej próbki (próbek) poprzez utworzenie biblioteki znanych struktur glikanów, skracając w ten sposób czas wyszukiwania danych i wskaźnik błędnej identyfikacji glikoproteiny. Koncentrując się na profilowaniu N-glikoproteomu, w niniejszym protokole szczegółowo opisano etapy przygotowania próbki do metody glikoproteomiki sterowanej glikomikiem oraz omówiono kluczowe aspekty gromadzenia i analizy danych. Metoda glikoproteomiki sterowana glikokomiką dostarcza ilościowych informacji na temat glikoprotein obecnych w TME i ich miejsc glikozylacji, zajętości miejsc i specyficznych dla danego miejsca struktur glikanów. Przedstawiono reprezentatywne wyniki badań nad tkankami nowotworowymi zatopionymi w parafinie utrwalonymi w formalinie od pacjentów z rakiem jelita grubego, co pokazuje, że metoda jest czuła i kompatybilna z wycinkami tkanek powszechnie znajdującymi się w biobankach. Glikoproteomika sterowana glikomiką oferuje zatem kompleksowe spojrzenie na niejednorodność i dynamikę glikoproteomu w złożonych TME, generując solidne dane biochemiczne niezbędne do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

W tej sekcji przedstawiono reprezentatywne wyniki metody glikoproteomiki kierowanej glikomiką, zastosowanej do preparatu tkankowego FFPE pobranego od pacjenta z rakiem jelita grubego (CRC) w stopniu II.
Aby uzyskać wystarczającą ilość materiału białkowego na potrzeby protokołu, połączono ekstrakty białkowe z dwóch slajdów (stosów z) pochodzących z tego samego bloku tkankowego FFPE, zgodnie z opublikowanym protokołem, a w celu zwiększenia czułości eksperymentu glikoproteomicznego zastosowano me...

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną przez glikomikę, zintegrowaną technologię omiczną, która oferuje wszechstronny wgląd w heterogeniczny glikoproteom w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych, niezbędny do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven ...

Badamy więc węglowodany złożone, czyli glikany, we wrodzonym układzie odpornościowym i zaburzeniach związanych z odpornością, koncentrując się obecnie na sepsie i nowotworach. Nasza praca obejmuje metody analityczne i systemy glikobiologii, w tym metody glikomiksowe i glikoproteomiczne, w celu szczegółowej charakterystyki ludzkiej glikoproteiny. W ciągu ostatnich dziesięcioleci w glikoproteomice nastąpił ogromny postęp, a postęp nie jest już ograniczony przez niedobór dostępnych wysokiej jakości danych ze spektrometrii mas.Wyzwaniem jest raczej interpretacja i wygenerowanie wiedzy biologicznej na podstawie danych spektralnych. Metoda glikoproteomiki sterowana glikokomiką umożliwia naukowcom zajmującym się glikotechniką uzyskanie głębokiego i dokładnego wglądu w glikoproteom i twarde bariery ze wskaźnikami zdrowia ludzkiego, dzięki czemu glikoproteomika jest wyjątkowo zdolna do generowania specyficznych dla miejsca wglądu w glikoproteom. Ale wskaźniki glikopeptydu pozostają wysokie.Aby rozwiązać te problemy z odtwarzalnością, nasza metoda glikoproteomiki glikomicznej umożliwia precyzyjne profilowanie glikoproteomu poprzez zdefiniowanie ograniczeń w przestrzeni wyszukiwania glikanów za pomocą badania glikomicznego tej samej próbki. Ostatecznie umożliwia szybsze i dokładniejsze wyszukiwanie glikopeptydów. Nasza metoda glikoproteomiki sterowana glikoproteomką pozwala na kompleksowe mapowanie niejednorodności i dynamiki wskaźników glikoproteomimu z wielu różnych próbek ludzkich.Metoda ta może zatem pomóc nam w lepszym zrozumieniu postępu choroby, a także może pomóc w znalezieniu nowych biomarkerów diagnostycznych dla celów terapeutycznych przeciwko szerokiej gamie chorób ludzkich. Metoda glikoproteomiki sterowana glikomiką pozwala nam rozszyfrować złożoność ludzkiego glikoproteomiomi, co z kolei otwiera nowe pytania biologiczne, takie jak to, jak struktury glikanów wpływają na funkcję białka, komunikację komórkową lub odpowiedzi immunologiczne. Rodzi to również pytania o to, jak i dlaczego zmienił się wzorzec glikozylacji w niektórych chorobach.Te spostrzeżenia mogą prowadzić do odkryć i nowych markerów diagnostycznych oraz spersonalizowanych terapii w złożonych chorobach. Aby unieruchomić białko będące przedmiotem zainteresowania na membranie PVDF, za pomocą pojedynczego nakłucia otworu należy przeciąć membranę w oparciu o liczbę próbek, które mają zostać wykryte. Zwilż wycięte błony metanolem, a następnie przenieś je na płaską płytkę 96-dołkową.Gdy membrany są prawie suche, nałóż 2,5 mikrolitra próbek białka na miejsce. Suszyć membrany na powietrzu w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza przez co najmniej trzy godziny, a najlepiej przez noc, uważając, aby uniknąć zanieczyszczenia. Dodaj 100 mikrolitrów 1% PDP-40 w metanolu do każdej studzienki zawierającej nakrapiane membrany.Wstrząśnij płytką w roztworze PDP-40 w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach wyrzuć roztwór PDP-40. Następnie umyj każdą studzienkę zawierającą zablokowane plamki białkowe 100 mikrolitrami ultraczystej wody i potrząsaj płytką przez pięć minut.Dodaj 15 mikrolitrów roztworu PNGazy F do każdej studzienki. Aby zapobiec odwodnieniu, dodaj wodę do otaczających pustych studni. Ostrożnie zamknąć płytkę przezroczystą folią i inkubować przez co najmniej osiem godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po inkubacji należy poddać sonikację płytki przez pięć minut, aby pomóc w zebraniu się na dnie wszelkich odparowanych kropelek po bokach studzienek. Przenieś uwolnione próbki N-glikanu do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek wirówek. Każdą próbkę dobrze umyć dwukrotnie 20 mikrolitrami ultraczystej wody, odsysając i łącząc wszystkie pozostałe próbki z nowymi probówkami.Następnie dodaj 10 mikrolitrów 100-milimolowego octanu amonu o pH 5 i inkubuj próbki przez godzinę w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza. Wysuszyć próbki N-glikanu w systemie koncentratora próżniowego. Aby przygotować domowej roboty porowaty węgiel grafitowy lub ekstrakcję do fazy stałej PGC-C18 lub mikrokolumny SPE, użyj strzykawki do zatkania i przeniesienia krążków C18 do 10-mikrolitrowych końcówek pipet.Odpipetować 10 mikrolitrów zawiesiny żywicy PGC zawieszonej w 50% metanolu do mikrokolumn C18 SPE. Umieść mikrokolumny w 2-mililitrowych probówkach z adapterami do mikrowirówek. Zakręć rurkami, aby utworzyć mikrokolumny PGC-C18 SPE o przybliżonej wysokości kolumny 0.5 centymetra.Następnie dodać 50 mikrolitrów 0,1% kwasu trifluorooctowego lub TFA w acetonitrylu do mikrokolumn i odwirować przy 2000 G przez 60 sekund, aby ułatwić przejście faz ruchomych przez mikrokolumny. Podobnie, umyj i kondycjonuj mikrokolumny trzykrotnie za pomocą 0,1% wodnego tłuszczu TFA. Próbki N-glikanu należy nanieść na każdą mikrokolumnę w objętościach ładunkowych do 40 mikrolitrów.Obracaj mikrokolumnę po każdym wydaniu, powtarzając tak długo, aż cała próbka zostanie załadowana. Umyj każdą mikrokolumnę 20 mikrolitrami ultraczystej wody. Przenieś mikrokolumny do nowych 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówkowych.Aby wymyć N-glikany, dodaj 40 mikrolitrów 0,1% TFA w 50% acetonitrylu do każdej mikrokolumny. Zakręć probówkami i połącz eluat z każdego wirowania. Wysuszyć odsolone N-glikany w układzie koncentratorów próżniowych.Przeglądaj wygenerowane dane RAW LC-MS/MS za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Potwierdź wysoką jakość danych, oceniając wąską szerokość piku LC, skuteczną separację izomerów N-glikanu, wysoką dokładność MS, rozdzielczość i stosunek sygnału do szumu, a także wysoką wydajność fragmentacji CID MS/MS. Ręczna identyfikacja N-glikanów w próbce na podstawie monoizotopowej masy prekursora, wzorców fragmentacji CID MS/MS oraz względnych i bezwzględnych czasów retencji PGC-LC.W celu względnego oznaczania ilościowego N-glikanu należy wygenerować listę przejść zawierającą stosunek masy monoizotopowego prekursora do ładunku dla wszystkich zidentyfikowanych izomerów N-glikanu. Określić pole pod krzywą wartości z wyekstrahowanych chromatogramów jonowych wszystkich jonów prekursorowych N-glikanów. Aby przygotować mikrokolumny ZIC-HILIC-C8-SPE, za pomocą strzykawki zatkaj i przenieś krążki C8 do 10-mikrolitrowych końcówek pipet.Osadzać zawiesinę żywicy ZIC-HILIC zawieszoną w metanolu w mikrokolumnach C8-SPE. Umieść mikrokolumny w 2-mililitrowych probówkach z adapterami do mikrowirówek, upewniając się, że kolumny są zawieszone pośrodku. Zawiruj, aby utworzyć mikrokolumny C8-SPE HPLC o przybliżonej wysokości jednego centymetra.Dodać 50 mikrolitrów metanolu do mikrokolumn i odwirować przy 2000 G przez 60 sekund, pozwalając ruchomym fazom przejść przez kolumnę. Podobnie, umyj mikrokolumny trzy razy, każda 50 mikrolitrami ultraczystej wody, a następnie 50 mikrolitrami 1% TFA w 80% acetonitrylu. Wysuszone mieszaniny peptydowe przeznaczone do wzbogacania N-glikopeptydów zawiesić w 50 mikrolitrach 1%TFA w 80% acetonitrylu i dokładnie wymieszać.Umieść stan Mikrokolumny ZIC-HILIC-C8-SPE w nowych 1,5-mililitrowych probówkach z adapterami do mikrowirówek. Nałożyć zawieszone mieszaniny peptydów na każdą mikrokolumnę i wirować z prędkością 2000 G przez 60 sekund. Zbierz przepływ przez frakcje i ponownie nałóż każdą frakcję do tej samej mikrokolumny ZIC-HILIC-C8-SPE.Następnie eluować N-glikopeptyd z sekwencyjnym dodatkiem 50 mikrolitrów 25-milimolowego wodorowęglanu amonu i 50 mikrolitrów 50% acetonitrylu. Przenieś mikrokolumny do nowych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych o niskim poziomie wiązania. Aby sekwencyjnie eluować zatrzymany N-glikopeptyd, dodaj 50 mikrolitrów 0,1% wodnego roztworu TFA do mikrokolumn i odwiruj przy 2000 G przez 60 sekund.Następnie eluować N-glikopeptyd z sekwencyjnym dodatkiem 50 mikrolitrów 0,1% wodnego roztworu TFA, a następnie 50 mikrolitrów 25-milimolowego wodorowęglanu amonu i 50 mikrolitrów 50% acetonitrylu. Zbierz, połącz i wysusz wzbogacone N-glikopeptydy, a niemodyfikowane peptydy przepływają przez frakcje w systemie koncentratora próżniowego. Analiza danych z N-glikomiki zidentyfikowała 76 izomerów N-glikanów w tkankach raka jelita grubego z 70% glikanów złożonych/hybrydowych, 20% oligomannozy i 10% paucymannozy.Wszystkie struktury N-glikanów potwierdzono dowodami spektralnymi, określonymi ilościowo za pomocą wartości pola pod krzywą z ekstrahowanych chromatogramów jonowych.

glycomics-guided-glycoproteomics-facilitates-comprehensive-profiling

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.

Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

Opisano technikę o nazwie Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP), służącą do charakterystyki glikanów ścian komórkowych roślin. Metoda ta łączy specyficzność przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko określonym epitopom glikanów z miniaturową analityczną platformą mikromacierzy, która umożliwia przesiewowe badanie występowania glikanów w szerokim zakresie kontekstów biologicznych.

Profilowanie glikanów polimerów ściany komórkowej roślin z wykorzystaniem mikromacierzy

Białka powierzchniowe komórek są biologicznie ważne i szeroko glikozylowane. Przedstawiamy tutaj podejście do wychwytywania glikopeptydów w celu rozpuszczania, wzbogacania i deglikozylowania tych białek w celu łatwego analizowania proteomicznego opartego na LC-MS.

Wychwytywanie glikopeptydu w proteomice powierzchni komórki

Dogłębne analizy proteomów komórek nowotworowych ułatwiają identyfikację nowych celów leków i biomarkerów diagnostycznych. Opisujemy eksperymentalny przepływ pracy do analizy ilościowej (fosfo-)proteomów w subpopulacjach komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych. Osiąga się to poprzez połączenie strategii wzbogacania komórek z ilościową spektrometrią mas opartą na Super-SILAC.

Ilościowe profilowanie spektrometryczne mas proteomów komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych

Ten artykuł przedstawia ulepszoną formę nowatorskiej techniki glikomicznej od dołu do góry, przeznaczonej do analizy zbiorczego profilu składu glikanów w niefrakcjonowanych biopłynach poprzez chemiczny rozkład glikanów na ich składowe specyficzne dla wiązania monosacharydy do wykrycia przez GC-MS. Potencjalne zastosowania obejmują wczesne wykrywanie raka i innych zaburzeń glikanowo-afektywnych.

Analiza węzłów glikanowych: oddolne podejście do glikomiksu

Ten artykuł opisuje metodologię przygotowania próbek tkanek sercowo-naczyniowych do analizy MS, która pozwala na (1) analizę składu białka ECM, (2) identyfikację miejsc glikozylacji oraz (3) charakterystykę składu form glikanów. Metodologia ta może być zastosowana, z niewielkimi modyfikacjami, do badania ECM w innych tkankach.

Glikoproteomika macierzy zewnątrzkomórkowej: metoda analizy nienaruszonego glikopeptydu przy użyciu spektrometrii mas

Test mikromacierzy sialoglycan może być używany do oceny przeciwciał anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich, co czyni go potencjalnym wysokoprzepustowym testem diagnostycznym dla raka i innych przewlekłych chorób ludzkich, w których pośredniczy stan zapalny.

Profilowanie IgG anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu

Ten protokół ilustruje, jak badać, porównywać i interpretować ludzkie glicomes białkowe za pomocą zasobów online.

Zasoby bioinformatyczne do badania oddziaływań białek za pośrednictwem glikanów

Protokół ten opisuje metodologię wykrywania multipleksowego mRNA za pomocą obrazowania białek w tkankach tkanek osadzonych formaliną w parafinie.

Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową

Protokół ten skutecznie przygotował wystarczającą ilość wysokiej jakości tkanki neowaskularnej z próbek glejaka za pomocą mikrodyssekcji laserowej do ilościowej analizy proteomicznej angiogenezy guza, przezwyciężając ograniczenia badań tradycyjnie koncentrujących się głównie na czynnikach angiogennych oraz dostarczając szeroko zakrojonego profilu proteomicznego angiogenezy glejaka.

Przygotowanie tkanek neowaskularnych z tkanek glejaka ludzkiego do ilościowej analizy proteomiki angiogenezy guza

Poznaj metodę glikoproteomiki sterowanej glikomiką do kompleksowego profilowania glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych. Ta technika umożliwia dokładną analizę struktur glikoprotein.

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów