Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Badamy więc węglowodany złożone, czyli glikany, we wrodzonym układzie odpornościowym i zaburzeniach związanych z odpornością, koncentrując się obecnie na sepsie i nowotworach. Nasza praca obejmuje metody analityczne i systemy glikobiologii, w tym metody glikomiksowe i glikoproteomiczne, w celu szczegółowej charakterystyki ludzkiej glikoproteiny. W ciągu ostatnich dziesięcioleci w glikoproteomice nastąpił ogromny postęp, a postęp nie jest już ograniczony przez niedobór dostępnych wysokiej jakości danych ze spektrometrii mas.

Wyzwaniem jest raczej interpretacja i wygenerowanie wiedzy biologicznej na podstawie danych spektralnych. Metoda glikoproteomiki sterowana glikokomiką umożliwia naukowcom zajmującym się glikotechniką uzyskanie głębokiego i dokładnego wglądu w glikoproteom i twarde bariery ze wskaźnikami zdrowia ludzkiego, dzięki czemu glikoproteomika jest wyjątkowo zdolna do generowania specyficznych dla miejsca wglądu w glikoproteom. Ale wskaźniki glikopeptydu pozostają wysokie.

Aby rozwiązać te problemy z odtwarzalnością, nasza metoda glikoproteomiki glikomicznej umożliwia precyzyjne profilowanie glikoproteomu poprzez zdefiniowanie ograniczeń w przestrzeni wyszukiwania glikanów za pomocą badania glikomicznego tej samej próbki. Ostatecznie umożliwia szybsze i dokładniejsze wyszukiwanie glikopeptydów. Nasza metoda glikoproteomiki sterowana glikoproteomką pozwala na kompleksowe mapowanie niejednorodności i dynamiki wskaźników glikoproteomimu z wielu różnych próbek ludzkich.

Metoda ta może zatem pomóc nam w lepszym zrozumieniu postępu choroby, a także może pomóc w znalezieniu nowych biomarkerów diagnostycznych dla celów terapeutycznych przeciwko szerokiej gamie chorób ludzkich. Metoda glikoproteomiki sterowana glikomiką pozwala nam rozszyfrować złożoność ludzkiego glikoproteomiomi, co z kolei otwiera nowe pytania biologiczne, takie jak to, jak struktury glikanów wpływają na funkcję białka, komunikację komórkową lub odpowiedzi immunologiczne. Rodzi to również pytania o to, jak i dlaczego zmienił się wzorzec glikozylacji w niektórych chorobach.

Te spostrzeżenia mogą prowadzić do odkryć i nowych markerów diagnostycznych oraz spersonalizowanych terapii w złożonych chorobach. Aby unieruchomić białko będące przedmiotem zainteresowania na membranie PVDF, za pomocą pojedynczego nakłucia otworu należy przeciąć membranę w oparciu o liczbę próbek, które mają zostać wykryte. Zwilż wycięte błony metanolem, a następnie przenieś je na płaską płytkę 96-dołkową.

Gdy membrany są prawie suche, nałóż 2,5 mikrolitra próbek białka na miejsce. Suszyć membrany na powietrzu w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza przez co najmniej trzy godziny, a najlepiej przez noc, uważając, aby uniknąć zanieczyszczenia. Dodaj 100 mikrolitrów 1% PDP-40 w metanolu do każdej studzienki zawierającej nakrapiane membrany.

Wstrząśnij płytką w roztworze PDP-40 w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach wyrzuć roztwór PDP-40. Następnie umyj każdą studzienkę zawierającą zablokowane plamki białkowe 100 mikrolitrami ultraczystej wody i potrząsaj płytką przez pięć minut.

Dodaj 15 mikrolitrów roztworu PNGazy F do każdej studzienki. Aby zapobiec odwodnieniu, dodaj wodę do otaczających pustych studni. Ostrożnie zamknąć płytkę przezroczystą folią i inkubować przez co najmniej osiem godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji należy poddać sonikację płytki przez pięć minut, aby pomóc w zebraniu się na dnie wszelkich odparowanych kropelek po bokach studzienek. Przenieś uwolnione próbki N-glikanu do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek wirówek. Każdą próbkę dobrze umyć dwukrotnie 20 mikrolitrami ultraczystej wody, odsysając i łącząc wszystkie pozostałe próbki z nowymi probówkami.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów 100-milimolowego octanu amonu o pH 5 i inkubuj próbki przez godzinę w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza. Wysuszyć próbki N-glikanu w systemie koncentratora próżniowego. Aby przygotować domowej roboty porowaty węgiel grafitowy lub ekstrakcję do fazy stałej PGC-C18 lub mikrokolumny SPE, użyj strzykawki do zatkania i przeniesienia krążków C18 do 10-mikrolitrowych końcówek pipet.

Odpipetować 10 mikrolitrów zawiesiny żywicy PGC zawieszonej w 50% metanolu do mikrokolumn C18 SPE. Umieść mikrokolumny w 2-mililitrowych probówkach z adapterami do mikrowirówek. Zakręć rurkami, aby utworzyć mikrokolumny PGC-C18 SPE o przybliżonej wysokości kolumny 0.5 centymetra.

Następnie dodać 50 mikrolitrów 0,1% kwasu trifluorooctowego lub TFA w acetonitrylu do mikrokolumn i odwirować przy 2000 G przez 60 sekund, aby ułatwić przejście faz ruchomych przez mikrokolumny. Podobnie, umyj i kondycjonuj mikrokolumny trzykrotnie za pomocą 0,1% wodnego tłuszczu TFA. Próbki N-glikanu należy nanieść na każdą mikrokolumnę w objętościach ładunkowych do 40 mikrolitrów.

Obracaj mikrokolumnę po każdym wydaniu, powtarzając tak długo, aż cała próbka zostanie załadowana. Umyj każdą mikrokolumnę 20 mikrolitrami ultraczystej wody. Przenieś mikrokolumny do nowych 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówkowych.

Aby wymyć N-glikany, dodaj 40 mikrolitrów 0,1% TFA w 50% acetonitrylu do każdej mikrokolumny. Zakręć probówkami i połącz eluat z każdego wirowania. Wysuszyć odsolone N-glikany w układzie koncentratorów próżniowych.

Przeglądaj wygenerowane dane RAW LC-MS/MS za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Potwierdź wysoką jakość danych, oceniając wąską szerokość piku LC, skuteczną separację izomerów N-glikanu, wysoką dokładność MS, rozdzielczość i stosunek sygnału do szumu, a także wysoką wydajność fragmentacji CID MS/MS. Ręczna identyfikacja N-glikanów w próbce na podstawie monoizotopowej masy prekursora, wzorców fragmentacji CID MS/MS oraz względnych i bezwzględnych czasów retencji PGC-LC.

W celu względnego oznaczania ilościowego N-glikanu należy wygenerować listę przejść zawierającą stosunek masy monoizotopowego prekursora do ładunku dla wszystkich zidentyfikowanych izomerów N-glikanu. Określić pole pod krzywą wartości z wyekstrahowanych chromatogramów jonowych wszystkich jonów prekursorowych N-glikanów. Aby przygotować mikrokolumny ZIC-HILIC-C8-SPE, za pomocą strzykawki zatkaj i przenieś krążki C8 do 10-mikrolitrowych końcówek pipet.

Osadzać zawiesinę żywicy ZIC-HILIC zawieszoną w metanolu w mikrokolumnach C8-SPE. Umieść mikrokolumny w 2-mililitrowych probówkach z adapterami do mikrowirówek, upewniając się, że kolumny są zawieszone pośrodku. Zawiruj, aby utworzyć mikrokolumny C8-SPE HPLC o przybliżonej wysokości jednego centymetra.

Dodać 50 mikrolitrów metanolu do mikrokolumn i odwirować przy 2000 G przez 60 sekund, pozwalając ruchomym fazom przejść przez kolumnę. Podobnie, umyj mikrokolumny trzy razy, każda 50 mikrolitrami ultraczystej wody, a następnie 50 mikrolitrami 1% TFA w 80% acetonitrylu. Wysuszone mieszaniny peptydowe przeznaczone do wzbogacania N-glikopeptydów zawiesić w 50 mikrolitrach 1%TFA w 80% acetonitrylu i dokładnie wymieszać.

Umieść stan Mikrokolumny ZIC-HILIC-C8-SPE w nowych 1,5-mililitrowych probówkach z adapterami do mikrowirówek. Nałożyć zawieszone mieszaniny peptydów na każdą mikrokolumnę i wirować z prędkością 2000 G przez 60 sekund. Zbierz przepływ przez frakcje i ponownie nałóż każdą frakcję do tej samej mikrokolumny ZIC-HILIC-C8-SPE.

Następnie eluować N-glikopeptyd z sekwencyjnym dodatkiem 50 mikrolitrów 25-milimolowego wodorowęglanu amonu i 50 mikrolitrów 50% acetonitrylu. Przenieś mikrokolumny do nowych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych o niskim poziomie wiązania. Aby sekwencyjnie eluować zatrzymany N-glikopeptyd, dodaj 50 mikrolitrów 0,1% wodnego roztworu TFA do mikrokolumn i odwiruj przy 2000 G przez 60 sekund.

Następnie eluować N-glikopeptyd z sekwencyjnym dodatkiem 50 mikrolitrów 0,1% wodnego roztworu TFA, a następnie 50 mikrolitrów 25-milimolowego wodorowęglanu amonu i 50 mikrolitrów 50% acetonitrylu. Zbierz, połącz i wysusz wzbogacone N-glikopeptydy, a niemodyfikowane peptydy przepływają przez frakcje w systemie koncentratora próżniowego. Analiza danych z N-glikomiki zidentyfikowała 76 izomerów N-glikanów w tkankach raka jelita grubego z 70% glikanów złożonych/hybrydowych, 20% oligomannozy i 10% paucymannozy.

Wszystkie struktury N-glikanów potwierdzono dowodami spektralnymi, określonymi ilościowo za pomocą wartości pola pod krzywą z ekstrahowanych chromatogramów jonowych.