Name: Ilościowy test oparty na PCR do pomiaru sygnalizacji sonic hedgehog w komórkowym modelu ciliogenezy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj ilościowy test PCR do oceny sygnalizacji Sonic Hedgehog w komórkowym modelu ciliogenezy. Ta metoda umożliwia badanie genetycznych i epigenetycznych zmian związanych z dysfunkcją pierwotnych rzęsek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez stypendium Ramalingaswami dla SM przez Departament Biotechnologii (DBT), Rząd Indii, oraz grant badawczy od Science and Engineering Research Board (SERB), Govt. of India dla SM (CRG/2020/004042). Stypendium PH jest sponsorowane przez Uniwersytecką Komisję Grantową (UGC), rząd Indii. Autorzy serdecznie dziękują dr Chandrama Mukherjee i panu Avikowi Mukherjee z RNABio Lab Instytutu Nauk o Zdrowiu, Uniwersytetu Prezydenckiego za dostęp do instrumentu qPCR i szkolenie w tym instrumencie.

1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Przejście przez prawie zlewającą się kolbę do hodowli komórek T-25 komórek RPE1 w rozcieńczeniu 1:5 oryginalnej kultury do świeżej kolby do hodowli komórek T-25 zawierającej 5 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% mieszaniną penicyliny i streptomycyny (końcowe stężenie - 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny). To podłoże jest określane jako kompletne podłoże. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2, 
	UWAGA: Komórki RPE1 są nietransformowanymi komórkami powszechnie używanymi do badania molekularnej regulacji składania i rozkładu PC w hodowli komórkowej. Około 80% komórek RPE1 gromadzi PC po zagłodzeniu surowicy, który jest ponownie demonstrowany po ponownym dodaniu serum16.</li>
	<li>Przygotować okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm, inkubując je przez noc w 50 ml 1 N HCl w przykrytej szklanej zlewce, bez wytrząsania w temperaturze 60 °C w łaźni wodnej lub inkubatorze.</li>
	<li>Następnego dnia, używając pipety o pojemności 25 ml, odpipetuj roztwór kwasu i wyrzuć go do pojemnika stanowiącego zagrożenie chemiczne. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe 3x w 100 ml wody destylowanej, inkubując przez 15 minut z okazjonalnym wstrząsaniem, a następnie pipetując.</li>
	<li>Powtórz kroki mycia z 70% etanolem i 95% etanolem. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe, umieszczając je pojedynczo na bibułce laboratoryjnej w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Po wysuszeniu sterylizować promieniowaniem UV przez 60 min.</li>
</ol>
2. Wzrost komórek, głód surowicy i leczenie SAG
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w kolbie T-25 we wstępnie podgrzanym, kompletnym pożywce po przemieszczeniu komórek przez aktywność enzymatyczną wstępnie podgrzanego 0,25% roztworu trypsyny-EDTA. Określ gęstość komórek zawiesiny, zliczając komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Przygotuj dwie szalki do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm i umieść w każdym z nich dwa sterylne szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm. Pasaż 2 x 105 asynchronicznie rosnących komórek RPE1 w każdej 35-milimetrowej szalce zawierającej szkiełka nakrywkowe i hodować komórki w 2 ml kompletnej pożywki przez 24 godziny.</li>
	<li>Po 24 godzinach usunąć pożywkę z rosnących komórek RPE1 i umyć komórki 1x wstępnie podgrzanym 1 ml buforu DPBS. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki DMEM zawierającej 1% penicyliny-streptomycyny, ale pozbawionej FBS (pożywki bez surowicy) do każdej szalki i inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 .</li>
	<li>Po 24 godzinach zastąpić pożywkę pożywką bez surowicy zawierającą SAG do końcowego stężenia 250 nM lub DMSO jako rozpuszczalnik kontrolny i inkubować komórki przez kolejne 24 godziny. Rysunkowy diagram protokołu hodowli komórkowej jest pokazany w Rysunek 1A.</li>
</ol>
3. Kolekcja komórek
<ol>
	<li>Przenieść szkiełka nakrywkowe na płytkę 24-dołkową z jednym szkiełkiem nakrywkowym w każdym dołku. Dodać 0,5 ml schłodzonego metanolu do każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze -20 °C przez 10 minut w celu utrwalenia komórek na szkiełkach nakrywkowych. Bezpośrednio po tym przemyć szkiełka nakrywkowe 3x 0,5 ml buforu do płukania (1x PBS zawierający 0,5 mM MgCl2 i 0,05% Triton-X 100).</li>
	<li>Wyrzuć pożywkę i dodaj 0,5 ml odczynnika do izolu bezpośrednio do każdej płytki. Pozwól mu równomiernie się rozprowadzić i trzymaj przez 5 minut. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną mieszaninę i zebrać ją w 1,5 ml probówkach wirówkowych bez nukleazy.</li>
</ol>
4. Przygotowanie całkowitego RNA i cDNA
<ol>
	<li>Dodać 0,1 ml chloroformu do każdej probówki zawierającej lizowane komórki i inkubować przez 2-3 minuty. Odwirować każdą próbkę przez 15 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C. Przenieść fazę wodną zawierającą RNA do świeżych probówek do mikrowirówek.</li>
	<li>Dodać 0,25 ml izopropanolu do fazy wodnej i inkubować przez 10 minut. Wirować przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4°C. Osad RNA tworzy białą osadę przypominającą żel. Za pomocą mikropipety wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad RNA w 0,5 ml świeżo rozcieńczonego 75% etanolu. Próbki należy krótko zwirować, a następnie odwirować przez 5 minut przy 7500 x g w temperaturze 4°C. Odrzucić supernatant za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Suszyć na powietrzu osad RNA przez 10 minut i ponownie zawieś w 25 μl wody wolnej od nukleaz. Oznaczyć stężenie całkowitego RNA, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.</li>
	<li>Użyj 1-3 μg całkowitego RNA z obu próbek, aby przygotować cDNA zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi zestawu do syntezy cDNA. Przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
5. Ilościowy PCR
<ol>
	<li>Ustawić reakcje qPCR (w trzech egzemplarzach, Tabela 1) przy użyciu rozcieńczonych w stosunku 1:5 cDNA z każdej próbki z zestawami starterów GLI1, PTCH1, HHIP, SMO i β-ACTIN (jako gen porządkowy; Tabela 2) geny z główną mieszanką qPCR zawierającą odpowiednią polimerazę DNA, dNTP i bufor, w odpowiedniej wielodołkowej, wrażliwej na fluorescencję płytce PCR.</li>
	<li>Przykryj płytkę odpowiednim uszczelniaczem, umieść ją w odpowiednim przyrządzie do qPCR i uruchom znormalizowany program qPCR z 40 cyklami amplifikacji i etapem analizy krzywej topnienia na końcu programu. Ustandaryzowany 40-cyklowy program qPCR, w tym analiza krzywej topnienia, jest schematycznie pokazany w <silna klasa="xfig">Rysunek 1B.</li>
	<li>Po zakończeniu programu qPCR sprawdź krzywą topnienia każdego amplikonu pod kątem pojedynczego piku w żądanej temperaturze. 
	UWAGA: Pod koniec cykli amplifikacji powiązana analiza krzywej topnienia mierzy temperaturę topnienia amplikonu, zwiększając temperaturę każdego dołka z 65°C do 95°C, z przyrostem 0,5°C na krok trwającym 5 sekund.</li>
	<li>Wyeksportuj dane amplifikacji do arkusza kalkulacyjnego i oblicz względne wyrażenie (metoda 2−ΔΔCT) każdego transkryptu, normalizując względem genu β-ACTIN dla każdej próbki. Wykreśl wykres i oblicz istotność statystyczną zmian we względnym wyrażeniu każdego transkryptu za pomocą niesparowanego testu T.</li>
</ol>
6. Barwienie immunologiczne i akwizycja obrazu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
<ol>
	<li>Inkubować utrwalone komórki na szkiełkach nakrywkowych w 200 μl buforu blokującego (2% BSA i 0,1% TritonX-100 w 1x PBS) przez 30 minut.</li>
	<li>Inkubować komórki z mieszaniną pierwszorzędowych przeciwciał (zazwyczaj przeciwciał anty-mysich przeciwko acetylowanej α-tubulinie aksonemu PC i przeciwciał anty-króliczych odpowiednio przeciwko błonie rzęskowej i centrioli) rozcieńczonych w buforze blokującym (patrz tabela materiałów dla końcowego rozcieńczenia) przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.
	<ol>
		<li>Przygotuj nawilżoną komorę, wkładając mokry ręcznik papierowy do dolnej połowy pustego pudełka na końcówki do pipet o pojemności 1 ml. Położyć pasek przezroczystej folii na powierzchni stojaka i nanieść kroplę (20 -25 μl) roztworu przeciwciała na folię, po jednej na każde szkiełko nakrywkowe, które ma być inkubowane. Umieść szkiełko nakrywkowe na kropelkach tak, aby komórki były zanurzone, i zamknij pokrywę pudełka z końcówkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego dnia ponownie odwróć szkiełka nakrywkowe i włóż je z powrotem do naczynia 24-dołkowego. Przemyć szkiełka nakrywkowe buforem do przemywania a następnie inkubować je w 150 μl mieszaniny przeciwciał drugorzędowych z wstępnie standaryzowanym rozcieńczeniem przeciwciał (w tym przypadku anty-mysim barwnikiem sprzężonym z barwnikiem zielono-fluorescencyjnym i anty-królikiem sprzężonym z barwnikiem czerwonej fluorescencji rozcieńczonym w buforze blokującym) i odczynnikami do barwienia jądrowego DNA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka nakrywkowe 3x.</li>
	<li>Na szklanym szkiełku mikroskopowym umieścić kroplę (około 3-5 μl) roztworu montażowego zawierającego odczynnik zapobiegający blaknięciu. Umieść szkiełko nakrywkowe, stroną z ogniwem skierowaną w dół, na roztwór montażowy. Wytrzyj nadmiar płynu, delikatnie naciskając czystą chusteczkę. Nałóż przezroczysty lakier do paznokci wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić go na szkiełku.</li>
	<li>Umieść szkiełko na mikroskopie (patrz tabela materiałów) przymocowane do zmotoryzowanego stolika i kamery zdolnej do obrazowania cyfrowego. Użyj 60-krotnego obiektywu immersyjnego z olejkiem Plan Apo (z aperturą numeryczną 1,4), aby uzyskać obrazy komórek RPE1 pozbawionych surowicy w temperaturze otoczenia, aby uwidocznić PC w komórkach, zgodnie z zaznaczonymi wspomnianymi przeciwciałami.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy różnych próbek na oddzielnych szkiełkach nakrywkowych przy użyciu identycznego czasu naświetlania dla różnych fluoroforów wzdłuż osi Z, korzystając z pakietu oprogramowania do obrazowania mikroskopii cyfrowej. Policz liczbę komórek zawierających PC z co najmniej 500 komórek, aby określić procentowy odsetek rzęsków w 48-godzinnym stanie głodu surowicy.</li>
</ol>

<ol><li>Nigg, E. A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrioles%2C+centrosomes%2C+and+cilia+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease.</a> Cell. 139 (4), 663-678 (2009).</li>
<li>Halder, P., Khatun, S., Majumder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeing+the+brake%3A+Proliferation+needs+primary+cilium+to+disassemble%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci%22%5BJournal%5D)">Freeing the brake: Proliferation needs primary cilium to disassemble.</a> J Biosci. 45, 117(2020).</li>
<li>Eguether, T., Cordelieres, F. P., Pazour, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+is+deeply+integrated+in+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport is deeply integrated in hedgehog signaling.</a> Mol Biol Cell. 29 (10), 1178-1189 (2018).</li>
<li>Ishikawa, H., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+and+ciliary+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport and ciliary dynamics.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (3), a021998(2017).</li>
<li>Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Ciliopathies.</a> N Engl J Med. 364 (16), 1533-1543 (2011).</li>
<li>Reiter, J. F., Leroux, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+molecular+pathways+underpinning+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (9), 533-547 (2017).</li>
<li>Hilgendorf, K. I., Myers, B. R., Reiter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+mechanistic+understanding+of+cilia+function+in+cellular+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging mechanistic understanding of cilia function in cellular signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (7), 555-573 (2024).</li>
<li>Bansal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+pathway+activation+alters+ciliary+signaling+in+primary+hypothalamic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hedgehog pathway activation alters ciliary signaling in primary hypothalamic cultures.</a> Front Cell Neurosci. 13, 266(2019).</li>
<li>Gigante, E. D., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+in+the+primary+cilium+through+the+lens+of+the+hedgehog+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling in the primary cilium through the lens of the hedgehog pathway.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 9 (6), e377(2020).</li>
<li>Anvarian, Z., Mykytyn, K., Mukhopadhyay, S., Pedersen, L. B., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+signalling+by+primary+cilia+in+development%2C+organ+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Cellular signalling by primary cilia in development, organ function and disease.</a> Nat Rev Nephrol. 15 (4), 199-219 (2019).</li>
<li>Bangs, F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+and+mammalian+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary cilia and mammalian hedgehog signaling.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (5), a028175(2017).</li>
<li>Brown, J. M., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%22%5BJournal%5D)">Cilia and diseases.</a> Bioscience. 64 (12), 1126-1137 (2014).</li>
<li>Hanaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alstrom+syndrome%3A+A+review+focusing+on+its+diverse+clinical+manifestations+and+their+etiology+as+a+ciliopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Yonago+Acta+Med%22%5BJournal%5D)">Alstrom syndrome: A review focusing on its diverse clinical manifestations and their etiology as a ciliopathy.</a> Yonago Acta Med. 67 (2), 93-99 (2024).</li>
<li>Merrill, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+abnormalities+due+to+defects+in+the+retrograde+transport+protein+dync2h1+in+short-rib+polydactyly+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Ciliary abnormalities due to defects in the retrograde transport protein dync2h1 in short-rib polydactyly syndrome.</a> Am J Hum Genet. 84 (4), 542-549 (2009).</li>
<li>Dagoneau, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dync2h1+mutations+cause+asphyxiating+thoracic+dystrophy+and+short+rib-polydactyly+syndrome%2C+type+iii%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Dync2h1 mutations cause asphyxiating thoracic dystrophy and short rib-polydactyly syndrome, type iii.</a> Am J Hum Genet. 84 (5), 706-711 (2009).</li>
<li>Majumder, S., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vdac3+and+mps1+negatively+regulate+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Vdac3 and mps1 negatively regulate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 12 (5), 849-858 (2013).</li>
<li>Briscoe, J., Therond, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+hedgehog+signalling+and+its+roles+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of hedgehog signalling and its roles in development and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (7), 416-429 (2013).</li>
<li>Placzek, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+in+vertebrate+neural+tube+development%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog in vertebrate neural tube development.</a> Int J Dev Biol. 62 (1-2-3), 225-234 (2018).</li>
<li>Wong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+can+both+mediate+and+suppress+hedgehog+pathway-dependent+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Primary cilia can both mediate and suppress hedgehog pathway-dependent tumorigenesis.</a> Nat Med. 15 (9), 1055-1061 (2009).</li>
<li>Deshpande, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoothened+stimulation+by+membrane+sterols+drives+hedgehog+pathway+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Smoothened stimulation by membrane sterols drives hedgehog pathway activity.</a> Nature. 571 (7764), 284-288 (2019).</li>
<li>Mukhopadhyay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+g-protein-coupled+receptor+gpr161+negatively+regulates+the+sonic+hedgehog+pathway+via+camp+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ciliary g-protein-coupled receptor gpr161 negatively regulates the sonic hedgehog pathway via camp signaling.</a> Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).</li>
<li>Niewiadomski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli+protein+activity+is+controlled+by+multisite+phosphorylation+in+vertebrate+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Gli protein activity is controlled by multisite phosphorylation in vertebrate hedgehog signaling.</a> Cell Rep. 6 (1), 168-181 (2014).</li>
<li>Kovacs, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-arrestin-mediated+localization+of+smoothened+to+the+primary+cilium%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Beta-arrestin-mediated localization of smoothened to the primary cilium.</a> Science. 320 (5884), 1777-1781 (2008).</li>
<li>He, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinesin-4+protein+kif7+regulates+mammalian+hedgehog+signalling+by+organizing+the+cilium+tip+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The kinesin-4 protein kif7 regulates mammalian hedgehog signalling by organizing the cilium tip compartment.</a> Nat Cell Biol. 16 (7), 663-672 (2014).</li>
<li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+hedgehog-dependent+full-length+gli3+accumulation+in+primary+cilia+and+subsequent+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of hedgehog-dependent full-length gli3 accumulation in primary cilia and subsequent degradation.</a> Mol Cell Biol. 30 (8), 1910-1922 (2010).</li>
<li>Griffiths, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog-interacting+protein+is+a+multimodal+antagonist+of+hedgehog+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hedgehog-interacting protein is a multimodal antagonist of hedgehog signalling.</a> Nat Commun. 12 (1), 7171(2021).</li>
<li>Gomez, A. E., Christman, A. K., Van De Weghe, J. C., Finn, M., Doherty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+cilia+characteristics+and+hedgehog+signaling+in+five+immortal+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of cilia characteristics and hedgehog signaling in five immortal cell lines.</a> PLoS One. 17 (12), e0266433(2022).</li>
<li>Schmidt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+and+shh+signaling+impairments+in+human+and+mouse+models+of+parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Primary cilia and shh signaling impairments in human and mouse models of parkinson's disease.</a> Nat Commun. 13 (1), 4819(2022).</li>
<li>Dutta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+primary+cilia+number+and+length+upon+vdac1+depletion+contributes+to+attenuated+proliferation+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Increase in primary cilia number and length upon vdac1 depletion contributes to attenuated proliferation of cancer cells.</a> Exp Cell Res. 429 (2), 113671(2023).</li>
<li>De, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphosphorylation+of+cdh1+in+glioblastoma+cancer+stem+cells+attenuates+apc%2Fc%28cdh1%29+activity+and+pharmacologic+inhibition+of+apc%2Fc%28cdh1%2Fcdc20%29+compromises+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Hyperphosphorylation of cdh1 in glioblastoma cancer stem cells attenuates apc/c(cdh1) activity and pharmacologic inhibition of apc/c(cdh1/cdc20) compromises viability.</a> Mol Cancer Res. 17 (7), 1519-1530 (2019).</li>
<li>Yang, S., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunofluorescence-based+detection+of+hedgehog+pathway+components+in+primary+cilia+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The immunofluorescence-based detection of hedgehog pathway components in primary cilia of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 2374, 89-94 (2022).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mir-669a-5p%2Fg3bp%2Fhdac6%2Fakap12+axis+regulates+primary+cilia+length%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">The mir-669a-5p/g3bp/hdac6/akap12 axis regulates primary cilia length.</a> Adv Sci (Weinh). 11 (6), e2305068(2024).</li>
<li>Alanazi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+roles+of+mir-17+in+ciliogenesis+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying the roles of mir-17 in ciliogenesis and cell cycle.</a> Front Cell Dev Biol. 12, 1397931(2024).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miqe+guidelines%3A+Minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+pcr+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The miqe guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time pcr experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Badanie funkcjonalności PC jest kluczowym krokiem w kierunku zrozumienia dynamiki rzęsek oraz chorób lub zaburzeń związanych z dysfunkcją PC. Oprócz badania rzęskowości przez barwienie immunologiczne markerów rzęskowych lub znakowanych fluoroforem składników strukturalnych rzęsek, funkcja PC jest zwykle określana przez oznaczanie kanonicznej aktywacji szlaku SHH poprzez pomiar translokacji rzęskowej Smo w tkankach i komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej27,31...

Rzęska to oparty na mikrotubulach i osłonięty błoną występ z powierzchni komórki, który jest złożony na podstawowym ciele1. U kręgowców obserwuje się dwa rodzaje rzęsek, a mianowicie ruchliwe i nieruchliwe. Rzęski ruchome znajdują się w wyspecjalizowanych tkankach i nadają ruchliwość. Nieruchome rzęski pierwotne (PC) są obecne w większości komórek kręgowców i pełnią funkcje sensoryczne oraz przekazują krytyczne sygnały ze środowiska zewnątrzkomórkowego do wnętrza komórek2. Po złożeniu wydłużenie rzęsek jest wspomagane przez maszynerię transportu śródwiciowego (IFT), która jest dwukierunkowym systemem transportowym przenoszącym ładunek napędzany przez kinezyny (ruch następczy) i białka motoryczne dyneiny-II (ruch wsteczny)3,4. Strukturalne lub funkcjonalne wady ruchliwych lub pierwotnych rzęsek mogą prowadzić do wielu wieloukładowych chorób ludzkich, które są zbiorczo znane jako ciliopaty5,6.
PC służy jako centrum dla różnych procesów sygnalizacji rozwojowej, takich jak bezskrzydłe (Wnt), receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), kinazy receptorowo-tyrozynowe (RTKs), transformujący czynnik wzrostu β (TGFβ) i sygnalizacja płytkowego czynnika wzrostu (PDGF)7,8. U ssaków sygnalizacja Sonic Hedgehog (SHH) jest krytyczna, która jest prawie wyłącznie transdukowana przez PC w komórkach zawierających PC9,10,11. Nieprawidłowa struktura lub funkcja PC prowadzi do osłabienia szlaków sygnałowych, które są związane z chorobami takimi jak wrodzone wady serca, wielotorbielowatość nerek, nieprawidłowości twarzoczaszki, dystrofia siatkówki i kilka rzadkich chorób, takich jak zespół Bardeta-Biedla (BBS), zespół Jouberta (JBTS), zespół Alströma, uduszająca dysplazja klatki piersiowej Jeune (JATD)12,13,14,15. Większość z nich to choroby wielogenowe tkanek nabłonka lub śródbłonka, które stanowią wyzwanie we wczesnej diagnostyce i leczeniu tych chorób. Określenie, w jaki sposób takie mutacje przyczyniają się do osłabionej sygnalizacji za pośrednictwem PC w modelu hodowli komórkowej, może nie tylko zapewnić wgląd w molekularną zawiłość tego szlaku sygnałowego, ale także ułatwić diagnozę różnych ciliopatii i może zasugerować interwencje terapeutyczne. Dzięki temu pojęciu opracowano ilościowy test oparty na PCR (qPCR) w celu określenia zmiany w szlaku sygnałowym SHH za pośrednictwem PC w ludzkich komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki z odwrotną transkryptazą telomerazy (hTERT) (hTERT-RPE1, określane tutaj jako RPE1). Komórki RPE1 są prawie diploidalnymi, nieprzekształconymi komórkami ludzkimi, które są szeroko stosowane jako model komórkowy do ciliogenezy, ponieważ około 75%-80% tych komórek gromadzi PC po głodzeniu surowicy (inkubacja komórek w pożywce wolnej od surowicy) przez 24-48 godzin, w porównaniu do zaledwie 15%-18% rzęsków w asynchronicznie rosnącej kulturze komórek RPE116.
Sygnalizacja jeża (HH) jest zachowana wśród kręgowców dla rozwoju embrionalnego17. U ssaków obserwuje się trzy różne typy sygnalizacji Hedgehog: Sonic (SHH), Indian (IHH) i Desert (DHH), z których SHH i IHH wykazują nakładające się funkcje na poziomie tkanki11. Sygnalizacja SHH odgrywa kluczową rolę podczas rozwoju embrionalnego, regulując ułożenie kończyn i specyfikację typu komórek w układzie nerwowym oraz utrzymując homeostazę dorosłych tkanek10,11,18. Chociaż sygnalizacja SHH jest złożona, istnieje coraz więcej dowodów sugerujących, że kanoniczna sygnalizacja SHH jest zależna od PC7,11,19, w którym pośredniczą zbiorowe funkcje czynników transkrypcyjnych Gli (Gli1, Gli2 i Gli3). Sugeruje się, że sygnalizacja HH i PC ewoluowały równocześnie, z krytycznymi komponentami sygnalizacyjnymi skoncentrowanymi w zwartej objętości na końcu rzęski, aby umożliwić skuteczne odpowiedzi na niskie proporcje ligandów11.
W przypadku braku ligandów SHH, Patched1 (Ptch1), który jest zlokalizowany na błonie PC, hamuje aktywność Smoothened (Smo) poprzez słabo poznany mechanizm, który prawdopodobnie obejmuje transport lipidów, utrzymując w ten sposób szlak stłumiony7,20. Konstytutywnie aktywny rzęskowy GPR161, który jest receptorem białkowym sprzężonym z G i negatywnym regulatorem systemu, zapewnia utrzymanie represji poprzez utrzymanie wysokiego poziomu rzęskowego cyklicznego AMP (cAMP), który zwiększa aktywność kinazy białkowej A (PKA)21, oraz poprzez utrzymanie rzęskowej lokalizacji PKA7. Aktywność PKA, wraz z kinazą kazeinową 1 (CK1) i kinazą syntazy glikogenu 3 β (GSK3β), fosforyluje wiele reszt białek Gli, Gli2 i Gli3, wewnątrz PC. Gli2 i Gli3 mogą działać zarówno jako aktywatory, jak i represory transkrypcji docelowych genów. Fosforylacja za pośrednictwem PKA powoduje hamowanie funkcji aktywatora Gli2, podczas gdy fosforylowany Gli3 jest rozszczepiany przez proteazy w celu wytworzenia represora w postaci Gli3R22. Ogólnie rzecz biorąc, ekspresja docelowych genów SHH jest w takich warunkach tłumiona.
Gdy ligand SHH jest obecny, Ptch1 wiąże się z nim, a GPR161 opuszcza PC, a Smo, fosforylowany przez receptor sprzężony z białkiem G (GPCR) kinazę 2 (GPRK2) i CK1, jest transportowany do PC, razem z β-aresztiną i silnikiem mikrotubul KIF3A23. W związku z tym promowana jest lokalizacja Gli2/3, supresora fuzji (SUFU) i Kif7 na końcu rzęsek i jest związana ze zmniejszonym rozszczepieniem Gli2/3, zwiększając w ten sposób funkcję aktywatora Gli2/324,25. Po aktywacji Gli2/3 indukuje ekspresję Gli1, który może działać tylko jako aktywator, a tym samym wzmacnia odpowiedź szlaku SHH22. Wiązanie SHH z Ptch1 jest ułatwione przez związane z CAM/w dół przez onkogeny (CDO), brata CDO (BOC), specyficzne dla zatrzymania wzrostu 1 (GAS1) i białko związane z receptorem lipoprotein o niskiej gęstości 2 (LRP2). I odwrotnie, białko oddziałujące z jeżem (HHIP) może sekwestrować SHH poprzez bezpośrednią interakcję z nim, a także konkuruje z Ptch1 w interakcji z SHH26. Co ważne, GLI1, HHIP i PTCH1 są transkrybowane po aktywacji szlaku SHH, podczas gdy dwa ostatnie uczestniczą w negatywnej regulacji szlaku SHH.
Poprzednie badania wykazały, że poziomy transkryptów docelowych genów SHH mogą być mierzone w celu oceny szlaku SHH, chociaż mogą się znacznie różnić w różnych typach komórek27,28. Taka zmienność w odpowiedzi szlaku SHH może być przypisana różnym kombinacjom sygnalizacji SHH za pośrednictwem PC i sygnalizacji SHH, w której pośredniczy błona komórkowa, prawdopodobnie przy braku PC. SAG jest agonistą Smo, który jest stosowany w tej metodzie do naśladowania aktywacji sygnalizacji SHH w komórkach RPE1 pozbawionych surowicy, które są głównie orzęsione. Poziomy transkryptów docelowych genów SHH, takich jak HHIP, GLI1 i PTCH1 oraz genu SMO niedocelowego mierzono za pomocą qPCR w komórkach kontrolnych i leczonych SAG i porównano w celu określenia aktywacji szlaku SHH. Udana demonstracja tego czułego testu opartego na hodowli komórkowej do pomiaru sygnalizacji SHH za pośrednictwem PC sugeruje jego obiecujące zastosowanie w badaniach biomedycznych związanych z pierwotną funkcją rzęsek.

<table><tbody><tr><td>DMSO, sterylnie filtrowany</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Osioł, anty-mysie IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Osioł, anty-królicze IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco</td><td>, Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td>Mikroskop fluorescencyjny <td>Himedia</td><td>RM1112</td><td></td></tr><tr><td>wyposażony w obiektyw 60X</td><td>Carl Zeiss&nbsp;</td><td></td><td>Axio observer colibri 5</td></tr><tr><td>komórek hTERT-RPE1</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>iScript Zestaw do syntezy cDNA</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>Mysz, monoklonalne przeciwciało antyacetylowane tubuliny</td><td>Milipore Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>Końcowe rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, 100X</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Ilościowa maszyna do PCR, CFX 96</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Królik, poliklonalne przeciwciało Arl13B</td><td>ProteinTech</td><td>17711-1-AP</td><td>Końcowe rozcieńczenie 1:250</td></tr><tr><td>Królik, poliklonalne przeciwciało Cep135</td><td>ProteinTech</td><td>24428-1-AP</td><td>Końcowe rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Złoto SlowFade Antifade moutant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S36940</td><td></td></tr><tr><td>Wygładzony Agonista (SAG)&nbsp;</td><td>Abmole</td><td>M4865</td><td>Roztwór podstawowy: w DMSO, 5 mM</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Uniwersalny SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>12605028</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowy test oparty na pcr do pomiaru sygnalizacji sonic hedgehog w komórkowym modelu ciliogenezy

Quantitative PCR-based Assay to Measure Sonic Hedgehog Signaling in Cellular Model of Ciliogenesis

Ciliopatia odnosi się do zbioru wieloukładowych i wielogenowych chorób i zaburzeń u ludzi, które powstają z powodu aberracji struktury lub funkcji ruchliwych lub nieruchomych (pierwotnych) rzęsek, które są wypukłościami komórkowymi opartymi na mikrotubulach. Rzęski pierwotne (PC) są obecne w większości ludzkich tkanek nabłonkowych i śródbłonka i służą jako centrum transdukcji sygnałów fizjologicznych, w tym sygnalizacji Sonic Hedgehog (SHH). Różne sytuacje wymagają zbadania funkcji PC, co można osiągnąć poprzez pomiar kanonicznej ścieżki sygnałowej SHH, która jest prawie wyłącznie pośredniczona przez PC. W tym przypadku opracowano ilościową technikę opartą na PCR (qPCR) w celu pomiaru poziomu transkrypcji genów szlaku SHH w komórkach w stanie spoczynku hTERT-RPE1 (lub RPE1), które w większości zawierają PC. Spoczynek w komórkach RPE1 osiąga się poprzez głód surowicy przez 48 godzin, podczas gdy aktywacja szlaku SHH jest promowana przez specyficznego agonistę. Ten test oparty na hodowlach komórkowych jest łatwy do naśladowania i czuły. Udana demonstracja tego testu na rzęskowych komórkach RPE1 wskazuje na jego ogromny potencjał jako testu in vitro do badania prawidłowej funkcji PC po genetycznej lub epigenetycznej zmianie jednego lub wielu genów, które mogą być związane z różnymi ciliopatiami.

Aktywacja szlaku przekazywania sygnału SHH pośredniczonego przez PC pozwala na zrozumienie prawidłowej funkcji PC7. W niniejszej procedurze mierzono względną ekspresję genów docelowych szlaku SHH za pomocą testu RT-qPCR po aktywacji szlaku SHH przez SAG w komórkach RPE1, z których większość posiada rzęski. Bezpośrednie produkty transkrypcyjne szlaku SHH, GLI1 i PTCH1, są często wykorzystywane do oceny aktywności tego szlaku11. Protokół ten obejmuje również transkrypty HHIP,...

Badanie demonstruje ilościowy test oparty na PCR dla aktywacji szlaku sygnałowego Sonic Hedgehog (SHH) za pośrednictwem rzęsek za pomocą agonisty SHH w komórkowym modelu ciliogenezy.

Ilościowy test oparty na PCR do pomiaru sygnalizacji sonic hedgehog w komórkowym modelu ciliogenezy

Ciliopathy refers to a collection of multisystemic and polygenic human diseases and disorders that arise due to aberration of structure or function of ...

Opracowaliśmy czuły i ilościowy test oparty na hodowli komórkowej, który można wykorzystać do oceny sygnalizacji Sonic Hedgehog, która jest transdukowana głównie przez rzęski pierwotne. Ten test może być wykorzystany do zbadania zmian genetycznych i epigenetycznych, które są związane z pierwotną dysfunkcją rzęsek. Pomimo centralnej roli rzęsek pierwotnych w sygnalizacji Sonic Hedgehog, obecnym metodologiom często brakuje czułości wymaganej do oceny funkcji rzęsek pierwotnych w przypadku zmian genetycznych.Protokół ten wypełnia tę lukę, zapewniając test oparty na hodowli komórkowej, naśladując aktywację Sonic Hedgehog i ekspresję docelowego genu Sonic Hedgehog w komórkach rzęskowych. W porównaniu z innymi protokołami, takimi jak lokalizacja wygładzonego białka wzdłuż rzęsek pierwotnych po aktywacji szlaku Sonic Hedgehog, nasz test jest ilościowy, łatwy do naśladowania i czuły, ponieważ opiera się na hodowli komórkowej. Na początek wyjmij kolbę do hodowli komórek T25 zawierającą prawie zlewające się komórki RPE-1 rosnące w pięciu mililitrach kompletnego podłoża z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Wyrzucić pożywkę hodowlaną z kolby do hodowli komórkowej i usunąć komórki z aktywnością enzymatyczną wstępnie podgrzanego 0,25% roztworu trypsyny-EDTA. Zawiesić komórki w kolbie przy użyciu wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża. Policz komórki na hemocytometrze, aby określić gęstość komórek zawiesiny.Umieść dwie sterylne 12-milimetrowe szkiełka przykrywkowe w dwóch 35-milimetrowych naczyniach do hodowli komórkowych. Wysiewaj dwa razy 10 do potęgi pięciu asynchronicznie rosnących komórek RPE-1 w każdym naczyniu zawierającym szkiełka nakrywkowe. Dodaj dwa mililitry kompletnej pożywki do każdego naczynia i hoduj komórki przez 24 godziny.Po inkubacji usunąć pożywkę z rosnących komórek RPE-1 i przemyć komórki raz jednym mililitrem wstępnie podgrzanego buforu DPBS. Do każdego naczynia dodać dwa mililitry podgrzanej pożywki DMEM zawierającej 1% streptomycyny penicyliny bez FBS. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny.Następnego dnia należy zastąpić pożywkę pożywką pozbawioną surowicy zawierającą wygładzonego agonistę o końcowym stężeniu 250 nanomolowych. Inkubuj komórki przez kolejne 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po inkubacji przenieść szkiełka nakrywkowe na płytkę 24-dołkową, umieszczając po jednym szkiełku nakrywkowym w każdym dołku.Dodaj 0,5 mililitra schłodzonego metanolu do każdej studzienki, aby utrwalić komórki. Inkubować płytkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 10 minut. Szkiełka nakrywkowe należy natychmiast trzykrotnie umyć 0,5 mililitra buforu do mycia.Wyrzuć pożywkę z naczyń. Dodaj 0,5 mililitra odczynnika TRIzol bezpośrednio do każdego naczynia. Rozprowadź odczynnik równomiernie i odstaw na pięć minut.Pipetuj kilka razy w górę iw dół, aby utworzyć jednorodną mieszaninę i zbierz ją do 1,5 mililitrowych, wolnych od nukleaz probówek mikrowirówek Dodaj 0,1 mililitra chloroformu do każdej probówki zawierającej komórki zmieszane z trizolem potraktowane wygładzonym agonistą i DMSO. Inkubować probówki przez dwie do trzech minut, a następnie odwirować w temperaturze 12 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść fazę wodną zawierającą RNA do świeżych probówek do mikrowirówek.Dodaj 0,25 mililitra izopropanolu do fazy wodnej i inkubuj probówki przez 10 minut. Odwirować próbki o masie 12 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Obserwuj tworzenie się białego, żelopodobnego osadu RNA.Ostrożnie wyrzucić supernatant za pomocą mikropipety. Następnie ponownie zawieś osad RNA w 0,5 mililitra świeżo rozcieńczonego 75% etanolu. Krótko zwiruj rurki, aby zapewnić mieszanie.Odwirować próbki o masie 7,500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie wyrzucić supernatant za pomocą mikropipety. Suszyć granulki RNA na powietrzu przez 10 minut.Ponownie zawiesić granulki w 25 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Zmierz całkowite stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego o długości 260 nanometrów. Użyj od jednego do trzech mikrogramów całkowitego RNA z każdej próbki do syntezy cDNA zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi zestawu do syntezy cDNA.Ustaw reakcje qPCR w trzech egzemplarzach, używając rozcieńczonego cDNA w proporcji jeden do pięciu z każdej próbki z zestawami starterów genów GLI1, PTCH1, HHIP, SMO i beta-aktyny, z główną mieszanką qPCR w wielodołkowej, wrażliwej na fluorescencje płytce PCR. Przykryj płytkę PCR odpowiednim uszczelniaczem. Umieścić płytkę w urządzeniu do qPCR.Uruchom standaryzowany program qPCR z 40 cyklami amplifikacji, a następnie analizą krzywej topnienia. Po przebiegu sprawdź krzywą topnienia każdego amplikonu pod kątem pojedynczego piku w żądanej temperaturze. Wyeksportuj dane wzmocnienia do arkusza kalkulacyjnego.Oblicz względną ekspresję każdego transkryptu, normalizując ekspresję beta-aktyny, wykreśl dane wyrażenia względnego na wykresie i oblicz istotność statystyczną zmian w ekspresji za pomocą niesparowanego testu t. Większość komórek pozbawionych surowicy złożyła pierwotne rzęski z ponad 85% rzęskami. W tym stanie poziomy ekspresji GLI1, PTCH1 i HHIP były znacznie zwiększone w gładkich komórkach traktowanych agonistami w porównaniu z komórkami traktowanymi DMSO, podczas gdy poziomy transkryptu SMO nie wykazały znaczącej zmiany.

quantitative-pcr-based-assay-to-measure-sonic-hedgehog-signaling

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy zastosowanie testu opartego na komórkach ES myszy w celu zidentyfikowania krytycznych okien czasowych aktywacji sygnałów Wnt/β-catenin i BMP podczas indukcji kardiogennej. Metoda ta stanowi standaryzowaną platformę, która pozwala na wiarygodne ilościowe określenie wydajności kardiogennej i może być stosowana do badania innych linii komórkowych.

Zmodyfikowany test oparty na mysich embrionalnych komórkach macierzystych do ilościowego określania wydajności indukcji kardiogennej

Analiza specyficzna dla tkanki w modelu regeneracji mieszka włosowego z wykorzystaniem lentiwirusów do mediacji funkcji wzmocnionej (gain-of-function) lub utraconej (loss-of-function).

Szybka analiza genetyczna sygnalizacji nabłonkowo-mezenchymalnej podczas regeneracji włosa

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

Pierwotne rzęski wpływają na różne szlaki sygnałowe. Ślimak ssaków jest idealny do badania sygnalizacji biegunowości komórek płaskich (PCP). Dysfunkcja rzęsek wpływa na rozrost ślimaka, wzór komórkowy i orientację komórek rzęsatych, odczyty PCP. Naszym celem jest analiza sygnalizacji PCP w ślimaku myszy za pomocą analizy fenotypowej, immunohistochemii i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

Ten artykuł wideo szczegółowo opisuje prostą metodologię in vivo, która może być używana do systematycznego i efektywnego charakteryzowania składników złożonych szlaków sygnałowych i sieci regulacyjnych w wielu zarodkach bezkręgowców.

Siła prostoty: zarodki jeżowców jako modele rozwojowe in vivo do badania złożonych interakcji sieci sygnalizacyjnych między komórkami

Udało nam się wygenerować dwa testy γ sekretazy specyficzne dla substratu. Oba przedstawione tutaj testy komórkowe mają na celu ilościowe określenie aktywności enzymatycznej γ-sekretazy poprzez wyniki reporterów lucyferazy świetlika.

Ilościowy pomiar białka prekursorowego amyloidu za pośrednictwem γ-sekretazy i rozszczepienia Notch w komórkowych platformach testowych reporterowych lucyferazy

Protokół hodowli i manipulacji tkanką embrionalną myszy na chipie mikroprzepływowym jest dostarczony. Stosując impulsy modulatorów szlaku, system ten może być wykorzystany do zewnętrznego sterowania oscylacjami sygnałowymi w celu funkcjonalnego badania somitogenezy myszy.

Podejście mikrofluidyczne do funkcjonalnego badania oscylacji sygnalizacyjnych rządzących somitogenezą

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Tutaj prezentujemy powtarzalny protokół elektroporacji in vitro do manipulacji genetycznej pierwotnych prekursorów komórek ziarnistych móżdżku (GCP), który jest opłacalny, wydajny i opłacalny. Co więcej, protokół ten demonstruje również prostą metodę badania molekularnego pierwotnych szlaków sygnałowych Hedgehog zależnych od rzęsek w pierwotnych komórkach GCP.

Wydajna i ekonomiczna metoda elektroporacji do badania pierwotnych szlaków sygnałowych zależnych od rzęsek w prekursorze komórek ziarnistych

Odruch wysuwania cycylka, znany jako PER, to test zachowań smakowych stosowany u muszek oraz pszczół miodnych. Gdy cycylek zetknie się z substancją atrakcyjną, mucha wysuwa go, aby spożyć tę substancję. Roztwory różnych cukrów są dla muchy bardzo atrakcyjne.

Test odpowiedzi wyciągania trąbka (PER) u Drosophila

Poznaj ilościowy test PCR do oceny sygnalizacji Sonic Hedgehog w komórkowym modelu ciliogenezy. Ta metoda umożliwia badanie genetycznych i epigenetycznych zmian związanych z dysfunkcją pierwotnych rzęsek.

Ilościowy test oparty na PCR do pomiaru sygnalizacji sonic hedgehog w komórkowym modelu ciliogenezy

Przeglądaj więcej filmów