Name: Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Poznaj technikę obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach z zastosowaniem barwnika Fura-2/AM do badania aktywacji kanałów jonowych TRPV1. Ta metoda umożliwia ilościowy monitoring zmian stężenia jonów wapnia w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania dla Bailong Xiao z Uniwersytetu Tsinghua za udostępnienie systemu obrazowania Ca2+ jednokomórkowego oraz systemu operacyjnego kontroli temperatury, a także za wsparcie i pomoc w tym projekcie. Badania te zostały sfinansowane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32000705), Program Sponsorowania Młodych Elitarnych Naukowców przez Chińskie Stowarzyszenie Medycyny Chińskiej (CACM-(2021–QNRC2–B11)), Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (2020–JYB–XJSJJ–026), (2024-JYB-KYPT-06).

Metody eksperymentalne zostały zatwierdzone i przestrzegały wytycznych IACUC Uniwersytetu Tsinghua i Pekińskiego Uniwersytetu Medycyny Chińskiej. Protokół ten wprowadza metody obrazowania pojedynczych komórek Ca2 + dla różnych typów komórek, w tym pierwotnych keratynocytów wyizolowanych ze skóry kilku nowonarodzonych myszy (w ciągu trzech dni od urodzenia, z losowo dobranymi płciowo rodzeństwem z miotu, myszy C57BL / 6). Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie komórek
UWAGA: Komórki pierwotne, linie komórkowe z endogennymi genami docelowymi lub te transfekowane nadekspresyjnymi plazmidami są odpowiednie do obrazowania pojedynczej komórki Ca2+. Plazmidy użyte w tym badaniu zostały uzyskane z laboratorium profesora Xiao Bailonga na Uniwersytecie Tsinghua. Plazmidy te zostały skonstruowane przez włączenie sekwencji białka fluorescencyjnego GFP z ludzkim STIM1, białka fluorescencyjnego DsRed z ludzkim Orai1, białka fluorescencyjnego mRuby z króliczym TRPV1, a także białka czerwonej fluorescencji mCherry do wektorów plazmidu fagowego10.
<ol>
	<li>Przygotować sterylne szkiełka podstawowe o średnicy 8 mm na płytce 24-dołkowej. Dodaj 500 μl buforu poli-D-lizyny (PDL) (50 μg/ml w DPBS) do każdego dołka.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić powlekanie, a następnie wyrzucić roztwór powlekający za pomocą pipety.</li>
	<li>Umyj szkiełka raz za pomocą DPBS i odłóż je na bok do późniejszego wykorzystania.</li>
	<li>Hoduj pierwotne komórki i linie komórkowe oddzielnie, zgodnie z ich specyficznymi metodami hodowli10.</li>
	<li>Komórki nasienne na przygotowaną 24-dołkową płytkę o gęstości około 1,5 x 105 komórek na dołek. Użyj komórek do obrazowania Ca2+ po przyklejeniu się do szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>W przypadku plazmidów z nadekspresją komórek, transfect10,15 docelowego plazmidu (1 μg/dołek) za pomocą odczynnika do transfekcji Lipofectamine 2000 (lub Lipofectamine 3000) w stosunku 1:1 i inkubować w inkubatorze hodowli komórkowych przez około 24 godziny 
	nuta: W przypadku większych białek może być konieczny dłuższy czas inkubacji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu roboczego Fura-2/AM
<ol>
	<li>Dodać 50 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do probówki zawierającej 50 μg proszku Fura-2/AM i dobrze wymieszać, aby przygotować 1 μg/μl roztwór podstawowy Fura-2/AM.</li>
	<li>Wymieszaj roztwór podstawowy Fura-2/AM i Pluronic F-127 z buforem Hanka zawierającym 1,3 mM Ca2 + 
	nuta: Końcowe stężenie Fura-2/AM i Pluronic F-127 w roztworze roboczym wynosi 2,5 μg/ml. Bufor Hanka przygotowuje się przez dodanie 10 mM HEPES do 1x bufora HBSS.</li>
	<li>Użyj folii aluminiowej, aby chronić roztwór roboczy Fura-2/AM przed światłem.</li>
</ol>
3. Wstępne leczenie komórek do obrazowania pojedynczych komórek Ca2+
<ol>
	<li>Przenieść szkiełka podstawowe z komórkami na nową 24-dołkową płytkę zawierającą bufor Hanka do mycia.</li>
	<li>Odrzucić bufor za pomocą pipety i dodać 500 μl buforu roboczego Fura-2/AM do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut, aby umożliwić załadowanie sondy.</li>
	<li>Usuń bufor roboczy Fura-2/AM i umyj komórki trzykrotnie buforem Hanka, aby wyeliminować nadmiar Fura-2/AM. Ogniwa są teraz gotowe do użycia.</li>
</ol>
4. Uruchamianie systemu obrazowania Ca2+
UWAGA: W tym badaniu, mikroskop fluorescencyjny jest używany do obrazowania Ca2+.
<ol>
	<li>Uruchom kolejno następujące komponenty: światło DG4 (lampa ksenonowa), kamera, źródło światła białego, kontroler stolika mikroskopu, mikroskop, komputer i oprogramowanie do obrazowania fluorescencyjnego. 
	nuta: Jeśli wykryjesz aktywację kanałów jonowych przez temperaturę, włącz również następujące elementy: system perfuzyjny, system grzewczy, regulator temperatury i urządzenie do ogrzewania/chłodzenia cyrkulacji cieczy.</li>
</ol>
5. Procedura odpowiedzi komórkowej Ca2+
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do obrazowania fluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Wybierz pozycję Protokół, a następnie wybierz pozycję Plik, a następnie pozycję Załaduj protokół. Wybierz protokół i kliknij OK.</li>
		<li>Skonfiguruj eksperyment (na liście menu).</li>
		<li>Wybierz pozycję Nowy eksperyment.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj komorę perfuzyjną w mikroskopie. 
	nuta: Zawsze całkowicie opuszczaj obiektyw podczas montażu lub wyjmowania komór za pomocą pokrętła szorstkiego ustawiania ostrości, aby zapobiec uszkodzeniu obiektywu.</li>
	<li>Usuń szkiełka komórkowe poddane działaniu Fura-2/AM i umieść je w komorze zawierającej bufor Hanka.</li>
	<li>Uruchom system perfuzyjny.</li>
	<li>Wybierz obiektyw DIC 20x i wyreguluj ostrość w białym świetle.</li>
	<li>Kliknij Cfg Exp na pasku zadań.
	<ol>
		<li>Wybierz żądane fluory do obrazowania.</li>
		<li>Określ częstotliwość akwizycji i ustawienia wyświetlania na ekranie (Pobieranie: sprawdź 340, 380, GFP; Interwał pozyskiwania: 1 s; Interwał zapisu: 1 s).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ognisko
	<ol>
		<li>W panelu sterowania eksperymentu kliknij przycisk Skup się.</li>
		<li>Dostosuj czas akwizycji (zwykle 100 ms) i wzmocnienie w razie potrzeby, a następnie "zapisz na tę falę" 
		nuta: W przypadku światła UV użyj wzmocnienia zamiast czasu ekspozycji.</li>
		<li>Wybierz żądaną długość fali do ustawiania ostrości (np. 380) i kliknij Rozpocznij ustawianie ostrości.</li>
		<li>Przełącz widok z lornetki na komputer.</li>
		<li>Upewnij się, że przez lornetkę widoczny jest słaby zielonkawy kolor.</li>
		<li>Skoncentruj się na komórkach, używając najpierw przybliżonej ostrości, aby zbliżyć obiektyw, a następnie precyzyjnej ostrości. 
		nuta: Mikroskop wyda sygnał dźwiękowy, jeśli zbliży się zbyt blisko sceny. Jeśli tak się stanie, opuść obiektyw, wyrównaj płytkę na stole montażowym i ponownie ustaw ostrość. Zminimalizuj czas spędzony na ustawianiu ostrości, aby zmniejszyć uszkodzenia komórek wywołane laserem.</li>
		<li>Sprawdź intensywność fluorescencji komórek podczas procesu ustawiania ostrości.</li>
		<li>Dostosuj intensywność fluorescencji komórek, modyfikując czas ekspozycji i wzmocnienie. 
		nuta: Czas ekspozycji i wzmocnienie dla 340 i 380 muszą być spójne.</li>
		<li>Po uzyskaniu dobrej ostrości naciśnij przycisk na mikroskopie, aby przełączyć view na komputer.</li>
		<li>W razie potrzeby ponownie ustaw ostrość, aby uzyskać najostrzejszy obraz na komputerze, a następnie kliknij Zatrzymaj ustawianie ostrości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywna procedura znajdowania komórek GFP dodatnich
	<ol>
		<li>Najpierw użyj procedury 340/380, aby uzyskać dobre skupienie na komórkach.</li>
		<li>Wybierz FITC, a następnie kliknij Rozpocznij ustawianie ostrości.</li>
		<li>Użyj kontrolera stopnia, aby znaleźć komórki GFP-dodatnie.</li>
		<li>Przełącz widok na komputer, a następnie kliknij Zatrzymaj ustawianie ostrości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybór regionu
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk Region na pasku menu.</li>
		<li>Wybierz odpowiedni typ oświetlenia (340/380/FITC/TRITC). Filtry FITC i TRITC są wybierane odpowiednio dla GFP i mCherry/DsRed/mRuby, dla komórek z nadekspresją docelowych plazmidów; w przeciwnym razie wybierz Fura-2. 
		nuta: Unikaj wybierania komórek, które są w złym stanie lub są martwe, takich jak te, które są wyraźnie zaokrąglone lub mają prześwietlone białka fluorescencyjne.</li>
		<li>Kliknij Pobierz obrazy, a następnie OK.</li>
		<li>Pojawi się nowe okno; zaznacz komórki, klikając narzędzie owalu, a następnie klikając komórkę.</li>
		<li>Wybierz żądane komórki pod wpływem fluorescencji przenoszonej przez białko docelowe (FITC lub TRITC). Wybierz komórki kontrolne, które nie wykazują ekspresji białka docelowego w warunkach 380 nm.</li>
		<li>Cofnij region, klikając prawym przyciskiem myszy okrąg, a następnie wybierając polecenie Usuń region.</li>
		<li>Wybierz próbkę tła jako ostatni region i zapisz jego numer identyfikacyjny.</li>
		<li>Kliknij Zapisz, a następnie Gotowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odejmowanie tła
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk menu Referencje.</li>
		<li>Wskaż numer regionu tła. 
		nuta: Jeśli tło było ostatnim wybranym regionem, wprowadzenie bardzo dużej liczby spowoduje automatyczne przełączenie na ostatnio wybrany region.</li>
		<li>Zaznacz pole Odejmij odwołania, a następnie kliknij OK.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dane dziennika
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk Log Data (Dane dziennika) na panelu sterowania eksperymentu. 
		nuta: Obrazy są zapisywane tylko wtedy, gdy istnieje chęć odtworzenia eksperymentu później; Zwykle wystarczy zaznaczyć pole danych.</li>
		<li>Upewnij się, że pojawi się monit z prośbą o preferowany typ pliku danych; wybierając . Zalecany jest format XLSX.</li>
		<li>Otworzy się arkusz typu ".xlsx". Zminimalizowanie arkusza roboczego zapobiegnie zajmowaniu przez niego miejsca na ekranie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja danych
	<ol>
		<li>W sekcji Upływ czasu w panelu sterowania ustaw interwał zbierania danych na 1 s. 
		nuta: Można to dostosować do rzeczywistych potrzeb.</li>
		<li>Kliknij Zegar Zerowy i Zdobądź na panelu sterowania eksperymentu, aby rozpocząć eksperyment. Linie bazowe będą widoczne na wykresie wskazującym każdy z wybranych regionów komórki.</li>
		<li>Wykonaj serię zabiegów na komórkach zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.</li>
		<li>Aby zaobserwować reakcję temperaturową komórek, należy podgrzać bufor w układzie perfuzyjnym do odpowiedniej temperatury za pomocą regulatora temperatury.</li>
		<li>Aby zaobserwować wpływ leków na komórki, należy wykonać perfuzję lub ręcznie dodać bufor zawierający lek i zarejestrować zmiany w komórkach.</li>
		<li>Po zakończeniu zbierania danych kliknij Pause. 
		nuta: Akwizycję danych można wstrzymać, a zegar można zresetować w dowolnym momencie eksperymentu.</li>
		<li>Zapisywanie i analizowanie danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij pozycję Plik i zamknij eksperyment, aby zakończyć eksperyment, a następnie wybierz opcję Nie w oknie dialogowym, aby zapisać protokół.</li>
	<li>Otwórz nowy eksperyment, klikając Nowy w menu i powtórz proces.</li>
	<li>Zamknięcie systemu
	<ol>
		<li>Zamknij oprogramowanie i przenieś dane z komputera.</li>
		<li>Odwróć procedurę uruchamiania.</li>
		<li>Rejestruj godziny na arkuszu rejestracyjnym i posprzątaj bałagan.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza danych
	<ol>
		<li>Przedstawić wewnątrzkomórkowe stężenie Ca2+ za pomocą stosunku Fura-2 340/380 lub przeliczyć na odpowiednie stężenie Ca2+.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Single Cell Calcium Imaging for Channel Activation Studies

<ol><li>Murthy, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+for+contraction+and+relaxation+in+smooth+muscle+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signaling for contraction and relaxation in smooth muscle of the gut.</a> Annu Rev Physiol. 68, 345-374 (2006).</li>
<li>Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+extracellular+fields+and+currents--eeg%2C+ecog%2C+lfp+and+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The origin of extracellular fields and currents--eeg, ecog, lfp and spikes.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).</li>
<li>Rogers, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+airway+mucus+secretion+and+pathophysiology+of+hypersecretion%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Care%22%5BJournal%5D)">Physiology of airway mucus secretion and pathophysiology of hypersecretion.</a> Respir Care. 52 (9), 1134-1146 (2007).</li>
<li>Mitra, R., Hasan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+Ca%282%2B%29+entry+regulates+neuronal+gene+expression+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Store-operated Ca(2+) entry regulates neuronal gene expression and function.</a> Curr Opin Neurobiol. 73, 2022(2022).</li>
<li>Landstrom, A. P., Dobrev, D., Wehrens, X. H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+cardiac+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and cardiac arrhythmias.</a> Circ Res. 120 (12), 1969-1993 (2017).</li>
<li>Zheng, C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+deficiency+of+coagulation+factors+v+and+viii%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Combined deficiency of coagulation factors v and viii: An update.</a> Semin Thromb Hemost. 39 (6), 613-620 (2013).</li>
<li>Ahmadian Elmi, M., Motamed, N., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analyses+of+the+g+protein-coupled+estrogen+receptor+gper1+reveal+constitutive+links+to+endoplasmic+reticulum%2C+glycosylation%2C+trafficking%2C+and+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Proteomic analyses of the g protein-coupled estrogen receptor gper1 reveal constitutive links to endoplasmic reticulum, glycosylation, trafficking, and calcium signaling.</a> Cells. 12 (21), 2571(2023).</li>
<li>Prakriya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orai1+is+an+essential+pore+subunit+of+the+crac+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Orai1 is an essential pore subunit of the crac channel.</a> Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).</li>
<li>Caterina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+A+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: A heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389 (6653), 816-824 (1997).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stim1+thermosensitivity+defines+the+optimal+preference+temperature+for+warm+sensation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Stim1 thermosensitivity defines the optimal preference temperature for warm sensation in mice.</a> Cell Res. 29 (2), 95-109 (2019).</li>
<li>Bharate, S. S., Bharate, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+thermoreceptor+trpm8+by+cooling+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modulation of thermoreceptor trpm8 by cooling compounds.</a> ACS Chem Neurosci. 3 (4), 248-267 (2012).</li>
<li>Coste, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo+proteins+are+pore-forming+subunits+of+mechanically+activated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels.</a> Nature. 483 (7388), 176-181 (2012).</li>
<li>Behera, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+Ca2%2B+dynamics+using+a+ubiquitin-10+promoter-driven+yellow+cameleon+3.6+indicator+reveal+reliable+transgene+expression+and+differences+in+cytoplasmic+Ca2%2B+responses+in+arabidopsis+and+rice+%28oryza+sativa%29+roots%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Analyses of Ca2+ dynamics using a ubiquitin-10 promoter-driven yellow cameleon 3.6 indicator reveal reliable transgene expression and differences in cytoplasmic Ca2+ responses in arabidopsis and rice (oryza sativa) roots.</a> New Phytol. 206 (2), 751-760 (2015).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+analysis+of+stim1+thermal+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism analysis of stim1 thermal sensation.</a> Cells. 12 (22), 2613(2023).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+safeguards+organelle+homeostasis+and+cellular+aging+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discov%22%5BJournal%5D)">ATF6 safeguards organelle homeostasis and cellular aging in human mesenchymal stem cells.</a> Cell Discov. 4, 2(2018).</li>
<li>Jiang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanosensitive+piezo1+channel+mediates+heart+mechano-chemo+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanosensitive piezo1 channel mediates heart mechano-chemo transduction.</a> Nat Commun. 12 (1), 869(2021).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Orai1-mediated+store-operated+Ca%282%2B%29+channel%2Fcalpain+signaling+contributes+to+high+glucose-induced+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced Orai1-mediated store-operated Ca(2+) channel/calpain signaling contributes to high glucose-induced podocyte injury.</a> J Biol Chem. 298 (6), 101990(2022).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+er+ion+homeostasis+maintained+by+an+er+anion+channel+clcc1+contributes+to+als-like+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Disruption of er ion homeostasis maintained by an er anion channel clcc1 contributes to als-like pathologies.</a> Cell Res. 33 (7), 497-515 (2023).</li>
<li>Gouin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trpv1+and+trpa1+in+cutaneous+neurogenic+and+chronic+inflammation%3A+Pro-inflammatory+response+induced+by+their+activation+and+their+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Trpv1 and trpa1 in cutaneous neurogenic and chronic inflammation: Pro-inflammatory response induced by their activation and their sensitization.</a> Protein Cell. 8 (9), 644-661 (2017).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+fura-2+am%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am.</a> J Vis Exp. (23), e1067(2009).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lever-like+transduction+pathway+for+long-distance+chemical-+and+mechano-gating+of+the+mechanosensitive+piezo1+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A lever-like transduction pathway for long-distance chemical- and mechano-gating of the mechanosensitive piezo1 channel.</a> Nat Commun. 9 (1), 1300(2018).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowanie jednokomórkowych systemów obrazowania Ca2 + jest szerokie, umożliwiając badanie sygnałów Ca2 + w różnych typach komórek, w tym keratynocytach, komórkach macierzystych16, komórkach wątroby, komórkach serca17, podocytach18, komórkach odpornościowych i liniach komórkowych z nadekspresją białek docelowych10,19. Technika ta mierzy zmiany i wartości bezwzględne stężeń komórkowych Ca2+ i odgrywa kluczową rolę w badaniu kanałów jonowych związanych z Ca2+, co czyni ją jednym z podstawowych instrumentów w laboratoriach badawczych kanałów jonowych.
Wraz z postępem badań znaczenie kanałów jonowych związanych z sygnałem Ca2+ zyskuje coraz większe uznanie wśród badaczy tradycyjnej medycyny chińskiej. Ich celem jest rozszyfrowanie podstawowych zagadnień tradycyjnej medycyny chińskiej przez pryzmat kanałów jonowych. Na przykład, gorące i zimne właściwości medycyny chińskiej wpływają na zasadę "traktowania ciepła zimnem i traktowania zimna ciepłem". Wiele wrażliwych na temperaturę kanałów jonowych, które pośredniczą w sygnałach Ca2+ , jest ściśle związanych z tą zasadą. Ponadto wiele chińskich leków wywiera efekty terapeutyczne poprzez działanie przeciwzapalne, przy czym wiele kanałów jonowych związanych z Ca2 + odgrywa znaczącą rolę w regulacji stanu zapalnego20.
Niezbędne jest zbadanie wpływu ważnych składników tradycyjnej medycyny chińskiej na charakterystykę kanałów jonowych, aby ujawnić właściwości farmakologiczne tych leków na poziomie molekularnym. Obecnie badacze tradycyjnej medycyny chińskiej skupiają się przede wszystkim na wykrywaniu ekspresji odpowiednich kanałów jonowych. Jednak monitorowanie w czasie rzeczywistym dotyczące wpływu tradycyjnej medycyny chińskiej na kanały jonowe związane z Ca2+ jest nadal stosunkowo ograniczone, a wiele podstawowych mechanizmów pozostaje niejasnych.
Ta grupa badawcza poświęciła się badaniom kanałów jonowych związanych z Ca2 +, takich jak STIM1 / Orai1, STIM1 / Orai3, TRPA110 i TRPV1 i jest dobrze zorientowana w zastosowaniu i szczegółowym wykorzystaniu jednokomórkowych systemów obrazowania Ca2 + . Badanie to demonstruje specyficzne zastosowanie obrazowania Ca2 + pojedynczych komórek do różnych celów badawczych, mając na celu zapewnienie czytelnikom kompleksowego zrozumienia jego rozległych zastosowań i szczegółowego wykorzystania. W porównaniu z wcześniej opublikowanymi powiązanymi badaniami21, badania te oferują nową perspektywę i metodologię stosowania obrazowania Ca2+ pojedynczych komórek pod różnymi kątami i w połączeniu z innymi systemami. Na przykład pierwotne komórki lub linie komórkowe z endogenną ekspresją genów docelowych mogą być bezpośrednio ładowane za pomocą sondy Fura-2 w celu monitorowania zmian w wewnątrzkomórkowych sygnałach Ca2 + w czasie rzeczywistym pod różnymi czynnikami stymulującymi przy użyciu systemu obrazowania Ca2 + pojedynczej komórki. Dodatkowo można przeprowadzić nadekspresję plazmidów zawierających białka fluorescencyjne w liniach komórkowych. Początkowo komórki są ładowane sondą Fura-2, jak opisano wcześniej. Następnie komórki z udaną ekspresją białka docelowego są wybierane na podstawie sygnałów FITC lub TRITC, które są następnie podświetlane w celu późniejszego monitorowania sygnałów Fura-2 Ca2+ w czasie rzeczywistym.
Obrazowanie Ca2+ w pojedynczej komórce to system detekcji, który można zintegrować z różnymi innymi konfiguracjami eksperymentalnymi zgodnie z celami eksperymentu. Na przykład, jeśli zachodzi potrzeba wykrycia reakcji wrażliwych na temperaturę kanałów jonowych na zmiany temperatury, system można połączyć z systemem operacyjnym kontroli temperatury i urządzeniem perfuzyjnym, aby jednocześnie monitorować zmiany w wewnątrzkomórkowych sygnałach Ca2 + poprzez kontrolowanie temperatury zewnątrzkomórkowego roztworu buforowego19. Takie podejście potwierdza reakcję odpowiednich kanałów jonowych na temperaturę. Co więcej, obrazowanie Ca2 + w pojedynczych komórkach można również połączyć z odpowiednimi urządzeniami do dostarczania leków lub innymi urządzeniami do stymulacji komórek w powiązanych eksperymentach.
W rzeczywistości jednokomórkowy system obrazowania Ca2+ pozwala nie tylko na monitorowanie w czasie rzeczywistym stosunku 340/380, ale także wartości FITC lub TRITC za pomocą określonych ustawień. Co więcej, technologia obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach ma zastosowanie do wykrywania zmian stężenia jonów wapnia nie tylko w cytoplazmie, ale także w retikulum endoplazmatycznym (ER), co świadczy o jej szerokimzastosowaniu19. Dane uzyskane przez ten system są jednolicie zapisywane w formacie ".xlsx", który można szybko przeanalizować w celu uzyskania wyników. Krzywa zmian ułatwia szybkie zrozumienie stanu aktywacji i charakterystyki komórek, tworząc wygodny system monitorowania sygnału Ca2+ . Oczekuje się, że ten raport z badań będzie skutecznie promował powszechne zastosowanie jednokomórkowego systemu obrazowania Ca2 + w dziedzinie badań nad tradycyjną medycyną chińską i przyczyni się do dekodowania tradycyjnej medycyny chińskiej.
Jednak zastosowanie technologii obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach ma pewne ograniczenia, takie jak niemożność uzyskania wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Na przykład w niektórych eksperymentach, gdy konieczne jest badanie przesiewowe w kierunku agonistów lub antagonistów określonego kanału, obrazowanie wapnia wymaga badań przesiewowych jeden po drugim, co jest bardzo czasochłonne. W takich przypadkach technika ta może wymagać połączenia z innymi technologiami, takimi jak FLIPR22, w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych przed dalszą walidacją wyników za pomocą obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach. Dodatkowo obrazy uzyskane z obrazowania pojedynczych komórek wapnia są generowane za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej, która ma niższą rozdzielczość w porównaniu z mikroskopią konfokalną15. W związku z tym skuteczne połączenie technologii obrazowania pojedynczych komórek wapnia z innymi technikami w celu wykorzystania ich zalet jest ważnym podejściem do rozwiązywania problemów w tej dziedzinie.

Ca2+ odgrywa kluczową rolę w transdukcji sygnału komórkowego, regulując różne funkcje komórkowe, takie jak skurcze mięśni1, przewodnictwo nerwowe2, secretion3, oraz ekspresja genów4, wpływając tym samym na wiele procesów fizjologicznych. Nieprawidłowe stężenia Ca2+ mogą prowadzić do chorób takich jak zaburzenia rytmu serca5, zaburzenia krzepnięcia6 i zaburzenia równowagi hormonalnej7. Dlatego badanie mechanizmów wewnątrzkomórkowych zmian stężenia Ca2+ ma ogromne znaczenie.
Różne kanały jonowe są zaangażowane w regulację stężenia Ca2+ w komórkach, w tym wysoce selektywne <kanały wapnia aktywowane uwalnianiem wapnia (CRAC) Ca2+ sup class="xref">8 i nieselektywne kanały kationowe rodziny TRP9. Te kanały jonowe mogą być aktywowane przez bodźce, takie jak temperatura10, związki i składniki aktywne występujące w tradycyjnej medycynie chińskiej11, odgrywające kluczową rolę w różnych procesach fizjologicznych związanych z Ca2+.
Skuteczne monitorowanie wewnątrzkomórkowych zmian stężeniaCa2+ jest niezbędne do badania kanałów jonowych związanych z Ca2+, szczególnie w dziedzinie tradycyjnej medycyny chińskiej, gdzie regulacja sygnalizacji wapniowej odgrywa kluczową rolę w wielu podejściach terapeutycznych. Obecnie podstawowe metody pomiaru wewnątrzkomórkowego Ca2+ można podzielić na dwa typy: pomiary elektryczne i optyczne. Podejście do pomiaru elektrycznego wykorzystuje technikę patch-clamp do oceny zmian potencjału błony komórkowej spowodowanych <napływem Ca2+ sup class="xref">12.
Podczas pomiarów optycznych, sondy fluorescencyjne specyficznie wiążą się z Ca2+, co pozwala badaczom śledzić zmiany intensywności fluorescencji komórkowej. Typowe metody optyczne obejmują techniki oparte na białkach fluorescencyjnych i barwnikach fluorescencyjnych. W metodach opartych na białkach fluorescencyjnych naukowcy mogą nadekspresję wrażliwych na Ca2+ białek fluorescencyjnych, takich jak Cameleon13 i GCaMP14 w komórkach i monitorować zmiany sygnału fluorescencji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej, aby obserwować zmiany w cytoplazmatycznych stężeniach Ca2 +. Ponadto naukowcy mogą nadekspresjonować te białka u myszy i wykorzystywać mikroskopię fluorescencyjną dwufotonową do monitorowania wewnątrzkomórkowych stężeń Ca2 + w czasie rzeczywistym in vivo lub na poziomie tkankowym, zapewniając wysoką rozdzielczość i głęboką penetrację tkanek10.
Dla metod opartych na barwnikach fluorescencyjnych, powszechnie używane sondy Ca2+ to Fluo-3/AM, Fluo-4/AM i Fura-2/AM10. Naukowcy inkubują komórki w roztworze zawierającym te sondy fluorescencyjne, które przechodzą przez błonę komórkową i są rozszczepiane przez wewnątrzkomórkowe esterazy w celu wytworzenia związków aktywnych (np. Fluo-3, Fluo-4 i Fura-2), które pozostają w komórce. Sondy te wykazują minimalną fluorescencję w postaci wolnego liganda, ale emitują silną fluorescencję po związaniu z wewnątrzkomórkowym Ca2 +, wskazując w ten sposób na zmiany w cytoplazmatycznych stężeniach Ca2 +. W porównaniu z innymi białkami fluorescencyjnymi i barwnikami, Fura-2 jest zwykle wzbudzana przy długościach fal 340 nm i 380 nm. Po związaniu z wewnątrzkomórkowym wolnym Ca2+, Fura-2 ulega przesunięciu absorpcyjnemu, przesuwając szczyt długości fali wzbudzenia z 380 nm do 340 nm, podczas gdy pik emisji w pobliżu 510 nm pozostaje niezmieniony. Istnieje ilościowa zależność między intensywnością fluorescencji a stężeniem związanegoCa2+, co pozwala na obliczenie wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ poprzez pomiar współczynnika intensywności fluorescencji na tych dwóch długościach fal wzbudzenia. Pomiary proporcji redukują skutki fotowybielania, wycieku z sondy fluorescencyjnej, nierównomiernego obciążenia i różnic w grubości komórek, dając bardziej wiarygodne i powtarzalne wyniki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
Systemy obrazowania pojedynczych komórek Ca2+ wykorzystują głównie techniki mikroskopowe i wskaźnik Ca2+ Fura-2/AM do wykrywania wewnątrzkomórkowych stężeń Ca2+. Systemy te składają się z mikroskopu fluorescencyjnego, źródła światła do obrazowania Ca2+ oraz oprogramowania do obrazowania fluorescencyjnego, umożliwiającego ilościowe monitorowanie w czasie rzeczywistym zmian Ca2+ w cytoplazmie wielu komórek jednocześnie (do 50 komórek na pole widzenia). Wyniki są zapisywane w formacie ".xlsx" w celu późniejszej analizy. System oferuje szybką szybkość analizy (około 1 minuty w przypadku analizy grupy komórek w jednym polu widzenia) i generuje intuicyjne krzywe zmian, co znacznie zwiększa skuteczność wykrywania. Obrazowanie Ca2 + pojedynczych komórek jest niezbędnym podejściem technicznym do badania kanałów związanych z Ca2 + i ma znaczną wartość w badaniach biomedycznych związanych z kanałami jonowymi. Oczekuje się, że jego zastosowanie w technologii obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach znacznie przyczyni się do postępu w badaniach nad mechanizmami leżącymi u podstaw tradycyjnej medycyny chińskiej.

<table><tbody><tr><td>Aparat</td><td>fotograficzny Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capsaicine</td><td>Sigma</td><td>211275</td><td></td></tr><tr><td>CL-100 regulator temperatury</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas cyklopiazonowy (CPA)</td><td>Sigma</td><td>C1530</td><td></td></tr><tr><td>DG-4 lekki</td><td>Sutter Instrument Company Sulftlenek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dimetylu (DMSO)&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania fluorescencyjnego (MetaFluor, oprogramowanie płatne)&nbsp;</td>Urządzenia <td></td><td></td><td>molekularne</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2/AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>HBSS bufor</td><td>Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>&nbsp; Beyotime</td><td>ST501</td><td></td></tr><tr><td>poli-D-lizyna</td><td>&nbsp; Beyotime</td><td>ST508</td><td></td></tr><tr><td>SC-20 urządzenie grzewcze/chłodzące z cyrkulacją cieczy&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła białego</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

Obrazowanie pojedynczej komórki Ca2+ jest niezbędne do badania kanałów Ca2+ aktywowanych przez różne bodźce, takie jak temperatura, napięcie, związki natywne i chemikalia itp. Opiera się przede wszystkim na technologii obrazowania mikroskopowego i powiązanym wskaźniku Ca2+ Fura-2/AM (AM to skrót od Acetoxymethyl ester). Wewnątrz komórek Fura-2 / AM jest hydrolizowany przez esterazy do Fura-2, który może odwracalnie wiązać się z wolnym cytoplazmatycznym Ca2+. Maksymalna długość fali wzbudzenia zmienia się z 380 nm na 340 nm (po nasyceniu Ca2+) po związaniu. Intensywność emitowanej fluorescencji jest ilościowo związana ze stężeniem związanegoCa2+. Mierząc stosunek 340/380, można określić stężenie Ca2+ w cytoplazmie, eliminując błędy spowodowane zmianami wydajności ładowania sondy fluorescencyjnej między różnymi próbkami. Technologia ta pozwala na ilościowe i jednoczesne monitorowanie zmian Ca2+ w czasie rzeczywistym. Wyniki są przechowywane w folderze ". XLSX" do późniejszej analizy, który jest szybki i generuje intuicyjne krzywe zmian, znacznie poprawiając skuteczność wykrywania. Z różnych perspektyw eksperymentalnych w artykule tym wymieniono zastosowanie tej technologii do wykrywania sygnałów Ca2+ w komórkach z endogennymi lub nadekspresyjnymi białkami kanałowymi. W międzyczasie pokazano i porównano różne metody aktywacji komórek. Celem jest zapewnienie czytelnikom lepszego zrozumienia zastosowania i zastosowań obrazowania pojedynczych komórek Ca2+.

Wykrywanie odpowiedzi temperaturowej 
Pierwotne keratynocyty 
Pierwotne keratynocyty wyizolowano z nowonarodzonych myszy i przygotowano zgodnie z uznanymi protokołami10. Komórki te wysiano na płytki 24-dołkowe zawierające szkiełka przedmiotowe. Po załadowaniu sondy Fura-2 dostrójono ostrość pod mikroskopem przy długości fali 380 nm, aby uzyskać wyraźną wizualizację morfologii komórek, jak pokazano na Rysunku 2A. Jeśli sonda nie zostałaby pomyślnie załadowana podczas tego procesu, komórki nie byłyby widoczne. Bufor zewnątrzkomórkowy w komorze był stale wymieniany za pomocą systemu perfuzji, co zapewniało optymalne warunki dla komórek. System kontroli temperatury był połączony z systemem perfuzji, co umożliwiało wykrywanie termicznych odpowiedzi komórkowych poprzez kontrolowanie zmian temperatury w buforze zewnątrzkomórkowym. Proces ten polegał na stopniowym ogrzewaniu, a następnie stopniowym chłodzeniu buforu zewnątrzkomórkowego.
System obrazowania pojedynczych komórek pod kątem stężenia Ca2+ został wykorzystany do monitorowania zmian wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ w różnych warunkach eksperymentalnych. Jak pokazano na Rysunku 2B, keratynocyty wykazały wyraźną odpowiedź termiczną podczas ogrzewania, a także zauważalną odpowiedź w fazie chłodzenia. Co istotne, odpowiedź na temperaturę ta zanikła po usunięciu genu STIM1, który jest głównym odpowiedzialnym za tę reakcję (Rysunek 2C)10. Obrazowanie Ca2+ w pojedynczych komórkach pozwala na obserwację zmian wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na różne bodźce zewnętrzne, co umożliwia szczegółową analizę zachowania komórek i sygnalizacji.
Komórki HEK293T nadekspresujące plazmidy docelowe 
Komórki HEK293T wysiano do płytki 24-dołkowej zawierającej szkiełka przedmiotowe zgodnie z metodą eksperymentalną. Następnie dokonano nadekspresji STIM1/Orai1 w komórkach, a ich pośrednią odpowiedź termiczną wykryto tą samą metodą, która została opisana powyżej dla komórek pierwotnych. W przypadku komórek nadekspresujących plazmid docelowy pomyślną transfekcję potwierdzono poprzez selekcję komórek wykazujących ekspresję odpowiedniego plazmidu, co objawiało się obecnością czerwonych lub zielonych białek fluorescencyjnych przenoszonych przez plazmid pod długościami fal TRITC lub FITC. W tym eksperymencie wykorzystano plazmidy STIM1-GFP/Orai1-DsRed, gdzie GFP wykrywano przy FITC (emisja zielonej fluorescencji), a DsRed przy TRITC (emisja czerwonej fluorescencji). Jako kontrole negatywne zastosowano komórki nadekspresujące pusty mCherry (TRITC). Jak pokazano na Rysunku 3A, fluorescencyjne komórki obserwowane przy FITC wskazywały na pomyślną ekspresję STIM1, co umożliwiło ich selekcję i rejestrację odpowiedzi termicznej podczas procesów ogrzewania i chłodzenia. Komórki nietransfekowane służyły jako kontrola negatywna. Rysunek 3B wykazuje, że STIM1/Orai1 wykazywały znaczną odpowiedź termiczną podczas procesu chłodzenia, co kontrastuje z kontrolą negatywną przedstawioną na Rysunku 3C.
Wykrywanie odpowiedzi na leki 
Technologia obrazowania Ca2+ w pojedynczych komórkach może być również wykorzystywana do wykrywania odpowiedzi komórkowych na związki chemiczne. Przygotowanie komórek do wykrywania odpowiedzi termicznej jest takie samo, jak opisano powyżej. Różnica między odpowiedzią na lek a odpowiedzią termiczną polega na tym, że odpowiedź termiczna zazwyczaj wymaga aktywacji komórek poprzez zmianę temperatury buforu zewnątrzkomórkowego za pomocą systemu perfuzji, natomiast związki mogą być podawane albo poprzez perfuzję, albo poprzez bezpośrednie dodanie ich za pomocą pipety. Bezpośrednie dodawanie pipetą pozwala skutecznie zredukować ilość zużytego związku; jednakże uzyskana w ten sposób krzywa może nie być zawsze tak estetyczna wizualnie jak ta otrzymana za pomocą perfuzji.
Przyjmując Rysunek 4 jako przykład, Rysunek 4A przedstawia odpowiedź w mechanizmie wewnątrzkomórkowego uwalniania wapnia zależnego od zapasów (SOCE) dla STIM1/Orai1, gdzie stężenie zewnątrzkomórkowego Ca2+ oraz zawartość kwasu cyklopiazonowego (CPA) są kolejno zmieniane za pomocą systemu perfuzyjnego w celu wywołania SOCE. Na Rysunku 4B agonista TRPV1, kapsaicyna, jest dodawana bezpośrednio za pomocą pipety do komórek nadekspresujących plazmid TRPV1. Kapsaicyna może aktywować TRPV1 i indukować napływ zewnątrzkomórkowego Ca2+.
<img alt="Obrazowanie wapnia z użyciem Fura-2; fluorescencja, hydroliza estru, intensywność przy 340/380 nm, schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1">
Rysunek 1: Schemat Fura-2 AM. Fura-2 jest powszechnie stosowaną w biologii komórki sondą fluorescencyjną do wykrywania Ca2+, która selektywnie wiąże Ca2+ w stosunku 1:1 i emituje fluorescencję. Ze względu na wysoką polarność jako związku kwasowego, Fura-2 nie może przenikać do wnętrza komórek. Aby zwiększyć przepuszczalność komórkową, grupa ujemna związku jest koniugowana z grupą acetoksymetylową (AM), tworząc Fura-2/AM. Modyfikacja ta zwiększa jego rozpuszczalność w estrach i eliminuje ładunek ujemny. Wewnątrz komórek Fura-2/AM jest hydrolizowana przez esterazy do Fura-2, która może odwracalnie wiązać wolny cytoplazmatyczny Ca2+. Po związaniu maksymalna długość fali wzbudzenia przesuwa się z 380 nm na 340 nm (po nasyceniu Ca2+). Intensywność emitowanej fluorescencji jest ilościowo powiązana z koncentracją związanego Ca2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, obrazowanie wapnia; wykresy stosunku Fura-2 pokazujące odpowiedź ATP komórek w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wykrywanie odpowiedzi temperaturowej pierwotnych keratynocytów. (A) Barwienie Fura-2 keratynocytów z noworodków myszy, obserwowane przy użyciu obiektywu 20x. (B,C) Odpowiedź temperaturowa keratynocytów WT (B) oraz keratynocytów z knockoutem STIM1 (C) z wykorzystaniem systemu obrazowania Ca2+ pojedynczych komórek. Powiększenie: 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna STIM1-GFP, wykresy stosunku Fura-2, analiza sygnalizacji wapniowej, ciepło i ATP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wykrywanie odpowiedzi temperaturowej dla nadekspresji STIM1-GFP/Orai1-Dsred w komórkach HEK293T. (A) Reprezentatywny obraz pokazujący komórki wykazujące ekspresję STIM1-GFP w kanale FITC. (B,C) Odpowiedź temperaturowa komórek HEK293T wykazujących ekspresję odpowiedniego plazmidu, wykryta za pomocą systemu obrazowania Ca2+ w pojedynczych komórkach. Powiększenie: 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres sygnalizacji wapniowej, zmiany stosunku Fura-2, STIM1-GFP/Orai1-DsRed, TRPV1-mRuby, efekt kapsaicyny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Wykrywanie odpowiedzi na lek z wykorzystaniem obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach2+ obrazowanie. (A) odpowiedź SOCE komórek HEK293T z nadekspresją STIM1/Orai1. Bufor zewnątrzkomórkowy zostaje zmieniony z Ca2+zawierający Ca2+– bez użycia systemu perfuzyjnego. W przypadku braku Ca2+, dodaje się CPA w celu usunięcia jonów Ca2+ z retikulum endoplazmatycznego. Następnie bufor zewnątrzkomórkowy zastępuje się buforem zawierającym Ca2+bufor zawierający [składnik], aby wywołać pozakomórkowe Ca2+ napływ, reprezentujący zależny od magazynów napływ Ca2+ wpis. Pojedyncza komórka Ca2+ obrazowanie jest wykorzystywane do dynamicznego rejestrowania zmian w stężeniu wapnia cytozolowego (Ca2+)2+ stężenie indukowane przez te procesy. (B) komórki HEK293T nadekspresujące TRPV1-mRuby, gdzie mRuby jest białkiem fluorescencyjnym służącym do weryfikacji stanu transfekcji białka TRPV1. Kapsaicynę dodaje się za pomocą pipety, podczas gdy Ca2+ pomiar napływu wykonuje się za pomocą detekcji Ca w pojedynczych komórkach2+ obrazowanie <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and ...

Badaliśmy nasze kanały związane z odczuwaniem temperatury, odczuwaniem wieku i odczuwaniem bólu. Interesują nas badania przesiewowe małych cząsteczek w naszych kanałach i badanie ich mechanizmów. Przebadaliśmy dwóch agonistów aktywujących TRPV1 i przeprowadziliśmy szczegółowe badanie dotyczące ich mechanizmów działania.Technologia ta umożliwia ilościowe i jednoczesne monitorowanie zmian wapnia w wielu komórkach w czasie rzeczywistym, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych. Naszym celem jest zbadanie mechanizmu leczenia różnych chorób za pomocą tradycyjnych leków chińskich poprzez modernizację kanałów jonowych związanych z wapniem. Na początek przygotuj sterylne szkiełka szkiełkowe o średnicy ośmiu milimetrów i umieść je na 24-dołkowej płytce.Dodaj 500 mikrolitrów buforu poli-D-lycine do każdej studzienki. Inkubować szkiełka w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby umożliwić powlekanie. Następnie za pomocą pipety wylej roztwór powlekający z każdej studzienki.Umyj szkiełka raz za pomocą PBS firmy Dulbecco i odłóż umyte szkiełka na bok do późniejszego wykorzystania. Wysiewaj komórki na przygotowanej 24-dołkowej płytce o gęstości około 1,5 razy 10 do mocy 5 komórek na dołek i umieść płytkę w inkubatorze, aż komórki staną się przylegające. Następnie wymieszaj roztwór podstawowy Fura-2/AM i Pluronic F-127 z buforem Hanka zawierającym 1,3 milimolowe jony wapnia.Za pomocą folii aluminiowej przykryj roztwór roboczy Fura-2/AM, aby chronić go przed światłem. W celu wstępnej obróbki komórek przenieś szkiełka podstawowe wraz z komórkami na nową 24-dołkową płytkę zawierającą bufor Hanka. Za pomocą pipety wyrzuć bufor z każdej studzienki i dodaj 500 mikrolitrów buforu roboczego Fura-2/AM do każdej studzienki.Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut, aby umożliwić załadowanie sondy. Następnie usuń bufor roboczy Fura-2/AM z każdej studzienki i umyj komórki trzykrotnie buforem Hanka, aby usunąć nadmiar Fura-2/AM. Na początek należy uzyskać wstępnie potraktowane komórki do obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach i uruchomić wszystkie elementy mikroskopu fluorescencyjnego.Otwórz oprogramowanie do obrazowania fluorescencji z dostępnych opcji. Wybierz żądany protokół i kliknij OK. Następnie wybierz Nowy eksperyment z menu głównego, aby zainicjować nową konfigurację eksperymentalną.Teraz zamontuj komorę perfuzyjną na stoliku mikroskopu i ostrożnie umieść szkiełka komórkowe poddane działaniu Fura-2 / AM w komorze zawierającej roztwór buforowy Hanka. Dostosuj ostrość w białym świetle, aby uzyskać optymalne viewing. Wybierz pozycję Fokus na panelu sterowania eksperymentu.Wybierz żądaną długość fali do ustawiania ostrości, na przykład 380 nanometrów, i kliknij Rozpocznij ustawianie ostrości, aby rozpocząć regulację ogniskowej. Dostosuj ostrość na komórkach za pomocą funkcji Przybliżona ostrość, aby zbliżyć obiektyw, a następnie funkcji Znajdź ostrość, aby uzyskać precyzyjne regulacje. Obserwuj ekspresję białka docelowego za pomocą długości fal FITC lub TRITC.Następnie kliknij przycisk Zatrzymaj ustawianie ostrości i zamknij panel ostrości. Kliknij Konfiguruj eksperyment na pasku zadań i wybierz żądane piętra do obrazowania w ustawieniach konfiguracji. Teraz kliknij przycisk Region na pasku menu, aby zdefiniować obszary do obrazowania i wybrać żądany typ oświetlenia do obrazowania.Kliknij Pobierz obrazy, a następnie naciśnij OK, aby przechwycić obrazy. Zidentyfikuj pożądane komórki wykazujące ekspresję białka docelowego pod wpływem fluorescencji, biorąc pod uwagę ślepy odczyt z kontrolami poniżej 380 nanometrów. Aby cofnąć wybrany region, kliknij prawym przyciskiem myszy kółko i wybierz Usuń region.Otwórz menu Odwołania, zaznacz pole wyboru Odejmij odwołania, a następnie kliknij przycisk OK, aby zastosować odejmowanie tła. W panelu sterowania eksperymentu kliknij Dane dziennika, aby zapisać dane eksperymentu. W sekcji Upływ czasu panelu sterowania ustaw Interwał akwizycji danych na jedną sekundę.Następnie kliknij opcję Zegar zerowy i Pobieranie w panelu sterowania Eksperyment, aby rozpocząć pobieranie danych. Teraz zastosuj zabiegi na komórkach zgodnie z wymaganiami. Po zakończeniu zbierania danych kliknij Wstrzymaj, aby zatrzymać proces.Zapisz pozyskane dane i kontynuuj analizę. Aby zakończyć eksperyment, kliknij Plik i wybierz Zamknij eksperyment. Na koniec zamknij oprogramowanie i przenieś wszystkie zapisane dane z komputera.Pierwotne keratynocyty załadowane sondą Fura-2 wykazywały widzialną morfologię komórek na długości fali 380 nanometrów. Odpowiedź termiczna keratynocytów wykazała wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia podczas ogrzewania z podobną reakcją obserwowaną podczas chłodzenia. Odpowiedź termiczna została zniesiona w keratynocytach, bez genu STIM1 wskazującego na rolę genu w termicznej sygnalizacji wapniowej.HEK293T komórki z nadmierną ekspresją STIM1 / Orai1 wykazały zauważalną odpowiedź termiczną po schłodzeniu, potwierdzając udaną ekspresję genów, o czym świadczą zielone i czerwone markery fluorescencyjne. Odpowiedź na wnikanie wapnia w komórkach z nadekspresją STIM1-Orai1 była skutecznie indukowana przez sekwencyjne zmiany w zewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i edycji kwasu cyklopiazonowego poprzez obfitość. Bezpośrednie pipetowanie kapsaicyny, agonisty TRPV1, wyzwalało zewnątrzkomórkowy napływ wapnia do komórek wykazujących ekspresję plazmidu TRPV1.

single-cell-calcium-imaging-for-studying-activation-calcium-ion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Spontaniczną aktywność rozwijających się sieci neuronalnych można mierzyć przy użyciu form estrów AM barwników wskaźnikowych wrażliwych na wapń. Zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, wskazujące na aktywację neuronalną, są wykrywane jako przejściowe zmiany fluorescencji wskaźnika za pomocą obrazowania jedno- lub dwufotonowego. Niniejszy protokół można dostosować do różnych sieci neuronalnych zależnych od etapu rozwoju in vitro.

Funkcjonalne obrazowanie wapnia w rozwijających się sieciach korowych

Ten film przedstawia koncepcje związane z obrazowaniem wapnia i zawiera przykładowy protokół obrazowania poklatkowego robaków znajdujących się w formowanych studzienkach agarozowych.

Obrazowanie wapnia: metoda wizualizacji aktywności neuronalnej u żywych C. elegans

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Tutaj prezentujemy techniki obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ za pośrednictwem IP3 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w nienaruszonych komórkach ssaków załadowanych wskaźnikami Ca2+ wraz z algorytmem, który automatyzuje identyfikację i analizę tych zdarzeń.

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Obrazowanie wapnia w komórkach jest wszechstronną metodologią do badania dynamicznej sygnalizacji pojedynczych komórek, na mieszanych populacjach w kulturze, a nawet na przebudzonych zwierzętach, w oparciu o ekspresję przepuszczalnych dla wapnia kanałów/receptorów, które dają unikalne sygnatury funkcjonalne.

Wizualizacja zmian w obwodzie neuron-glej za pomocą techniki obrazowania wapnia

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

Tutaj udostępniamy kompleksowy protokół do rozwiązywania początkowych lokalnych sygnałów Ca2+, znanych jako mikrodomeny Ca2+, w pierwotnych mysich i ludzkich limfocytach T za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten służy jako cenne źródło informacji dla naukowców badających szlaki sygnałowe Ca2+ w komórkach odpornościowych i do dalszego odkrywania ich funkcji.

Obrazowanie początkowych mikrodomen Ca2+ w pierwotnych limfocytach T

Poznaj technikę obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach z zastosowaniem barwnika Fura-2/AM do badania aktywacji kanałów jonowych TRPV1. Ta metoda umożliwia ilościowy monitoring zmian stężenia jonów wapnia w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Przeglądaj więcej filmów