Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia
13 grudnia 2024
Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.
Badaliśmy nasze kanały związane z odczuwaniem temperatury, odczuwaniem wieku i odczuwaniem bólu. Interesują nas badania przesiewowe małych cząsteczek w naszych kanałach i badanie ich mechanizmów. Przebadaliśmy dwóch agonistów aktywujących TRPV1 i przeprowadziliśmy szczegółowe badanie dotyczące ich mechanizmów działania.
Technologia ta umożliwia ilościowe i jednoczesne monitorowanie zmian wapnia w wielu komórkach w czasie rzeczywistym, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych. Naszym celem jest zbadanie mechanizmu leczenia różnych chorób za pomocą tradycyjnych leków chińskich poprzez modernizację kanałów jonowych związanych z wapniem. Na początek przygotuj sterylne szkiełka szkiełkowe o średnicy ośmiu milimetrów i umieść je na 24-dołkowej płytce.
Dodaj 500 mikrolitrów buforu poli-D-lycine do każdej studzienki. Inkubować szkiełka w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby umożliwić powlekanie. Następnie za pomocą pipety wylej roztwór powlekający z każdej studzienki.
Umyj szkiełka raz za pomocą PBS firmy Dulbecco i odłóż umyte szkiełka na bok do późniejszego wykorzystania. Wysiewaj komórki na przygotowanej 24-dołkowej płytce o gęstości około 1,5 razy 10 do mocy 5 komórek na dołek i umieść płytkę w inkubatorze, aż komórki staną się przylegające. Następnie wymieszaj roztwór podstawowy Fura-2/AM i Pluronic F-127 z buforem Hanka zawierającym 1,3 milimolowe jony wapnia.
Za pomocą folii aluminiowej przykryj roztwór roboczy Fura-2/AM, aby chronić go przed światłem. W celu wstępnej obróbki komórek przenieś szkiełka podstawowe wraz z komórkami na nową 24-dołkową płytkę zawierającą bufor Hanka. Za pomocą pipety wyrzuć bufor z każdej studzienki i dodaj 500 mikrolitrów buforu roboczego Fura-2/AM do każdej studzienki.
Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut, aby umożliwić załadowanie sondy. Następnie usuń bufor roboczy Fura-2/AM z każdej studzienki i umyj komórki trzykrotnie buforem Hanka, aby usunąć nadmiar Fura-2/AM. Na początek należy uzyskać wstępnie potraktowane komórki do obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach i uruchomić wszystkie elementy mikroskopu fluorescencyjnego.
Otwórz oprogramowanie do obrazowania fluorescencji z dostępnych opcji. Wybierz żądany protokół i kliknij OK. Następnie wybierz Nowy eksperyment z menu głównego, aby zainicjować nową konfigurację eksperymentalną.
Teraz zamontuj komorę perfuzyjną na stoliku mikroskopu i ostrożnie umieść szkiełka komórkowe poddane działaniu Fura-2 / AM w komorze zawierającej roztwór buforowy Hanka. Dostosuj ostrość w białym świetle, aby uzyskać optymalne viewing. Wybierz pozycję Fokus na panelu sterowania eksperymentu.
Wybierz żądaną długość fali do ustawiania ostrości, na przykład 380 nanometrów, i kliknij Rozpocznij ustawianie ostrości, aby rozpocząć regulację ogniskowej. Dostosuj ostrość na komórkach za pomocą funkcji Przybliżona ostrość, aby zbliżyć obiektyw, a następnie funkcji Znajdź ostrość, aby uzyskać precyzyjne regulacje. Obserwuj ekspresję białka docelowego za pomocą długości fal FITC lub TRITC.
Następnie kliknij przycisk Zatrzymaj ustawianie ostrości i zamknij panel ostrości. Kliknij Konfiguruj eksperyment na pasku zadań i wybierz żądane piętra do obrazowania w ustawieniach konfiguracji. Teraz kliknij przycisk Region na pasku menu, aby zdefiniować obszary do obrazowania i wybrać żądany typ oświetlenia do obrazowania.
Kliknij Pobierz obrazy, a następnie naciśnij OK, aby przechwycić obrazy. Zidentyfikuj pożądane komórki wykazujące ekspresję białka docelowego pod wpływem fluorescencji, biorąc pod uwagę ślepy odczyt z kontrolami poniżej 380 nanometrów. Aby cofnąć wybrany region, kliknij prawym przyciskiem myszy kółko i wybierz Usuń region.
Otwórz menu Odwołania, zaznacz pole wyboru Odejmij odwołania, a następnie kliknij przycisk OK, aby zastosować odejmowanie tła. W panelu sterowania eksperymentu kliknij Dane dziennika, aby zapisać dane eksperymentu. W sekcji Upływ czasu panelu sterowania ustaw Interwał akwizycji danych na jedną sekundę.
Następnie kliknij opcję Zegar zerowy i Pobieranie w panelu sterowania Eksperyment, aby rozpocząć pobieranie danych. Teraz zastosuj zabiegi na komórkach zgodnie z wymaganiami. Po zakończeniu zbierania danych kliknij Wstrzymaj, aby zatrzymać proces.
Zapisz pozyskane dane i kontynuuj analizę. Aby zakończyć eksperyment, kliknij Plik i wybierz Zamknij eksperyment. Na koniec zamknij oprogramowanie i przenieś wszystkie zapisane dane z komputera.
Pierwotne keratynocyty załadowane sondą Fura-2 wykazywały widzialną morfologię komórek na długości fali 380 nanometrów. Odpowiedź termiczna keratynocytów wykazała wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia podczas ogrzewania z podobną reakcją obserwowaną podczas chłodzenia. Odpowiedź termiczna została zniesiona w keratynocytach, bez genu STIM1 wskazującego na rolę genu w termicznej sygnalizacji wapniowej.
HEK293T komórki z nadmierną ekspresją STIM1 / Orai1 wykazały zauważalną odpowiedź termiczną po schłodzeniu, potwierdzając udaną ekspresję genów, o czym świadczą zielone i czerwone markery fluorescencyjne. Odpowiedź na wnikanie wapnia w komórkach z nadekspresją STIM1-Orai1 była skutecznie indukowana przez sekwencyjne zmiany w zewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i edycji kwasu cyklopiazonowego poprzez obfitość. Bezpośrednie pipetowanie kapsaicyny, agonisty TRPV1, wyzwalało zewnątrzkomórkowy napływ wapnia do komórek wykazujących ekspresję plazmidu TRPV1.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężeń jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym, z wykorzystaniem obrazowania Ca2+ w pojedynczych komórkach przy użyciu barwnika Fura-2/AM. Technika ta jest skuteczna w badaniu kanałów odpowiedzialnych za odczuwanie temperatury i bólu, umożliwiając efektywne wprowadzanie barwnika do komórek oraz precyzyjne obliczanie poziomów Ca2+ poprzez stosunki intensywności fluorescencji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Sygnalizacja wapniowa
Wstęp
- Badano kanały związane z odczuwaniem temperatury i bólu.
- Przeprowadzono przesiew małych cząsteczek wpływających na kanały TRPV1.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym umożliwia jednoczesną obserwację wielu komórek.
- Zmiany stężenia jonów wapnia są kluczowe dla zrozumienia mechanizmów sensorycznych.
Cel badania
- Zbadanie mechanizmów działania agonistów aktywujących TRPV1.
- Analiza mechanizmów terapeutycznych tradycyjnej medycyny chińskiej poprzez kanały jonowe zależne od wapnia.
- Zapewnienie szybkiego podejścia do zastosowań badawczych w zakresie odpowiedzi komórkowych.
Zastosowane metody
- Technika obrazowania pojedynczych komórek z wykorzystaniem barwnika Fura-2/AM.
- Kultury komórkowe keratynocytów oraz komórek HEK293T nadekspresujących białka związane z sygnalizacją wapniową.
- Protokoły inkubacji i obróbki w celu ładowania barwnika oraz akwizycji danych.
- Do monitorowania odpowiedzi komórkowych wykorzystano mikroskopię fluorescencyjną.
Główne wyniki
- Keratynocyty wykazały zwiększone wewnątrzkomórkowe stężenia wapnia podczas ogrzewania i chłodzenia.
- Reakcje te były powiązane z obecnością genu STIM1, co podkreśla jego rolę w termicznym przekazywaniu sygnałów wapniowych.
- Agoniści TRPV1 wywołali znaczny napływ wapnia w zmodyfikowanych liniach komórkowych.
- Wykazano efektywne szlaki sygnalizacji wapniowej, które mogą być przedmiotem dalszych badań terapeutycznych.
Wnioski
- Badanie demonstruje niezawodną metodę monitorowania dynamiki jonów wapnia w żywych komórkach.
- Pozwala ono na lepsze zrozumienie kanałów sensorycznych w regulacji bólu i temperatury, co jest kluczowe dla opracowania nowych metod leczenia.
- Ogólne implikacje obejmują pogłębienie wiedzy na temat mechanizmów neuronalnych oraz potencjalne zastosowania w modelach chorobowych.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach z wykorzystaniem Fura-2/AM umożliwia ilościową ocenę aktywacji kanałów jonowych wapnia w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na różnorodne bodźce, co wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w fazie wczesnego odkrywania leków. Podejście to dostarcza wysokotreściowych, multipleksowych danych krytycznych dla walidacji celu oraz charakterystyki funkcjonalnej kanałów jonowych zaangażowanych w szlaki sensoryczne. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w kluczowych punktach zwrotnych w portfelach projektów odkrywania leków ukierunkowanych na kanały jonowe.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie badanie mechanizmów aktywacji kanałów wapniowych w warunkach kontrolowanej stymulacji.
- Wspiera walidację funkcjonalną endogennych oraz nadekspresyjnych celów w postaci kanałów jonowych.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez powiązanie perturbacji genetycznych lub farmakologicznych z ilościowymi odpowiedziami komórkowymi.
- Zapewnia dane o rozdzielczości pojedynczych komórek w układzie multipleksowym, co pozwala na uzyskanie wysokiej pewności w wyborze celu.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe odczyty do opracowywania i optymalizacji testów.
- Umożliwia powtarzalny pomiar przepływu wapnia w odpowiedzi na małocząsteczkowe agoniści lub antagoniści.
- Wspiera gotowość do screeningu, pozwalając na jednoczesne monitorowanie wielu komórek i warunków.
- Generuje dane w formacie .XLSX w celu usprawnienia późniejszej analizy i integracji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie funkcjonalnych odczytów ze ścieżkami istotnymi dla przebiegu choroby, takimi jak odczuwanie bólu i temperatury.
- Zapewnia ciągłość przejścia od modeli komórkowych do przedklinicznej walidacji modulatorów kanałów jonowych.
- Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych poprzez kwantyfikację odpowiedzi komórkowych na kandydackie terapeutyki.
- Dostarcza wglądów w mechanizmy działania, co pozwala na podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Ten schemat obrazowania wapnia w pojedynczych komórkach łączy wczesny etap odkryć, opracowywanie testów oraz badania translacyjne dla celów w postaci kanałów jonowych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowy obrazowanie wapnia wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków dla sensorycznych kanałów jonowych.
- Przesiewanie: Znormalizowane pomiary stosunku fluorescencji umożliwiają powtarzalną ocenę związków oraz skalowalność testów.
- Analityka: Ilościowe wyniki w czasie rzeczywistym ułatwiają statystyczne porównanie warunków eksperymentalnych i interpretację mechanistyczną.
- Badania translacyjne: Funkcjonalne dane dotyczące aktywacji kanałów pomagają w wyborze modeli przedklinicznych i dopasowaniu biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Platforma obrazowania i potok analizy są adaptowalne dla różnych celów w postaci kanałów jonowych oraz systemów komórkowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów w postaci kanałów jonowych.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje pozyskiwanie danych, standaryzację oraz powtarzalność przeprowadzanych eksperymentów.
- Wartość strategiczna: Ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową poprzez dostarczenie solidnych danych funkcjonalnych na wczesnym etapie procesu rozwoju.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój modulatorów kanałów jonowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej oraz ilościowej analizy obrazowania.
- Wymaga dostępu do skalibrowanych instrumentów obrazujących oraz kompatybilnego oprogramowania analitycznego.
- Wymaga standaryzacji procesu wprowadzania sond, protokołów stymulacji oraz przetwarzania danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowalna do różnych typów komórek wykazujących ekspresję endogennych lub rekombinowanych kanałów jonowych.
- Potencjalne ograniczenia obejmują fotoblaknięcie oraz konieczność starannej kontroli wydajności wprowadzania sond.
