Rejestracja wewnętrznych prądów prostowniczych K⁺ w świeżo wyizolowanych komórkach mięśni gładkich tętnicy podstawnej techniką patch clamp

Moje badania koncentrują się głównie na elektrofizjologii sercowo-naczyniowej mózgu. W badaniu tym opisano metodę izolowania pierwotnych komórek mięśni naczyniowych i wykorzystania technologii zaciskania całych komórek w celu wspokojenia ich właściwości elektrofizjologicznych. Izolacja świeżych komórek ma ograniczenia, takie jak wpływ temperatury na separację enzymów, różne czasy trawienia dla różnych naczyń krwionośnych i natychmiastowa zdolność w natywnym środowisku komórek.

Ponadto technologia zaciskania zaciskowego stanowi wyzwanie w przypadku pękania sufitu i membrany, co wymaga wykwalifikowanej obsługi. Badania nad tym protokołem mają na celu łatwe pozyskiwanie aktywnych komórek pierwotnych z tętnic manualnych i szybko muszą zadzwonić do zastosowania techniki zaciskania zaciskowego. Na początek napełnij szalkę Petriego zimnym roztworem soli fizjologicznej nasyconym 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla.

Umieść izolowany mózg szczura na szalce Petriego. Umieść mózg brzusznie do góry na szalce Petriego i zabezpiecz go igłami. Pod mikroskopem świetlnym zlokalizuj tętnicę podstawną.

Za pomocą autoklawu, pęsety i nożyczek ostrożnie usuń otaczającą tkankę. Następnie włóż dwucentymetrowy drut o średnicy 25 mikrometrów do izolowanej tętnicy podstawnej. Delikatnie przetrzyj wewnętrzną ścianę tętnicy drutem, aby skutecznie usunąć śródbłonek naczyniowy.

Aby wyizolować komórki mięśni gładkich, najpierw podgrzej roztwory w probówkach od jednej do trzech. Przenieś izolowaną tętnicę podstawną do probówki drugiej. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, ciągle wstrzykując do probówki mieszaninę 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla.

Następnie przenieś tętnicę podstawną z probówki drugiej do probówki trzeciej i inkubuj. Przenieś jeden mililitr podgrzanego roztworu do separacji komórek z probówki pierwszej do probówki trzeciej. Kontynuuj wstrzykiwanie 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla, utrzymując leczenie enzymatyczne przez trzy minuty.

Przygotować tętnicę podstawną w celu uwolnienia komórek. Następnie odpipetuj cztery mililitry zimnego roztworu separacyjnego do probówki trzeciej, aby zakończyć proces enzymatyczny. Odwirować mieszaninę o sile 59 g przez sześć minut.

Za pomocą pipety wyrzucić supernatant. Następnie ponownie dodaj zimny roztwór rozdzielający. Po ostatnim praniu usunąć supernatant.

Pozostaw jeden mililitr zawiesiny komórek. Zawiesinę komórek należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez sześć do ośmiu godzin. Przenieść 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do kąpieli.

Dodaj jeden mililitr płynu zewnątrzkomórkowego do kąpieli i pozwól mu odpocząć. Aby rozpocząć, włącz polaryzację mikropipet. Umieść szklaną rurkę w biegunie.

Na panelu sterowania wybierz program pierwszy. Kliknij Enter i uzyskaj dostęp do programu pierwszego. Teraz wykonaj test rampy, klikając rampę na panelu sterowania, aby zmierzyć wartość cieplną szklanej rurki.

Włóż nową szklaną rurkę. Następnie wybierz program pierwszy i kliknij Enter, aby wyprodukować mikropipetę. Aby zarejestrować prąd opieki, najpierw uruchom oprogramowanie do akwizycji danych.

Wybierz plik, a następnie kliknij ustaw nazwy plików danych, aby ustalić ścieżkę do przechowywania danych. Włącz funkcję testu membranowego w menu narzędzi. Umieść próbkę wyizolowanych komórek mięśni gładkich z tętnicy podstawnej szczura w środku widoku kamery mikroskopu.

Zanurz końcówkę przewodu referencyjnego w roztworze kąpieli. Następnie napełnij 20% wyprodukowanej mikropipety roztworem wewnątrzkomórkowym. Zamocuj załadowaną mikropipetę na uchwycie elektrody rejestrującej.

Teraz za pomocą strzykawki zastosuj nadciśnienie. Przenieś końcówkę pipety do roztworu kąpieli i wyreguluj przesunięcie pipety w oprogramowaniu wzmacniacza sygnału, aby ustawić bieżącą linię bazową na zero pikomerów. Delikatnie dociśnij pipetę do błony komórkowej.

Obserwuj wzrost odporności uszczelnienia na co najmniej jedną magumę. Usuń nadciśnienie i zastosuj podciśnienie. Aby uzyskać wysoką rezystancję, z rezystancją uszczelnienia wynoszącą co najmniej jeden giggom, ustaw napięcie podtrzymania na minus 60 miliwoltów i skompensuj pojemność elektrody za pomocą CP FAST i CP slow.

Zastosuj krótkie podciśnienie, aby rozerwać błonę komórkową, tworząc konfigurację całej komórki. Wybierz całą komórkę w oprogramowaniu wzmacniacza sygnału. Następnie kliknij auto, aby uzyskać kompensację pojemności membrany.

Załaduj protokół kir i rozpocznij rejestrację danych. Wyizolowano świeżo wyizolowane komórki mięśni gładkich o morfologii wrzeciona. Komórki były zdrowe i nadawały się do eksperymentów z klamrą łatkową.

Typowy prąd utwardzania wykazywał prostowanie wewnętrzne przy napięciach ujemnych przy minimalnym lub zerowym przepływie prądu jonów potasu przy napięciach dodatnich. Chlorek baru w stężeniach od 100 do 300 mikromoli na litr skutecznie hamował aktywność kanału kir, potwierdzając prąd jako kir. Nitroprusydek sodu zwiększał prąd kir, co wskazuje na rolę kanałów kir w rozszerzeniu naczyń krwionośnych wywołanym SNP.

Porównanie zależności prądowo-napięciowych wykazało spadek gęstości prądu w obecności chlorku baru i wzrost w przypadku SNP.