Name: Rejestracja wewnętrznych prądów prostowniczych K+ w świeżo wyizolowanych komórkach mięśni gładkich tętnicy podstawnej techniką patch clamp (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek mięśni gładkich z tętnicy podstawnej szczura i rejestracji prądów kanałów potasowych techniką patch clamp. Protokół umożliwia szczegółowe badanie elektrofizjologicznych właściwości komórek naczyniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Specjalny Program Talentów Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu dla "Xinglin Scholars and Discipline Talents Research Promotion Plan" (33002324) oraz Kluczowy Projekt Badawczo-Rozwojowy dla Wprowadzenia Talentów Naukowych i Technologicznych na Wysokim Poziomie w Mieście Luliang (2022RC28).

Protokół dotyczący zwierząt został zatwierdzony przez Komitet Etyki ds. Dobrostanu Zwierząt Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (Rekord nr 2024035). W badaniu wykorzystano samce szczurów Sprague-Dawley (SD) o masie ciała 260-300 g i wieku 8-10 tygodni. Zwierzętom zaopatrywano w wodę i pożywienie (eksperymentalna pasza SPF) ad libitum. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Rozwarstwienie tętnicy podstawnej u szczura
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory zgodnie z opisem w tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulić szczura przez inhalację 2% izofluranu. Potwierdź głębokie znieczulenie za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. W razie potrzeby podać dodatkowe środki znieczulające. Natychmiast przystąp do otwarcia czaszki i odsłonięcia mózgu na przenośnym stole operacyjnym.</li>
	<li>Szybko przenieś mózg na szalkę Petriego zawierającą PSS nasyconą 95%O2 i 5% CO2 w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że roztwór ma pH 7,40.</li>
	<li>Umieść mózg brzusznie do góry na szalce Petriego i zabezpiecz go igłami. Pod mikroskopem świetlnym zlokalizuj tętnicę podstawną i ostrożnie usuń otaczającą tkankę za pomocą autoklawowanej pęsety i nożyczek (patrz <silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Wprowadzić drut o długości 2 cm i średnicy 25 μm do izolowanej tętnicy podstawnej. Delikatnie przetrzyj wewnętrzną ścianę drutem, aby skutecznie usunąć śródbłonek naczyniowy. 
	UWAGA: Tętnica podstawna u szczurów znajduje się w bruzdach podstawy pnia mózgu u podstawy mózgu i jest tworzona przez zbieg lewej i prawej tętnicy kręgowej2. Podczas procesu izolacji należy obchodzić się z tętnicą ostrożnie, aby uniknąć nadmiernego rozciągania lub ściskania, które mogłoby spowodować uszkodzenie.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek mięśni gładkich
<ol>
	<li>Podgrzej 1 ml roztworu do separacji komórek, 1 ml hydrolizatu enzymatycznego I i 1 ml hydrolizatu enzymatycznego II do temperatury 37 °C odpowiednio w probówkach 1, 2 i 3 (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).</li>
	<li>Przenieś izolowaną tętnicę podstawną do probówki 2. Ciągle wstrzykiwać mieszaninę 95%O2 i 5% CO2 do probówki i utrzymywać obróbkę enzymatyczną przez 30 minut (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Przenieś tętnicę podstawną z probówki 2 do probówki 3. Kontynuuj wstrzykiwanie 95%O2 i 5% CO2 do probówki i utrzymuj obróbkę enzymatyczną przez 5 minut (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D).</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu do separacji komórek o temperaturze 37 °C z probówki 1 do probówki 3. Kontynuować wstrzykiwanie 95%O2 i 5% CO2 , utrzymując obróbkę enzymatyczną przez 3 minuty. Przygotować tętnicę podstawną do uwolnienia komórek (patrz <silna klasa="xfig">Ryc. 1E).</li>
	<li>Dodać roztwór rozdzielający o temperaturze 4 °C do probówki 3, aby zakończyć proces enzymatyczny (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1F). Odwirować mieszaninę o masie 59 × g przez 6 minut. Odrzucić supernatant za pomocą pipety, ponownie dodać roztwór rozdzielający o temperaturze 4 °C (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1G) i powtórzyć wirowanie dwukrotnie, aby usunąć pozostałości enzymów.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą pipety i przechowywać 1 ml zawiesiny komórek w temperaturze 4 °C przez okres do 6-8 godzin.</li>
	<li>Weź 100 μl zawiesiny komórkowej i umieść ją w kąpieli (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1H). Dodaj 1 ml płynu zewnątrzkomórkowego do kąpieli i pozwól komórkom osiąść przez 40 minut, aby przyczepić się do dna (patrz <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2). 
	UWAGA: W przypadku komórek w grupie poddanej działaniu substancji (np. BaCl2 lub nitroprusydek sodu) należy wstępnie inkubować z odpowiednimi substancjami w temperaturze pokojowej (22-26°C) przez 40 minut w okresie przyłączania.</li>
</ol>
3. Rejestracja prądu Kir za pomocą zacisku krosowego dla całej komórki
<ol>
	<li>Produkcja mikropipet
	<ol>
		<li>Włącz ściągacz do mikropipet (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Umieść szklaną rurkę (średnica zewnętrzna: 1.5 mm, średnica wewnętrzna: 1.10 mm, długość: 10 cm) w ściągaczu. Wybierz Program 1, kliknij Enter i uzyskaj dostęp do Programu 1. Wykonaj test rampy, klikając Rampa na panelu sterowania, aby zmierzyć wartość cieplną szklanej rurki. 
		UWAGA: Edytuj program 1 z następującymi parametrami: Ciepło: Rampa, Ciągnięcie: 0, Prędkość: 25, Opóźnienie: 1, Ciśnienie: 500, Tryb: Opóźnienie, Bezpieczne ogrzewanie włączone. Test rampy musi być wykonywany przy zmianie rodzajów filamentów lub szklanych pipet. Mikropipety powinny mieć średnicę końcówki ~1-2 μm i długość stożka około 5 mm. Mniejsze średnice końcówek i dłuższe stożki skutkują większą rezystancją pipety.</li>
		<li>Włóż nową szklaną rurkę i wybierz Program 1. Kliknij Enter, aby wyprodukować mikropipetę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nagrywanie prądu Kir
	<ol>
		<li>Włączaj kolejno urządzenia sprzętowe: przetwornik cyfrowo-analogowy, wzmacniacz sygnału, mikromanipulator, mikroskop, kamerę i komputer.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie w następującej kolejności: kamera, wzmacniacz sygnału i oprogramowanie do akwizycji danych. 
		UWAGA: Jeśli mikroskop nie jest wyposażony w kamerę, aktywacji wymaga tylko oprogramowanie instrumentu. Upewnij się, że oprogramowanie jest otwierane po zainicjowaniu sprzętu, aby umożliwić prawidłowe działanie.</li>
		<li>W oprogramowaniu do akwizycji danych wybierz opcję File (Plik) > Set Data File Names (Ustaw nazwy plików danych), aby ustalić ścieżkę do przechowywania danych.</li>
		<li>Edytuj protokół rejestrowania prądów Kir w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Interfejs przebiegu: Epoka A i D: Typ = krok; Pierwszy poziom = −60 mV; Poziom delta = 0 mV; Pierwszy czas trwania = 100 ms; Czas trwania delta = 0 ms. Epoka B: Typ = krok; Pierwszy poziom = −160 mV; Poziom delta = 0 mV; Pierwszy czas trwania = 1 ms; Czas trwania delty = 0 ms. Epoka C: Typ = rampa; Pierwszy poziom = 40 mV; Poziom delta = 20 mV; Pierwszy czas trwania = 500 ms; Czas trwania delta = 0 ms.</li>
			<li>Interfejs trybu/szybkości: Opóźnienie próbne = 0 s; Przebiegi = 1; Zamiatanie = 1; Czas trwania przemiatania = 0,8 s.</li>
			<li>Interfejs wyjść: Kanał #0; Poziom podtrzymania = −60 mV. Zapisz protokół i nazwij go jako "Protokół Kir"." 
			UWAGA: Konfiguracja protokołu jest dostosowana do konkretnych bieżących nagrań i może być ponownie wykorzystana po zapisaniu. Upewnij się, że interfejs wyjściowy pasuje do okablowania przyrządu (np. Kanał #0).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Włącz funkcję Membrane Test (Test membranowy) w menu Tools (Narzędzia) oprogramowania do akwizycji danych.</li>
		<li>Umieść celę do pomiaru w środku kamery mikroskopu view.</li>
		<li>Zanurz końcówkę przewodu referencyjnego w roztworze kąpieli. Napełnij 20% mikropipety (wytworzonej w kroku 3.1) roztworem wewnątrzkomórkowym i zabezpiecz ją na uchwycie elektrody rejestrującej.
		<ol>
			<li>Zastosuj nadciśnienie za pomocą strzykawki, wsuń końcówkę pipety do roztworu do kąpieli i wyreguluj przesunięcie pipety w oprogramowaniu wzmacniacza sygnału, aby ustawić aktualną linię bazową na 0 pA (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3A). 
			UWAGA: Należy używać przewodów odniesienia Ag/AgCl. Rezystancja pipety powinna wynosić 4-6 MΩ.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Delikatnie dociśnij pipetę do błony komórkowej. Obserwuj wzrost rezystancji uszczelnienia (Rt) do co najmniej 1 MΩ (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Usuń nadciśnienie i zastosuj podciśnienie, aby uzyskać wysoką rezystancję przy Rt ≥ 1 GΩ (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C).
		<ol>
			<li>Ustaw napięcie podtrzymania na -60 mV i skompensuj pojemność elektrody za pomocą Cp Fast i Cp Slow (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D). 
			UWAGA: Jeśli Rt utrzymuje się powyżej 1 GΩ, przejdź do następnego kroku; W przeciwnym razie wymień kuwetę lub pipetę i powtórz kroki 3.2.6-3.2.8.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zastosuj krótkie podciśnienie, aby rozerwać błonę komórkową, tworząc konfigurację całej komórki (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3E). Wybierz Whole Cell w oprogramowaniu wzmacniacza sygnału, kliknij Auto dla kompensacji pojemności membrany (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3F), załaduj protokół Kir i rozpocznij rejestrację danych. Powtórz kroki 3.2.6-3.2.9 dla komórek poddanych działaniu substancji. 
		UWAGA: Jeśli rezystancja szeregowa (Ra) wynosi >30 MΩ, wybierz nowe ogniwo. Jeśli 30 MΩ > Ra > 10 MΩ, przed nagrywaniem należy zastosować kompensację rezystancji szeregowej. Ten protokół wymaga Ra < 10 MΩ.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizowanie danych
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie do analizy danych i załaduj zarejestrowane dane. Użyj kursorów, aby przeanalizować bieżące ślady i wyeksportować dane do wykreślenia krzywej I-V.</li>
		<li>Utwórz sygnał fali bodźca, wybierając Edytuj > Utwórz sygnał fali bodźca i potwierdź.</li>
		<li>Wyeksportuj ślad protokołu Kir, wybierając opcję Edytuj > Transfer Traces, określając pełny region śledzenia i sygnał (A0 #0) oraz kopiując dane do dalszej analizy.</li>
		<li>Wyeksportuj reprezentatywne bieżące ślady Kir, wybierając opcję Edytuj > Przenieś ślady, określając pełny region śledzenia i sygnał (IN 0), a następnie kopiując dane w celu wygenerowania bieżących wykresów śledzenia. 
		UWAGA: Znormalizuj bieżące dane przy użyciu gęstości prądu (pA/pF), aby uzyskać dokładne porównanie między komórkami o różnych rozmiarach. Upewnij się, że pojemność membrany (Cm) jest zarejestrowana podczas eksperymentu17.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Goins, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+body+functioning+and+correlates+among+older+american+indians%3A+The+cerebrovascular+disease+and+its+consequences+in+american+indians+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Geriatrics%22%5BJournal%5D)">Lower body functioning and correlates among older american indians: The cerebrovascular disease and its consequences in american indians study.</a> BMC Geriatrics. 18 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Mattle, H. P., Arnold, M., Lindsberg, P. J., Schonewille, W. J., Schroth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basilar+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Basilar artery occlusion.</a> Lancet Neurol. 10 (11), 1002-1014 (2011).</li>
<li>Morales, A., Parry, P. V., Jadhav, A., Jovin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+route+of+revascularization+in+basilar+artery+occlusion+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Case+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel route of revascularization in basilar artery occlusion and review of the literature.</a> BMJ Case Reports. , 1-6 (2015).</li>
<li>Ghantous, C. M., Azrak, Z., Rahman, F. A., Itani, H. A., Zeidan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+basilar+artery+reactivity+in+stroke+and+subarachnoid+hemorrhage+using+wire+myograph%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of basilar artery reactivity in stroke and subarachnoid hemorrhage using wire myograph.</a> Methods Mol Biol. 34, 625-643 (2016).</li>
<li>Tykocki, N. R., Boerman, E. M., Jackson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+ion+channels+and+regulation+of+vascular+tone+in+resistance+arteries+and+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle ion channels and regulation of vascular tone in resistance arteries and arterioles.</a> Compr Physiol. 7 (2), 485-581 (2017).</li>
<li>Wu, B. -N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyposmotic+challenge+inhibits+inward+rectifying+K%2B+channels+in+cerebral+arterial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyposmotic challenge inhibits inward rectifying K+ channels in cerebral arterial smooth muscle cells.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (2), H1085-H1094 (2007).</li>
<li>Jackson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+and+vascular%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Ion channels and vascular.</a> Hypertension. 35 (2), 173-178 (2000).</li>
<li>Jackson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channels+in+the+peripheral+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Potassium channels in the peripheral microcirculation.</a> Microcirculation. 12 (1), 113-127 (2005).</li>
<li>Dogan, M. F., Yildiz, O., Arslan, S. O., Ulusoy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channels+in+vascular+smooth+muscle%3A+A+pathophysiological+and+pharmacological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Fundam+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Potassium channels in vascular smooth muscle: A pathophysiological and pharmacological perspective.</a> Fundam Clin Pharmacol. 33 (5), 504-523 (2019).</li>
<li>Daghbouche-Rubio, N., López-López, J. R., Pérez-García, M. T., Cidad, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+ion+channels+in+essential+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle ion channels in essential hypertension.</a> Front Physiol. 13, 1-9 (2022).</li>
<li>Sahranavard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+potassium+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The role of potassium in atherosclerosis.</a> Eur J Clin Invest. 51 (3), 1-19 (2020).</li>
<li>Crecelius, A. R., Dinenno, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+regulation+via+kir+channels+and+Na%2B%2FK%2B-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Vascular regulation via kir channels and Na+/K+-ATPase.</a> Channels. 9 (4), 171-172 (2015).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostanoids+contribute+to+regulation+of+inwardly+rectifying+K%2B+channels+in+intrarenal+arterial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Prostanoids contribute to regulation of inwardly rectifying K+ channels in intrarenal arterial smooth muscle cells.</a> Life Sci. 250, 1-9 (2020).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luteolin-induced+coronary+arterial+relaxation+involves+activation+of+the+myocyte+voltage-gated+K%2B+channels+and+inward+rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Luteolin-induced coronary arterial relaxation involves activation of the myocyte voltage-gated K+ channels and inward rectifier K+ channels.</a> Life Sci. 221, 233-240 (2019).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+hypercontractility+to+acidosis+owes+to+the+greater+activity+of+tmem16a%2Fano1+in+the+arterial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Coronary hypercontractility to acidosis owes to the greater activity of tmem16a/ano1 in the arterial smooth muscle cells.</a> Biomed Pharmacother. 139, 1-14 (2021).</li>
<li>Jing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apigenin+relaxes+rat+intrarenal+arteries%2C+depresses+Ca2%2B-activated+Cl%E2%88%92+currents+and+augments+voltage-dependent+K%2B+currents+of+the+arterial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Apigenin relaxes rat intrarenal arteries, depresses Ca2+-activated Cl− currents and augments voltage-dependent K+ currents of the arterial smooth muscle cells.</a> Biomed Pharmacother. 115, 1-9 (2019).</li>
<li>Manz, K. M., Siemann, J. K., Mcmahon, D. G., Grueter, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+and+multi-electrode+array+electrophysiological+analysis+in+acute+mouse+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices.</a> STAR Protocols. 2 (2), 1-30 (2021).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Langton, P. D., Standen, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+currents+elicited+by+voltage+steps+and+steady+voltages+in+myocytes+isolated+from+the+rat+basilar+artery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium currents elicited by voltage steps and steady voltages in myocytes isolated from the rat basilar artery.</a> J Physiol. 469 (0), 535-548 (1993).</li>
<li>Kittiwoot, T. -O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intrapulmonary+artery+and+smooth+muscle+cells+to+investigate+vascular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses.</a> J Vis Exp. (184), e63686(2022).</li>
<li>Trask, A. J., Lucchesi, P. A., Mccallinhart, P. E., Zhang, X., Husarek, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+coronary+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells.</a> J Vis Exp. 111, e53983(2016).</li>
<li>Ribeiro, M. P., Relvas, R., Chiquita, S., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+umbilical+arterial+smooth+muscle+cells+%28HUASMC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human umbilical arterial smooth muscle cells (HUASMC).</a> J Vis Exp. (41), e1940(2010).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+inward+rectifier+K%2B+current+of+coronary+artery+smooth+muscle+cells+in+spontaneously+hypertensive+rats%3B+partial+compensation+of+the+attenuated+endothelium-dependent+relaxation+via+Ca2%2B-activated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased inward rectifier K+ current of coronary artery smooth muscle cells in spontaneously hypertensive rats; partial compensation of the attenuated endothelium-dependent relaxation via Ca2+-activated K+ channels.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 47 (1), 38-48 (2019).</li>
<li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kir2.1+regulates+rat+smooth+muscle+cell+proliferation%2C+migration%2C+and+post-injury+carotid+neointimal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Kir2.1 regulates rat smooth muscle cell proliferation, migration, and post-injury carotid neointimal formation.</a> Biochem Biophys Res Commun. 477 (4), 774-780 (2016).</li>
<li>Tykocki, N. R., Bonev, A. D., Longden, T. A., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+smooth+muscle+inward-rectifier+K%2Bchannels+restores+myogenic+tone+in+mouse+urinary+bladder+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular smooth muscle inward-rectifier K+channels restores myogenic tone in mouse urinary bladder arterioles.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 312 (5), F836-F847 (2017).</li>
<li>Ko, E. A., Han, J., Jung, I. D., Park, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+of+K%2B+channels+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Smooth+Muscle+Res%22%5BJournal%5D)">Physiological roles of K+ channels in vascular smooth muscle cells.</a> Smooth Muscle Res. 44 (2), 65-81 (2008).</li>
<li>Standen, N. B., Quayle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K%2B+channel+modulation+in+arterial+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Scand%22%5BJournal%5D)">K+ channel modulation in arterial smooth muscle.</a> Acta Physiol Scand. 164, 549-557 (1998).</li>
<li>Smith, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kir+channels+function+as+electrical+amplifiers+in+rat+vascular+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kir channels function as electrical amplifiers in rat vascular smooth muscle.</a> J Physiol. 586 (4), 1147-1160 (2008).</li>
<li>Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+pressure-clamped+patch-clamp+recording+at+the+node+of+Ranvier+of+rat+myelinated+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves.</a> STAR Protocols. 2 (1), 1-12 (2021).</li>
<li>Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+problems+with+in+vitro+screening+of+drugs+for+qt+interval+prolongation+using+HERG+K%2B+channels+expressed+in+mammalian+cell+lines+and+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for qt interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 48 (2), 65-80 (2002).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li>
<li>Park, W. S., Han, J., Earm, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+role+of+inward+rectifier+K%2B+channels+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Physiological role of inward rectifier K+ channels in vascular smooth muscle cells.</a> Pflugers Arch. 457 (1), 137-147 (2008).</li>
<li>Thomas, C., Svehla, L., Moffett, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+nitroprusside+induced+cyanide+toxicity+in+pediatric+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Saf%22%5BJournal%5D)">Sodium nitroprusside induced cyanide toxicity in pediatric patients.</a> Expert Opin Drug Saf. 8 (5), 599-602 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Zapis całych komórek przy użyciu świeżo wyizolowanych komórek sięga wczesnych lat osiemdziesiątychXX wieku 18, a rejestrowanie prądów kanałowych z komórek mięśni gładkich podstawy gryzoni stało się szeroko praktykowane w latach dziewięćdziesiątych XX wieku19. Wraz z postępem technologicznym naukowcy coraz bardziej koncentrują się na wynikach osiąganych dzięki tym technologiom. Jednak uwaga poświęcana aktualizowaniu i podsumowywaniu metod technicznych stopniowo malała. W art...

Choroba naczyń mózgowych jest powszechnym schorzeniem w populacji osób starszych. Wraz z poprawą standardu życia, wydłużeniem średniej długości życia i starzeniem się społeczeństwa, częstość występowania chorób naczyń mózgowych stale rośnie1. Tętnica podstawna, niesparowane naczynie powstałe w wyniku fuzji obustronnych tętnic kręgowych, biegnie pod mostem w czaszce i dzieli się na dwie tylne tętnice mózgowe. Zaopatruje most, móżdżek, tylne obszary mózgu i ucho wewnętrzne. Niedostateczny dopływ krwi do tętnicy podstawnej może prowadzić do epizodycznych zawrotów głowy, którym często towarzyszą nudności i wymioty. Pacjenci mogą również odczuwać objawy, takie jak szumy uszne, utrata słuchu i inne powiązane problemy. Objawy te są często związane ze stanami takimi jak spondyloza szyjna, miażdżyca tętnic mózgowych i nieprawidłowe ciśnienie krwi. Choroby naczyń mózgowych, szczególnie rozpowszechnione wśród osób w średnim i starszym wieku, są często związane z tymi podstawowymi schorzeniami2,3,4.
Tętnice oporowe odgrywają istotną rolę w funkcjonowaniu układu krążenia i utrzymaniu homeostazy organizmu. Jako główne miejsce oporu naczyniowego, regulują ciśnienie krwi i pojemność minutową serca, zapewniając wystarczający przepływ krwi, aby zaspokoić metaboliczne i fizjologiczne wymagania tkanek i narządów5. Tętnica podstawna, klasyfikowana jako tętnica oporowa, przede wszystkim reguluje przepływ krwi do pnia mózgu6. Komórki mięśni gładkich, które tworzą ściany tętnic oporowych, są kluczowymi mediatorami oporu naczyniowego poprzez regulację skurczu w stanie ustalonym lub napięcia naczyniowego. Komórki te zawierają liczne kanały jonowe, w tym kanały K+, kanały Ca2+ i kanały Cl-, które mają kluczowe znaczenie dla modulacji tonu naczyniowego5,7.
K+ kanały są kluczowe w ustalaniu potencjału błonowego i regulowaniu napięcia skurczowego komórek mięśni gładkich tętnic8. Istnieją cztery typy kanałów K+ w mięśniach gładkich tętnic: zależne od napięcia K+ (Kᴠ), K + zależne od Ca2+ (KCa), K + zależne od ATP (KATP) i kanały prostownika wewnętrznego K+ (Kir) 9,10,11. Kanały Kir są podzielone na siedem podtypów, przy czym Kir2.x jest klasycznym kanałem Kir. Wśród nich podrodziny Kir2.x są najbardziej istotne w unaczynieniu. Prądy Kir wykazują prostowanie wewnętrzne przy napięciach ujemnych, co wskazuje na napływ netto K+ do ogniwa, podczas gdy przy napięciach dodatnich przepływ prądu netto K+ jest minimalny lub żaden5. W układzie sercowo-naczyniowym kanały Kir są niezbędne do stabilizacji potencjału błonowego. Ich aktywacja indukuje hiperpolaryzację błony komórkowej i rozszerzenie naczyń krwionośnych12,13,14.
Eksperymenty z klamrą na świeżo wyizolowanych komórkach mięśni gładkich zostały przeprowadzone w różnych tętnicach, w tym tętnicach wieńcowych, mózgowych, nerkowych i krezkowych15,16. Podczas gdy niektóre metody wykorzystują ten sam rodzaj kolagenazy do izolacji komórek, dokładne procedury różnią się. Niewiele badań kompleksowo podsumowało metody izolowania komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Dlatego badanie to koncentruje się na świeżej izolacji pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych z tętnicy podstawnej szczura i rejestrowaniu prądów kanału Kir w tych komórkach przy użyciu techniki zaciskania łatek na całe komórki, zapewniając szczegółowy i kompletny protokół dla badaczy w pokrewnych dziedzinach.

<table><tbody><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma, USA</td><td>B2064</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek baru</td><td>Macklin Biochemical Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>B861682</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>A501330</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Hamamatsu, Japonia</td><td>C11440</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie kamery</td><td>Obraz J, USA</td><td>Mikromenedżer 2.0.0-gammal</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza F</td><td>Sigma, USA</td><td>C7926</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza H</td><td>Sigma, USA</td><td>C8051</td><td></td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Lenovo, Chiny</td> <td>~</td><td></td></tr> <tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych</td><td>Urządzenia molekularne, USA</td><td>Clampex 10.4</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych</td><td>Axon, USA</td><td>clampfit 10.4</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>A610219</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik cyfrowo-analogowy</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>Axon digidata 1550B</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do rysowania</td><td>San Diego, Kalifornia, USA</td><td>GraphPad&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>A600077</td><td></td></tr><tr><td>Szklana rurka</td><td>DL Naturegene Life Sciences.USA</td><td>B150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, Chiny</td><td>S3872</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>A100395</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>A100781</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chińska Republika Ludowa</td><td>A100288</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Mikromanipulator</td>, <td>USA</td><td>MP285A</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>sutter, USA</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus, Japonia</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Na2-ATP</td><td>Sigma, USA</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>A610404</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>A600878</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>A100865</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>A100173</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma, Stany Zjednoczone</td><td>P4762</td><td></td></tr><tr><td>D-glukonian potasu</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>A507810</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz sygnału</td><td>Molecular Devices, Stany Zjednoczone</td> Oprogramowanie wzmacniacza sygnału <td>Axon MutiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devices, USA</td> Oprogramowanie <td></td><td>MultiClamp Commander</td></tr><tr><td>Nitroprusydek sodu</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>A600867</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej</td><td>San Diego, Kalifornia, USA</td><td>GraphPad&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

rejestracja wewnętrznych prądów prostowniczych k+ w świeżo wyizolowanych komórkach mięśni gładkich tętnicy podstawnej techniką patch clamp

Recording of Inward Rectifying K+ Currents in Freshly Isolated Basilar Artery Smooth Muscle Cells by Patch Clamp Technique

Choroba naczyń mózgowych jest powszechnym schorzeniem wśród osób starszych, a częstość jej występowania stale rośnie. Tętnica podstawna jest krytycznym naczyniem mózgowym, które zaopatruje most, móżdżek, tylne obszary mózgu i ucho wewnętrzne. Aktywność kanału potasowego (K+) odgrywa znaczącą rolę w określaniu napięcia naczyniowego poprzez regulację potencjału błony komórkowej. Aktywacja wewnętrznych kanałów rektyfikujących K+ (Kir), podobnie jak innych kanałów K+, prowadzi do hiperpolaryzacji błony komórkowej i rozszerzenia naczyń krwionośnych. W tym badaniu świeżo wyizolowane komórki mięśni gładkich z tętnicy podstawnej wykorzystano do rejestrowania prądów Kir za pomocą techniki zacisku krosowego dla całych komórek. Badano wpływ 100 μmol/L BaCl2, inhibitora kanału Kir, i 10 μmol/L nitroprusydku sodu (SNP), nitro rozszerzającego naczynia krwionośne, na prądy kanału Kir. Wyniki wykazały, że BaCl2 hamował prądy kanału Kir w komórkach mięśni gładkich tętnicy podstawnej, podczas gdy SNP wzmacniał te prądy. Protokół ten stanowi obszerny przewodnik po przygotowywaniu świeżo wyizolowanych komórek mięśni gładkich tętnic i rejestrowaniu prądów kanału Kir przy użyciu techniki zacisku krosowego, oferując cenne źródło informacji dla badaczy dążących do opanowania tej metody.

Izolacja komórek mięśni gładkich tętnic 
Pierwsza część procedury szczegółowo opisuje proces izolacji komórek mięśni gładkich z tętnicy podstawnej mózgu szczura. Proces ten został przedstawiony na Rysunku 1. Procedura obejmuje trawienie enzymatyczne oraz etapy separacji komórek w celu uwolnienia komórek mięśni gładkich z tętnicy.
Reprezentatywne obrazy wyizolowanych komórek mięśni gładkich 
Druga sekcja przedstawia reprezent...

Ten protokół opisuje szybką i skuteczną metodę izolowania komórek mięśni gładkich od tętnicy podstawnej szczura i rejestrowania do wewnątrz korygujących prądów kanału potasowego w tych komórkach za pomocą techniki zacisku krosowego dla całych komórek. Stanowi on nowatorskie podejście dla naukowców badających tętnicę podstawną i kanały jonowe.

Rejestracja wewnętrznych prądów prostowniczych K+ w świeżo wyizolowanych komórkach mięśni gładkich tętnicy podstawnej techniką patch clamp

Cerebrovascular disease is a prevalent condition among the elderly, with its incidence steadily rising. The basilar artery is a critical cerebral vessel ...

Moje badania koncentrują się głównie na elektrofizjologii sercowo-naczyniowej mózgu. W badaniu tym opisano metodę izolowania pierwotnych komórek mięśni naczyniowych i wykorzystania technologii zaciskania całych komórek w celu wspokojenia ich właściwości elektrofizjologicznych. Izolacja świeżych komórek ma ograniczenia, takie jak wpływ temperatury na separację enzymów, różne czasy trawienia dla różnych naczyń krwionośnych i natychmiastowa zdolność w natywnym środowisku komórek.Ponadto technologia zaciskania zaciskowego stanowi wyzwanie w przypadku pękania sufitu i membrany, co wymaga wykwalifikowanej obsługi. Badania nad tym protokołem mają na celu łatwe pozyskiwanie aktywnych komórek pierwotnych z tętnic manualnych i szybko muszą zadzwonić do zastosowania techniki zaciskania zaciskowego. Na początek napełnij szalkę Petriego zimnym roztworem soli fizjologicznej nasyconym 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla.Umieść izolowany mózg szczura na szalce Petriego. Umieść mózg brzusznie do góry na szalce Petriego i zabezpiecz go igłami. Pod mikroskopem świetlnym zlokalizuj tętnicę podstawną.Za pomocą autoklawu, pęsety i nożyczek ostrożnie usuń otaczającą tkankę. Następnie włóż dwucentymetrowy drut o średnicy 25 mikrometrów do izolowanej tętnicy podstawnej. Delikatnie przetrzyj wewnętrzną ścianę tętnicy drutem, aby skutecznie usunąć śródbłonek naczyniowy.Aby wyizolować komórki mięśni gładkich, najpierw podgrzej roztwory w probówkach od jednej do trzech. Przenieś izolowaną tętnicę podstawną do probówki drugiej. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, ciągle wstrzykując do probówki mieszaninę 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla.Następnie przenieś tętnicę podstawną z probówki drugiej do probówki trzeciej i inkubuj. Przenieś jeden mililitr podgrzanego roztworu do separacji komórek z probówki pierwszej do probówki trzeciej. Kontynuuj wstrzykiwanie 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla, utrzymując leczenie enzymatyczne przez trzy minuty.Przygotować tętnicę podstawną w celu uwolnienia komórek. Następnie odpipetuj cztery mililitry zimnego roztworu separacyjnego do probówki trzeciej, aby zakończyć proces enzymatyczny. Odwirować mieszaninę o sile 59 g przez sześć minut.Za pomocą pipety wyrzucić supernatant. Następnie ponownie dodaj zimny roztwór rozdzielający. Po ostatnim praniu usunąć supernatant.Pozostaw jeden mililitr zawiesiny komórek. Zawiesinę komórek należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez sześć do ośmiu godzin. Przenieść 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do kąpieli.Dodaj jeden mililitr płynu zewnątrzkomórkowego do kąpieli i pozwól mu odpocząć. Aby rozpocząć, włącz polaryzację mikropipet. Umieść szklaną rurkę w biegunie.Na panelu sterowania wybierz program pierwszy. Kliknij Enter i uzyskaj dostęp do programu pierwszego. Teraz wykonaj test rampy, klikając rampę na panelu sterowania, aby zmierzyć wartość cieplną szklanej rurki.Włóż nową szklaną rurkę. Następnie wybierz program pierwszy i kliknij Enter, aby wyprodukować mikropipetę. Aby zarejestrować prąd opieki, najpierw uruchom oprogramowanie do akwizycji danych.Wybierz plik, a następnie kliknij ustaw nazwy plików danych, aby ustalić ścieżkę do przechowywania danych. Włącz funkcję testu membranowego w menu narzędzi. Umieść próbkę wyizolowanych komórek mięśni gładkich z tętnicy podstawnej szczura w środku widoku kamery mikroskopu.Zanurz końcówkę przewodu referencyjnego w roztworze kąpieli. Następnie napełnij 20% wyprodukowanej mikropipety roztworem wewnątrzkomórkowym. Zamocuj załadowaną mikropipetę na uchwycie elektrody rejestrującej.Teraz za pomocą strzykawki zastosuj nadciśnienie. Przenieś końcówkę pipety do roztworu kąpieli i wyreguluj przesunięcie pipety w oprogramowaniu wzmacniacza sygnału, aby ustawić bieżącą linię bazową na zero pikomerów. Delikatnie dociśnij pipetę do błony komórkowej.Obserwuj wzrost odporności uszczelnienia na co najmniej jedną magumę. Usuń nadciśnienie i zastosuj podciśnienie. Aby uzyskać wysoką rezystancję, z rezystancją uszczelnienia wynoszącą co najmniej jeden giggom, ustaw napięcie podtrzymania na minus 60 miliwoltów i skompensuj pojemność elektrody za pomocą CP FAST i CP slow.Zastosuj krótkie podciśnienie, aby rozerwać błonę komórkową, tworząc konfigurację całej komórki. Wybierz całą komórkę w oprogramowaniu wzmacniacza sygnału. Następnie kliknij auto, aby uzyskać kompensację pojemności membrany.Załaduj protokół kir i rozpocznij rejestrację danych. Wyizolowano świeżo wyizolowane komórki mięśni gładkich o morfologii wrzeciona. Komórki były zdrowe i nadawały się do eksperymentów z klamrą łatkową.Typowy prąd utwardzania wykazywał prostowanie wewnętrzne przy napięciach ujemnych przy minimalnym lub zerowym przepływie prądu jonów potasu przy napięciach dodatnich. Chlorek baru w stężeniach od 100 do 300 mikromoli na litr skutecznie hamował aktywność kanału kir, potwierdzając prąd jako kir. Nitroprusydek sodu zwiększał prąd kir, co wskazuje na rolę kanałów kir w rozszerzeniu naczyń krwionośnych wywołanym SNP.Porównanie zależności prądowo-napięciowych wykazało spadek gęstości prądu w obecności chlorku baru i wzrost w przypadku SNP.

recording-inward-rectifying-k-currents-freshly-isolated-basilar

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy materiał stanowi wprowadzenie do rejestracji metodą patch clamp z oocytów Xenopus laevis. Obejmuje on usuwanie błony witelinowej, tworzenie uszczelnienia gigaomowego (gigaseal) oraz opcjonalną konwersję patcha do topologii outside-out.

Rejestracja metodą patch clamp kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Pomiary aktywności kanałów potasowych Kv7 (KCNQ) w izolowanych miocytach tętniczych (przy użyciu technik elektrofizjologicznych patch clamp) równolegle z pomiarami odpowiedzi skurczowych/rozkurczowych (przy użyciu myografii ciśnieniowej) mogą dostarczyć istotnych informacji na temat roli kanałów Kv7 w fizjologii i farmakologii mięśni gładkich naczyń krwionośnych.

Badanie funkcji kanałów potasowych Kv7 w mięśniach gładkich tętnic z wykorzystaniem elektrofizjologii patch-clamp i myografii ciśnieniowej

Celem tego filmu jest zaprezentowanie procedur pozyskiwania zdrowych, nienaruszonych komórek rzęskowych z organów ucha wewnętrznego dorosłych danio pręgowanych, a następnie wykorzystania ich w badaniach metodą patch clamp w celu scharakteryzowania właściwości biofizycznych ich kanałów sterowanych napięciem.

Rejestracje metodą patch-clamp w komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego wyizolowanych z ryby danio-ostrobramowej

Ten film demonstruje badanie pobudliwości neuronów czuciowych w zwojach korzenia grzbietowego za pomocą techniki zacisku łatkowego do pomiaru potencjału reozasady i błony, analizując reakcje neuronów na przyrostowe wstrzyknięcia prądu.

Nagrania klamry krosowej całej komórki na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego szczura

Dysfunkcja kanału Kv jest związana z zaburzeniami rytmu serca. W celu zbadania mechanizmów molekularnych, które prowadzą do takich arytmii, stosujemy systematyczny protokół izolacji kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych od myszy z nokautem podjednostki pomocniczej kanału Kv. Wyizolowane kardiomiocyty można następnie natychmiast wykorzystać do komórkowych badań elektrofizjologicznych, testów biochemicznych lub immunofluorescencyjnych (IF).

Izolacja i zapisy kanału Kv w kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych myszy

Opisujemy izolację ludzkich miocytów przedsionkowych, które mogą być używane do wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca2+ w połączeniu z elektrofizjologicznymi badaniami patch-clamp.

Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądów błonowych

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować nienaruszone zwoje korzenia grzbietowego do nagrań z zaciskiem łatowym. Preparat ten utrzymuje mikrośrodowisko dla neuronów i satelitarnych komórek glejowych, unikając w ten sposób zmian fenotypowych i funkcjonalnych obserwowanych przy użyciu zdysocjowanych neuronów DRG.

Nagrania zacisków łatkowych na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego od dorosłych szczurów

Ten protokół pokazuje, jak przeprowadzić zapis klamry całokomórkowej na neuronach siatkówki z preparatu do montażu płaskiego.

Zapis patch clamp komórek amakrynowych Starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy

Celem tego protokołu jest opisanie zmodyfikowanej równoległej komory przepływowej do wykorzystania w badaniu w czasie rzeczywistym aktywacji mechanowrażliwych kanałów jonowych przez naprężenie ścinające.

Elektrofizjologiczne zapisy prądów jonowych pojedynczych ogniw pod wpływem dobrze zdefiniowanego naprężenia ścinającego

Obecny protokół opisuje efektywną metodę dynamicznego pozyskiwania prądów kanału potasowego (Kv) w czasie rzeczywistym w kardiomiocytach H9c2 za pomocą techniki patch-clamp dla całych komórek.

Zależny od napięcia zapis prądu potasu na kardiomiocytach H9C2 za pomocą techniki Whole-Cell Patch-Clamp

Poznaj metodę izolacji komórek mięśni gładkich z tętnicy podstawnej szczura i rejestracji prądów kanałów potasowych techniką patch clamp. Protokół umożliwia szczegółowe badanie elektrofizjologicznych właściwości komórek naczyniowych.

Rejestracja wewnętrznych prądów prostowniczych K+ w świeżo wyizolowanych komórkach mięśni gładkich tętnicy podstawnej techniką patch clamp (Wideo) | JoVE Journal

Rejestracja wewnętrznych prądów prostowniczych K⁺ w świeżo wyizolowanych komórkach mięśni gładkich tętnicy podstawnej techniką patch clamp

Przeglądaj więcej filmów