Analiza cytometrii masowej układowych i lokalnych odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym
25 kwietnia 2025
Ten protokół opisuje kompleksową metodę analizy cytometrii masowej (cytometria czasu przelotu [CyTOF]) do oceny zarówno ogólnoustrojowych, jak i lokalnych odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym (HCC). Podejście to ma na celu zapewnienie wglądu w krajobraz immunologiczny HCC, oferując głębsze zrozumienie mikrośrodowiska guza i powiązanych mechanizmów immunologicznych.
Cytometria masowa pozwala nam analizować zarówno układowe, jak i lokalne odpowiedzi immunologiczne w raku wątrobowokomórkowym. Poprzez profilowanie komórek odpornościowych na poziomie pojedynczych komórek, identyfikujemy unikalne podzbiory oraz stany funkcjonalne związane z progresją nowotworu, oferując wgląd w mechanizmy unikania odpowiedzi immunologicznej oraz potencjalne cele terapeutyczne dla spersonalizowanych terapii. Nasz protokół wykorzystuje cytometrię masową do analizy ponad 14 markerów jednocześnie na poziomie pojedynczych komórek, unikając nakładania widm, które obserwujemy w tradycyjnej cytometrii przepływowej. Polega to na precyzyjnym identyfikowaniu rzeczywistych populacji komórek i zapewnia wysokowymiarowe dane dla szczegółowego profilowania odpornościowego i odkrywania biomarkerów.
[Narrator] Na początek rozmroź zamrożone frakcje komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i zawiesinę komórek raka wątrobowokomórkowego. Po odzyskaniu komórek, zawieś je w jednym mililitru PBS bez wapnia i magnezu. Dodaj cysplatynę do ostatecznego stężenia 0,5 mikromolarnego, dobrze wymieszaj i inkubatyw w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Aby zatrzymać reakcję, wyśrodkuj probówki w wirówce przy 500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odsuń nadstan, a następnie dodaj jeden mililitr buforu barwienia komórek do każdej probówki. Po ponownym wyśrodkowaniu, ostrożnie odsuń nadstan. Aby wykonać blokadę receptorów FC, najpierw przygotuj 50 mikrolitrów mieszanki blokującej dla każdej próbki, połącz 48 mikrolitrów buforu barwienia komórek z dwoma mikrolirami roztworu blokującego FC. Zawiesz pelętkę komórek w mieszance blokującej i inkubatyw. Następnie dodaj 1,1 mikrolitra każdego przeciwciała na próbkę do etykietowanej probówki, aby przygotować mieszaninę przeciwciał przeciwko białkom błonowym. Uzupełnij objętość do 55 mikrolitrów buforem barwienia komórek. Przenieś 50 mikrolitrów przygotowanej mieszaniny przeciwciał do każdej probówki próbki, zwiększając objętość całkowitą do 100 mikrolitrów. Następnie delikatnie kołysz próbki, aby je wymieszać przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodaj jeden mililitr buforu barwienia komórek do każdej probówki. Wyśrodkuj w wirówce przy 500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i odsuń nadstan. Po ostatnim płukaniu krótko wiruję pozostałą ciecz z peletką komórkową, aby dokładnie zawiesić komórki. W przypadku barwienia białek jąder, dodaj 500 mikrolitrów zmieszanego roztworu fiksującego do zawieszonych komórek. Delikatnie wymieszaj próbki przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji wyśrodkuj w wirówce przy 500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i odsuń nadstan. Następnie pipetuję 1000 mikrolitrów buforu permeabilizacyjnego do każdej probówki, aby przepłukać komórki. Następnie wyśrodkuj probówki w wirówce przy 1000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 50 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał do każdej probówki po odsuciu nadstan. Delikatnie pipetuję komórki, aby je dokładnie wymieszać przed inkubacją. Następnie pipetuję 1000 mikrolitrów buforu permeabilizacyjnego do każdej probówki, wyśrodkuj ponownie, a następnie odsuń nadstan. Aby zfiksować komórki, dodaj jeden mililitr 1,6% formaldehydu przygotowanego w PBS do każdej probówki próbki i wiruję, aby dokładnie wymieszać zawartość. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut, wyśrodkuj próbki i odsuń nadstan. W przypadku barwienia interkalacyjnego jąder, najpierw rozcieńcz Intercalator Iridium Cell-ID buforem fiksującym i permeabilizacyjnym. Pipetuję jeden mililitr roztworu interkalacyjnego do każdej próbki. Delikatnie wymieszaj i wiruję. Umieść próbki w czterech stopniach Celsjusza na noc, a następnie wyśrodkuj jak poprzednio. Po zakończeniu inkubacji, pipetuję 1000 mikrolitrów buforu barwienia komórek do probówki. Wyśrodkuj probówki w wirówce przy 800 G przez pięć minut i odsuń nadstan. W końcu zawieś komórki w 450 do 900 mikrolitrach dejonizowanej wody. Barw komórki niebieskim trypanowym na liczenie komórek przed dalszą analizą. Na początek włącz cytometr masowy i uruchom program. Analizuj próbki w systemie CyTOF i pozyskaj dane cytometrii masowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i próbek komórek raka wątrobowokomórkowego. Uruchom oprogramowanie do przetwarzania danych na urządzeniu i przetwarzaj wstępnie populację komórek CD45+ w pliku FCS. Następnie wyeliminuj martwe komórki za pomocą barwienia żywotności, takiego jak wykluczanie cysplatyny. Bramuj populację CD45+, aby skoncentrować się na komórkach odpornościowych, i eksportuj bramowane populacje na dalszą analizę. Przekształć dane za pomocą współczynnika pięciu. Następnie uruchom oprogramowanie klastrujące i zidentyfikuj główne klastery na podstawie algorytmu SPADE, grupując komórki o podobnych profilach ekspresji markerów w klastery. Zastosuj hierarchiczne osadzanie sąsiadów stochastycznych, lub HSNE, dla redukcji wymiarowości i identyfikacji odrębnych klastery. Następnie użyj pakietu CyTOF kit w naszym oprogramowaniu, aby wykonać ponowne klasteryzację głównych klastery. Użyj programu PhenoGraph, aby zidentyfikować podklastery z parametrami domyślnymi. Łącznie zidentyfikowano 14
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę analizy cytometrii masowej (CyTOF) do oceny ogólnoustrojowych i lokalnych reakcji odpornościowych w rak wątrobowokomórkowym (HCC). Przez profilowanie komórek odpornościowych na poziomie pojedynczych komórek, podejście to poszerza rozumienie krajobrazu odporności i mechanizmów związanych z progresją nowotworową.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Odpowiedź odpornościowa w raku wątrobowokomórkowym
- Profilowanie odporności na poziomie pojedynczych komórek
- Spersonalizowane strategie leczenia
Tło
- Rozumienie unikania odpowiedzi odpornościowej w nowotworach
- Znaczenie analizy krajobrazu odpornościowego
- Zastosowanie cytometrii masowej w badaniach nad rakiem
Stosowane metody
- Cytometria masowa do analizy komórek odpornościowych
- Próbki raka wątrobowokomórkowego
- Identyfikacja wielu markerów jednocześnie
Główne wyniki
- Odkrycie 14 różnych typów komórek w próbkach PBMC
- Identyfikacja unikalnych profili ekspresji dla różnych komórek odpornościowych
- Charakterystyka odpowiedzi odpornościowych u pacjentów z HCC
Wnioski
- To badanie wykazuje przydatność cytometrii masowej w głębokiej profilacji odpornościowej w HCC.
- Wyniki wzbogacają rozumienie interakcji nowotwór-odpowiedzi odpornościowych i mogą wpłynąć na podejścia terapeutyczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Mass cytometry enables high-dimensional, single-cell immune profiling in hepatocellular carcinoma (HCC), addressing the challenge of characterizing complex tumor-immune interactions. This approach enhances predictive confidence in identifying immune cell subsets and functional states relevant to disease progression and therapeutic targeting. Integrating systemic and local immune landscape data supports risk-adjusted portfolio decisions in immuno-oncology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detailed interrogation of immune cell heterogeneity and functional states in HCC.
- Supports identification of immune evasion mechanisms and potential therapeutic targets.
- Facilitates biological de-risking by clarifying immune pathway involvement in tumor progression.
- Improves predictive confidence for target selection and validation in immunotherapy pipelines.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative immune cell marker panels for downstream screening workflows.
- Enables reproducible, high-throughput analysis of immune cell populations across patient samples.
- Supports assay standardization and scalability for immune profiling in translational studies.
- Delivers robust data for evaluating compound effects on specific immune subsets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune profiling outputs with disease-relevant biomarkers for translational continuity.
- Enables comparison of systemic and tumor-local immune responses to inform preclinical models.
- Supports risk-adjusted advancement of immunotherapeutic candidates based on mechanistic insights.
- Facilitates identification of shared immunological features across patient cohorts for biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This mass cytometry workflow bridges early discovery, target validation, and translational research by providing high-resolution immune landscape data in HCC.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immune cell involvement and pathway activity in tumor progression.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible immune cell marker data for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-dimensional readouts and clustering outputs for robust comparison of immune profiles across samples.
- Translational Research: Aligns immune cell signatures with disease state and biomarker strategies for preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for immune profiling across oncology indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune-oncology research.
- Operational Value: Standardizes immune profiling workflows and enhances reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in immunotherapy development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and candidates based on immune landscape data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass cytometry operation and high-dimensional data analysis.
- Demands access to CyTOF instrumentation and advanced computational tools for clustering and visualization.
- Necessitates standardized protocols for sample preparation and marker panel validation.
- May require adaptation for different tumor types or immune contexts based on marker selection.
- Dependent on robust cross-team collaboration for data interpretation and integration.
