Name: Analiza cytometrii masowej ogólnoustrojowych i miejscowych odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Poznaj metodę cytometrii masowej do analizy odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym. Protokół umożliwia identyfikację 14 typów komórek immunologicznych na poziomie pojedynczych komórek, dostarczając danych o mechanizmach unikania odpowiedzi immunologicznej przez nowotwór.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To dzieło było wspierane przez Narodowy Program Kluczowych Badań i Rozwoju Chin (grant 2019YFA0803000 dla J.S.), Fundusz Doskonałej Młodzieży Ze Scientifique Zhejiang (grant R22H1610037 dla J.S.), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant 82173078 dla J.S.), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (grant 2022C03037 dla J.S.).

Kroki pobierania próbek krwi i HCC, izolowaniu komórek jednordzeniowych z krwi obwodowej (PBMC), dysocjacji pojedynczych komórek i barwieniu zostały szczegółowo opisane w poniższym planie. Wszystkie eksperymentalne reagenty i materiały są wymienione w Tabeli Materiałów. Wszystkie eksperymenty były przeprowadzane za zgodą Komitetu Etycznego Pierwszego Szpitala Afiliacyjnego, Szkoły Medycznej Uniwersytetu Zhejiang, zapewniając, że pobieranie próbek nowotworowych nie zakłóciło diagnozy patologicznej. Pisemną zgodę świadomą uzyskaono od wszystkich ludzkich podmiotów badawczych.
1. Izolowanie PBMC
<ol>
	<li>Pobrać próbkę krwi z żyły pacjentów z HCC i użyć probówki wypełnionej antykoagulantem, aby zapobiec krzepnięciu krwi. Próbki krwi zostały pobrane od 4 pacjentów (2 mężczyzn i 2 kobiet) w wieku 50-60 lat, ze średnim wiekiem 55 lat. Dla każdego pacjenta zebrać 10-20 ml krwi obwodowej, aby zapewnić wystarczającą objętość do późniejszego izolowania PBMC, jednocześnie minimalizując dyskomfort pacjenta.</li>
	<li>Pobrać określoną objętość krwi (np. 6 ml) i dodać równą objętość płynu do separacji limfocytów krwi obwodowej (Ficol-paque lub Lymphoprep) do 15 ml probówki do wirowania. 
	UWAGA: Całkowita objętość powinna idealnie nie przekraczać 12 ml, aby pozostawić miejsce na właściwe mieszanie i zapobiec przelewaniu; maksymalna zalecana objętość dla 15 ml probówki do wirowania to 14 ml.</li>
	<li>Przechylić probówkę wirującą pod kątem 45° i powoli wleć krew wzdłuż ścianki probówki, ostrożnie układając krew powoli na powierzchni płynu do separacji limfocytów krwi obwodowej, aby uniknąć zmieszania się dwóch warstw. 
	UWAGA: Można użyć pipety do powolnego wlania krwi wzdłuż ścianki probówki.</li>
	<li>Umieścić probówkę wirującą w wirówce i ustawić przyspieszenie na 8 oraz zwolnienie na 3. Wirować z prędkością 450 x g, 4 °C, przez 30 minut. Po wirowaniu, w probówce powstają 4 warstwy, od góry do dołu: warstwa osocza, warstwa PBMC (biała warstwa błony), warstwa Ficol-Paque i warstwa czerwonych krwinek i granulocytów.</li>
	<li>Za pomocą pipety ostrożnie zebrać warstwę PBMC do nowej sterylnej probówki do wirowania. Dodać 3 razy większą objętość PBS i wirować z prędkością 500 x g w 4°C przez 5 minut. Po wirowaniu, na dnie probówki powstaje pellet.</li>
	<li>Odstawić nadstan przy użyciu pipety, dodać 1 ml 2% Fetalnego Surowicy Bydlęcej-Tamponu Buforowego z Fosfatem (FBS-PBS) do resuspendacji komórek, a następnie dodać 3 ml buforu lizy czerwonych krwinek (RBC). Wirować z prędkością 500 x g w 4°C przez 5 minut.</li>
	<li>Upewnić się, że na dnie probówki nie ma czerwonych krwinek, co wskazuje, że czerwone krwinki zostały całkowicie lizysowane. Resuspendować komórki w 2% FBS-PBS i przejść bezpośrednio do następnych eksperymentów lub dodać roztwór do krioprezerwacji komórek i przechowywać w -80°C przez 2-3 miesiące. 
	UWAGA: Jako ogólną zasadę, do resuspendacji użyć 0,5 ml 2% FBS-PBS na 1 x 106 komórek. Liczba komórek jest ustalana za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek po barwieniu niebieską trypanu, aby odróżnić żywe komórki od martwych. Ten stosunek pomaga zapewnić optymalne odzyskanie i żywotność komórek podczas kolejnych procedur.</li>
</ol>
2. Izolowanie komórek tkanki nowotworowej
UWAGA: Metoda izolowania komórek tkanki nowotworowej została zaadaptowana z Song i wsp.22.
<ol>
	<li>Po resekcji HCC, pod wskazówkami patologa, użyć sterylnego skalpela do wycięcia części tkanki nowotworowej. Blok tkanki powinien mieć około 1 cm3 wielkości. Spłukać wszelkie plamy powierzchniowe za pomocą chłodzonego wstępnie 1x PBS. Zanurzyć tkankę w probówce 15 ml zawierającej około 5 ml medium RPMI 1640 zawierającego 10% FBS. Umieścić probówkę na lodzie i przetransportować z powrotem do laboratorium w celu dalszej obróbki.</li>
	<li>Dokładnie spłukać plamy krwi i ręcznie usunąć tkankę tłuszczową i łączną za pomocą kleszczy, aby zapewnić całkowite oczyszczenie tkanki za pomocą chłodzonego wstępnie 2% FBS-PBS. Przenieść tkankę do naczynia hodowlany, zawierającego roztwór do trawienia. Zabezpieczyć tkankę nowotworową za pomocą kleszczy i pokroić ją na kawałki mniejsze niż 1 mm3 za pomocą skalpela. Przenieść roztwór do trawienia tkanki do 50 ml probówki do wirowania, dodając więcej roztworu do trawienia tkanki, aż łączna objętość wynosi około 15 ml.</li>
	<li>Umieścić probówkę zawierającą mieszankę do trawienia tkanki w szekerze. Przechylić lub spłaszczyć ją i zabezpieczyć do trawienia z prędkością 150 rpm i 37 °C przez 1 godzinę. Przefiltrować

<ol><li>Zhang, C. H., Cheng, Y., Zhang, S., Fan, J., Gao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+epidemiology+of+hepatocellular+carcinoma+in+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Changing epidemiology of hepatocellular carcinoma in Asia.</a> Liver Int. 42 (9), 2029-2041 (2022).</li>
<li>Renne, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%3A+A+clinical+and+pathological+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Pathologica%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma: A clinical and pathological overview.</a> Pathologica. 113 (3), 203-217 (2021).</li>
<li>Sayiner, M., Golabi, P., Younossi, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+burden+of+hepatocellular+carcinoma%3A+A+global+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Disease burden of hepatocellular carcinoma: A global perspective.</a> Dig Dis Sci. 64 (4), 910-917 (2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+and+prevention+of+viral+hepatitis-related+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Risk factors and prevention of viral hepatitis-related hepatocellular carcinoma.</a> Front Oncol. 11, 686962(2021).</li>
<li>Zou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Economic+burden+and+quality+of+life+of+hepatocellular+carcinoma+in+greater+China%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Economic burden and quality of life of hepatocellular carcinoma in greater China: A systematic review.</a> Front Public Health. 10, 801981(2022).</li>
<li>Li, Y., You, Z., Tang, R., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+memory+t+cells+in+chronic+liver+diseases%3A+Phenotype%2C+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident memory t cells in chronic liver diseases: Phenotype, development and function.</a> Front Immunol. 13, 967055(2022).</li>
<li>Shen, K. Y., Zhu, Y., Xie, S. Z., Qin, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+tumor+microenvironment+and+immunotherapy+of+hepatocellular+carcinoma%3A+Current+status+and+prospectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive tumor microenvironment and immunotherapy of hepatocellular carcinoma: Current status and prospectives.</a> J Hematol Oncol. 17 (1), 25(2024).</li>
<li>Oura, K., Morishita, A., Tani, J., Masaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+immune+microenvironment+and+immunosuppressive+therapy+in+hepatocellular+carcinoma%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tumor immune microenvironment and immunosuppressive therapy in hepatocellular carcinoma: A review.</a> Int J Mol Sci. 22 (11), 5801(2021).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+infiltrating+immune+cells+in+tumor+microenvironment+on+metastasis+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Oncol%22%5BJournal%5D)">Effect of infiltrating immune cells in tumor microenvironment on metastasis of hepatocellular carcinoma.</a> Cell Oncol. 46 (6), 1595-1604 (2023).</li>
<li>Du, Q., An, Q., Zhang, J., Liu, C., Hu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+immune+microenvironment+features+underlying+tumor+progression+in+the+single-cell+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Unravelling immune microenvironment features underlying tumor progression in the single-cell era.</a> Cancer Cell Int. 24 (1), 143(2024).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reshaping+the+systemic+tumor+immune+environment+%28stie%29+and+tumor+immune+microenvironment+%28time%29+to+enhance+immunotherapy+efficacy+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Reshaping the systemic tumor immune environment (stie) and tumor immune microenvironment (time) to enhance immunotherapy efficacy in solid tumors.</a> J Hematol Oncol. 15 (1), 87(2022).</li>
<li>Mao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+cancer-associated+fibroblasts+and+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%3A+New+findings+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives.</a> Mol Cancer. 20 (1), 131(2021).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+compensation+for+flow+cytometry%3A+Visualization+artifacts%2C+limitations%2C+and+caveats%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Spectral compensation for flow cytometry: Visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li>
<li>Sahaf, B., Rahman, A., Maecker, H. T., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSahaf%2C+B+%22Biomarkers+for+immunotherapy+of+cancer%3A+Methods+and+protocols%22">Biomarkers for immunotherapy of cancer: Methods and protocols</a>. , Springer. New York, New York, NY. (2020).</li>
<li>Turaç, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+flow+cytometric+analysis+of+surface+and+intracellular+antigens+reveals+surface+molecule+markers+of+human+neuropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis.</a> PLoS One. 8 (6), e68519(2013).</li>
<li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+tumor-associated+macrophage+subpopulations+and+functions+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Redefining tumor-associated macrophage subpopulations and functions in the tumor microenvironment.</a> Front Immunol. 11, 1731(2020).</li>
<li>Elaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+dimensional+imaging+mass+cytometry+panel+to+visualize+the+tumor+immune+microenvironment+contexture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">High dimensional imaging mass cytometry panel to visualize the tumor immune microenvironment contexture.</a> Front Immunol. 12, 666233(2021).</li>
<li>Gadalla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+cytof+against+flow+cytometry+for+immunological+studies+and+monitoring+of+human+cancer+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Validation of cytof against flow cytometry for immunological studies and monitoring of human cancer clinical trials.</a> Front Oncol. 9, 415(2019).</li>
<li>Ijsselsteijn, M. E., Van Der Breggen, R., Farina Sarasqueta, A., Koning, F., De Miranda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+40-marker+panel+for+high+dimensional+characterization+of+cancer+immune+microenvironments+by+imaging+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">A 40-marker panel for high dimensional characterization of cancer immune microenvironments by imaging mass cytometry.</a> Front Immunol. 10, 2534(2019).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry-based+peripheral+blood+analysis+as+a+novel+tool+for+early+detection+of+solid+tumours%3A+A+multicentre+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry-based peripheral blood analysis as a novel tool for early detection of solid tumours: A multicentre study.</a> Gut. 72 (5), 996-1006 (2023).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trajectory+and+functional+analysis+of+pd-1%28high%29+cd4%28%2B%29cd8%28%2B%29+t+cells+in+hepatocellular+carcinoma+by+single-cell+cytometry+and+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Trajectory and functional analysis of pd-1(high) cd4(+)cd8(+) t cells in hepatocellular carcinoma by single-cell cytometry and transcriptome sequencing.</a> Adv Sci. 7 (13), 2000224(2020).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+isolating+single+cells+from+human+pancreatic+cancer+tissues+and+analyzing+major+immune+cell+populations+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for isolating single cells from human pancreatic cancer tissues and analyzing major immune cell populations using flow cytometry.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102679(2023).</li>
<li>Simoni, Y., Chng, M. H. Y., Li, S., Fehlings, M., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+A+powerful+tool+for+dissecting+the+immune+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: A powerful tool for dissecting the immune landscape.</a> Curr Opin Immunol. 51, 187-196 (2018).</li>
<li>Comi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+cd163+and+cd141+identifies+human+circulating+il-10-producing+dendritic+cells+%28dc-10%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Coexpression of cd163 and cd141 identifies human circulating il-10-producing dendritic cells (dc-10).</a> Cell Mol Immunol. 17 (1), 95-107 (2020).</li>
<li>Fan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+single-cell+analysis+delineates+peripheral+immune+signature+of+coronary+atherosclerosis+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">High-dimensional single-cell analysis delineates peripheral immune signature of coronary atherosclerosis in human blood.</a> Theranostics. 12 (15), 6809-6825 (2022).</li>
<li>Sheng, J., et al. Human endogenous retrovirus activation contributes to biliary atresia pathogenesis through re-education of resident macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSheng%2C+J+%22Biorxiv%22">Biorxiv</a>. , (2022).</li>
<li>Terekhova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+atlas+of+healthy+human+blood+unveils+age-related+loss+of+nkg2c%28%2B%29gzmb%28-%29cd8%28%2B%29+memory+t+cells+and+accumulation+of+type+2+memory+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Single-cell atlas of healthy human blood unveils age-related loss of nkg2c(+)gzmb(-)cd8(+) memory t cells and accumulation of type 2 memory t cells.</a> Immunity. 56 (12), 2836-2854.e9 (2023).</li>
<li>Sathaliyawala, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+compartmentalization+of+human+circulating+and+tissue-resident+memory+t+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Distribution and compartmentalization of human circulating and tissue-resident memory t cell subsets.</a> Immunity. 38 (1), 187-197 (2013).</li>
<li>Lee, S., Vu, H. M., Lee, J. H., Lim, H., Kim, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+mass+spectrometry-based+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in mass spectrometry-based single cell analysis.</a> Biology. 12 (3), 395(2023).</li>
<li>Iyer, A., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytof+for+the+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytof for the masses.</a> Front Immunol. 13, 815828(2022).</li>
<li>Yuan, X., Wang, J., Huang, Y., Shangguan, D., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+to+explore+immunological+heterogeneity+of+tumor+microenvironment+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling to explore immunological heterogeneity of tumor microenvironment in breast cancer.</a> Front Immunol. 12, 643692(2021).</li>
<li>Serban, G. M., Mănescu, I. B., Manu, D. R., Dobreanu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+density+gradient+centrifugation+protocol+for+isolation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Marisiensis+-+Seria+Medica%22%5BJournal%5D)">Optimization of a density gradient centrifugation protocol for isolation of peripheral blood mononuclear cells.</a> Acta Marisiensis - Seria Medica. 64 (2), 83-90 (2018).</li>
<li>Shcherbakova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+cell+viability+during+the+enzymatic+dissociation+of+human+endocrine+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Factors affecting cell viability during the enzymatic dissociation of human endocrine tumor tissues.</a> Biology (Basel). 13 (9), 665(2024).</li>
<li>Devine, R. D., Alkhalaileh, H. S., Lyberger, J. M., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+methods+of+viability+determination+in+single+cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Alternative methods of viability determination in single cell mass cytometry.</a> Cytometry A. 99 (10), 1042-1053 (2021).</li>
<li>Gonzalez, V. D., Huang, Y. W., Fantl, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry+for+the+characterization+of+individual+cell+types+in+ovarian+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry for the characterization of individual cell types in ovarian solid tumors.</a> Methods Mol Biol. 2424, 59-94 (2022).</li>
<li>Zabransky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+syngeneic+mouse+hcc+tumor+models+as+a+framework+to+understand+anti-pd-1+sensitive+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Profiling of syngeneic mouse hcc tumor models as a framework to understand anti-pd-1 sensitive tumor microenvironments.</a> Hepatology. 77 (5), 1566-1579 (2023).</li>
<li>Levine, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+by+mass+cytometry+reveals+metabolic+states+of+early-activated+cd8%28%2B%29+t+cells+during+the+primary+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis by mass cytometry reveals metabolic states of early-activated cd8(+) t cells during the primary immune response.</a> Immunity. 54 (4), 829-844.e5 (2021).</li>
<li>Lv, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy%3A+Reshape+the+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy: Reshape the tumor immune microenvironment.</a> Front Immunol. 13, 844142(2022).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+tumor+immune+microenvironment+from+a+multidimensional+omics+perspective%3A+Insight+into+next-generation+car-t+cell+immunotherapy+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Deciphering the tumor immune microenvironment from a multidimensional omics perspective: Insight into next-generation car-t cell immunotherapy and beyond.</a> Mol Cancer. 23 (1), 131(2024).</li>
<li>Hsieh, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+multi-omics+analyses+of+the+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Spatial multi-omics analyses of the tumor immune microenvironment.</a> J Biomed Sci. 29 (1), 96(2022).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gdf15+induces+immunosuppression+via+cd48+on+regulatory+t+cells+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gdf15 induces immunosuppression via cd48 on regulatory t cells in hepatocellular carcinoma.</a> J Immunother Cancer. 9 (9), e002787(2021).</li>
<li>Krams, S. M., Schaffert, S., Lau, A. H., Martinez, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+mass+cytometry+to+the+analysis+of+lymphoid+populations+in+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Applying mass cytometry to the analysis of lymphoid populations in transplantation.</a> Am J Transplant. 17 (8), 1992-1999 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktów interesów.

Badanie to wykorzystuje technologię cytometrii masowej w celu przeprowadzenia szczegółowej analizy zarówno układowych, jak i lokalnych reakcji odpornościowych w HCC. Zastosowanie cytometrii masowej w tym kontekście umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu markerów na poziomie pojedynczych komórek, oferując szczegółową immunofenotypową charakterystykę, która jest kluczowa dla zrozumienia złożonego układu odpornościowego HCC. Cytometria masowa zrewolucjonizowała badania immunologiczne, umożliwiając wielowymiarową analizę poj...

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest najczęstszym pierwotnym rakiem wątroby i istotnym globalnym problemem zdrowotnym ze względu na wysoką zachorowalność i wskaźniki śmiertelności1. Według Światowej Organizacji Zdrowia, HCC zajmuje piąte miejsce pod względem najczęstszych nowotworów i jest drugą przyczyną zgonów związanych z rakiem na świecie2. Jest szczególnie rozpowszechniony w regionach o wysokich wskaźnikach przewlekłych infekcji wirusem zapalenia wątroby typu B i C, takich jak Azja Wschodnia i Afryka Subsaharyjska3. Głównymi czynnikami ryzyka są wirusowe zapalenie wątroby, marskość wątroby i zespół metaboliczny4. HCC wymaga długotrwałego leczenia, obciążając znacznym fizycznym i finansowym ciężarem, co podkreśla potrzebę skutecznej prewencji, wczesnego wykrywania i innowacyjnych strategii leczenia5.
Układ odpornościowy odgrywa kluczową rolę w rozwoju HCC. Wątroba jest narządem immunologicznie aktywnym z obfitością komórek odpornościowych, w tym makrofagów rezydujących w wątrobie, komórek naturalnych zabójców (NK) i komórek T, które są niezbędne do monitorowania i eliminowania nieprawidłowych komórek6. Jednak HCC może unikać immunologicznej obserwacji poprzez wydzielanie cząstek immunosupresyjnych, rekrutację komórek immunosupresyjnych i zmiany mikrośrodowiska nowotworowego7,8. Ta ucieczka odpornościowa nie tylko promuje wzrost i przerzuty nowotworowe, ale także wpływa na odpowiedź na immunoterapię9,10.
Odpowiedzi odpornościowe ogólnoustrojowe i lokalne w mikrośrodowisku nowotworowym są kluczowymi czynnikami wpływającymi na progresję raka i wyniki leczenia. Odpowiedzi odpornościowe ogólnoustrojowe obejmują krążące komórki odpornościowe, które mogą rozpoznawać i atakować oddalone komórki nowotworowe, takie jak obwodowe komórki T, komórki NK i monocyty, które mogą atakować komórki nowotworowe w całym ciele. Odpowiedzi odpornościowe lokalne koncentrują się na aktywności komórek odpornościowych w mikrośrodowisku nowotworowym, w tym na limfocytach infiltrujących guz (TIL), makrofagach związanych z guzem (TAM) i komórkach T regulacyjnych (Treg). Podczas gdy TIL często wywierają cytotoksyczne działanie przeciwko komórkom nowotworowym, TAM i Treg zwykle przyczyniają się do stworzenia środowiska immunosupresyjnego, które wspomaga wzrost guza11,12. Komórki nowotworowe i komórki stromy mogą przekształcać mikrośrodowisko guza, aby promować immunosupresję i uniknąć immunologicznej obserwacji. Interakcja między odpowiedziami odpornościowymi ogólnoustrojowymi i lokalnymi decyduje o ogólnej skuteczności odpowiedzi przeciwnowotworowej11. Zrozumienie tej interakcji może pomóc w opracowaniu bardziej efektywnych strategii immunoterapii.
Tradycyjna cytometria przepływowa i immunohistochemia, choć szeroko stosowane w badaniach immunologicznych, wykazują znaczne ograniczenia, jeśli chodzi o analizę złożonych krajobrazów odpornościowych, ze względu na niezdolność do przeprowadzenia kompleksowej, wielowymiarowej analizy. Cytometria przepływowa jest wysoce skuteczna w wykrywaniu markerów powierzchniowych i funkcjonalnych na poziomie pojedynczych komórek; jednak jej zdolność do jednoczesnej analizy wielu markerów jest ograniczona, często ograniczona przez nakładanie widmowe i praktyczne ograniczenia dotyczące liczby stosowanych fluorescencyjnych znaczników13,14. Z kolei immunohistochemia dostarcza cennych informacji na temat kontekstu tkankowego określonych markerów, ale podobnie jak cytometria przepływowa, jest ograniczona przez ograniczoną liczbę analizowanych markerów oraz związane z tym trudności z uzyskaniem solidnych, ilościowych, wielowymiarowych ocen15.
Aby skutecznie scharakteryzować złożone środowiska odpornościowe, niezbędne są techniki wielowymiarowe, takie jak cytometria masowa (cytometria w czasie przelotu [CyTOF]). Cytometria masowa to zaawansowana technologia, która wykorzystuje spektrometrię mas do analizy wielu markerów białkowych w pojedynczych komórkach. Umożliwia wieloparametrową analizę pojedynczych komórek bez problemów z nakładaniem widmowym, jak w przypadku tradycyjnej cytometrii przepływowej16. Dzięki stosowaniu przeciwciał z metalowymi znacznikami może mierzyć dziesiątki markerów jednocześnie, oferując kompleksowy i bezstronny widok fenotypów i funkcji komórek17. Na przykład Gadalla i wsp. opracowali panel CyTOF z ponad 40 parametrami do analizy krwinek obwodowych (PBMC) i tkanki nowotworowej, demonstrując jego przewagę w wielowymiarowej immunofenotypizacji18. Tradycyjna cytometria przepływowa, z ograniczonymi parametrami do wykrywania, nie była w stanie zidentyfikować tych rzadkich populacji komórek o unikalnych fenotypach. W przeciwieństwie do tego, cytometria masowa umożliwiła kompleksową ocenę stanu funkcjonalnego tych komórek, zapewniając bardziej szcz

<table><tbody><tr><td>1&times;PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>10&times;PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>100 mm&times;20 mm tissue-culture-treated culture dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL pipette tips</td><td>Rainin</td><td>30389218</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tube</td><td>NEST</td><td>601052</td><td></td></tr><tr><td>200 mL pipette tips</td><td>Rainin</td><td>30389241</td><td></td></tr><tr><td>40 mm nylon cell strainer/70-mm nylon cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>NEST</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m syringe fifilter</td><td>Sangon Biotech</td><td>F613462-9001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CCR2 Antibody (clone: K036C2)</td><td>BioLegend</td><td>357224</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CCR3 Antibody (clone: 5E8)</td><td>BioLegend</td><td>310724</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CCR7 Antibody (clone: G043H7)</td><td>BioLegend</td><td>353240</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD103 Antibody (clone: Ber-ACT8)</td><td>BioLegend</td><td>350202</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD115 Antibody (clone: 9-4D2-1E4)</td><td>BioLegend</td><td>347314</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD117 Antibody (clone: 104D2)</td><td>BioLegend</td><td>313201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD11b Antibody (clone: 1CRF44)&nbsp;</td><td>BD</td><td>562721</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD11c Antibody (clone: B-ly6)&nbsp;</td><td>BD</td><td>563026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD123 Antibody (clone: 6H6)</td><td>BioLegend</td><td>306002</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD127 Antibody (clone: A019D5)</td><td>BioLegend</td><td>351337</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD13 Antibody (clone: WM19)</td><td>BioLegend</td><td>301701</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD138 Antibody (clone: MI15)</td><td>BioLegend</td><td>356535</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD14 Antibody (clone: HCD14)</td><td>BioLegend</td><td>325604</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD141 Antibody (clone: M80)</td><td>BioLegend</td><td>344102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD15 Antibody (clone: QA19A61)</td><td>BioLegend</td><td>376302</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD16 Antibody (clone: B7311)&nbsp;</td><td>BD</td><td>561313</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD161 Antibody (clone: HP-3G10)</td><td>BioLegend</td><td>339902</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD163 Antibody (clone: GHI/61)</td><td>BioLegend</td><td>333603</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD169 Antibody (clone: 7-239)</td><td>BioLegend</td><td>346002</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD19 Antibody (clone: HIB19)</td><td>BioLegend</td><td>302226</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD1c Antibody (clone: L161)</td><td>BioLegend</td><td>331501</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD20 Antibody (clone: 2H7)</td><td>BioLegend</td><td>302301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD206 Antibody (clone: 15-2)</td><td>BioLegend</td><td>321151</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD24 Antibody (clone: ML5)</td><td>BioLegend</td><td>311129</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD25 Antibody (clone: BC96)</td><td>BioLegend</td><td>302624</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD3 Antibody (clone: UCHT1)&nbsp;</td><td>BD</td><td>555916</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD31 Antibody (clone: W18200D)</td><td>BioLegend</td><td>375902</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD32 Antibody (clone: FUN-2)</td><td>BioLegend</td><td>303232</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD326 Antibody (clone: CO17-1A)</td><td>BioLegend</td><td>369812</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD33 Antibody (clone: WM53)</td><td>BioLegend</td><td>303402</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD4 Antibody (clone: L200)&nbsp;</td><td>BD</td><td>563094</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD45 Antibody (clone: HI30)&nbsp;</td><td>BD</td><td>563716</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD45RO Antibody (clone: UCHL1)</td><td>BioLegend</td><td>304220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD56 Antibody (clone: 5.1H11)</td><td>BioLegend</td><td>362510</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD64 Antibody (clone: S18012C)</td><td>BioLegend</td><td>399502</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD66b Antibody (clone: 6/40c)</td><td>BioLegend</td><td>392917</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD68 Antibody (clone: Y1/82A)</td><td>BioLegend</td><td>333808</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD69 Antibody (clone: FN50)</td><td>BioLegend</td><td>310902</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD7 Antibody (clone: 4H9/CD7)</td><td>BioLegend</td><td>395602</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD8 Antibody (clone: RPA-T8)&nbsp;</td><td>BD</td><td>557750</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD80 Antibody (clone: W17149D)</td><td>BioLegend</td><td>375402</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD86 Antibody (clone: BU63)</td><td>BioLegend</td><td>374202</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human FOXP3 Antibody (clone: 206D)</td><td>BioLegend</td><td>320101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human HLA_ABC Antibody (clone: W6/32)</td><td>BioLegend</td><td>311426</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human HLA-DR Antibody (clone: L243)</td><td>BioLegend</td><td>307650</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human IgD Antibody (clone: IA6-2)</td><td>BioLegend</td><td>348211</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human Ki67 Antibody (clone: Ki-67)</td><td>BioLegend</td><td>350501</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human PD_L2 Antibody (clone: MH22B2)</td><td>BD</td><td>567783</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human PD1 Antibody (clone: EH12.2H7)</td><td>BioLegend</td><td>329951</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human PDL1 Antibody (clone: MIH2)</td><td>BioLegend</td><td>393602</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human TCR-&gamma;&delta; Antibody (clone: B1)&nbsp;</td><td>BD</td><td>74

analiza cytometrii masowej układowych i lokalnych odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym

Mass Cytometry Analysis of Systemic and Local Immune Responses in Hepatocellular Carcinoma

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest jedną z najczęstszych i najbardziej śmiercionośnych postaci raka wątroby na całym świecie. Pomimo postępów w leczeniu, rokowanie dla pacjentów z HCC pozostaje niekorzystne ze względu na złożoną interakcję czynników genetycznych, środowiskowych i immunologicznych, które napędzają jego progresję. Zrozumienie immunologicznego krajobrazu HCC jest kluczowe dla opracowania skutecznych terapii, szczególnie w dziedzinie immunoterapii, która daje duże nadzieje na poprawę wyników leczenia pacjentów. To badanie wykorzystuje technologię cytometrii masowej (cytometria z wykorzystaniem czasu lotu [CyTOF]) do zbadania zarówno ogólnoustrojowych, jak i lokalnych reakcji odpornościowych u pacjentów z HCC. Poprzez analizę krwi obwodowej i próbek nowotworowych, badania mają na celu zidentyfikowanie unikalnych populacji komórek odpornościowych oraz ich stanów funkcjonalnych związanych z progresją HCC. Wyniki zapewniają kompleksowy przegląd krajobrazu immunologicznego w HCC, podkreślając potencjalne biomarkery i cele terapeutyczne. Takie podejście oferuje cenne wglądy w mechanizmy immunologiczne leżące u podstaw HCC i otwiera drogę do opracowania bardziej skutecznych immunoterapii dla tej nowotworowości.

Aby wyjaśnić cechy immunologiczne związane z HCC, przeprowadzono kompleksową analizę populacji komórek immunologicznych. Zebrano powiązane komórki PBMC oraz próbki tkanki HCC od 4 pacjentów z HCC. Profilowanie cytometrią masową zostało przeprowadzone, aby zbadać populacje komórek immunologicznych na poziomie pojedynczej komórki proteomicznej, stosując dwa panele przeciwciał zarówno dla komórek PBMC, jak i próbek tkanki HCC.
Po k...

Ten protokół opisuje kompleksową metodę analizy cytometrii masowej (cytometria czasu przelotu [CyTOF]) do oceny zarówno ogólnoustrojowych, jak i lokalnych odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym (HCC). Podejście to ma na celu zapewnienie wglądu w krajobraz immunologiczny HCC, oferując głębsze zrozumienie mikrośrodowiska guza i powiązanych mechanizmów immunologicznych.

Analiza cytometrii masowej układowych i lokalnych odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common and deadliest forms of liver cancer worldwide. Despite advances in treatment, the prognosis for ...

Cytometria masowa pozwala nam analizować zarówno układowe, jak i lokalne odpowiedzi immunologiczne w raku wątrobowokomórkowym. Poprzez profilowanie komórek odpornościowych na poziomie pojedynczych komórek, identyfikujemy unikalne podzbiory oraz stany funkcjonalne związane z progresją nowotworu, oferując wgląd w mechanizmy unikania odpowiedzi immunologicznej oraz potencjalne cele terapeutyczne dla spersonalizowanych terapii. Nasz protokół wykorzystuje cytometrię masową do analizy ponad 14 markerów jednocześnie na poziomie pojedynczych komórek, unikając nakładania widm, które obserwujemy w tradycyjnej cytometrii przepływowej. Polega to na precyzyjnym identyfikowaniu rzeczywistych populacji komórek i zapewnia wysokowymiarowe dane dla szczegółowego profilowania odpornościowego i odkrywania biomarkerów.[Narrator] Na początek rozmroź zamrożone frakcje komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i zawiesinę komórek raka wątrobowokomórkowego. Po odzyskaniu komórek, zawieś je w jednym mililitru PBS bez wapnia i magnezu. Dodaj cysplatynę do ostatecznego stężenia 0,5 mikromolarnego, dobrze wymieszaj i inkubatyw w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Aby zatrzymać reakcję, wyśrodkuj probówki w wirówce przy 500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odsuń nadstan, a następnie dodaj jeden mililitr buforu barwienia komórek do każdej probówki. Po ponownym wyśrodkowaniu, ostrożnie odsuń nadstan. Aby wykonać blokadę receptorów FC, najpierw przygotuj 50 mikrolitrów mieszanki blokującej dla każdej próbki, połącz 48 mikrolitrów buforu barwienia komórek z dwoma mikrolirami roztworu blokującego FC. Zawiesz pelętkę komórek w mieszance blokującej i inkubatyw. Następnie dodaj 1,1 mikrolitra każdego przeciwciała na próbkę do etykietowanej probówki, aby przygotować mieszaninę przeciwciał przeciwko białkom błonowym. Uzupełnij objętość do 55 mikrolitrów buforem barwienia komórek. Przenieś 50 mikrolitrów przygotowanej mieszaniny przeciwciał do każdej probówki próbki, zwiększając objętość całkowitą do 100 mikrolitrów. Następnie delikatnie kołysz próbki, aby je wymieszać przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodaj jeden mililitr buforu barwienia komórek do każdej probówki. Wyśrodkuj w wirówce przy 500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i odsuń nadstan. Po ostatnim płukaniu krótko wiruję pozostałą ciecz z peletką komórkową, aby dokładnie zawiesić komórki. W przypadku barwienia białek jąder, dodaj 500 mikrolitrów zmieszanego roztworu fiksującego do zawieszonych komórek. Delikatnie wymieszaj próbki przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji wyśrodkuj w wirówce przy 500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i odsuń nadstan. Następnie pipetuję 1000 mikrolitrów buforu permeabilizacyjnego do każdej probówki, aby przepłukać komórki. Następnie wyśrodkuj probówki w wirówce przy 1000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 50 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał do każdej probówki po odsuciu nadstan. Delikatnie pipetuję komórki, aby je dokładnie wymieszać przed inkubacją. Następnie pipetuję 1000 mikrolitrów buforu permeabilizacyjnego do każdej probówki, wyśrodkuj ponownie, a następnie odsuń nadstan. Aby zfiksować komórki, dodaj jeden mililitr 1,6% formaldehydu przygotowanego w PBS do każdej probówki próbki i wiruję, aby dokładnie wymieszać zawartość. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut, wyśrodkuj próbki i odsuń nadstan. W przypadku barwienia interkalacyjnego jąder, najpierw rozcieńcz Intercalator Iridium Cell-ID buforem fiksującym i permeabilizacyjnym. Pipetuję jeden mililitr roztworu interkalacyjnego do każdej próbki. Delikatnie wymieszaj i wiruję. Umieść próbki w czterech stopniach Celsjusza na noc, a następnie wyśrodkuj jak poprzednio. Po zakończeniu inkubacji, pipetuję 1000 mikrolitrów buforu barwienia komórek do probówki. Wyśrodkuj probówki w wirówce przy 800 G przez pięć minut i odsuń nadstan. W końcu zawieś komórki w 450 do 900 mikrolitrach dejonizowanej wody. Barw komórki niebieskim trypanowym na liczenie komórek przed dalszą analizą. Na początek włącz cytometr masowy i uruchom program. Analizuj próbki w systemie CyTOF i pozyskaj dane cytometrii masowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i próbek komórek raka wątrobowokomórkowego. Uruchom oprogramowanie do przetwarzania danych na urządzeniu i przetwarzaj wstępnie populację komórek CD45+ w pliku FCS. Następnie wyeliminuj martwe komórki za pomocą barwienia żywotności, takiego jak wykluczanie cysplatyny. Bramuj populację CD45+, aby skoncentrować się na komórkach odpornościowych, i eksportuj bramowane populacje na dalszą analizę. Przekształć dane za pomocą współczynnika pięciu. Następnie uruchom oprogramowanie klastrujące i zidentyfikuj główne klastery na podstawie algorytmu SPADE, grupując komórki o podobnych profilach ekspresji markerów w klastery. Zastosuj hierarchiczne osadzanie sąsiadów stochastycznych, lub HSNE, dla redukcji wymiarowości i identyfikacji odrębnych klastery. Następnie użyj pakietu CyTOF kit w naszym oprogramowaniu, aby wykonać ponowne klasteryzację głównych klastery. Użyj programu PhenoGraph, aby zidentyfikować podklastery z parametrami domyślnymi. Łącznie zidentyfikowano 14

mass-cytometry-analysis-systemic-local-immune-responses

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

Tutaj opisujemy proteomiczne podejście pojedynczej komórki do oceny immunologicznych zmian fenotypowych i funkcjonalnych (indukcja cytokin wewnątrzkomórkowych) w próbkach krwi pełnej z obwodu, analizowanych za pomocą cytometrii masowej.

Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Tutaj opisujemy rozwój klinicznie istotnego mysiego modelu raka wątroby, podsumowującego typowe cechy immunologiczne raka wątrobowokomórkowego (HCC).

Onkogenny, indukowany hepatocytami, ortotopowy mysi model raka wątrobowokomórkowego powstającego w warunkach zapalenia i zwłóknienia wątroby

Unikanie eliminacji za pośrednictwem komórek NK przez komórki rakowe jest ważne dla inicjacji i progresji raka. Tutaj przedstawiamy dwa protokoły nieoparte na radioaktywności do oceny cytotoksyczności komórek NK w stosunku do komórek nowotworowych wątroby. Dodatkowo przedstawiono trzeci protokół do analizy migracji komórek NK.

Pomiar cytotoksyczności i migracji komórek NK w kontekście komórek nowotworowych wątroby

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Brakuje kompleksowych modeli in vitro, które wiernie odwzorowują daną chorobę ludzką. Obecne badanie przedstawia trójwymiarowe (3D) tworzenie i hodowlę sferoidów guza, wiarygodne narzędzie in vitro do badania interakcji guz-zręb w ludzkim raku wątrobowokomórkowym.

Trójwymiarowy model sferoidalny do badania interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym

Ten protokół opisuje generowanie myszy z ludzkim układem odpornościowym (HIS) do badań immunoonkologicznych. Przedstawiono instrukcje i rozważania dotyczące stosowania tego modelu do testowania ludzkich immunoterapeutyków na ludzkich nowotworach wszczepionych w tym modelu z naciskiem na scharakteryzowanie odpowiedzi ludzkiego układu odpornościowego na guz.

Testowanie immunoterapeutyków przeciwnowotworowych w humanizowanym modelu mysim z ludzkimi nowotworami

Tutaj szczegółowo opisujemy prosty, szybki i niezawodny protokół wspomagany wieloparametryczną cytometrią przepływową i nowotworem na chipie, aby monitorować i charakteryzować etapy składające się na cykl rak-odporność. Rzeczywiście, dogłębne zrozumienie wzajemnych zależności między rakiem a komórkami odpornościowymi dostarcza kluczowych informacji, które pozwalają przechytrzyć nowotwory i kierować opieką kliniczną.

Systemy kohodowli in vitro w celu odtworzenia cyklu rak-odporność

Obecność komórek tucznych na wewnętrznym brzegu i obszarach okołonowotworowych raka wątrobowokomórkowego po resekcji daje korzystne rokowanie. Badanie to potwierdza oprogramowanie do analizy obrazu QuPath jako obiecującą platformę, która może zaspokoić potrzebę odtwarzalności, spójności i dokładności w patologii cyfrowej.

Komórki tuczne w mikrośrodowisku raka wątrobowokomórkowego dają korzystne rokowanie: badanie retrospektywne przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu QuPath

W niniejszym filmie zaprezentowano technikę wycięcia i usunięcia grasicy płodowej, a także przygotowanie kultur ex vivo grasicy traktowanej 2-dGuo. <br...

Przygotowanie hodowli organowych grasicy traktowanych 2-dGuo

Poznaj metodę cytometrii masowej do analizy odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym. Protokół umożliwia identyfikację 14 typów komórek immunologicznych na poziomie pojedynczych komórek, dostarczając danych o mechanizmach unikania odpowiedzi immunologicznej przez nowotwór.

Analiza cytometrii masowej układowych i lokalnych odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym

Przeglądaj więcej filmów