Izolacja mikroorganizmów glebowych z wykorzystaniem technologii iChip

Próbujemy odkryć nowe rodzaje chemii do zwalczania patogenów rolniczych. Korzystając z technologii iChip, wyizolowaliśmy nowe organizmy, które, mamy nadzieję, doprowadzą do powstania nowej chemii. Testowanie tych organizmów i/lub ich naturalnych produktów pod kątem patogenów rolniczych może prowadzić do znalezienia nowych organizmów kandydujących na biopestycydy i/lub ich związków.

Metoda iChip pozwala na wyizolowanie mikroorganizmów, które nie nadają się do hodowli w konwencjonalnych warunkach, zapewniając okres udomowienia i kontaktu z ich naturalnym środowiskiem. Nasza zmodyfikowana konstrukcja iChip jest prosta, niedroga i zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego, dzięki czemu jest łatwo dostępna dla różnych celów badawczych. Wyniki naszego projektu iChip pozwalają zadać takie pytania, jak: jakie mechanizmy napędzają supresję patogenów przez nowe mikroorganizmy?

Czy te związki bioaktywne mogą działać niezawodnie w rzeczywistych badaniach? Jak czynniki środowiskowe wpływają na ich skuteczność? Odpowiedzi na te pytania pomogą w zrównoważonym rozwoju biopestycydów, przekształceniu zarządzania chorobami roślin i zmniejszeniu zależności od syntetycznych fungicydów.

Laboratorium zastosuje technologię iChip do izolowania nowych bakterii z gleb hamujących choroby wytwarzanych przez uprawy okrywowe, identyfikując nowe mikroorganizmy i związki bioaktywne. Zostaną one przetestowane w kontrolowanych badaniach nad chorobami roślin w celu opracowania innowacyjnych, zrównoważonych alternatyw dla syntetycznych fungicydów do zwalczania chorób rolniczych. Aby skonstruować zmodyfikowany iChip za pomocą 5-milimetrowego narzędzia do dziurkowania agaru, usuń dna studzienek z 96-dołkowej płytki.

Wytnij membrany poliwęglanowe o grubości 0,05 mikrometra na prostokąty, upewniając się, że wymiary pasują do dolnej powierzchni płytki 96-dołkowej. Nałóż uszczelniacz silikonowy, aby przykleić membranę poliwęglanową do dna płytki 96-dołkowej. Upewnij się, że klej uszczelnia studzienki, ale nie zakrywa całkowicie otworów studni.

Pozostaw płytki do wyschnięcia na 24 godziny. Dodaj 4,5 mililitra sterylnej wody do każdej z 15-mililitrowych probówek wirówkowych oznaczonych od A do D oraz do każdej z 50-mililitrowych probówek oznaczonych od E do H. Dodaj 1 gram gleby do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie dodaj 10 mililitrów wody do probówki i mieszaj mieszaninę przez 10 minut.

Pozostaw zawiesinę gleby na 10 minut, aby opadła. Następnie odpipetować 0,5 mililitra supernatantu glebowego do probówki A i dokładnie wymieszać. Teraz przenieś 0,5 mililitra zawiesiny komórek z probówki A do probówki B i dokładnie wymieszaj.

Powtórz tę czynność dla wszystkich pozostałych probówek wirówkowych, wykonując serię dziesięciokrotnych rozcieńczeń w ośmiu probówkach. Na początek zanurz iChips całkowicie w 95% etanolu. Po 15 minutach wyjmij płytki z etanolu i umieść je na sterylnym ręczniku papierowym w okapie z przepływem laminarnym.

Pozwól etanolowi odparować, włączając sterylizator ultrafioletowy w okapie z przepływem laminarnym na 15 minut. Odpipetować 360 mikrolitrów sterylnego bursztynianu minimalnej ilości soli lub pożywki SMS do pierwszej kolumny płytki, aby służyły jako kontrola. Dodać 45 mililitrów SMS do zawiesiny komórek w probówce E. Dokładnie wymieszać, aby połączyć zawiesinę komórek z agarem.

Odpipetować 360 mikrolitrów mieszaniny komórek agarowych do wszystkich pozostałych studzienek 96-dołkowej płytki. Po ustawieniu podłoża uszczelnij górną część płytki pokrywą płytki PCR. Napełnić płytki za pomocą probówek F, G i H, aby przygotować w sumie cztery płytki o dziesięciokrotnych różnicach stężeń.

Umieść płytki w pojemniku zawierającym około 1 cala gleby, stroną z membraną skierowaną w dół. Inkubować płytki wewnątrz przykrytego pojemnika w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po sześciu tygodniach sprawdź iChips pod kątem rozwoju drobnoustrojów.

Spłucz zmodyfikowany iChip trzykrotnie sterylną wodą, aby usunąć wszystkie cząstki brudu. Przetrzyj górną i boki płytki 95% etanolem, omijając stronę z membraną półprzepuszczalną. Za pomocą sterylnego ostrza przetnij pokrywę płytki wokół studzienki zawierającej kolonię i usuń kwadrat sterylną pęsetą.

Za pomocą sterylnego narzędzia do smug przekłuć kolonię i smugi na płytce agarowej SMS metodą czterech ćwiartek. Inkubuj płytki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez tydzień lub do momentu zaobserwowania wzrostu kolonii. Po inkubacji zbadaj kolonie, aby potwierdzić izolację kultur.