Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki u myszy za pomocą barwienia immunologicznego

Zakres badań polega na zbadaniu morfologii i rozmieszczenia przestrzennego pasożytów w unaczynieniu siatkówki z wykorzystaniem zaawansowanych technik obrazowania. Aby zapewnić szczegółowy obraz w celu zademonstrowania cech morfologicznych pasożytów, w badaniu opisano nowe podejście łączące retroorbitalne wstrzyknięcie środka fluorescencyjnego, barwienie immunofluorescencyjne i leczenie oczyszczania tkanek w celu przyspieszenia badań w naszej dziedzinie.

W porównaniu ze stanem przed oczyszczeniem tkanki siatkówki myszy, sygnały tła naczyń krwionośnych i pasożytów znakowanych fluorescencyjną laktyną pomidorową i PDGFR-beta są znacznie zmniejszone po oczyszczeniu tkanek, co ułatwia bardziej precyzyjną obserwację ich relacji przestrzennej.

Nasze wyniki wskazują, że techniki te są wysoce kompatybilne w demonstrowaniu pasożytów w unaczynieniu siatkówki w całej siatkówce. Połączenie tych technik histologicznych jest skutecznym podejściem do szczegółowej wizualizacji cech morfologicznych pasożytów z trójwymiarowego widoku.

[Instruktor] Na początek umieść znieczuloną mysz w prawej bocznej pozycji leżącej z głową skierowaną w lewo. Delikatnie naciśnij dwa palce na obszarze okołooczodołowym, aby odsłonić lewe oko myszy. Za pomocą jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 27 delikatnie wbij około dwóch do trzech milimetrów w zatokę żylną oczodołu, upewniając się, że skos igły jest skierowany do przodu pod kątem 45 stopni. Wstrzyknij 0,1 mililitra fluorescencyjnej laktyny pomidorowej do zatoki żylnej oczodołu. Po pięciu minutach wstrzyknięcia zaoczodołowego należy poddać mysz eutanazji i użyć nożyczek chirurgicznych, aby otworzyć klatkę piersiową. Włóż igłę o rozmiarze 24 dwa milimetry do lewej komory serca przez wierzchołek lewej komory. Wykonaj perfuzję z szybkością trzech mililitrów na minutę z 20 mililitrami 0,9% soli fizjologicznej, a następnie 20 mililitrami 4% soli fizjologicznej. Wstrzyknąć 0,1 mililitra 0,9% formaldehydu do 0,1-molowego buforu fosforanowego. Następnie połóż ofiarowaną mysz na boku i usuń skórę zakrywającą oczy nożyczkami. Wyłuszczeć oczy nożyczkami i kleszczami. Przetnij nerw wzrokowy i otaczające tkanki i wyjmij oko. Przenieść oko na 12-dołkową płytkę w celu utrwalenia w 4% formaldehydzie w 0,1-molowym buforze fosforanowym przez dwie godziny. Po utrwaleniu krioprotekcjonalnie oko w 25% sacharozie w 0,1-molowym buforze fosforanowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż opadnie na dno roztworu. Za pomocą plastikowej pipety pastora przenieś oko na szalkę Petriego zawierającą 0,1-molowy bufor fosforanowy. Przebij krawędź rogówki ostrymi nożyczkami, przetnij wokół rogówki i tęczówki i wyrzuć je. Za pomocą kleszczy usuń soczewkę i ciało szkliste. Następnie użyj cienkich kleszczyków, aby odciągnąć siatkówkę w kształcie miseczki od środka oka. Przepłukać siatkówkę 0,1-molowym buforem fosforanowym na czystej szalce Petriego. Po wyizolowaniu siatkówki myszy w kształcie miseczki, inkubuj ją w 20-godzinnym inkubatorze z 2% roztworem Triton X-100 w 0,1-molowym buforze fosforanowym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś siatkówkę do roztworu blokującego i obracaj z prędkością 72 obr./min na wytrząsarce przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umieść siatkówkę w probówce mikrowirówkowej zawierającej pierwszorzędowe przeciwciała koziego anty-PDGFR beta w buforze rozcieńczającym. Obracaj rurkę na wytrząsarce przez dwa dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po dwóch dniach dwukrotnie przemyć siatkówkę buforem do przemywania w temperaturze pokojowej. Umieść siatkówkę w buforze do płukania i przenieś ją na noc do shakera w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś siatkówkę do probówki mikrowirówkowej zawierającej roztwór jednego miligrama na mililitr przeciwciała wtórnego anty-kozy osła 488 i 0,2 nanograma na mililitr fluorescencyjnego barwnika jądrowego DAPI. Obracaj rurkę na wytrząsarce z prędkością 72 obr./min przez pięć godzin w czterech stopniach Celsjusza. Przemyć siatkówkę w sześciodołkowej płytce z buforem do przemywania przez jedną godzinę dwa razy w temperaturze pokojowej. Inkubować siatkówkę w buforze do przemywania na wytrząsarce przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś siatkówkę do odczynnika do oczyszczania tkanek i delikatnie obracaj go na wytrząsarce z prędkością 60 obr./min przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po oczyszczeniu tkanek przepłukać siatkówkę 0,1-molowym buforem fosforanowym na czystej szalce Petriego. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj cztery promieniste nacięcia sięgające około 2/3 promienia siatkówki, aby uzyskać kształt płatka. Spłaszcz siatkówkę i zamontuj ją na szkiełku mikroskopowym wnętrzem siatkówki skierowaną do góry. Użyj małego kawałka chłonnego papieru, aby usunąć nadmiar buforu fosforanowego. Okrąż zamontowaną siatkówkę za pomocą przekładki. Wypełnij lukę świeżym odczynnikiem do czyszczenia tkanek i umieść na wierzchu szkiełko nakrywkowe. Zeskanuj widoki montażowe oznakowanej siatkówki za pomocą panoramicznego skanera plastrów tkanek. Wykonuj zdjęcia w większym powiększeniu za pomocą systemu obrazowania wyposażonego w obiektyw 2X i 10X z przysłonami numerycznymi odpowiednio 0,40 i 0,95. Przechwytuj obrazy stosu 50Z z oznakowanej siatkówki w dwóch mikrometrowych ramkach. Kolejno kliknij Ustaw początkową płaszczyznę ogniskową, Ustaw końcową płaszczyznę ogniskowej, Ustaw rozmiar kroku, wybierz Wzór głębi, Przechwytywanie obrazu i Seria Z, aby zintegrować wszystkie obrazy w jeden ostry obraz w trybie projekcji i topografii. Następnie uchwyć obrazy za pomocą zielonej fluorescencji o długości 499 i 519 nanometrów, czerwonej fluorescencji o długości 591 i 618 nanometrów oraz niebieskiej fluorescencji o długości 401 i 421 nanometrów. Kolejno wybierz Dodaj nowe powierzchnie, wybierz Ustawienia głośności, wybierz Kanał źródłowy, dostosuj wyświetlanie, dostosuj kąt powierzchni i migawkę, aby zaimportować obrazy konfokalne Z-Stack do oprogramowania analitycznego i zrekonstruować obrazy w trójwymiarowym wzorze. Przezroczystość tkanki całej siatkówki mount była zwiększona po zabiegu oczyszczania tkanek w porównaniu z siatkówką bez oczyszczania tkanki. Unaczynienie siatkówki znakowane lektyną pomidorową i pasożyty siatkówki znakowane PDGFR-β były widoczne zarówno przed, jak i po oczyszczeniu tkanek, ale szum tła został zmniejszony po oczyszczeniu tkanek. Pasożyty siatkówki zaobserwowano wzdłuż drzewa naczyniowego, wykazując stopniowy rozkład od centralnych do obwodowych obszarów siatkówki. Trójwymiarowe obrazy Z-Stack z oczyszczonej siatkówki pokazały pasożyty ciasno owinięte wokół naczyń siatkówki o różnych średnicach z silniejszym zabarwieniem PDGFR-β w naczyniach włosowatych.