Name: Enzymatyczna izolacja śródmiąższowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Naucz się izolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z mięśni szkieletowych gryzoni metodą enzymatyczną. Protokół obejmuje rozdział mechaniczny, filtrację i różnicową ultrawirówkę, zapewniając wysoką czystość i wydajność izolacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Departament Obrony W81XWH2210261 (do Yao Yao).

Ten protokół izoluje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) z tkanki mięśni szkieletowych za pomocą mechanicznego oddzielania, dysocjacji enzymatycznej, filtracji i ultrawirowania różnicowego. Pozwala na izolację EV z pojedynczych lub połączonych grup mięśni kończyn gryzoni, w tym kości piszczelowej przedniej (TA), prostownika długiego palca (EDL), płaszczkowatego (SOL), mięśnia brzuchatego łydki (GAS) i mięśnia czworogłowego uda (QUA). Wykorzystanie zwierząt zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie w Georgii, a badanie było zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystywania zwierząt w badaniach. Zwierzęta były trzymane w obiektach dla zwierząt na Wydziale Nauk o Zwierzętach i Mleczarstwie na Uniwersytecie Georgii. W tym badaniu wykorzystano dorosłe samce myszy typu dzikiego (C57BL/6J), z tkankami pobranymi od myszy uśmierconych w wieku 3 miesięcy. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu znajdują się w Tabeli Materiałów.
1. Mechaniczne oderwanie grup mięśniowych od myszy
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji za pomocą CO2 , a następnie zwichnięciu szyjki macicy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Ogolić obie tylne kończyny.</li>
	<li>Zamocuj nogę myszy na sterylnej płytce z przednią stroną nogi skierowaną do góry (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie (5 mm) w skórze po bocznej stronie kostki myszy za pomocą nożyczek preparacyjnych.</li>
	<li>Ostrożnie włóż jedno ostrze nożyczek w nacięcie, umieszczając je pod skórą, ale nie w tkance mięśniowej poniżej. Następnie przetnij skórę w górę w kierunku kolana, aby przedłużyć długość nacięcia.</li>
	<li>Chwyć skórę wzdłuż nacięcia za pomocą szorstko zakończonej pęsety i rozszerz otwór, aż mięsień będzie widoczny.</li>
	<li>Zlokalizuj mięsień TA, który biegnie od kolana do kostki po bocznej stronie kości piszczelowej11, i użyj pęsety z ostrym końcem, aby chwycić i oderwać cienką warstwę tkanki łącznej pokrywającej mięsień (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>W pobliżu kostki zidentyfikuj dwa ścięgna na końcu TA, jedno bezpośrednio połączone z mięśniem TA, a drugie ścięgno EDL, które jest mniejsze i znajduje się obok ścięgna TA po stronie bocznej. Przeciąć oba ścięgna za pomocą nożyczek preparacyjnych.</li>
	<li>Chwyć oba ścięgna szorstko zakończonym pęsetą. Następnie użyj kolejnej pary szorstkich lub ostro zakończonych pęset, aby oddzielić ścięgna, oddzielając w ten sposób TA od EDL (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Podnieś TA za świeżo zerwane ścięgno za pomocą szorstko zakończonej pęsety. Następnie przetnij ścięgno TA w pobliżu kolana za pomocą nożyczek preparacyjnych, usuwając w ten sposób mięsień. Powtórz ten proces, aby usunąć EDL i przechowywać oba mięśnie w PBS na lodzie.</li>
	<li>Zwolnij nogę i odwróć mysz tak, aby tylna powierzchnia była skierowana do góry.</li>
	<li>Gdy skóra na nodze jest teraz częściowo usunięta, przetnij skórę w pobliżu kostki za pomocą nożyczek preparacyjnych. Następnie użyj szorstko zakończonej pęsety, aby chwycić i oderwać skórę w górę w kierunku tylnej części kolana, odsłaniając GAZ.</li>
	<li>Przeciąć ścięgno GAS w pobliżu kostki za pomocą nożyczek preparacyjnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Chwyć ścięgno GAS szorstko zakończonym pęsetą i podnieś je do góry, aby odsłonić spód GAS.</li>
	<li>Zlokalizuj małe ścięgno SOL na spodzie GAS w pobliżu kolana (gdzie GAS jest nadal podłączony). Przeciąć ścięgno SOL za pomocą nożyczek preparacyjnych, powodując skurcz SOL w górę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Chwyć zerwane ścięgno SOL pęsetą z ostrymi końcami i delikatnie je podnieś, odrywając w ten sposób SOL od spodu GAS.</li>
	<li>Przeciąć koniec SOL w miejscu, w którym przyczepia się do odciętego końca GAS, za pomocą nożyczek preparacyjnych, oddzielając w ten sposób dwa mięśnie. Przechowywać SOL w PBS na lodzie.</li>
	<li>Odetnij koniec GAS w pobliżu kolana i umieść go w PBS na lodzie.</li>
	<li>Po usunięciu czterech wymienionych mięśni poniżej kolana, odwróć mysz tak, aby przednia twarz była skierowana do góry.</li>
	<li>W razie potrzeby obierz skórę dalej szorstko zakończonym pęsetą, aby odsłonić QUA. Ustaw nogę myszy pod kątem 90°, aby zmusić QUA do zgięcia. Przetnij ścięgno najbliżej kolana za pomocą nożyczek preparacyjnych.
	<ol>
		<li>Oddziel QUA od kości udowej, przecinając mięsień i kość, aż QUA będzie połączone tylko ścięgnem bliższym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E). Następnie przeciąć ścięgno bliższe i usunąć QUA. Umieść QUA w PBS na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upewnij się, że po odwarstwieniu mięśni kość piszczelowa i strzałkowa są wyraźnie odsłonięte (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Przepłucz mięśnie kilka razy PBS, aby usunąć zanieczyszczenia, takie jak sierść i krew (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G). Następnie delikatnie osusz mięśnie ręcznikami papierowymi. Użyj wagi analitycznej, aby zmierzyć masę mięśniową, która zostanie później wykorzystana do obliczenia EV zebranej na gram mięśni.</li>
</ol>
2. Enzymatyczna dysocjacja oderwanych fragmentów mięśni
<ol>
	<li>Delikatnie usuń ścięgna mięśniowe z próbki mięśniowej za pomocą pęsety z ostrym końcem, pęsety do odłamków, skalpeli lub nożyczek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Po usunięciu ścięgna przetnij mięsień wzdłuż włókien mięśniowych (od ścięgna do ścięgna) na kawałki mięśni o grubości 1 mm za pomocą nożyczek lub skalpela, aby zwiększyć stosunek powierzchni do objętości (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B,C). 
	UWAGA: Staraj się ograniczyć uszkodzenia włókien mięśniowych podczas cięcia. W przypadku większych mięśni, takich jak TA, GAZ i QUA, wykonaj dodatkowe cięcia w porównaniu z mniejszymi mięśniami, takimi jak EDL i SOL, aby zapewnić mniej więcej równy stosunek powierzchni do objętości we wszystkich próbkach mięśni (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D).</li>
	<li>Przygotuj 10 ml świeżego buforu enzymów trawiennych (DEB) dla każdej myszy i trzymaj go na lodzie do czasu użycia.
	<ol>
		<li>Aby przygotować DEB, należy zmieszać 2 mg enzymu kolagenazy II na 1 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 1% roztworem penicyliny i streptomycyny. Po wymieszaniu przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 μm.</li>
		<li>Upewnij się, że DEB ma aktywność enzymatyczną ponad 250 jednostek. Wirować DEB, aż roztwór zostanie dokładnie wymieszany, a proszek enzymu kolagenazy II nie będzie już widoczny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podziel tkankę mięśniową na podwielokrotności, z których każda zawiera 20 mg tkanki mięśniowej. Następnie dodaj 1 ml DEB do każdej podwielokrotności w celu dysocjacji enzymatycznej.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę DEB i mięśni na wytrząsarce w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 12 godzin z prędkością wytrząsania 100 obrotów na minutę (rpm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
</ol>
3. Filtracja i wirowanie z niską prędkością w celu wzbogacenia SkM-EV
UWAGA: Ustaw wirówkę chłodniczą na 4 °C i uruchamiaj ją, aż osiągnie ustawioną temperaturę. Wszystkie potrzebne probówki i próbki należy przechowywać na lodzie do czasu, aż będą gotowe do użycia.
<ol>
	<li>Postępując zgodnie z procedurami trawienia enzymatycznego, upewnij się, że nie są widoczne żadne dostrzegalne kawałki mięśni (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A). Przed odwirowaniem w lodówce należy wyekstrahować 10 μl roztworu z mieszaniny DEB-muscle i przenieść go do probówki o pojemności 0,2 ml w celu zbadania żywotności komórek, jeśli to konieczne.</li>
	<li>Przygotuj i oznacz nowe puste probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Ustaw filtr 0,45 μm i strzykawkę 5 ml, wyjmując tłok (nie wyrzucaj) i wkręcając piastę w górny koniec filtra 0,45 μm. Ustaw filtr tak, aby dolny koniec został umieszczony w nowo oznaczonej pustej tubie (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3D). Przefiltruj 1x PBS przez filtr 0,2 μm.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 1 000 x g i 4 °C, aby osadzać wszelkie zanieczyszczenia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B). Przenieść supernatant (około 1 ml) do strzykawki za pomocą mikropipety P200 (<klasa mocna = "xfig" >Rysunek 3C, E).</li>
	<li>Ponownie włożyć tłok strzykawki i powoli przepchnąć supernatant przez filtr, pozwalając mu przejść i zebrać się w nowo oznaczonej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3F).</li>
	<li>Ponownie usunąć tłok i odpipetować około 200 μl 1x PBS do strzykawki.</li>
	<li>Ponownie włóż tłok i powoli przepchnij 200 μl 1x PBS przez filtr (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3G), aby usunąć pozostały supernatant z filtra i do oznaczonej 1,5 ml probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Powtórz proces filtracji dla innych probówek, używając nowego filtra dla każdej próbki tkanki.</li>
	<li>Po filtracji upewnij się, że roztwór jest przezroczysty i pozbawiony resztek kawałków mięśni (<silna klasa="xfig">Rysunek 3H).</li>
</ol>
4. Ultrawirowanie różnicowe do oczyszczania SkM-EV
UWAGA: Ustaw wirówkę chłodniczą na 4 °C i uruchamiaj ją, aż osiągnie ustawioną temperaturę. Wszystkie potrzebne probówki i próbki należy przechowywać na lodzie i są gotowe do użycia.
<ol>
	<li>Przefiltrowany roztwór przenieść do nowych mikroprobówek o pojemności 1,5 ml (odpowiednich dla 200 000 x g). Zrównoważ wszystkie mikroprobówki dodatkowym 1x PBS, aby zapewnić równą objętość przed umieszczeniem ich w mikro-ultrawirówce.</li>
	<li>Po upewnieniu się, że objętość wszystkich probówek jest równa, zamknij probówki i umieść je w wirniku mikro-ultrawirówki, która ma być zrównoważona (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A).</li>
	<li>Włącz mikro-ultrawirówkę i ustaw ją tak, aby pracowała przez 1 godzinę przy 100 000 x g i 4 °C (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Umieść wirnik załadowany probówkami w mikro-ultrawirówce, zamknij pokrywę i włącz próżnię (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C).</li>
	<li>Gdy próżnia osiągnie poziom 2, naciśnij przycisk start i poczekaj, aż proces wirowania zostanie zakończony (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 4D).</li>
	<li>Po zakończeniu cyklu mikro-ultrawirówki kliknij przycisk próżni, aby ponownie zwiększyć ciśnienie w komorze przed wyjęciem wirnika i rur. Trzymaj rurki na lodzie i ustaw je pionowo, aby nie naruszyć granulki.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety P200, unikając zakłócenia osadu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4E).</li>
	<li>Wysunąć końcówkę, a następnie dodać 50 μl 1x PBS do probówki po usunięciu supernatantu za pomocą mikropipety P200. W przypadku próbek GAS i QUA dodać do 500 μl 1x PBS, aby ułatwić rozpuszczanie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4F).</li>
	<li>Zawiesić osad, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą mikropipety P20 (lub mikropipety P200, jeśli dodano 500 μl), aż zostanie całkowicie rozdrobniony i nie będzie już widoczny.</li>
	<li>Zamknąć probówkę i przechowywać ją w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego przechowywania (krócej niż tydzień), -80 °C do długotrwałego przechowywania lub umieścić probówkę z powrotem na lodzie, jeśli próbka zostanie natychmiast scharakteryzowana za pomocą cytometrii nanoprzepływowej, Western blot lub innych testów.</li>
</ol>

Optimized Isolation of Skeletal Muscle-Derived EVs for Research and Therapeutics

<ol><li>Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+ultrasound+promotes+secretion+of+anti-inflammatory+extracellular+vesicles+from+skeletal+myotubes+via+elevation+of+intracellular+calcium+level%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pulsed ultrasound promotes secretion of anti-inflammatory extracellular vesicles from skeletal myotubes via elevation of intracellular calcium level.</a> Elife. 12, 89512(2023).</li>
<li>Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+myotube-derived+extracellular+vesicles+enhance+itaconate+production+and+attenuate+inflammatory+responses+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skeletal myotube-derived extracellular vesicles enhance itaconate production and attenuate inflammatory responses of macrophages.</a> Front Immunol. 14, 1099799(2023).</li>
<li>Takada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-%CE%B1+blunts+the+osteogenic+effects+of+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles+by+affecting+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-α blunts the osteogenic effects of muscle cell-derived extracellular vesicles by affecting muscle cells.</a> Calcif Tissue Int. 112 (3), 377-388 (2023).</li>
<li>Bourgeois, B. L., Levitt, D. E., Molina, P. E., Simon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+adipocyte+and+myotube+extracellular+vesicle+miRNA+cargo+in+chronic+binge+alcohol-administered+siv-infected+male+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of adipocyte and myotube extracellular vesicle miRNA cargo in chronic binge alcohol-administered siv-infected male macaques.</a> Alcohol. 108, 1-9 (2023).</li>
<li>Kargl, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+potential+of+skeletal+muscle+derived+extracellular+vesicles+differs+between+oxidative+and+glycolytic+muscle+tissue+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Angiogenic potential of skeletal muscle derived extracellular vesicles differs between oxidative and glycolytic muscle tissue in mice.</a> Sci Rep. 13 (1), 18943(2023).</li>
<li>Vann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+microRNA+profiles+of+intramuscular+and+secreted+extracellular+vesicles+in+human+tissue-engineered+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential microRNA profiles of intramuscular and secreted extracellular vesicles in human tissue-engineered muscle.</a> Front Physiol. 13, 937899(2022).</li>
<li>Anakor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+vesicles+secreted+by+als+patient+myotubes+is+specific+to+exosome-like+and+not+larger+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of vesicles secreted by als patient myotubes is specific to exosome-like and not larger subtypes.</a> Cells. 11 (5), 845(2022).</li>
<li>Mendhe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+extracellular+vesicles+from+adipose-derived+stem+cells+increase+muscle+reperfusion+but+degrade+muscle+structural+proteins+in+a+mouse+model+of+hindlimb+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lyophilized extracellular vesicles from adipose-derived stem cells increase muscle reperfusion but degrade muscle structural proteins in a mouse model of hindlimb ischemia-reperfusion injury.</a> Cells. 12 (4), 557(2023).</li>
<li>Madison, R. D., Robinson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-derived+extracellular+vesicles+influence+motor+neuron+regeneration+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Muscle-derived extracellular vesicles influence motor neuron regeneration accuracy.</a> Neuroscience. 419, 46-59 (2019).</li>
<li>Hanson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-mediated+promotion+of+myogenic+differentiation+is+dependent+on+dose%2C+collection+medium%2C+and+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">EV-mediated promotion of myogenic differentiation is dependent on dose, collection medium, and isolation method.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 33, 511-528 (2023).</li>
<li>Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., De Morrée, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+quiescent+stem+cell+populations+from+individual+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles.</a> J Vis Exp. 190, e64557(2022).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28misev2018%29%3A+A+position+statement+of+the+international+society+for+extracellular+vesicles+and+update+of+the+misev2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28misev2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+proteomics+argues+against+a+general+role+for+CD9%2C+CD81+or+CD63+in+the+sorting+of+proteins+into+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).</li>
<li>Baietti, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-syntenin-Alix+regulates+the+biogenesis+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Syndecan-syntenin-Alix regulates the biogenesis of exosomes.</a> Nat Cell Biol. 14 (7), 677-685 (2012).</li>
<li>Shanely, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+biopsy+procedures+using+the+modified+bergstr%C3%B6m+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified bergström technique.</a> J Vis Exp. (91), e51812(2014).</li>
<li>Mousavi, K., Miranda, W., Parry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+factors+enhance+the+survival+of+muscle+fibers+in+edl%2C+but+not+sol%2C+after+neonatal+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic factors enhance the survival of muscle fibers in edl, but not sol, after neonatal nerve injury.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 283 (3), C950-C959 (2002).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Ishii, K., Suzuki, N., Mabuchi, Y., Sekiya, I., Akazawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+advantage+of+recombinant+collagenase+for+isolation+of+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Technical advantage of recombinant collagenase for isolation of muscle stem cells.</a> Regen Ther. 7, 1-7 (2017).</li>
<li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> J Vis Exp. (86), e50846(2014).</li>
<li>Mozzetta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of muscle stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1480, 311-322 (2016).</li>
<li>Clemens, Z., Wang, K., Ambrosio, F., Barchowsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+disrupts+extracellular+vesicle-mediated+signaling+in+regenerating+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Arsenic disrupts extracellular vesicle-mediated signaling in regenerating myofibers.</a> Toxicol Sci. 195 (2), 231-245 (2023).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle-derived+extracellular+vesicles+transport+glycolytic+enzymes+to+mediate+muscle-to-bone+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle-derived extracellular vesicles transport glycolytic enzymes to mediate muscle-to-bone crosstalk.</a> Cell Metab. 35 (11), 2028-2043.e7 (2023).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół rozpoczyna się od wypreparowania grup mięśni kończyn tylnych od myszy lub pozyskania pośmiertnej ludzkiej tkanki mięśniowej w oparciu o dostępne protokoły16. Następujące procedury izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych (SkM-EVs) obejmują trzy podstawowe sekcje: łagodne trawienie enzymatyczne tkanki w celu uwolnienia śródmiąższowych SkM-EV, filtracja i wirowanie z niską prędkością oraz ultrawirowanie. Na koniec stosuje się różne techniki profilowania izolowanych SkM-...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to nano-size, związane z błoną cząsteczki uwalniane przez komórki do środowiska zewnątrzkomórkowego. Te EV przenoszą kwasy nukleinowe, białka i lipidy, aby modulować wiele szlaków sygnałowych po wychwycie przez komórki biorcy. W szczególności EV wyizolowane z mięśni szkieletowych (SkM-EVs) są zaangażowane w degenerację, regenerację i wzrost mięśni poprzez transfer miogennych regulatorowych mikroRNA lub czynników transkrypcyjnych1,2,3,4. Ponieważ nasza wiedza na temat subpopulacji i cech SkM-EV wciąż ewoluuje, pęcherzyki te są obiecujące jako biomarkery dla wczesnej diagnostyki5,6 oraz jako cele terapeutyczne w zaburzeniach nerwowo-mięśniowych. Ta rozwijająca się dziedzina oferuje ekscytujące możliwości zarówno w zakresie badań patologicznych, jak i zastosowań klinicznych.
Obecne badania nad SkM-EVs koncentrują się głównie na tych uzyskanych z supernatantów do hodowli komórkowych po hodowli ex vivo2,7,8, co budzi obawy dotyczące wierności docelowych linii komórkowych po kolejnych przejściach i podatności cech EV na zmiany w sztucznych środowiskach. Podkreśla to potrzebę izolowania SkM-EV bezpośrednio z tkanek mięśniowych, aby uniknąć wpływów hodowli ex vivo i lepiej odtworzyć warunki in vivo. Chociaż opracowano kilka podejść do izolowania EV z tkanek mięśniowych9,10, badania nadal różnią się znacznie pod względem szczegółów protokołu, co wpływa na spójność i porównywalność. Pilnie potrzebny jest ustandaryzowany protokół izolacji i charakterystyki SkM-EV, aby zapewnić wiarygodność we wszystkich powiązanych badaniach.
Biorąc pod uwagę fizjologiczne cechy mięśni szkieletowych, opracowaliśmy protokół izolacji i oczyszczania SkM-EVs z próbek mięśni szkieletowych gryzoni za pomocą mechanicznego oddzielania, dysocjacji enzymatycznej, filtracji i ultrawirowania różnicowego. Dzięki kompleksowej analizie przy użyciu cytometrii nanoprzepływowej, testu BCA i testu Western blot stwierdziliśmy, że protokół ten konsekwentnie daje SkM-EV o wysokiej czystości i ilości w ograniczonym czasie. Może być stosowany do próbek mięśni szkieletowych w różnych stanach, w tym w ostrych i przewlekłych urazach mięśni. Ponadto, przy odpowiednich dostosowaniach, metoda ta może być dostosowana do tkanek mięśniowych pacjentów lub innych modeli zwierzęcych. Standaryzacja procesu izolacji SkM-EV jest niezbędna do zapewnienia spójnej jakości SkM-EV, ułatwienia porównań cech pojazdów elektrycznych – takich jak wydajność, rozmiar, skład ładunku i funkcja – oraz zwiększenia ich potencjalnych zastosowań jako biomarkerów diagnostycznych, a także zwiększenia naszej wiedzy na temat ich roli w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 0,6 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka 1,5 ml (C)&nbsp;</td><td>Probówki do mikrowirówek Eppendorf</td><td>5720411009</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3448</td><td>Przezroczysta, wyskalowana, niesterylna</td></tr><tr><td>strzykawka BD 5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>14-827-52&nbsp;</td><td>Końcówka Luer-Lok</td></tr><tr><td>Szkiełka do liczenia komórek, dwukomorowe do licznika komórek</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>22620667</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór czyszczący</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza II</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x) Płyn (-wapń,-magnez)</td><td>Cytiva</td><td>SH30378.02</td><td>Końcowe użyte rozcieńczenie to 1x</td></tr><tr><td>DPBS/Zmodyfikowane (1x)</td><td>Cytiva</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td></td></tr><tr><td>E-POD Pure Zdalny dozownik wody</td><td>Millipore Sigma ZRXSP0D01</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FA-45-30-11 Wirnik mikrowirówki</td><td>Eppendorf</td><td>05-401-503</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>NanoAnalyzer</td><td>przepływu NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heratherm OGS60 Piekarnik z protokołem ogólnym</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51028112</td><td>Konwekcja grawitacyjna, 2,3 stopy sześciennej 120 V</td></tr><tr><td>Sonda MemGlow-488</td><td>Cytoszkielet Inc.</td><td>MG01-02</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Millipak Special</td><td>Millipore Millipore Sigma</td><td>TANKMPK02</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta do penicyliny-streptomycyny</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta do Pipet-Lite LTS L-200XLS+</td><td>Pipeta</td> do <td>17014391</td><td></td>Rainin</tr> do pipety do pipet <tr><td>LTS L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet ER LTS 1000&micro; L F 768G/8</td><td>Rainin</td><td>30808038</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet ER LTS 20&micro; L F 960G/10</td><td>Rainin</td><td>30807966</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet ER LTS 200&micro; L F 960G/10</td><td>Rainin</td><td>30807967</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki do kontroli jakości</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S110-AT Rotor o stałym kącie</td><td>nachylenia ThermoFisher Scientific</td><td>45539</td><td>1,10,000 obr./min</td></tr><tr><td>Koraliki S16 exo 65-155nm</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>SPI, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall mX 150+ Mikroultrawirówka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50135641</td><td></td></tr><tr><td>TC 20 Automatyczny licznik komórek</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Pęseta Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SPI, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe VWR 15 ml</td><td>Avantor</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Puradisc 13 Filtry</td><td>Cytiva</td><td>6782-1304</td><td>0,45 &mikro; m wielkość porów</td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6J typu dzikiego</td> Jackson <td>Laboratory</td><td>stock #000664</td><td></td></tr></tbody></table>

enzymatyczna izolacja śródmiąższowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych

Enzymatic Isolation of Skeletal Muscle Interstitial Extracellular Vesicles

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to dwuwarstwowe nanocząsteczki lipidowe uwalniane przez komórki do transportu bioaktywnych ładunków, takich jak białka, RNA i DNA, do komunikacji międzykomórkowej. Badanie przesłuchów między komórkami w homeostazie i chorobach mięśni za pośrednictwem EV ma znaczący potencjał w pogłębieniu naszej wiedzy na temat rozwoju, regeneracji i atrofii mięśni. Jednak obecne protokoły izolacji EV pochodzących z mięśni szkieletowych (SkM-EVs) stoją przed wyzwaniami w osiągnięciu wysokiej czystości i wydajności, głównie ze względu na trudności w uwalnianiu EV z tkanek mięśniowych bez naruszania błon komórkowych. W artykule przedstawiono skuteczny protokół izolacji SkM-EV, obejmujący mechaniczne odłączanie, dysocjację enzymatyczną, filtrację i ultrawirowanie. Kroki te są zoptymalizowane w celu zwiększenia uwalniania EV z tkanek mięśniowych, dając SkM-EV o wysokiej czystości. Następnie przeprowadza się cytometrię nanoprzepływową, test BCA i test Western blot w celu scharakteryzowania ilości i jakości wyizolowanych SkM-EV. Protokół ten daje nadzieję na stworzenie niezawodnej platformy do uzyskiwania EV pochodzących z tkanek w celu przyspieszenia badań podstawowych, diagnostyki chorób i dostarczania leków.

Zgodnie z tym protokołem pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z mięśni szkieletowych (SkM-EVs) zostały pomyślnie wyekstrahowane z różnych grup mięśniowych, w tym z mięśnia piszczelowego przedniego (TA), długiego prostownika palców (EDL), płaszczkowatego (SOL), brzuchatego (GAS) oraz czworogłowego (QUA) u myszy typu dzikiego. Następnie przeprowadzono charakterystykę tych SkM-EVs za pomocą nano-cytometrii przepływowej, co pozwoliło wyjaśnić ich odrębne cechy, zestawione w Tabeli 1. Co istotne, z zaledwie 1 g tkank...

Ten protokół ma na celu izolację i oczyszczenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych (SkM-EVs) z tkanek mięśni gryzoni poprzez mechaniczne oderwanie, dysocjację enzymatyczną, filtrację i ultrawirowanie różnicowe. Świadczy o spójności i niezawodności. Wyizolowane SkM-EV dostarczają informacji na temat homeostazy i chorób mięśni, z potencjalnymi zastosowaniami jako biomarkery diagnostyczne lub nośniki terapeutyczne.

Enzymatyczna izolacja śródmiąższowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych

Extracellular vesicles (EVs) are lipid bilayer-enclosed nanoparticles released by cells to transport bioactive cargo, such as proteins, RNAs, and DNAs, ...

Protokół ten ma na celu wyizolowanie i oczyszczenie śródmiąższowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych w tkankach mięśniowych gryzoni. Ten pęcherzyk zewnątrzkomórkowy dostarczy bezcennych informacji na temat mechanizmu choroby stanu mięśni u człowieka, z potencjalnym zastosowaniem jako biomarkery diagnostyczne i nośniki terapeutyczne. Ten ustandaryzowany protokół umożliwi analizę i porównanie cech EV pochodzących z mięśni szkieletu w różnych próbkach mięśni, w tym wydajności, wielkości, składu ładunku i funkcji.Wyniki te pogłębią naszą wiedzę na temat ich roli w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych, a także ułatwią zastosowanie tych EV jako biomarkerów diagnostycznych. Nasze laboratorium skupi się na niezawodnej produkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych śródmiąższowych mięśni szkieletowych o wysokiej czystości i wysokiej wydajności w sposób wydajny i efektywny czasowo. Naszym celem jest zbadanie ich patologicznej roli i potencjału terapeutycznego, szczególnie w kontekście zaburzeń nerwowo-mięśniowych.Na początek zabezpiecz uśpioną nogę myszy na sterylnej płytce z przednią stroną nogi skierowaną do góry. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj małe nacięcie o długości pięciu milimetrów w skórze po bocznej stronie kostki myszy. Włóż jedno ostrze nożyczek do nacięcia, umieszczając je pod skórą, ale nad tkanką mięśniową.Następnie przetnij skórę w górę w kierunku kolana, aby przedłużyć nacięcie. Użyj szorstko zakończonej pęsety, aby chwycić skórę wzdłuż nacięcia i pociągnij ją do tyłu, aby poszerzyć otwór, aż mięsień stanie się widoczny. Teraz zlokalizuj mięsień piszczelowy przedni lub TA, biegnący od kolana do kostki, wzdłuż bocznej strony kości piszczelowej.Użyj zaostrzonej pęsety, aby chwycić i ostrożnie oderwać tkankę łączną pokrywającą mięsień TA. W pobliżu kostki zidentyfikuj ścięgno TA połączone z mięśniem TA i mniejsze ścięgno EDL, znajdujące się obok ścięgna TA po stronie bocznej. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć oba ścięgna.Użyj szorstko zakończonej pęsety, aby chwycić oba ścięgna. Za pomocą kolejnej pary pęset ostrożnie oddziel ścięgna, izolując TA od EDL. Następnie unieś mięsień TA za świeżo zerwane ścięgno za pomocą szorstko zakończonej pęsety.Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć ścięgno TA w pobliżu kolana, usuwając mięsień. Teraz zwolnij nogę i odwróć mysz tak, aby tylna strona nogi była skierowana do góry. Gdy część skóry została już usunięta, użyj nożyczek do preparowania, aby przeciąć pozostałą skórę w pobliżu kostki.Chwyć przeciętą skórę szorstko zakończonym pęsetą i oderwij ją w górę w kierunku tylnej części kolana, odsłaniając mięsień brzuchaty łydki. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć ścięgno brzuchatego łydki w pobliżu kostki. Chwyć ścięgno brzuchatego łydki szorstko zakończonym pęsetą i unieś je do góry, aby odsłonić spód mięśnia brzuchatego łydki.Następnie zlokalizuj mniejsze ścięgno płaszczkowate poniżej mięśnia brzuchatego łydki, blisko kolana, gdzie mięsień brzuchaty łydki jest nadal połączony. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć ścięgno płaszczkowate, umożliwiając skurczenie mięśnia płaszczkowatego w górę. Chwyć zerwane ścięgno płaszczkowate ostro zakończonym pęsetą i delikatnie podnieś, aby odłączyć mięsień płaszczkowaty od spodu mięśnia brzuchatego łydki.Użyj nożyczek preparacyjnych, aby odciąć koniec mięśnia płaszczkowatego, gdzie przyczepia się do odciętego końca mięśnia brzuchatego łydki, całkowicie oddzielając dwa mięśnie. Za pomocą nożyczek preparacyjnych odetnij koniec mięśnia brzuchatego łydki w pobliżu kolana i umieść go w PBS na lodzie. Po usunięciu czterech mięśni poniżej kolana odwróć mysz tak, aby przednia strona była skierowana do góry.Ustaw nogę myszy pod kątem 90 stopni, aby zmusić mięsień czworogłowy uda do zgięcia. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć ścięgno najbliżej kolana. Następnie, aby oddzielić mięsień czworogłowy uda od kości udowej, przeciąć między mięśniem a kością, aż przyczepione pozostanie tylko ścięgno proksymalne.Przeciąć ścięgno bliższe za pomocą nożyczek preparacyjnych i usunąć mięsień czworogłowy. Przepłucz wszystkie usunięte mięśnie kilka razy PBS, aby usunąć zanieczyszczenia, takie jak sierść i krew. Delikatnie osusz mięśnie za pomocą ręczników papierowych.Zacznij od delikatnego usunięcia ścięgien z próbki mięśniowej za pomocą pęsety z ostrym końcem, pęsety do drzazg, skalpela lub nożyczek. Następnie za pomocą nożyczek lub skalpela przetnij mięsień wzdłuż włókien mięśniowych od jednego ścięgna do drugiego, na kawałki o grubości jednego milimetra. Aby przygotować bufor enzymów trawiennych, wymieszaj dwa miligramy kolagenazy, dwa enzymy na mililitr DMEM z 1% roztworem streptomycyny penicyliny.Po wymieszaniu przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 mikrometra. Podziel tkankę mięśniową na porcje, z których każda zawiera 20 miligramów mięśni. Dodać jeden mililitr przygotowanego buforu do każdej podwielokrotności w celu dysocjacji enzymatycznej i inkubacji.Przygotuj i oznacz nowe 1,5-mililitrowe probówki do mikrowirówek. Ustaw filtr 0,45 mikrometra, wyjmując tłok z pięciomililitrowej strzykawki. Wkręć piastę strzykawki w górny koniec filtra 0,45 mikrometra i umieść dolny koniec filtra w oznaczonej probówce do mikrowirówki.Następnie odwiruj mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 1000 G i czterech stopniach Celsjusza, aby rozdrobnić resztki. Za pomocą mikropipety P-200 przenieść supernatant do strzykawki. Po ponownym włożeniu tłoka do strzykawki, powoli przepchnąć supernatant przez filtr, pozwalając mu zebrać się w oznakowanej 1,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki.Ponownie wyjąć tłok strzykawki. Za pomocą mikropipety P-200 dodać do strzykawki około 200 mikrolitrów PBS. Ponownie włóż tłok i powoli przepchnij 200 mikrolitrów PBS przez filtr, aby wypłukać pozostały supernatant do oznakowanej probówki do mikrowirówki.Przefiltrowany roztwór przenieść do nowych 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek, odpowiednich do prędkości do 200 000 G. Po zamknięciu probówek umieść je w wirniku mikrowirówki, aby upewnić się, że są zrównoważone. Włącz mikrowirówkę i ustaw ją tak, aby pracowała przez godzinę w temperaturze 100 000 G i czterech stopniach Celsjusza. Umieść załadowany wirnik wraz z probówkami wewnątrz mikrowirówki.Zamknij pokrywę i włącz odkurzacz, aby rozpocząć proces. Gdy próżnia osiągnie drugi poziom, naciśnij przycisk start i poczekaj na zakończenie procesu wirowania. Po zakończeniu cyklu wirowania kliknij przycisk próżni, aby zwiększyć ciśnienie w komorze przed wyjęciem wirnika i rurek.Ostrożnie usunąć supernatant z każdej probówki za pomocą mikropipety P-200. Następnie użyj tej samej mikropipety P-200, aby dodać 50 mikrolitrów PBS do każdej probówki.

enzymatic-isolation-skeletal-muscle-interstitial-extracellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Naczynia krwionośne w ludzkich mięśniach szkieletowych zawierają kilka wieloliniowych populacji prekursorów, które są idealne do zastosowań regeneracyjnych. Ta metoda izolacji pozwala na jednoczesne oczyszczanie trzech multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych odpowiednio z trzech warstw strukturalnych naczyń krwionośnych: miogennych komórek śródbłonka z błony wewnętrznej, perycytów z pożywki i komórek przybyszowych z przydanki.

Izolacja multipotencjalnych prekursorów pochodzących z naczyń krwionośnych z ludzkich mięśni szkieletowych

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Mikronaczyniowe komórki śródbłonka mięśni szkieletowych (MMEC) kształtują wewnętrzną ścianę naczyń włosowatych mięśni i regulują zarówno wymianę płynów/molekuł, jak i migrację komórek (immunologicznych) między tkanką mięśniową a krwią. Opisana tutaj izolacja pierwotnego mysiego MMEC umożliwia kompleksowe badania in vitro "jednostki mięśniowo-naczyniowej".

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z całych tkanek, w tym próbek mózgu i nowotworów. Metoda ta oferuje powtarzalną technikę ekstrakcji EV z tkanki stałej w celu dalszych analiz.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całej tkanki

Ten protokół ilustruje 1) izolację i hodowlę pierwotnych fibroblastów z mięśnia brzuchatego łydki dorosłej myszy, a także 2) oczyszczanie i charakterystykę egzosomów za pomocą różnicowej metody ultrawirowania w połączeniu z gradientami gęstości sacharozy, a następnie analizami western blot.

Izolacja i charakterystyka egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych

Tutaj opisujemy wzbogacanie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby za pomocą zoptymalizowanej metody różnicowego ultrawirowania.

Metoda wzbogacania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki raka wątroby

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych mięśni i fibro-adipogennych komórek progenitorowych z indywidualnych mięśni szkieletowych u myszy. Protokół obejmuje rozwarstwienie pojedynczego mięśnia, izolację komórek macierzystych przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją, ocenę czystości za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego oraz ilościowy pomiar wejścia w fazę S za pomocą testu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny.

Izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Ten protokół opisuje izolację nienaruszonych pojedynczych włókien mięśniowych z utlenianego mięśnia podkolanowego oraz ustanowienie wysoce czystych kultur mioblastów pochodzących z tych włókien. Zoptymalizowana procedura niezawodnie przynosi około 300–500 nienaruszonych miofibryli na jednego mysza, umożliwiając dalszą molekularną i komórkową analizę.

Test izolacji pojedynczych włókien do oceny utleniania zachowania miofibrili

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Naucz się izolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z mięśni szkieletowych gryzoni metodą enzymatyczną. Protokół obejmuje rozdział mechaniczny, filtrację i różnicową ultrawirówkę, zapewniając wysoką czystość i wydajność izolacji.

Enzymatyczna izolacja śródmiąższowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów