Enzymatyczna izolacja śródmiąższowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych

Protokół ten ma na celu wyizolowanie i oczyszczenie śródmiąższowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mięśni szkieletowych w tkankach mięśniowych gryzoni. Ten pęcherzyk zewnątrzkomórkowy dostarczy bezcennych informacji na temat mechanizmu choroby stanu mięśni u człowieka, z potencjalnym zastosowaniem jako biomarkery diagnostyczne i nośniki terapeutyczne. Ten ustandaryzowany protokół umożliwi analizę i porównanie cech EV pochodzących z mięśni szkieletu w różnych próbkach mięśni, w tym wydajności, wielkości, składu ładunku i funkcji.

Wyniki te pogłębią naszą wiedzę na temat ich roli w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych, a także ułatwią zastosowanie tych EV jako biomarkerów diagnostycznych. Nasze laboratorium skupi się na niezawodnej produkcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych śródmiąższowych mięśni szkieletowych o wysokiej czystości i wysokiej wydajności w sposób wydajny i efektywny czasowo. Naszym celem jest zbadanie ich patologicznej roli i potencjału terapeutycznego, szczególnie w kontekście zaburzeń nerwowo-mięśniowych.

Na początek zabezpiecz uśpioną nogę myszy na sterylnej płytce z przednią stroną nogi skierowaną do góry. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj małe nacięcie o długości pięciu milimetrów w skórze po bocznej stronie kostki myszy. Włóż jedno ostrze nożyczek do nacięcia, umieszczając je pod skórą, ale nad tkanką mięśniową.

Następnie przetnij skórę w górę w kierunku kolana, aby przedłużyć nacięcie. Użyj szorstko zakończonej pęsety, aby chwycić skórę wzdłuż nacięcia i pociągnij ją do tyłu, aby poszerzyć otwór, aż mięsień stanie się widoczny. Teraz zlokalizuj mięsień piszczelowy przedni lub TA, biegnący od kolana do kostki, wzdłuż bocznej strony kości piszczelowej.

Użyj zaostrzonej pęsety, aby chwycić i ostrożnie oderwać tkankę łączną pokrywającą mięsień TA. W pobliżu kostki zidentyfikuj ścięgno TA połączone z mięśniem TA i mniejsze ścięgno EDL, znajdujące się obok ścięgna TA po stronie bocznej. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć oba ścięgna.

Użyj szorstko zakończonej pęsety, aby chwycić oba ścięgna. Za pomocą kolejnej pary pęset ostrożnie oddziel ścięgna, izolując TA od EDL. Następnie unieś mięsień TA za świeżo zerwane ścięgno za pomocą szorstko zakończonej pęsety.

Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć ścięgno TA w pobliżu kolana, usuwając mięsień. Teraz zwolnij nogę i odwróć mysz tak, aby tylna strona nogi była skierowana do góry. Gdy część skóry została już usunięta, użyj nożyczek do preparowania, aby przeciąć pozostałą skórę w pobliżu kostki.

Chwyć przeciętą skórę szorstko zakończonym pęsetą i oderwij ją w górę w kierunku tylnej części kolana, odsłaniając mięsień brzuchaty łydki. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć ścięgno brzuchatego łydki w pobliżu kostki. Chwyć ścięgno brzuchatego łydki szorstko zakończonym pęsetą i unieś je do góry, aby odsłonić spód mięśnia brzuchatego łydki.

Następnie zlokalizuj mniejsze ścięgno płaszczkowate poniżej mięśnia brzuchatego łydki, blisko kolana, gdzie mięsień brzuchaty łydki jest nadal połączony. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć ścięgno płaszczkowate, umożliwiając skurczenie mięśnia płaszczkowatego w górę. Chwyć zerwane ścięgno płaszczkowate ostro zakończonym pęsetą i delikatnie podnieś, aby odłączyć mięsień płaszczkowaty od spodu mięśnia brzuchatego łydki.

Użyj nożyczek preparacyjnych, aby odciąć koniec mięśnia płaszczkowatego, gdzie przyczepia się do odciętego końca mięśnia brzuchatego łydki, całkowicie oddzielając dwa mięśnie. Za pomocą nożyczek preparacyjnych odetnij koniec mięśnia brzuchatego łydki w pobliżu kolana i umieść go w PBS na lodzie. Po usunięciu czterech mięśni poniżej kolana odwróć mysz tak, aby przednia strona była skierowana do góry.

Ustaw nogę myszy pod kątem 90 stopni, aby zmusić mięsień czworogłowy uda do zgięcia. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć ścięgno najbliżej kolana. Następnie, aby oddzielić mięsień czworogłowy uda od kości udowej, przeciąć między mięśniem a kością, aż przyczepione pozostanie tylko ścięgno proksymalne.

Przeciąć ścięgno bliższe za pomocą nożyczek preparacyjnych i usunąć mięsień czworogłowy. Przepłucz wszystkie usunięte mięśnie kilka razy PBS, aby usunąć zanieczyszczenia, takie jak sierść i krew. Delikatnie osusz mięśnie za pomocą ręczników papierowych.

Zacznij od delikatnego usunięcia ścięgien z próbki mięśniowej za pomocą pęsety z ostrym końcem, pęsety do drzazg, skalpela lub nożyczek. Następnie za pomocą nożyczek lub skalpela przetnij mięsień wzdłuż włókien mięśniowych od jednego ścięgna do drugiego, na kawałki o grubości jednego milimetra. Aby przygotować bufor enzymów trawiennych, wymieszaj dwa miligramy kolagenazy, dwa enzymy na mililitr DMEM z 1% roztworem streptomycyny penicyliny.

Po wymieszaniu przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 mikrometra. Podziel tkankę mięśniową na porcje, z których każda zawiera 20 miligramów mięśni. Dodać jeden mililitr przygotowanego buforu do każdej podwielokrotności w celu dysocjacji enzymatycznej i inkubacji.

Przygotuj i oznacz nowe 1,5-mililitrowe probówki do mikrowirówek. Ustaw filtr 0,45 mikrometra, wyjmując tłok z pięciomililitrowej strzykawki. Wkręć piastę strzykawki w górny koniec filtra 0,45 mikrometra i umieść dolny koniec filtra w oznaczonej probówce do mikrowirówki.

Następnie odwiruj mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 1000 G i czterech stopniach Celsjusza, aby rozdrobnić resztki. Za pomocą mikropipety P-200 przenieść supernatant do strzykawki. Po ponownym włożeniu tłoka do strzykawki, powoli przepchnąć supernatant przez filtr, pozwalając mu zebrać się w oznakowanej 1,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki.

Ponownie wyjąć tłok strzykawki. Za pomocą mikropipety P-200 dodać do strzykawki około 200 mikrolitrów PBS. Ponownie włóż tłok i powoli przepchnij 200 mikrolitrów PBS przez filtr, aby wypłukać pozostały supernatant do oznakowanej probówki do mikrowirówki.

Przefiltrowany roztwór przenieść do nowych 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek, odpowiednich do prędkości do 200 000 G. Po zamknięciu probówek umieść je w wirniku mikrowirówki, aby upewnić się, że są zrównoważone. Włącz mikrowirówkę i ustaw ją tak, aby pracowała przez godzinę w temperaturze 100 000 G i czterech stopniach Celsjusza. Umieść załadowany wirnik wraz z probówkami wewnątrz mikrowirówki.

Zamknij pokrywę i włącz odkurzacz, aby rozpocząć proces. Gdy próżnia osiągnie drugi poziom, naciśnij przycisk start i poczekaj na zakończenie procesu wirowania. Po zakończeniu cyklu wirowania kliknij przycisk próżni, aby zwiększyć ciśnienie w komorze przed wyjęciem wirnika i rurek.

Ostrożnie usunąć supernatant z każdej probówki za pomocą mikropipety P-200. Następnie użyj tej samej mikropipety P-200, aby dodać 50 mikrolitrów PBS do każdej probówki.