Opracowanie systemu protoplastu kapusty do badania tolerancji niedotlenienia u kapustnych

Badamy, jak kapusta reaguje na niski poziom tlenu na poziomie molekularnym. Ponieważ kapusta jest trudna do zdobycia, opracowujemy system wykorzystujący izolowane komórki kapusty. Wystawiając te zapasowe komórki, znane również jako protoplasty, na warunki o niskiej zawartości tlenu, możemy łatwo zbadać ich reakcję na stres.

Praca z protoplastem, który jest zawieszony w roztworze w celu zbadania reakcji o niskiej zawartości tlenu, jest trudna. Dużym wyzwaniem jest utrzymanie wystarczającej ilości tlenu dla naszych próbek kontrolnych. Wymyśliliśmy sposób na wypompowanie tlenu z cieczy.

Zwalidowaliśmy metodę za pomocą testów reporterowych markerów niedotlenienia. Sprawdziliśmy różne metody radzenia sobie z niskim poziomem tlenu i stwierdziliśmy, że pakiet pochłaniacza tlenu działa najlepiej. Jest łatwy w użyciu i skuteczny, dzięki czemu doskonale nadaje się do badania, jak protoplasty zachowują się w warunkach niskiego poziomu tlenu.

Badanie mechanizmu molekularnego w uprawach liściastych w warunkach niedotlenienia było wyzwaniem ze względu na ograniczenie dostępnych narzędzi, ale dzięki niedawnym postępom poczyniliśmy ogromne postępy, stosując system protoplastów kapusty do leczenia hipoksji. Ta nowa metoda pomaga nam zrozumieć, w jaki sposób niski poziom tlenu wpływa na te rośliny na poziomie molekularnym. W przyszłości planujemy połączyć system protoplastów z testami immunoprecypitacyjnymi i reporterowymi, aby zilustrować molekularny szlak regulacyjny zaangażowany w kapustę podczas stresu powodziowego.

Naszym celem jest zidentyfikowanie kluczowych regulatorów tolerancji na zalanie, które, mamy nadzieję, pomogą w wyhodowaniu nowej odmiany kapusty o zwiększonej tolerancji na zalanie. Na początek wypełnij okrągłe kwadratowe otwory w 48-dołkowej tacce z korkami komercyjnym podłożem roślinnym i zasiej Fuyudori i 228 nasion kapusty na głębokość około jednego centymetra w podłożu uprawowym. Aby przygotować 12,5 mililitra roztworu enzymatycznego, podgrzej roztwór zawierający 10 milimolowy MES i 0,6 molowego mannitolu w temperaturze 55 stopni Celsjusza.

Następnie dodać 1,5% celulazy R-10 i 0,75% macerozymu R-10. Wymieszaj roztwór i kontynuuj podgrzewanie w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 10 minut. Poczekaj, aż roztwór enzymu ostygnie do temperatury pokojowej.

Następnie dodaj 10 milimolowy chlorek wapnia i 0,1% albuminę surowicy bydlęcej. Używając filtra strzykawkowego o średnicy 0,22 mikrometra, wysterylizuj roztwór enzymu na dziewięciocentymetrowej szalce Petriego. Po dwóch do trzech tygodniach wzrostu zbierz sadzonki kapusty w drugiej fazie liścia w celu izolacji protoplastów mezofilu.

Zbierz drugie nowo rozwinięte prawdziwe liście z pięciu do ośmiu sadzonek kapusty. Za pomocą ostrej żyletki pokrój liście w paski o grubości od 0,5 do 1,0 milimetra. Natychmiast przenieś paski liści do świeżo przygotowanego roztworu enzymu.

Poddaj paski liści kapusty infiltracji próżniowej w ciemności przez 30 minut. Po infiltracji próżniowej paski liści należy zanurzyć w roztworze enzymu w ciemności przez cztery do 16 godzin. Następnego dnia rozcieńczyć roztwór zawierający protoplasty równą objętością roztworu W5, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne.

Aby uwolnić zawiesinę protoplastów, delikatnie zamieszaj mieszaninę na wytrząsarce orbitalnej. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Odwirować roztwór protoplastu o stężeniu 150 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Dodaj 10 mililitrów roztworu W5 wzdłuż ścianki probówki przy natężeniu przepływu około jednego mililitra na sekundę, aby przemyć granulowane protoplasty. Po ostatnim odwirowaniu ponownie zawiesić protoplasty w roztworze W5 i umieścić probówkę na lodzie na 30 minut. Następnie usuwaj po jednym mililitrze supernatantu, aż cały supernatant zostanie usunięty.

Ponownie zawiesić protoplasty w lodowatym, wstępnie schłodzonym roztworze MMG. Zmierz stężenie protoplastów za pomocą hemocytometru. Dostosuj końcowe stężenie do 4 razy 10 do mocy 5 protoplastów na mililitr za pomocą roztworu MMG.

Po izolacji i nocnym trawieniu wydajność protoplastów wynosiła 1,04 razy 10 do potęgi 7 dla Fuyudori i 4,00 razy 10 do potęgi 6 protoplastów na gram świeżej masy dla 228. Skuteczność transfekcji protoplastów wynosiła ponad 40% zarówno w odmianach Fuyudori, jak i 228, co wykazano za pomocą genu reporterowego GFP. Po wyizolowaniu protoplastu kapusty wymieszaj 100 mikrolitrów 4 razy 10 do potęgi 4 protoplastów z 10 mikrolitrami plazmidu i umieść mieszaninę na lodzie na 10 minut.

Dodać równą objętość świeżo przygotowanego roztworu PEG do roztworu protoplastu i delikatnie wymieszać. Mieszaninę protoplastów inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut. Następnie dodaj 440 mikrolitrów roztworu W5, aby zakończyć reakcję.

Odwirować transfekowane protoplasty w stężeniu 150 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zawiesić osad w 750 mikrolitrach wzbogaconego tlenem roztworu W5. Przenieś zawieszone protoplasty na sześciodołkową płytkę do hodowli tkankowej wstępnie zakodowaną 1% albuminą surowicy bydlęcej.

W przypadku niedotlenienia wywołanego workiem zużywającym tlen umieść płytkę zawierającą roztwór protoplastu W5 w 3,5-litrowym słoiku beztlenowym. Następnie dodaj dwa pakiety pochłaniaczy tlenu do słoika, aby stworzyć środowisko hipoksyjne. Po poddaniu działaniu substancji odwirować protoplasty w temperaturze 150 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odrzuć supernatant i zamroź zebrane protoplasty w ciekłym azocie przed przystąpieniem do testu podwójnej lucyferazy. Pakiet absorbera tlenu wywołał 7,0-krotny wzrost aktywności promotora BoADH1 w porównaniu z kontrolą, wykazując najwyższą odpowiedź hipoksyjną. Aktywność promotora BoSUS1L wzrosła ponad 5,6-krotnie, przy czym leczenie pakietem absorbera tlenu wykazało największą indukcję wśród terapii.