Name: Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj metodę CRISPR-Cas9 opartą na elektroporacji do modyfikacji genetycznej komórek THP-1, modelu ludzkich makrofagów. Protokół umożliwia izolację klonów pojedynczych komórek do badań odporności na HIV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni JP Concordet (MNHN, U1154/UMR7196, Paryż), G. Bossisowi (IGMM, Montpellier) i D. Schlüterowi (Hannover Medical School, Niemcy) za udostępnienie protokołów i dyskusję. Projekt ten otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 (umowa o grant nr 101017572 dla AZ) oraz ANRS (grant ECTZ162721 dla AZ). Infrastruktura badawcza Modelu Chorób Zakaźnych i Terapii Innowacyjnych (IDMIT) jest wspierana przez "programme investissement d'avenir (PIA)" pod numerem ANR_11_INSB_0008.

<ol><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Danis, V. A., Millington, M., Hyland, V. J., Grennan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+production+by+normal+human+monocytes%3A+inter-subject+variation+and+relationship+to+an+IL-1+receptor+antagonist+%28IL-lRa%29+gene+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokine production by normal human monocytes: inter-subject variation and relationship to an IL-1 receptor antagonist (IL-lRa) gene polymorphism.</a> Clin Exp Immunol. 99, https://academic.oup.com/cei/article/99/2/303/6484286 (1995).</li>
<li>Bol, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+variation+in+in+vitro+HIV-1+susceptibility+of+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Donor variation in in vitro HIV-1 susceptibility of monocyte-derived macrophages.</a> Virology. 390 (2), 205-211 (2009).</li>
<li>Appleby, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+heterogeneity+in+human+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Sources of heterogeneity in human monocyte subsets.</a> Immunol Lett. 152 (1), 32-41 (2013).</li>
<li>O'Neill, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+bulk+RNA-sequencing+reveal+differences+in+monocyte+susceptibility+to+Influenza+A+virus+infection+between+Africans+and+Europeans%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell and bulk RNA-sequencing reveal differences in monocyte susceptibility to Influenza A virus infection between Africans and Europeans.</a> Front Immunol. 12, 768189(2021).</li>
<li>Wen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparability+study+of+monocyte-derived+dendritic+cells%2C+primary+monocytes%2C+and+THP1+cells+for+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparability study of monocyte-derived dendritic cells, primary monocytes, and THP1 cells for innate immune responses.</a> J Immunol Methods. 498, 113147(2021).</li>
<li>Inagaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-g-induced+apoptosis+and+activation+of+THP-1+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Interferon-g-induced apoptosis and activation of THP-1 macrophages.</a> Life Sci. 71 (21), 2499-2508 (2002).</li>
<li>Boonkaewwan, C., Toskulkao, C., Vongsakul, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+immunomodulatory+activities+of+stevioside+and+its+metabolite+steviol+on+THP-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and immunomodulatory activities of stevioside and its metabolite steviol on THP-1 cells.</a> J Agric Food Chem. 54 (3), 785-789 (2006).</li>
<li>Chanput, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Glucans+are+involved+in+immune-modulation+of+THP-1+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">β-Glucans are involved in immune-modulation of THP-1 macrophages.</a> Mol Nutr Food Res. 56 (5), 822-833 (2012).</li>
<li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP3+inhibits+type+I+interferon+signaling+by+deubiquitinating+RIG-I-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">USP3 inhibits type I interferon signaling by deubiquitinating RIG-I-like receptors.</a> Cell Res. 24 (4), 400-416 (2014).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+suppresses+innate+immune+responses+to+viral+infections+and+inflammatory+stimuli+by+inhibiting+the+NF-%CE%BAB+and+interferon+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 suppresses innate immune responses to viral infections and inflammatory stimuli by inhibiting the NF-κB and interferon pathways.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (16), E3798-E3807 (2018).</li>
<li>Pradhananga, S., Spalinskas, R., Poujade, F. A., Eriksson, P., Sahlén, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+anchored+interaction+landscape+of+THP-1+macrophages+captures+early+immune+response+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promoter anchored interaction landscape of THP-1 macrophages captures early immune response processes.</a> Cell Immunol. 355, 104148(2020).</li>
<li>Mezzasoma, L., Talesa, V. N., Romani, R., Bellezza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anp+and+BNP+exert+anti-inflammatory+action+via+npr-1%2Fcgmp+axis+by+interfering+with+canonical%2C+non-canonical%2C+and+alternative+routes+of+inflammasome+activation+in+human+THP1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Anp and BNP exert anti-inflammatory action via npr-1/cgmp axis by interfering with canonical, non-canonical, and alternative routes of inflammasome activation in human THP1 cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (1), 1-17 (2021).</li>
<li>Martinat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+of+SAMHD1+at+Lysine+595+is+required+for+HIV-1+restriction+in+non-cycling+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SUMOylation of SAMHD1 at Lysine 595 is required for HIV-1 restriction in non-cycling cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 4582(2021).</li>
<li>Rensen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+and+reverse+transcription+of+HIV-1+genomes+in+nuclear+niches+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Clustering and reverse transcription of HIV-1 genomes in nuclear niches of macrophages.</a> EMBO J. 40 (1), e105247(2021).</li>
<li>Ikeda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APOBEC3+degradation+is+the+primary+function+of+HIV-1+Vif+determining+virion+infectivity+in+the+myeloid+cell+line+THP-1%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">APOBEC3 degradation is the primary function of HIV-1 Vif determining virion infectivity in the myeloid cell line THP-1.</a> mBio. 14 (4), e0078223(2023).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual+RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li>
<li>Kurosaki, T., Maquat, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense-mediated+mRNA+decay+in+humans+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Nonsense-mediated mRNA decay in humans at a glance.</a> J Cell Sci. 129 (3), 461-467 (2016).</li>
<li>Tuladhar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-based+mutagenesis+frequently+provokes+on-target+mRNA+misregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-based mutagenesis frequently provokes on-target mRNA misregulation.</a> Nat Commun. 10 (1), 4056(2019).</li>
<li>Embree, C. M., Abu-Alhasan, R., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+factors+that+dictate+if+terminating+ribosomes+cause+or+counteract+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Features and factors that dictate if terminating ribosomes cause or counteract nonsense-mediated mRNA decay.</a> J Biol Chem. 298 (11), 102592(2022).</li>
<li>Xue, C., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+pathway+choices+in+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing.</a> Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).</li>
<li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high+transfection+efficiency+in+THP-1+suspension+cells+without+PMA+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A method for high transfection efficiency in THP-1 suspension cells without PMA treatment.</a> Anal Biochem. 544, 93-97 (2018).</li>
<li>Ji, W., Zhang, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+using+lentivirus+to+establish+THP-1+suspension+cell+lines+for+immunostaining+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol using lentivirus to establish THP-1 suspension cell lines for immunostaining and confocal microscopy.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102032(2023).</li>
<li>Guo, C., Ma, X., Gao, F., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, (2023).</li>
<li>Synthego Performance Analysis, ICE Analysis. 3.0, Synthego. 
 <a target="_blank" href="https://www.synthego.com/help/citing-ice">https://www.synthego.com/help/citing-ice</a> (2019).</li>
<li>Salamov, A. A., Nishikawa, T., Swindells, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+protein+coding+region+integrity+in+cDNA+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Assessing protein coding region integrity in cDNA sequencing projects.</a> Bioinformatics. 14, 384-390 (1998).</li>
<li>Pedersen, A. G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+network+prediction+of+translation+initiation+sites+in+eukaryotes%3A+Perspectives+for+EST+and+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Int+Conf+Intell+Syst+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural network prediction of translation initiation sites in eukaryotes: Perspectives for EST and genome analysis.</a> Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol. 5, 226-233 (1997).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Res. 46 (W1), W242-W245 (2018).</li>
<li>Laguette, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+is+the+dendritic-+and+myeloid-cell-specific+HIV-1+restriction+factor+counteracted+by+Vpx%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 is the dendritic- and myeloid-cell-specific HIV-1 restriction factor counteracted by Vpx.</a> Nature. 474 (7353), 654-657 (2011).</li>
<li>Hrecka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vpx+relieves+inhibition+of+HIV-1+infection+of+macrophages+mediated+by+the+SAMHD1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vpx relieves inhibition of HIV-1 infection of macrophages mediated by the SAMHD1 protein.</a> Nature. 474 (7353), 658-661 (2011).</li>
<li>Seki, A., Rutz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+RNP+transfection+for+highly+efficient+CRI+SPR%2FCas9-mediated+gene+knockout+in+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Optimized RNP transfection for highly efficient CRI SPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells.</a> J Exp Med. 215 (3), 985-997 (2018).</li>
<li>Batista Napotnik, T., Polajžer, T., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+due+to+electroporation+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell death due to electroporation - A review.</a> Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).</li>
<li>Perretta-Tejedor, N., Freke, G., Seda, M., Long, D. A., Jenkins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+mutant+renal+cell+lines+using+CRISPR+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generating mutant renal cell lines using CRISPR technologies.</a> Methods Mol Biol. 2067, 323-340 (2020).</li>
<li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+validation+strategies+for+CRISPR-Cas9+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing.</a> Sci Rep. 8 (1), 888(2018).</li>
<li>Makino, S., Fukumura, R., Gondo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illegitimate+translation+causes+unexpected+gene+expression+from+on-target+out-of-frame+alleles+created+by+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Illegitimate translation causes unexpected gene expression from on-target out-of-frame alleles created by CRISPR-Cas9.</a> Sci Rep. 6, 39608(2016).</li>
<li>Bowling, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+alternate+start+site+allows+N-terminal+nonsense+variants+to+escape+NMD+and+results+in+functional+recovery+by+readthrough+and+modulator+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">Downstream alternate start site allows N-terminal nonsense variants to escape NMD and results in functional recovery by readthrough and modulator combination.</a> J Pers Med. 12 (9), 1448(2022).</li>
<li>Inácios, Â, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+mutations+in+close+proximity+to+the+initiation+codon+fail+to+trigger+full+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense mutations in close proximity to the initiation codon fail to trigger full nonsense-mediated mRNA decay.</a> J Biol Chem. 279 (31), 32170-32180 (2004).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+inversions+and+duplications+of+mammalian+regulatory+DNA+elements+and+gene+clusters+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient inversions and duplications of mammalian regulatory DNA elements and gene clusters by CRISPR/Cas9.</a> J Mol Cell Biol. 7 (4), 284-298 (2015).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+inversion+of+CTCF+sites+alters+genome+topology+and+enhancer%2Fpromoter+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function.</a> Cell. 162 (4), 900-910 (2015).</li>
</ol>

Wszystkich autorów nie ma konfliktu interesów.

W tym miejscu opisano protokół mający na celu uzyskanie udanej edycji linii komórkowej THP-1 za pośrednictwem CRISPR. Podejście to opiera się na przenoszeniu wstępnie zmontowanych RNP sgRNA/Cas9 za pomocą elektroporacji/nukleofekcji. Strategia ta została wybrana w celu ograniczenia efektów off-target, które potencjalnie powstają po integracji kasety sgRNA/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa, co prowadzi do trwałej ekspresji nukleazy. Wybrano wiele sgRNA ukierunkowanych na gen będący przedmiotem zainteresowania, aby osiągną...

THP-1 to ludzka linia komórkowa pochodząca z monocytów wyizolowana od pacjenta cierpiącego na ostrą białaczkę (AML), która wykazuje cechy fenotypowe bardzo podobne do cech pierwotnych monocytów1. W porównaniu z pierwotnymi makrofagami pochodzącymi z monocytów, które nie dzielą się i wykazują zarówno ograniczoną długość życia, jak i zmienność między / wewnątrz dawcy w fenotypie, komórki THP-1 mogą być hodowane praktycznie w nieskończoność i mają bardziej jednorodne zachowanie, które sprzyja odtwarzalności wyników2,3,4,5,6. Warto zauważyć, że komórki THP-1 mogą być różnicowane w kierunku fenotypu podobnego do makrofagów z 13-octanem forbolu-12-mirystynianu (PMA), co czyni je szeroko stosowanym modelem in vitro do badania odpowiedzi monocytów/makrofagów na sygnały zapalne7,8,9,10,11,12,13 lub zakażenie klinicznie istotnymi ludzkimi patogenami, w tym HIV14,15,16. Możliwość inżynierii genetycznej komórek THP-1 jest przedmiotem zainteresowania w wielu obszarach badań związanych z biologią.
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9 (CRISPR-Cas9) to prokariotyczny adaptacyjny układ odpornościowy wykorzystujący nukleazę sterowaną przez RNA w celu degradacji atakujących genomów wirusowych, który został przeprogramowany jako narzędzie inżynierii genetycznej17. Proces edycji genomu przebiega w trzech etapach: rozpoznanie, rozszczepienie i naprawa. RNA z pojedynczym przewodnikiem (sgRNA) rekrutuje nukleazę Cas9 do określonego locus genomowego poprzez parowanie zasad z sekwencją prowadzącą 20 pz. Obecność sekwencji Protospacer Adjacent Motif (PAM) bezpośrednio 3' genomowej sekwencji docelowej 20-bp wyzwala rozwijanie i rozszczepianie za pośrednictwem Cas9 na obu niciach DNA między pozycjami 17 i 18 (3-bp 5' PAM). Powstałe w ten sposób pęknięcie dwuniciowe (DSB) jest przetwarzane przez dwie główne ścieżki naprawy. W przypadku braku matrycy naprawczej posiadającej homologię z uszkodzonym locus, podatny na błędy szlak niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) wprowadzi losowe inserpcje nukleotydów i / lub delecje (indele), potencjalnie prowadząc do mutacji przesunięcia ramki i / lub wprowadzenia kodonów przedwczesnej terminacji (PTC). Z kolei mRNA zawierające PTC są ukierunkowane na degradację przez nonsensowny szlak rozpadu mRNA (NMD), ostatecznie zakłócając ekspresję/funkcję białka18,19,20. Alternatywnie, zależna od szablonu ścieżka naprawy kierowanej homologią (HDR) może działać i wiernie naprawiać DSB. Mechanizm ten został wykorzystany do osiągnięcia precyzyjnej edycji genów, w tym knock-inów i podstawień zasad. Warto zauważyć, że stan cyklu komórkowego jest ważnym czynnikiem wpływającym na wybór ścieżki naprawy DSB. Rzeczywiście, NHEJ jest aktywny na wszystkich etapach cyklu komórkowego, podczas gdy HDR jest głównie ograniczony do faz S/G221.
Komórki THP-1 rosną w zawiesinie i są niezwykle trudne do transfekcji plazmidowym DNA, co prawdopodobnie również zmienia ich żywotność i/lub zdolność różnicowania22,23. Transdukcja za pomocą wektorów lentiwirusowych opartych na HIV-1, kodujących zarówno Cas9, jak i sgRNA, jest często stosowana do nokautowania (KO) genu będącego przedmiotem zainteresowania24. Integracja kasety Cas9/sgRNA z genomem komórkowym zapewnia przedłużoną ekspresję i wydajny KO, ale jest również stałym źródłem efektów off-target25. Alternatywnie, wstępnie zmontowane rybonukleoproteiny Cas9:sgRNA (RNP) są dostarczane przez elektroporację, metodę polegającą na tymczasowym tworzeniu porów zarówno w plazmie, jak i błonach jądrowych po zastosowaniu impulsów elektrycznych. Zachowanie żywotności komórek jest ważnym wyzwaniem przy wdrażaniu tego podejścia.
Tutaj stworzono linię komórkową THP-1 stabilnie wyrażającą GFP (THP-1_GFP), która służy jako narzędzie do ustanowienia protokołu umożliwiającego efektywną edycję opartą na CRISPR-Cas9. Po zaprojektowaniu strategii inaktywacji genu EGFP przy użyciu trzech sgRNA jednocześnie (podejście wielokierunkowe), określono wydajność KO w kilku warunkach elektroporacji przy użyciu ekspresji GFP jako odczytu. Równolegle monitorowano proliferację komórek. Edycja genów została potwierdzona zarówno testem endonukleazy T7 I (T7EI), jak i sekwencjonowaniem Sangera, a następnie analizą za pomocą algorytmu wnioskowania o edycjach CRISPR (ICE)26. Parametry, które spowodowały zmniejszenie ekspresji GFP nawet o 95%, przy czym komórki THP-1 odzyskuwały normalne tempo wzrostu po elektroporacji, zostały z powodzeniem wykorzystane do inaktywacji endogennego genu (SAMHD1) i wytworzenia jednokomórkowych klonów THP-1.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mikro; m filtr strzykawkowy</td><td>ClearLine</td><td>146560</td><td>_</td></tr><tr><td>0,4 % trypan niebieski</td><td>Beckman Coulter</td><td>383200</td><td>_</td></tr><tr><td>1,5 mL probówka</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td>_</td></tr><tr><td>24-dołkowa</td><td>Corning</td><td>353047</td><td>_</td></tr><tr><td>6x TriTrack DNA Loading Dye</td><td>Thermo scientific</td><td>R1161</td><td>_</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; Kolba hodowlana z wentylowaną nasadką</td><td>Corning</td><td>353136</td><td>_</td></tr><tr><td>8-paskowe probówki do PCR z nakrętkami</td><td>Technologie życia</td><td>AM12230</td><td>_</td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe Płytki płaskie Corning</td><td></td><td>353072</td><td>_</td></tr><tr><td>96-dołkowe Okrągłe dno</td><td>Corning</td><td>353077</td><td>_</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Euromedex</td><td>D5</td><td>_</td></tr><tr><td>ATGpr</td><td>_</td><td>_</td><td>https://atgpr.dbcls.jp/</td></tr> <tr><td>ChemiDoc System obrazowania</td><td>BIO-RAD</td><td>12003153</td><td>_</td></tr><tr><td>Szkiełko zliczające</td><td>NanoEntek</td><td>DHC-N04</td><td>_</td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>_</td><td>_http://crispor.gi.ucsc.edu/</td><td></td></tr> <tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>_</td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>EMBL-EBI</td><td>_</td><td>https://www.ensembl.org/index.html</td></tr><tr><td>Bydło płodowe Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>_</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Life Sciences</td><td>v10.10</td><td>_</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td><td>Thermo scientific</td><td>SM0323</td><td>_</td></tr><tr><td>Przeglądarka danych genomu</td><td>NCBI_</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/</td></tr> <tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td>_</td><td>Version 9.3.1</td></tr><tr><td>Polimerazy DNA z fuzji Herculase II</td><td>Agilent</td><td>600679</td><td>_</td></tr><tr><td>ICE Narzędzie do analizy CRISPR</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis</td></tr><tr><td>Image Lab Touch</td><td>BIO-RAD_</td><td></td><td>Wersja 2.4.0.03</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>W zestawie z zestawem T7EI M0302S</td></tr><tr><td>Neon, 10 i mikro; L</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025K</td><td>Zestaw do elektroporacji zawierający końcówki, probówki, bufor R i E</td></tr><tr><td>System transfekcji neonowej</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>_</td></tr><tr><td>NetStart 1.0</td><td>_</td><td>_</td><td>https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Starter do PCR bez nukleaz (</td><td></td></tr><tr><td>EGFP)</td><td>Eurofins</td><td>_</td><td>Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT</td></tr><tr><td>Starter PCR (SAMHD1)</td><td>Eurofins</td><td>_</td><td>Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Wersja : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (10 000 U / mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>_</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15714</td><td>_</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>_</td></tr><tr><td>PrimerQuest</td><td>IDT</td><td>_</td><td>https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>_</td></tr><tr><td>Rozwiązanie do ekstrakcji DNA QuickExtract</td><td>Biosearch Technologies</td><td>QE09050</td><td>_</td></tr><tr><td>RPMI 1640, GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870010</td><td>_</td></tr><tr><td>SnapGene Viewer</td><td>Dotmatics</td><td>_</td><td>Version 7</td></tr><tr><td>SpCas9 2NLS Nukleaza</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>_</td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNA</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>_</td></tr><tr><td>Syntetyczne sgRNA (EGFP)</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG</td></tr><tr><td>Syntetyczne sgRNA (SAMHD1)</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU</td></tr><tr><td>Strzykawka Plastipak Luer Lock</td><td>BD</td><td>301229</td><td></td></tr><tr><td>_T100 Termocykler</td><td>BIO-RAD</td><td>1861096</td><td>_</td></tr><tr><td>T7 endonukleaza I</td><td>Nowość Anglia Biolabs</td><td>M0302S</td><td>_</td></tr><tr><td>TAE bufor UltraPure, 10x</td><td>Invitrogen</td><td>15558026</td><td>400 mM Tris-Acetate, 10 mM EDTA</td></tr><tr><td>Komórki THP-1</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td>_</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05 %)</td><td>Gibco</td><td></td> <td>25300054</td></tr><tr><td>_ZE5 Analizator komórek</td><td>BIO-RAD</td><td>12014135</td><td>_</td></tr></tbody></table>

nokaut genów za pośrednictwem crispr-cas9 oparty na elektroporacji w komórkach thp-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Electroporation-Based CRISPR-Cas9-Mediated Gene Knockout in THP-1 Cells and Single-Cell Clone Isolation

Ludzka linia komórkowa THP-1 ludzkiej ostrej białaczki monocytowej (AML) jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów, w tym ich interakcji z istotnymi ludzkimi patogenami, takimi jak ludzki wirus niedoboru odporności (HIV). W porównaniu z innymi unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi pochodzenia szpikowego, komórki THP-1 zachowują wiele nienaruszonych szlaków sygnalizacji zapalnej i wykazują cechy fenotypowe, które bardziej przypominają cechy pierwotnych monocytów, w tym zdolność do różnicowania się w makrofagi po potraktowaniu octanem forbolu-12-mirystynianu 13 (PMA). Zastosowanie technologii CRISPR-Cas9 do inżynierii komórek THP-1 poprzez celowany nokaut genów (KO) zapewnia potężne podejście do lepszego scharakteryzowania mechanizmów związanych z odpornością, w tym interakcji wirus-gospodarz. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 wykorzystującej elektroporację do dostarczania wstępnie zmontowanych rybonukleoprotein Cas9:sgRNA do jądra komórkowego. Użycie wielu sgRNA celujących w ten sam locus w nieco różnych pozycjach powoduje delecję dużych fragmentów DNA, zwiększając w ten sposób wydajność edycji, jak oceniono za pomocą testu endonukleazy T7 I. Edycja za pośrednictwem CRISPR-Cas9 na poziomie genetycznym została zwalidowana przez sekwencjonowanie Sangera, a następnie analizę wnioskowania o edycjach CRISPR (ICE). Niedobór białka potwierdzono za pomocą immunoblottingu połączonego z testem czynnościowym. Korzystając z tego protokołu, osiągnięto do 100% indeli w docelowym locus i spadek ekspresji białka o ponad 95%. Wysoka wydajność edycji sprawia, że izolowanie klonów jednokomórkowych jest wygodne poprzez ograniczenie rozcieńczenia.

Wytworzono linię komórkową THP-1 stabilnie eksponującą białko reporterowe GFP (THP-1_GFP) (Rysunek 2A), która posłużyła jako narzędzie do opracowania protokołu wydajnej edycji genów za pomocą systemu CRISPR-Cas9. W tym celu, przy użyciu narzędzia internetowego CRISPOR29&#160;(Rysunek 2B), zaprojektowano 3 sgRNA nakierowane na gen EGFP, które następnie kompleksowano jednocześnie z Cas9 w stosunku molowym 9:1 w celu utworzenia RNP ...

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including ...

Moja działalność badawcza skupia się na zrozumieniu mechanizmów, które czynią makrofagi odpornymi na zakażenie wirusem HIV, odpowiedzialnym za pandemię AIDS. W szczególności skupiamy się na aktywności enzymu zwanego HT-1, który degraduje NTP, elementy budulcowe genomów wirusa. Ale enzym ten ma też inne działania, które staramy się wyjaśnić.Opracowaliśmy protokół inżynierii genetycznej komórek THP1. Komórki te są dobrze ugruntowanym substytutem dla ludzkich makrofagów do badania. Na przykład replikacja wirusa HIV-1.Komórki te są trudne do transfekcji w celu manipulowania zawartością białka. Dlatego opracowujemy metody manipulowania ich genomem za pomocą technologii CRISPR-Cas9. Od projektowania RNA SG po walidację populacji poliklonalnych i monoklonalnych.Nasz protokół ma na celu osiągnięcie wysokiej wydajności edycji genu będącego przedmiotem zainteresowania w komórkach THP1, które zostaną elektroporowane wstępnie złożonymi kompleksami rybonukleoproteinowymi wytworzonymi przez RNA energii nukleazy Cas9. W tym podejściu aktywność Cas9 jest ograniczona w czasie. Zmniejsza to możliwość generowania docelowych efektów, które często pojawiają się w przypadku stosowania wektorów lenti.I w tym przypadku rzeczywiście ekspresja Cas9 wydłuża czas i dlatego może być szkodliwa dla komórki. Na początek napełnij każdą studzienkę 24-dołkowej płytki hodowlanej 500 mikrolitrami pożywki RPMI 1640 bez antybiotyku i uzupełnionej 20% inaktywowanym i przefiltrowanym FBS. Umieść płytkę na noc w wilgotnym inkubatorze.Aby ponownie nawodnić suchy pojedynczy przewodnik lub sgRNA do końcowego stężenia 100 mikromolów, dodaj 10 mikrolitrów buforu TE na jeden nanomol sgRNA. Wiruj roztwór przez 30 sekund i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby zapewnić całkowite nawodnienie. Następnego dnia, aby przygotować 30-mikromolowy roboczy roztwór sgRNA, najpierw krótko homogenizuj 100-mikromolowy podstawowy roztwór sgRNA za pomocą pipety, a następnie rozcieńcz łodygę w wodzie wolnej od nukleaz.Wiruj roztwór przez 30 sekund i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Rozcieńczyć jeden mikrolitr każdego z trzech, 30 mikromolowych roztworów roboczych sgRNA i 0,5 mikrolitra 20 mikromolowego roztworu Cas9 w 3,5 mikrolitra buforu do respensji R, aby złożyć rybonukleoproteiny Cas9 sgRNA, dodać stosunek jeden do dziewięciu molowych. Krótko wirować i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Aby przygotować nieedytowaną kontrolę, dodać 0,5 mikrolitra 20 mikromolowego roztworu Cas9 do 6,5 mikrolitra buforu do respensji R.Vortex krótko i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, dodać pięć mikrolitrów buforu do respensji R do próbek, aby uzyskać końcową objętość 12 mikrolitrów na warunki elektroporacji. Aby przygotować komórki THP-1 po zliczeniu komórek, należy zebrać objętość odpowiadającą 0,2 razy 10 do mocy sześciu komórek THP-1 i odwirować je w temperaturze 336G przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza, odessać supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach PBS. Ponownie odwirować i ponownie zawiesić osad komórkowy w 12 mikrolitrach roztworu rybonukleoproteiny.Aby skonfigurować system elektroporacji, umieść stację pipetową pod szafką bezpieczeństwa biologicznego i umieść rurkę do elektroporacji wewnątrz szafki, dodaj trzy mililitry buforu E z zestawu do elektroporacji do rurki do elektroporacji. Włącz urządzenie do elektroporacji i za pomocą ekranu dotykowego ustaw parametry elektroporacji, napięcie na 1 500 woltów. Czas trwania do 10 milisekund.I numer do trzech. Wyposażyć pipetę do elektroporacji w końcówkę i odessać 10 mikrolitrów roztworu rybonukleoproteiny THP-1. Włóż pipetę do rurki do elektroporacji i naciśnij start na ekranie urządzenia do elektroporacji.Poczekaj, aż pojawi się komunikat zakończony i wyjmij pipetę z probówki. Przenieść komórki THP-1 do dołka podgrzanej 24-dołkowej płytki hodowlanej i delikatnie homogenizować próbkę. Umieścić płytkę z powrotem w nawilżonym inkubatorze i pozostawić komórki do spokojnego odpoczynku przez 72 godziny.Po elektroporacji i zliczeniu ogniw należy pobrać objętość odpowiadającą 0,1 razy 10 do mocy sześciu ogniw THP-1 do rurki o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować komórki w temperaturze 336G przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza i odessać supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 500 mikrolitrach PBS. Ponownie odwiruj komórki, odessaj jak najwięcej supernatantu bez naruszania osadu i zatrzaśnij, zamroź osad.W celu ekstrakcji genomowego DNA należy ponownie zawiesić osad z 50 mikrolitrami roztworu do ekstrakcji DNA. Homogenizuj go i przenieś całą objętość do 0,2 mililitrowej probówki do PCR. Zmieszaj probówkę i odwiruj ją krótko przez impuls trwający trzy sekundy.Umieść rurkę w termocyklerze i podgrzewaj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie rozcieńczyć wyekstrahowane DNA 90 mikrolitrami ultraczystej wody, wirować i krótko wirować w temperaturze 5000G przez trzy sekundy. Rozcieńczyć starter PCR w ultraczystej wodzie do końcowego stężenia 10 mikromoli.Przygotuj mieszankę PCR w 0,2 mililitrowej probówce do PCR. Umieść probówki PCR w termocyklerze i uruchom program z określonymi ustawieniami. Dla edytowanych populacji poliklonalnych w nowej probówce o pojemności 0,2 mililitra.Wymieszaj 17,5 mikrolitra amplikonu PCR z dwoma mikrolitrami buforu E dwa, aby uzyskać końcową objętość 19,5 mikrolitrów. Wirować roztwór i krótko odwirować, alternatywnie, w celu przesiewania klonów pojedynczych komórek, wymieszać produkty PCR z edytowanych i nieedytowanych komórek kontrolnych w stosunku jeden do jednego. W celu tworzenia hetero duplex umieść lampy w termocyklerze i uruchom podany program.Po utworzeniu heterodupleksu dodać 0,5 mikrolitra endonukleazy T siedem jeden roztwór do probówki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby przygotować próbki do elektroforezy żelowej, wymieszaj pięć mikrolitrów endonukleazy T7 jeden produkt trawienia lub niestrawiony produkt PCR z pięcioma mikrolitrami wody i dwoma mikrolitrami sześciu barwników ładujących xDNA, załaduj próbki i drabinkę do rozmiaru do żelu i uruchom żel pod napięciem 80 woltów przez 45 minut. Edycja genów locus EGFP za pośrednictwem CRISPR Cas9 spowodowała gwałtowny spadek liczby komórek GFP, osiągając ponad 90% redukcję do siódmego dnia po elektroporacji.Trzeciego dnia po elektroporacji liczba komórek zmniejszyła się o połowę z powodu stresu wywołanego elektroporacją, ale w pełni wróciła do normy w siódmym dniu w pełnym pożywce RPMI. Endonukleaza T7 i elektroforeza żelowa agarozy wykazały utratę około 75 fragmentów par zasad w edytowanych komórkach, potwierdzając edycję CRISPR miejsca docelowego EGFP.

electroporation-based-crispr-cas9-mediated-gene-knockout-thp-1-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie demonstrujemy edycję genomu opartą na CRISPR-Cas9 w hodowanych komórkach, gdzie Cas9 i sgRNA są dostarczane jako pojedynczy konstrukt plazmidowy do komórek. System CRISPR-Cas9 i pożądany gen, który ma zostać wstawiony, został wprowadzony do komórek za pomocą techniki elektroporacji, aby ułatwić pomyślną edycję genów.

Kompleksowa edycja genomu CRISPR: metoda homologii sterowanej naprawą genów w hodowanych komórkach przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Ten film demonstruje test do edycji genów w ludzkich limfocytach T przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Mieszanina pierwotnych limfocytów T CD4 + i CD8 + jest połączona z kompleksem rybonukleoproteinowym CRISPR-Cas9, ukierunkowanym na określone geny w celu nokautu. Po elektroporacji sgRNA kieruje Cas9 do docelowej sekwencji DNA, tworząc precyzyjne cięcia. Cięcia te są następnie naprawiane przez niehomologiczny mechanizm łączenia końców komórki, co prowadzi do nokautu genu.

Technika CRISPR-Cas9 do edycji genów w limfocytach T

Opisana tutaj technika genotypowania, która łączy reakcję łańcuchową fluorescencyjnej polimerazy (PCR) z elektroforezą żelu kapilarnego, pozwala na wysokoprzepustowe genotypowanie klonów nokautujących za pośrednictwem nukleazy. Omija ograniczenia, z jakimi borykają się inne techniki genotypowania, i jest bardziej opłacalna niż metody sekwencjonowania.

Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Ten protokół szczegółowo opisuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) bez śladu z ludzkich komórek trzustki w warunkach wolnych od karmienia, a następnie edycję za pomocą rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i charakterystykę zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek.

Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Tutaj prezentujemy protokół genetycznej modyfikacji pierwotnych lub rozszerzonych komórek NK (ang. human natural killer) za pomocą rybonukleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy ludzkie komórki NK z niedoborem receptora 2 czynnika wzrostu b (TGFBR2) i fosforybozylotransferazy hipoksantynowej 1 (HPRT1).

Generowanie nokautujących pierwotnych i ekspandowanych ludzkich komórek NK przy użyciu rybonukleoprotein Cas9

Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Tutaj przedstawiamy kompleksowy protokół generowania i wykorzystywania laboratoryjnie zaprojektowanych organoidów glejaka (LEGO) do badania zależności genotyp-fenotyp i badania potencjalnych leków do leczenia glejaka.

Laboratoryjnie zmodyfikowana hodowla organoidów glejaka wielopostaciowego i badania przesiewowe leków

Szczegółowy protokół jest dostępny dla użycia technologii CRISPR/Cas9 w celu osiągnięcia wysoce efektywnego docelowego wkręcania dużych, multicistronicznych konstruktów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pośrednictwem homologii (HMEJ) szlaku naprawy DNA. Limfocyty T zmodyfikowane za pomocą tego protokołu adaptowalnego do cGMP utrzymują doskonałą ekspansję komórek, cytotoksyczność i produkcję cytokin.

Inżynieria niewirusowa pierwotnych ludzkich limfocytów T poprzez ukierunkowaną integrację dużych matryc DNA za pośrednictwem homologii

Poznaj metodę CRISPR-Cas9 opartą na elektroporacji do modyfikacji genetycznej komórek THP-1, modelu ludzkich makrofagów. Protokół umożliwia izolację klonów pojedynczych komórek do badań odporności na HIV.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów