Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Moja działalność badawcza skupia się na zrozumieniu mechanizmów, które czynią makrofagi odpornymi na zakażenie wirusem HIV, odpowiedzialnym za pandemię AIDS. W szczególności skupiamy się na aktywności enzymu zwanego HT-1, który degraduje NTP, elementy budulcowe genomów wirusa. Ale enzym ten ma też inne działania, które staramy się wyjaśnić.

Opracowaliśmy protokół inżynierii genetycznej komórek THP1. Komórki te są dobrze ugruntowanym substytutem dla ludzkich makrofagów do badania. Na przykład replikacja wirusa HIV-1.

Komórki te są trudne do transfekcji w celu manipulowania zawartością białka. Dlatego opracowujemy metody manipulowania ich genomem za pomocą technologii CRISPR-Cas9. Od projektowania RNA SG po walidację populacji poliklonalnych i monoklonalnych

Nasz protokół ma na celu osiągnięcie wysokiej wydajności edycji genu będącego przedmiotem zainteresowania w komórkach THP1, które zostaną elektroporowane wstępnie złożonymi kompleksami rybonukleoproteinowymi wytworzonymi przez RNA energii nukleazy Cas9. W tym podejściu aktywność Cas9 jest ograniczona w czasie. Zmniejsza to możliwość generowania docelowych efektów, które często pojawiają się w przypadku stosowania wektorów lenti.

I w tym przypadku rzeczywiście ekspresja Cas9 wydłuża czas i dlatego może być szkodliwa dla komórki. Na początek napełnij każdą studzienkę 24-dołkowej płytki hodowlanej 500 mikrolitrami pożywki RPMI 1640 bez antybiotyku i uzupełnionej 20% inaktywowanym i przefiltrowanym FBS. Umieść płytkę na noc w wilgotnym inkubatorze.

Aby ponownie nawodnić suchy pojedynczy przewodnik lub sgRNA do końcowego stężenia 100 mikromolów, dodaj 10 mikrolitrów buforu TE na jeden nanomol sgRNA. Wiruj roztwór przez 30 sekund i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby zapewnić całkowite nawodnienie. Następnego dnia, aby przygotować 30-mikromolowy roboczy roztwór sgRNA, najpierw krótko homogenizuj 100-mikromolowy podstawowy roztwór sgRNA za pomocą pipety, a następnie rozcieńcz łodygę w wodzie wolnej od nukleaz.

Wiruj roztwór przez 30 sekund i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Rozcieńczyć jeden mikrolitr każdego z trzech, 30 mikromolowych roztworów roboczych sgRNA i 0,5 mikrolitra 20 mikromolowego roztworu Cas9 w 3,5 mikrolitra buforu do respensji R, aby złożyć rybonukleoproteiny Cas9 sgRNA, dodać stosunek jeden do dziewięciu molowych. Krótko wirować i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Aby przygotować nieedytowaną kontrolę, dodać 0,5 mikrolitra 20 mikromolowego roztworu Cas9 do 6,5 mikrolitra buforu do respensji R.Vortex krótko i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, dodać pięć mikrolitrów buforu do respensji R do próbek, aby uzyskać końcową objętość 12 mikrolitrów na warunki elektroporacji. Aby przygotować komórki THP-1 po zliczeniu komórek, należy zebrać objętość odpowiadającą 0,2 razy 10 do mocy sześciu komórek THP-1 i odwirować je w temperaturze 336G przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza, odessać supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach PBS. Ponownie odwirować i ponownie zawiesić osad komórkowy w 12 mikrolitrach roztworu rybonukleoproteiny.

Aby skonfigurować system elektroporacji, umieść stację pipetową pod szafką bezpieczeństwa biologicznego i umieść rurkę do elektroporacji wewnątrz szafki, dodaj trzy mililitry buforu E z zestawu do elektroporacji do rurki do elektroporacji. Włącz urządzenie do elektroporacji i za pomocą ekranu dotykowego ustaw parametry elektroporacji, napięcie na 1 500 woltów. Czas trwania do 10 milisekund.

I numer do trzech. Wyposażyć pipetę do elektroporacji w końcówkę i odessać 10 mikrolitrów roztworu rybonukleoproteiny THP-1. Włóż pipetę do rurki do elektroporacji i naciśnij start na ekranie urządzenia do elektroporacji.

Poczekaj, aż pojawi się komunikat zakończony i wyjmij pipetę z probówki. Przenieść komórki THP-1 do dołka podgrzanej 24-dołkowej płytki hodowlanej i delikatnie homogenizować próbkę. Umieścić płytkę z powrotem w nawilżonym inkubatorze i pozostawić komórki do spokojnego odpoczynku przez 72 godziny.

Po elektroporacji i zliczeniu ogniw należy pobrać objętość odpowiadającą 0,1 razy 10 do mocy sześciu ogniw THP-1 do rurki o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować komórki w temperaturze 336G przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza i odessać supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 500 mikrolitrach PBS. Ponownie odwiruj komórki, odessaj jak najwięcej supernatantu bez naruszania osadu i zatrzaśnij, zamroź osad.

W celu ekstrakcji genomowego DNA należy ponownie zawiesić osad z 50 mikrolitrami roztworu do ekstrakcji DNA. Homogenizuj go i przenieś całą objętość do 0,2 mililitrowej probówki do PCR. Zmieszaj probówkę i odwiruj ją krótko przez impuls trwający trzy sekundy.

Umieść rurkę w termocyklerze i podgrzewaj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie rozcieńczyć wyekstrahowane DNA 90 mikrolitrami ultraczystej wody, wirować i krótko wirować w temperaturze 5000G przez trzy sekundy. Rozcieńczyć starter PCR w ultraczystej wodzie do końcowego stężenia 10 mikromoli.

Przygotuj mieszankę PCR w 0,2 mililitrowej probówce do PCR. Umieść probówki PCR w termocyklerze i uruchom program z określonymi ustawieniami. Dla edytowanych populacji poliklonalnych w nowej probówce o pojemności 0,2 mililitra.

Wymieszaj 17,5 mikrolitra amplikonu PCR z dwoma mikrolitrami buforu E dwa, aby uzyskać końcową objętość 19,5 mikrolitrów. Wirować roztwór i krótko odwirować, alternatywnie, w celu przesiewania klonów pojedynczych komórek, wymieszać produkty PCR z edytowanych i nieedytowanych komórek kontrolnych w stosunku jeden do jednego. W celu tworzenia hetero duplex umieść lampy w termocyklerze i uruchom podany program.

Po utworzeniu heterodupleksu dodać 0,5 mikrolitra endonukleazy T siedem jeden roztwór do probówki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby przygotować próbki do elektroforezy żelowej, wymieszaj pięć mikrolitrów endonukleazy T7 jeden produkt trawienia lub niestrawiony produkt PCR z pięcioma mikrolitrami wody i dwoma mikrolitrami sześciu barwników ładujących xDNA, załaduj próbki i drabinkę do rozmiaru do żelu i uruchom żel pod napięciem 80 woltów przez 45 minut. Edycja genów locus EGFP za pośrednictwem CRISPR Cas9 spowodowała gwałtowny spadek liczby komórek GFP, osiągając ponad 90% redukcję do siódmego dnia po elektroporacji.

Trzeciego dnia po elektroporacji liczba komórek zmniejszyła się o połowę z powodu stresu wywołanego elektroporacją, ale w pełni wróciła do normy w siódmym dniu w pełnym pożywce RPMI. Endonukleaza T7 i elektroforeza żelowa agarozy wykazały utratę około 75 fragmentów par zasad w edytowanych komórkach, potwierdzając edycję CRISPR miejsca docelowego EGFP.