Model zagregowanego biofilmu mukowiscydozy do badania ekspresji genów istotnych dla infekcji

W ramach naszych badań opracowano zagregowany model biofilmu w sztucznej plwocinie w celu odtworzenia infekcji płuc u pacjentów z mukowiscydozą. Model ten pozwala nam analizować zmiany ekspresji genów i zrozumieć, dlaczego bakterie stają się bardziej odporne na terapie w tych warunkach w porównaniu ze standardowymi środowiskami testowania leków. Opracowanie złożonego modelu biofilmu uwypukliło wyzwania związane z rekapitulacją wrogiego środowiska płuc, co utrudnia przewidzenie, czy efekty przeciwdrobnoustrojowe in vitro pokrywają się z wynikami in vivo.

Specyficzny dla pacjenta charakter zakażeń płuc związanych z mukowiscydozą dodatkowo komplikuje opracowanie skutecznych modeli laboratoryjnych do testowania środków przeciwdrobnoustrojowych. W ramach tych badań udało nam się stworzyć model biofilmu agregatu wielomikrobiologicznego, który stanowi platformę do testowania środków przeciwdrobnoustrojowych w realistycznym środowisku, pokazuje poziom oporności, który można zaobserwować w tych biofilmach, oraz podkreśla potencjał terapii przeciwwirulencyjnych ukierunkowanych na składniki takie jak alginian. Posiadanie modelu badań przeciwdrobnoustrojowych zaprojektowanego tak, aby naśladować środowisko płuc mukowiscydozy, wypełni lukę istniejącą między badaniami in vivo i in vitro.

Co więcej, ocena wiromu bakterii w środowisku, które bardziej naśladuje płuca z mukowiscydozą, pozwoli na opracowanie i przetestowanie leków przeciwwirulentnych. Na początek rozprowadź pojedynczą kulkę pseudomonas aeruginosa PAO1 z zamrożonych kultur bulwarkowych na ślimak bulionu lizogenicznego. Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

W celu przygotowania jednogatunkowego biofilmu należy przygotować nocne kultury pseudomonas aeruginosa PAO1 z pojedynczą kolonią z płytki smugowej i inkubować przez noc przez 18 godzin. Następnie rozcieńczyć kulturę do gęstości optycznej 0,05 przy 600 nanometrach, co odpowiada 1 razy 10 do mocy 8 jednostek tworzących kolonie na mililitr. Ponadto rozcieńczyć tę kulturę od 1 do 100 w pożywce SCFM2.

Następnie dodać 180 mikrolitrów inokulum do dołków okrągłodennej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 75 obrotów na minutę przez 24 godziny. Ożywić pseudomonas aeruginosa PAO1 i Staphylococcus aureus SH1000 z zamrożonych kultur perełek, jak wykazano wcześniej.

Ożywić Candida albican CAF 2.1 w postaci pojedynczej smugi koralików na agarze dekstrozowym sabouraud i inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotuj nocne kultury gronkowca złocistego i candida albicans z pojedynczymi koloniami z odpowiednich płytek smugowych w 5 mililitrach bulionu lizogenicznego. Rozcieńczyć standaryzowane kultury, aby utworzyć pojedynczy inokulum zawierający oba gatunki w wymaganych stężeniach w SCFM2.

Następnie dodać 162 mikrolitry zmieszanego inokulum do dołków 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 75 obrotów na minutę przez 24 godziny, aby umożliwić tworzenie wielogatunkowych biofilmów. Następnie dodaj 14,2 mikrolitra przygotowanej przez noc kultury Pseudomonas aeruginosa do studzienek 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej i ponownie inkubuj płytkę, aby umożliwić tworzenie biofilmu wielodrobnoustrojowego.

Na początek należy uzyskać jednogatunkowe i wielogatunkowe biofilmy na 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych. W celu przerwania biofilmu dodać 8,81 mikrolitra osadu DNazy 1 bezpośrednio do studzienek zawierających biofilmy, uzyskując końcowe stężenie 50 mikrogramów na mililitr. Inkubować płytkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 75 obrotów na minutę.

Otrzymać podstawowy roztwór meropenemu antybiotyku w stężeniu 2,56 miligrama na mililitr. Wykonuj seryjne rozcieńczenia dwukrotnie, aby uzyskać zakres stężeń od 0,01 miligrama na mililitr do 2,56 miligrama na mililitr. Teraz dodaj 20 mikrolitrów każdego rozcieńczenia miropenemu do biofilmów, uzyskując zakres dawkowania od 1 mikrograma na mililitr do 256 mikrogramów na mililitr.

Uszczelnij 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania przezroczystą folią i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny, potrząsając nią z prędkością 75 obrotów na minutę. Biofilmy jednogatunkowe Pseudomonas nie wykazały znaczącego spadku liczby żywotnych komórek po potraktowaniu meropenemem w dowolnej dawce do 256 mikrogramów na mililitr. Odzysk Pseudomonas aeruginosa był o 0,74 log 10 jednostek tworzących kolonie na mililitr wyższy w warunkach jednogatunkowych niż w środowiskach wielodrobnoustrojowych bez antybiotyków.

Na początek przygotuj jednogatunkowe i wielogatunkowe biofilmy do ekstrakcji RNA. Po inkubacji przenieść biofilmy z każdej studzienki do mikrolitrowej probówki wirówkowej o pojemności jednego mililitra, łącząc repliki biofilmu dla każdej próbki. Odwirować probówkę o stężeniu 16 000 G przez pięć minut.

Jeśli ekstrakcja RNA zostanie przeprowadzona później, usuń supernatant i przechowuj osad w 250 mikrolitrach roztworu stabilizującego RNA w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Później rozmrozić probówkę z granulkami w temperaturze pokojowej i odwirować przy 16 000 G przez pięć minut. Ponownie zawiesić osad w 600 mikrolitrach odczynnika TRIzol i ręcznie go rozbić za pomocą igły 0,2 milimetra przymocowanej do dwumililitrowej strzykawki, zasysając od 5 do 10 razy lub do całkowitego rozpadu pastylki.

Postępuj zgodnie z wytycznymi producenta, aby oczyścić RNA z rozerwanych biofilmów. Aby określić ilościowo oczyszczony RNA, należy przygotować roztwór roboczy ze 199 mikrolitrami buforu i jednym mikrolitrem odczynnika na każdą próbkę. Wymieszaj 190 mikrolitrów roztworu roboczego i 10 mikrolitrów standardowego jednego i standardowego dwóch do oddzielnych probówek.

Następnie do pojedynczych probówek dodać 199 mikrolitrów roztworu roboczego i 1 mikrolitr próbki RNA. Wiruj przez 30 sekund i przechowuj w ciemnym miejscu przez pięć minut. Następnie na fluorymetrze wybierz RNA, a następnie RNA o szerokim zakresie i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.

Po wykonaniu ślepej próby odczytu nanieć pipetą jeden mikrolitr RNA na uchwyt próbki spektrofotometru i zmierzyć absorbancję przy 260 na 280 nanometrów. W celu komplementarnej syntezy DNA należy przygotować mieszaninę reakcyjną w probówkach. Umieść probówki w termocyklerze i uruchom program.

CDNA należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Ekspresja algD w jednogatunkowych biofilmach Pseudomonas aeruginosa nie różniła się istotnie w zależności od stężeń meropenemu. W biofilmach wielomikrobiologicznych ekspresja algD była znacznie wyższa i wynosiła 256 mikrogramów na mililitr, co wskazuje na zwiększoną produkcję alginianów w obecności organizmów współkolonizujących.