Name: Model zagregowanego biofilmu mukowiscydozy do badania ekspresji genów istotnych dla infekcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj model zagregowanego biofilmu do badania ekspresji genów w infekcjach płuc związanych z mukowiscydozą. Ta metoda pozwala analizować mechanizmy oporności bakteryjnej i testować terapie antywirulencyjne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HL, DN, and JF otrzymały wsparcie grantowe dla Centrum Badań Strategicznych (SRC) Oparte na dowodach ramy przedkliniczne dla rozwoju terapii przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie (PIPE-CF; Nr projektu SRC 022) z brytyjskiego funduszu powierniczego ds. mukowiscydozy (Cystic Fibrosis Trust) i amerykańskiej fundacji (ang. American Cystic Fibrosis Foundation). TH jest wspierany przez stypendium doktoranckie MRC Discovery Medicine North Doctoral Training Partnership. Dziękujemy Fundacji CF Trust and CF Foundation (SRC022) oraz programowi MRC DiMEN DTP za dofinansowanie

1. Przygotowanie jednogatunkowych biofilmów
<ol>
	<li>Ożywić P. aeruginosa PAO1 z zamrożonych kultur granulek, rozsypując pojedynczą kulkę na agarze z bulionu lizogenicznego (LB) i inkubując przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotuj nocne kultury PAO1, pobierając pojedynczą kolonię z płytki smugowej i dodając ją do 5 ml pożywki LB. Inkubować przez noc (18 godzin), następnie rozcieńczyć do OD600 0,05 (co odpowiada 1 x 108 CFU/ml), a następnie rozcieńczyć 1:100 w SCFM2 przygotowanym zgodnie z Palmerem, et al.16.</li>
	<li>Dodać 180 μl inokulum do studzienek okrągłodennej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Przygotować biofilmy w biologicznym potrójnym egzemplarzu do oznaczania liczbowego za pomocą jednostek tworzących kolonie (CFU). Łącznie 3 kontrpróby na kontrpróbę biologiczną przeprowadza się tylko dla qPCR. Do 3 oddzielnych studzienek dodać 180 μl sterylnego SCFM2, który ma być użyty do kontroli pożywki. 
	UWAGA: Płytki z okrągłym dnem zostały wybrane w przeciwieństwie do tradycyjnych płytek z płaskim dnem ze względu na ich przewagę w umożliwieniu jednorodnej ekspozycji całego biofilmu na otaczające podłoża wzrostowe17.</li>
	<li>Pozostawić biofilmy do wytworzenia się przez 24 godziny, inkubując w temperaturze 37 °C i wytrząsając przy 75 obr./min.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wielogatunkowych biofilmów
<ol>
	<li>Ożywić P. aeruginosa PAO1 i S. aureus SH1000 z zamrożonych kultur perełkowych, jak opisano powyżej. Ożywić C. albicans CAF2.1 z zamrożonych kultur granulek, nanosząc pojedynczą kulkę na agar z dekstrozą Saboraud i inkubując przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotuj nocne kultury SH1000 i CAF2.1, pobierając pojedynczą kolonię z płytki smugowej i dodając 5 ml LB (oddzielne kultury na noc dla każdego organizmu). Inkubować przez noc przez 18 godzin. Standaryzacja nocnych kultur S. aureus SH1000 i C. albicans CAF2.1 w LB do OD600 wartości 0,1, co odpowiada odpowiednio 1 x 109 i 1,2 x 107 CFU/ml17,18.</li>
	<li>Rozcieńczyć S. aureus i C. albicans, aby utworzyć pojedynczy inokulum zawierający oba gatunki w stężeniach odpowiednio 1 x 106 i 1 x 105 CFU/ml w SCFM2.</li>
	<li>Dodać 162 μl inokulum do studzienek 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Zaszczepić biofilmy w biologicznym potrójnym egzemplarzu w celu oznaczenia za pomocą jednostek tworzących kolonie (CFU). Łącznie 3 kontrpróby na kontrpróbę biologiczną przeprowadza się tylko dla qPCR. Do 3 oddzielnych studzienek dodaj 180 μl sterylnego SCFM2, który ma być używany do kontroli pożywki.</li>
	<li>Pozostawić biofilmy do wytworzenia się przez 24 godziny, inkubując w temperaturze 37 °C i wytrząsając przy 75 obr./min.</li>
	<li>Przygotuj nocną kulturę PAO1, pobierając pojedynczą kolonię z płytki smugowej i dodając ją do 5 ml pożywki LB. Inkubować przez noc (18 godzin), następnie dodać przy OD600 0,05 (co odpowiada 1 x 108 CFU/ml) i dalej rozcieńczać do 1 x 105 CFU/ml w SCFM2.</li>
	<li>Dodać 14,2 μl inokulum PAO1 do studzienek 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej, otrzymując końcowe inokulum PAO1 o wymiarach 1 x 104 CFU/mL. 
	UWAGA: Ta różnica w stężeniu inokulatu między różnymi gatunkami ma na celu zapewnienie, że S. aureus i C. albicans nie zostaną pokonane przez P. aeruginosa i wszystkie można odzyskać przez posiew punktowy z 24-godzinnego biofilmu, w którym nie są obecne antybiotyki.</li>
	<li>Pozostawić biofilmy wielodrobnoustrojowe do wytworzenia się przez 24 godziny, inkubując w temperaturze 37 °C i wstrząsając przy prędkości 75 obr./min.</li>
</ol>
3. DNaza i antybiotykoterapia jednogatunkowych i wielogatunkowych biofilmów
<ol>
	<li>Dodać 2 μl DNazy I bezpośrednio do studzienek zawierających biofilmy o końcowym stężeniu 50 μg/ml, inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i wstrząsać z prędkością 75 obr./min. 
	UWAGA: Jest on dodawany w celu rozrzedzenia lepkich biofilmów, aby umożliwić lepszą penetrację środków przeciwdrobnoustrojowych, odzwierciedlając dawkę rhDNazy (rekombinowanej ludzkiej DNazy), która jest przyjmowana przez wiele osób z mukowiscydozą jako strategia leczenia zaostrzeń płuc.</li>
	<li>Przygotować zapas antybiotyku meropenemu do 2,56 mg/ml, używając wody destylowanej jako rozcieńczalnika. Seryjnie rozcieńczyć 2-krotnie, aby osiągnąć stężenia 0,01 mg/ml - 2,56 mg/ml.</li>
	<li>Dodać 20 μl każdego rozcieńczenia meropenemu do biofilmów, aby uzyskać zakres dawkowania 1 μg/ml - 256 μg/ml. Dodać 20 μl wody destylowanej do biofilmów kontroli ujemnej w miejsce antybiotyku.</li>
	<li>Uszczelnić 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania przezroczystą folią i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, wytrząsając z prędkością 75 obr./min.</li>
</ol>
4. Wyliczanie żywotnych komórek i aktywność metaboliczna
UWAGA: Poniższe kroki dotyczą tylko biofilmów przeznaczonych do ilościowego oznaczania CFU.
<ol>
	<li>Dodać 10 μl celulazy (100 mg/ml, 0,05 M buforu cytrynianowego) do biofilmów i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, wytrząsając z prędkością 140 obr./min. Celulaza jest regularnie stosowana do rozbijania szkieletów celulozy w biofilmach19,20,21. W razie potrzeby należy dalej rozbijać biofilmy, pipetując w górę i w dół, aż nie pojawią się żadne widoczne grudki.</li>
	<li>Dodać 10 μl 0,02% roztworu rezazuryny w celu oceny aktywności metabolicznej badanych biofilmów i kontrolnych biofilmów i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, wytrząsając z prędkością 140 obr./min.</li>
	<li>Zmierzyć fluorescencję każdej studzienki za pomocą długości fali wzbudzenia 540 nm i długości fali emisji 590 nm w czytniku mikropłytek.</li>
	<li>Skorygować fluorescencję tła poprzez odjęcie wartości fluorescencji od próbek pożywek zerowych i obliczyć procentową redukcję jako (średniabiofilmów poddanych działaniu antybiotyku F/średniakontrola ujemna F) x 100 %.</li>
	<li>Wyliczyć zawartość studzienek, zawierających zarówno przerwane biofilmy, jak i komórki planktonowe, poprzez seryjne rozcieńczanie i punktowe posiewanie na selektywnym agarze w następujący sposób: 
	Selektywny agar Pseudomonas uzupełniony 1% glicerolem i suplementem CN do oznaczania liczby P. aeruginosa 
	Agar z solą mannitolu do oznaczania liczby S. aureus | 
	Drożdżowy agar dekstrozowy peptonowy uzupełniony penicyliną (250 U/ml), streptomycyną (250 μg/ml), siarczanem gentamycyny (30 μg/ml) i wankomycyną (3 μg/ml) do oznaczania liczby C. albicans. 
	UWAGA: Cała zawartość studzienek jest wyliczana ze względu na wyzwania związane z oddzieleniem swobodnie unoszącego się biofilmu kruszywa od komórek planktonowych. Jednak takie podejście dokładniej odzwierciedla warunki panujące w płucach mukowiscydozy. Po inkubacji na pokrywie może wystąpić kondensacja. Aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia między studzienkami, sterylne kontrole należy umieścić na selektywnym agarze płytkowe.</li>
	<li>Po punktowym posiewie na selektywnym agarze inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C przed oznaczaniem liczb.</li>
</ol>
5. Przygotowanie biofilmów do ekstrakcji RNA
UWAGA: Wszystkie kroki od tego momentu dotyczą tylko biofilmów przeznaczonych do analizy RT-qPCR.
<ol>
	<li>Wyjąć 96-dołkową płytkę mikromiareczkową zawierającą biofilmy z inkubatora w temperaturze 37 °C i przenieść je do probówki do mikrowirówki o pojemności 1 ml. Podczas przenoszenia należy upewnić się, że kontrpróby biofilmu są łączone dla każdego wykonanego powtórzenia biologicznego. Gwarantuje to, że jest wystarczająca ilość biomasy do ekstrakcji RNA.</li>
	<li>Odwirować probówki o pojemności 1,5 ml zawierające biofilmy o stężeniu 16 000 x g przez 5 minut. Jeśli wykonujesz ekstrakcję RNA tego samego dnia, przejdź do kroku 6.2.1. Jeżeli ekstrakcja RNA nie zostanie przeprowadzona tego samego dnia, należy usunąć supernatant i przechowywać osad w 250 μl roztworu stabilizującego RNA w temperaturze -20 °C. To rozwiązanie było używane do przechowywania osadów bakteryjnych w kilku badaniach22,23.</li>
</ol>
6. Ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Ekstrakcja bakteryjnego RNA, jednogatunkowych i wielogatunkowych biofilmów za pomocą komercyjnego zestawu. Przygotuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w wytycznych producenta.</li>
	<li>Usunąć supernatant pożywki hodowlanej i wyrzucić ją. Jeśli osad był przechowywany w roztworze stabilizacyjnym, rozmrozić go do temperatury pokojowej i odwirować przy 16 000 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić osad w 600 μl odczynnika do ekstrakcji RNA, a następnie ręcznie rozbić go za pomocą igły 0,2 mm dołączonej do strzykawki o pojemności 2 ml (zassać 5x-10x lub do całkowitego rozpadu osadu).</li>
	<li>Wykonaj kroki oczyszczania RNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Określ ilościowo RNA za pomocą spektroskopu UV, zestawu do oznaczania RNA BR i probówek. Wykrywalne granice RNA przy użyciu zestawu testowego wynoszą 10 - 1200 ng/μl, dlatego minimalna akceptowalna wydajność RNA dla tego protokołu wynosi 10 ng/μl.
	<ol>
		<li>Ustaw wymaganą liczbę probówek dla próbek i wzorców (wymagane są 2 wzorce).</li>
		<li>Przygotować roztwór roboczy, dodając 199 μl buforu i 1 μl odczynnika na liczbę próbek (+ 2 wzorce i 2 dla błędu).</li>
		<li>Dodać 190 μl roztworu roboczego i 10 μl roztworu wzorcowego 1 i wzorca 2 do oddzielnych probówek.</li>
		<li>Dodać 199 μl roztworu roboczego i 1 μl próbki RNA do oddzielnych probówek. Wiruj przez 30 s, a następnie przechowuj w ciemnym miejscu przez 5 minut.</li>
		<li>Na fluorometrze wybierz RNA > Szeroki zakres RNA i postępuj zgodnie z instrukcjami.</li>
		<li>Oceń jakość RNA za pomocą spektrofotometru. Opróżnij spektrofotometr, pipetując 1 μl wody wolnej od DNazy/RNaz na spektrofotometr. Wytrzyj wodę za pomocą niestrzępiącej się ściereczki i ustaw stosunek absorbancji na 260/280 nM. Pobrać pipetę 1 μl RNA na spektrofotometr. Jeśli RNA jest czyste, zaobserwuje się pojedynczy pik między 260 a 280 nM, a stosunek ten wyniesie ~ 2,0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć wyekstrahowane RNA w komplementarne DNA (cDNA) za pomocą zestawu do syntezy cDNA. W przypadku wszelkich próbek RNA przekraczających 50 ng/μl należy najpierw rozcieńczyć do 50 ng/μl przy użyciu wody wolnej od DNaz/RNaz.
	<ol>
		<li>Za pomocą probówek przygotować mieszaninę reakcyjną cDNA zgodnie z tabelą 1.</li>
		<li>Umieść probówki w termocyklerze w następujących warunkach: 25 °C przez 5 minut, 42 °C przez 30 minut, 85 °C przez 5 minut. Albo natychmiast użyj cDNA, albo przechowuj je zamrożone w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. qPCR
<ol>
	<li>Wykonaj qPCR za pomocą qPCR Master Mix. Użyj następujących starterów algD i genu porządkowania (16S) (Tabela 2). 
	UWAGA: Startery zostały zaprojektowane przy użyciu internetowego narzędzia NCBI-primer Blast w odniesieniu do sekwencji całego genomu P. aeruginosa, a następnie zsyntetyzowane przez komercyjnego dostawcę. Startery poddano walidacji pod kątem specyficzności w biofilmach polimikrobiologicznych poprzez dopasowanie sekwencji za pomocą narzędzia NCBI-primer Blast.</li>
	<li>Rozcieńczyć startery do 4 μM (4 pm/μL), rozcieńczając 20 μl startera w 480 μl wody wolnej od DNazy/RNaz. Można je zamrozić do wielu zastosowań.</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy głównej mieszanki qPCR zgodnie z instrukcją w tabeli 3. 
	UWAGA: Roztwór roboczy algD zawiera wystarczającą ilość roztworu na 3x powtórzenia biologiczne i 3x powtórzenia techniczne na stężenie meropenemu, 6x kontrole ujemne i 2x błąd. Roztwory robocze 16S zawierają wystarczającą ilość roztworu dla 2x standardów znanego stężenia RNA i 2x błędu.</li>
	<li>Dodać 18 μl roztworu roboczego algD do odpowiednich probówek reakcyjnych qPCR. Będzie to łącznie 36 probówek do analizy ekspresji algD i 6 probówek do kontroli ujemnych.</li>
	<li>Dodać 2 μl RNA do każdej z probówek reakcyjnych qPCR lub 2 μl wody wolnej od DNazy/RNaz do kontroli ujemnych.</li>
	<li>Dodać 18 μl roztworu roboczego 16S do odpowiednich probówek reakcyjnych qPCR. Będzie to w sumie 2 rurki. Dodać 2 μl RNA o znanym stężeniu do probówek reakcyjnych qPCR.</li>
	<li>Przeprowadzić qPCR w następujących warunkach: 2 min w 95 °C, 15 s w 95 °C (40 cykli), 1 min w 60 °C.</li>
	<li>Przeanalizuj wyniki qPCR przy użyciu metody 2-ΔΔCt, jak opisano wcześniej24. Analizując ekspresję algD, należy użyć ekspresji algD na poziomie 0 μg/ml jako kontroli dla odpowiednich kompozycji biofilmu i rozważyć ekspresję zmiany fałdowania odpowiednią dla kultur niepoddanych działaniu</li> substancji
</ol>

Anti-Infective Efficacy in Cystic Fibrosis with Aggregate Biofilm Models

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wyniki te pokazują, że pomimo częstego stosowania meropenemu w leczeniu zaostrzeń płuc u osób z mukowiscydozą, nie wpływał on znacząco na wzrost P. aeruginosa w jednogatunkowym lub wielogatunkowym modelu biofilmu. Nieznaczny wzrost odzysku P. aeruginosa zaobserwowano w obu modelach po leczeniu meropenemem w stężeniach 128 μg/ml i 256 μg/mL, co zaobserwowano również w przypadku S. aureus w biofilmie wielogatunkowym; Wzrosty te były jednak nieznaczne. Spadek liczby C. albicans po poddaniu meropenemowi może być spowodowany nieprzyjaznymi warunkami dla grzyba tworzonego przez bakterie w odpowiedzi na stres związany z substancją przeciwdrobnoustrojową. Nie zaobserwowano istotnych różnic w ekspresji algD między stężeniami meropenemu, gdy P. aeruginosa był uprawiany jako biofilm jednogatunkowy. Jednak ekspresja algD była znacznie wyższa w biofilmach wielogatunkowych po potraktowaniu meropenemem 256 μg/mL, co sugeruje, że produkcja alginianów może być zwiększona w tych warunkach. Różnice w ekspresji algD zaobserwowane między składem biofilmu a stężeniami meropenemu pokazują, w jaki sposób obecność odpowiednich czynników może wpływać na ekspresję genów istotnych dla infekcji i podkreślają znaczenie uwzględnienia stosowania środków przeciwdrobnoustrojowych i statusu infekcji wielodrobnoustrojowej podczas opracowywania i testowania alternatyw antybiotykowych.
Pomimo użyteczności modeli, istnieje kilka czynników, które należy wziąć pod uwagę, aby zapewnić pomyślne zastosowanie. Pojawienie się S. aureus i C. albicans w biofilmach jest niezbędne przed zakażeniem P. aeruginosa, ze względu na ryzyko, że S. aureus i C. albicans zostaną wyprzedzone przez Gram-ujemny. W tym modelu biofilmu C. albicans wydaje się być słabym partnerem ze względu na znacznie niższe wskaźniki przeżywalności w porównaniu z S. aureus i P. aeruginosa, nawet przy braku antybiotyków. Sugeruje to, że drożdże albo konkurują o zasoby, albo negatywnie wpływają na nie interakcje międzygatunkowe w obrębie biofilmu27,28. Brak C. albicans w obecności meropenemu, mimo że antybiotyk nie ma bezpośredniego działania przeciwgrzybiczego, wspiera ideę, że reakcja stresowa S. aureus na meropenem może stworzyć środowisko, które jest niegościnne dla C. albicans29,30. Należy jednak pamiętać, że wybór szczepu może mieć wpływ na ilość C. albicans, którą można odzyskać z modelu biofilmu polimikrobiologicznego. Różne tendencje obserwuje się przy stosowaniu P. aeruginosa LESB58 zamiast PAO1 (rysunek uzupełniający 1). W przypadku LESB58 C. albicans jest odzyskiwalny we wszystkich stężeniach meropenemu i w rzeczywistości wykazuje niewielki wzrost, ponieważ stężenie P. aeruginosa spada w wyniku działania środka przeciwdrobnoustrojowego, co pozwala na zmianę składu zbiorowiska. Jednak pomimo tych różnic, PAO1 jest używany w tym modelu, ponieważ jest laboratoryjnym szczepem referencyjnym, który zapewnia spójny i dobrze scharakteryzowany punkt odniesienia dla badań porównawczych. Ta spójność ma kluczowe znaczenie dla odtwarzalności i wyciągania wiarygodnych wniosków na temat interakcji w obrębie biofilmu.
Ekstrakcja dużych ilości RNA z bakterii hodowanych w SCFM2 może być trudna ze względu na lepki charakter pożywki. W związku z tym przerwanie biofilmu za pomocą igieł o średnicy 0,2 mm przed ekstrakcją RNA jest ważnym krokiem w kierunku zwiększenia wydajności RNA i zapewnienia ekstrakcji wystarczających stężeń (≥10 ng/μL) dla RT-qPCR. RNA jest wysoce podatne na degradację31, dlatego po ekstrakcji należy upewnić się, że wszystkie dalsze działania wykorzystujące RNA są wykonywane na lodzie. Regularne zamrażanie i rozmrażanie starterów RNA, cDNA i qPCR może zwiększyć prawdopodobieństwo degradacji produktu. Dlatego należy go maksymalnie ograniczyć. Innym częstym wyzwaniem w stosowaniu tych modeli jest ryzyko zanieczyszczenia podczas ekstrakcji RNA lub testu qPCR. Ryzyko to można zminimalizować, spryskując sprzęt roztworem do degradacji DNA przed ekstrakcją RNA oraz używając końcówek pipet wolnych od DNaz/RNaz podczas całej procedury. Regularna wymiana wody wolnej od DNaz/RNaz pomoże również zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia w teście qPCR.
W protokole tym zdecydowano się skupić na algD jako genie zainteresowania ze względu na jego konieczność w produkcji alginianu, który jest opisywany jako kluczowy czynnik wirulencji P. aeruginosa zarówno podczas ostrych, jak i przewlekłych infekcji32. W związku z tym alginian jest coraz częściej badany jako cel terapii przeciwzjadliwych 33,34. Chociaż model ten został wykorzystany do oceny ekspresji algD, można go zastosować do oceny ekspresji innych genów P. aeruginosa dla różnych celów leków przeciwzjadliwych. Meropenem został wykorzystany w tym badaniu ze względu na dowody sugerujące, że antybiotyk wpływa na ekspresję genów biosyntezy alginianów, szczególnie gdy P. aeruginosa jest hodowany w obecności C. albicans35. Ponadto meropenem jest często przepisywany klinicznie w leczeniu i leczeniu zakażeń dróg oddechowych P. aeruginosa, co podkreśla jego odpowiednie zastosowanie w tym modelu36. Jednak w przypadku tych modeli możliwe jest również dodanie różnych antybiotyków, a nawet podwójnych metod leczenia. Włączenie antybiotyków do tego modelu pozwoliłoby również na wykorzystanie tego modelu do badania ewolucyjnych zmian w mechanizmach oporności bakterii, takich jak rozwój oporności P. aeruginosa na karbapenemy za pośrednictwem poryny37. Ten model biofilmu wielodrobnoustrojowego można dostosować tak, aby obejmował inne istotne gatunki, na przykład bakterie komensalne, takie jak Rothia sp. i Streptococcus sp., lub zastąpić go innymi drobnoustrojami wywołującymi infekcje, takimi jak Aspergillus sp., aby odzwierciedlić wymagania badanego kandydata na lek.
Wcześniej opracowano wielomikrobiologiczne modele biofilmu naśladujące płuca z mukowiscydozą38 lat. Opisany tutaj model opiera się na wcześniejszych pracach mających na celu zwiększenie przepustowości poprzez zastosowanie konfiguracji dostosowanej do hodowli drobnoustrojów na małą skalę. Jest to korzystne w przypadku testowania nowych związków, w przypadku których dostępny materiał może być ograniczony. Ponieważ model jest mały i statyczny, możliwe jest hodowanie biofilmów w różnych dostępnych tlenach, aby lepiej odzwierciedlić środowisko mikroaerofilne w płucach39,40. Ze względu na łatwość odtwarzalności i opłacalność, biofilmy zgłoszone w tym badaniu były hodowane tlenowo.
Pomimo cennych spostrzeżeń uzyskanych z tego badania, należy przyznać się do kilku ograniczeń. Po pierwsze, brak komórek gospodarza ogranicza jego użyteczność w badaniu czynników wirulencji, które mają bezpośredni cel komórkowy ssaków. Przedstawiono w nim wyzwania związane z ustanowieniem modeli in vitro odpowiednich do badania czynników wirulencji i podkreślono potrzebę dalszego rozwoju modeli, które odtwarzają wrogie środowisko przewlekłych zakażeń. Ponadto, chociaż uważa się go za czynnik wirulencji, alginian jest kluczową cechą biofilmów i jest wytwarzany przez P. aeruginosa zarówno w laboratorium, jak i w środowisku. Wykorzystanie modeli in vitro do badania środków przeciwbiofilmowych może być mniejszym wyzwaniem niż wykorzystanie modeli do badania innych terapii przeciwzjadliwych, takich jak środki przeciwegzotoksynowe, w których cel ma bezpośrednie działanie na komórki eukariotyczne41.
Chociaż wybór szczepu PAO1 P. aeruginosa jest odpowiedni dla odtwarzalności i standaryzacji modelu in vitro , może być pożądane włączenie izolatów z przewlekłej infekcji. W przyszłości planowane jest przeprowadzenie eksperymentów z wykorzystaniem tego modelu ze szczepem wyizolowanym z próbek pobranych od pacjentów, aby zaobserwować wpływ środków przeciwdrobnoustrojowych na szczepy przystosowane do niszy oddechowej.
Zastosowanie SCFM2 jako naśladowcy plwociny w tym modelu in vitro pozwala na standaryzowaną i powtarzalną obserwację zmian behawioralnych zagregowanych biofilmów hodowanych w środowisku istotnym dla dróg oddechowych w trakcie antybiotykoterapii. SCFM2 został wybrany zamiast oryginalnej wersji SCFM ze względu na włączenie zewnątrzkomórkowego DNA (eDNA) i mucyny, które są ważnymi czynnikami wspierającymi tworzenie biofilmów. Należy jednak zauważyć, że dostępne są również inne warianty syntetycznych pożywek z plwociny, takie jak SCFM3, który zawiera kwas p-aminobenzoesowy, NAD +, adeninę, guaninę, ksantynę i hipoksantynę42 oraz SCFM4, który jest wersją z niedoborem żelaza. Ponadto zastosowanie syntetycznych pożywek z plwociny, takich jak mukowiscydoza płucna (CFLM) i cyscydoza zatokowa (CFSM), opracowane przez Ruhluela i współpracowników43, pozwoliłoby na podział dróg oddechowych w celu wizualizacji zachowania i wpływu terapii przeciwwirusowych na biofilmy wielodrobnoustrojowe w różnych środowiskach.
Chociaż AlgD jest kluczowym enzymem w szlaku biosyntezy alginianu, sam jego poziom ekspresji nie powinien być traktowany jako wskaźnik produkcji alginianu. Inne czynniki, takie jak modyfikacje potranskrypcyjne i potranslacyjne, a także mechanizmy regulacyjne, mogą wpływać na ilość wytwarzanego alginianu, prowadząc do zmniejszenia tworzenia biofilmu, zwiększonej podatności na stres środowiskowy i zwiększonej wrażliwości na antybiotyki, gdy produkcja alginianów jest zmniejszona12,14. W fazie rozwoju jest kilka terapii przeciwwirulencyjnych, które są ukierunkowane na białko alginianowe, w przypadku gdy ten model nie byłby odpowiedni do określenia ich skuteczności i gdzie bardziej korzystny byłby bezpośredni pomiar produkcji alginianów lub odczyt funkcjonalny44. Ponadto niektóre terapie przeciwwirusowe mogą być ukierunkowane na różne etapy biosyntezy lub regulacji alginianów, więc pomiar produkcji alginianów bezpośrednio rejestruje efekt netto terapii na czynnik wirulencji44. Niemniej jednak kilka terapii przeciwwirusowych w obecnych badaniach jest ukierunkowanych na kluczowe geny alginianowe, a modele ekspresji genów, takie jak te, byłyby odpowiednie do badania skutków takich terapii13,14. Techniki takie jak ta można również łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, co pozwala na szybką ocenę wielu próbek lub warunków, co jest korzystne w badaniach na dużą skalę, obejmujących wstępne badania przesiewowe potencjalnych związków przeciwwirusowych.
Ogólnie rzecz biorąc, jednogatunkowe i wielogatunkowe modele biofilmu stanowią cenne narzędzia do badania ekspresji genów P. aeruginosa istotnych dla infekcji w warunkach odpowiednich dla mukowiscydozy. Wprowadzenie na szeroką skalę terapii modulatorowej zrewolucjonizowało krajobraz opieki zdrowotnej nad chorymi na mukowiscydozę. Jednak pomimo szeregu korzyści klinicznych modulatorów mukowiscydozy, badania wykazały, że linie klonalne Pseudomonas są nadalw obiegu, co podkreśla, że nadal potrzebne są nowe terapie w leczeniu zakażeń płuc P. aeruginosa 45,46. Pomimo omówionych ograniczeń, zastosowanie tych modeli może być przydatne w fazie odkrywania w procesie opracowywania leków w celu oceny skuteczności związków w niszy płuc mukowiscydozy oraz interakcji nowych związków przeciwwirusowych ze znanymi antybiotykami w tym środowisku.

Mukowiscydoza (CF) jest najczęstszą chorobą dziedziczoną autosomalnie recesywnie w populacjach rasy kaukaskiej1. Mutacje w genie CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) powodują szereg objawów klinicznych, w tym nadprodukcję śluzu w drogach oddechowych. Upośledzony transport jonów powoduje odwodnienie tego śluzu, w wyniku czego nie jest on odpowiednio usuwany przez układ śluzowo-rzęskowy, co zwiększa podatność na przewlekłe infekcje płuc1. Mikrobiologia płuc z mukowiscydozą składa się z odrębnej grupy patogenów oportunistycznych, przy czym Haemophilus influenzae i Staphylococcus aureus są uważane za organizmy pierwotne infekujące płuca niemowląt i dzieci z mukowiscydozą, po których następuje spadek liczby tych organizmów i późniejsza kolonizacja przez Burkholderia spp. lub Pseudomonas aeruginosa w wieku dorosłym1,2,3,4. Oprócz gatunków bakterii, mikroorganizmy grzybowe są również powszechne w środowisku płuc mukowiscydozy, przy czym Candida spp i Aspergillus spp należą do najczęściej izolowanych gatunków grzybów3,4,5. Chociaż organizmy te odgrywają ważną rolę w zakażeniach płuc mukowiscydozą, postęp w technikach hodowli i metodach niezależnych od hodowli wykazał, że infekcje płuc mukowiscydozy rzadko ograniczają się do jednego gatunku bakterii, podkreślając w ten sposób złożoną, wielomikrobiologiczną naturę mukowiscydozy płuc1,6.
Pomimo tej wiedzy, obecne metody in vitro i in vivo do opracowywania i testowania antybiotyków do stosowania w przewlekłych infekcjach płuc nie są całkowicie podobne do niszy płuc na mukowiscydozę7, przy czym nacisk kładziony jest na określenie minimalnego stężenia hamującego (MIC) leku przeciwko kulturom jednogatunkowym. Pozwala to w ograniczonym stopniu uwzględnić mikrośrodowisko zakaźne, które jest kluczowym składnikiem patologii płuc mukowiscydozy8. W związku z tym metody zazwyczaj obejmują wzrost bakterii w postaci kultur planktonowych, stanu wzrostu, który prawdopodobnie nie odzwierciedla stanu bakterii w płucach z mukowiscydozą. Jest to szczególnie ważne w przypadku P. aeruginosa, który zazwyczaj objawia się jako agregaty biofilmu, które często zawierają dodatkowo inne gatunki bakterii i grzybów9. Czynniki te stanowią wyzwanie podczas testowania antybiotyków pod kątem przewlekłych zakażeń płuc i podkreślają rozbieżność między metodami badania wrażliwości na antybiotyki a aktywnością przeciwdrobnoustrojową w środowisku płuc mukowiscydozy9,10. Wyzwania te nasilają się podczas badań przesiewowych pod kątem alternatywnych antybiotyków, takich jak terapie przeciwzwirulencyjne, gdzie testy MIC nie są wskaźnikiem aktywności i nie zapewniają zrozumienia interakcji gospodarz-patogen11.
Alginian, zewnątrzkomórkowy polisacharyd, jest kluczowym składnikiem biofilmów P. aeruginosa w niszy płucnej i zwiększa tolerancję bakterii na antybiotyki i czynniki odpornościowe, a także zwiększa przyczepność powierzchniową12. Alginian jest atrakcyjnym celem dla rozwoju terapii przeciwwirulencyjnej, a kilka terapii ukierunkowanych na biosyntezę alginianów zostało opracowanych, takich jak te ukierunkowane na algD, kluczowy gen w biosyntezie alginianów13,14. Takie terapie mogą być stosowane w połączeniu z antybiotykoterapią u osób z mukowiscydozą w celu zakłócenia biofilmów P. aeruginosa, przekształcając bakterie w stan planktonowy. Zwiększa to skuteczność antybiotyku, ponieważ przerwanie macierzy zewnątrzkomórkowej biofilmu pozwala na zwiększenie zdolności antybiotyku do dotarcia do celu bakteryjnego15. Jednak pomimo dowodów na aktywność in vitro, działanie tych środków terapeutycznych w niszy płuc mukowiscydozy pozostaje niejasne.
Przedstawiony tutaj model zagregowanego biofilmu rozwiązuje te problemy poprzez dodanie S. aureus i C. albicans, które są powszechnymi współkolonizatorami z P. aeruginosa w płucach mukowiscydozy. Pozwala również P. aeruginosa rosnąć w agregatach biofilmu, co widać w środowisku oddechowym. Zastosowanie podłoża naśladującego plwocinę Synthetic Cystic Fibrosis Media 2 (SCFM2) jako środowiska odżywczego dla wzrostu pozwala na dodanie wpływów gospodarza, w tym mucyny, zewnątrzkomórkowego (e)DNA i profilu aminokwasowego, który replikuje ten widoczny w CF lung16.
Aby dokładniej uchwycić warunki płuc mukowiscydozy, biofilmy są wystawione na działanie meropenemu, antybiotyku, który jest często przepisywany osobom z mukowiscydozą w okresach zaostrzenia choroby płuc. Stosowanie antybiotyku w tym modelu jest zalecane jako sposób na odtworzenie stanów klinicznych, w których można przepisać środek przeciwwirulencyjny, np. jako terapię skojarzoną w połączeniu z antybiotykoterapią w celu opanowania objawów ze strony układu oddechowego podczas zaostrzenia. Ponadto włączenie meropenemu umożliwia ocenę odpowiedzi transkrypcyjnej P. aeruginosa na ekspozycję na antybiotyk w warunkach istotnych dla zakażenia. Model ten może być wykorzystany do uzyskania informacji na temat tego, które czynniki byłyby odpowiednimi celami dla leków w płucach z mukowiscydozą. Model może być również zmieniony w celu uwzględnienia innych istotnych antybiotyków, takich jak tobramycyna, oraz w celu oceny ekspresji innych genów będących przedmiotem zainteresowania.
Tutaj ten zbiorczy model wielomikrobiologiczny jest wykorzystywany do oceny wpływu obecności Staphylococcus aureus i Candida albicans oraz różnych stężeń meropenemu (1, 16 i 256 μg/mL) na ekspresję algD przez P. aeruginosa. Meropenem jest przepisywany głównie w leczeniu zakażeń płuc wywołanych przez P. aeruginosa i nie ma bezpośredniego wpływu na S. aureus lub C. albicans, gdzie wartość MIC dla obu tych współżyjących gatunków wynosi >256 μg/ml.
Ta praca zwiększy zrozumienie, w jaki sposób istotne czynniki, takie jak czynniki gospodarza w SCFM2 i mikroorganizmy współkolonizujące, mogą wpływać na ekspresję genów związanych z infekcją P. aeruginosa i stworzą podstawy do rozwoju i testowania leków przeciwwirulencyjnych do stosowania w przewlekłych infekcjach dróg oddechowych CF.

<table><tbody><tr><td>Oddychająca membrana uszczelniająca do płytek wielodołkowych&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>Z763624</tr><tr><td>Palnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsena Celulaza (100 mg/ml)</td><td>Cambridge Bioscience&nbsp;</td><td>HY-B2220-5g</td><td></td></tr><tr><td>Suplement CN&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>1.07624</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do miniprzygotowania bezpośredniego zolu RNA</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>Dnaza I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od DNaz/RNAZ</td><td>VWR</td><td>J60610. XC</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny (30 &mikro; g/mL)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>G3632</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol (1 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15514029</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>A6101</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy iScript Cdna&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina (250 U/ml)</td><td>Materiały laboratoryjne Scientfic</td><td>P3032-10MU</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorometr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania kubitowego RNA BR&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q10210</td><td></td></tr><tr><td>Rurki kubitowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór resazuryny (0,02 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R12204</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Soln</td><td>Invitrogen</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna (250 &mikro; g/mL)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler (użyliśmy termocyklera T100)</td><td>Odczynnik TRIzol 1861096</td><td></td><td></td>Biorad</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Vancomycin (3 &micro; g/mL)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>1709007</tr></tbody></table>

model zagregowanego biofilmu mukowiscydozy do badania ekspresji genów istotnych dla infekcji

Cystic Fibrosis Aggregate Biofilm Model to Study Infection-relevant Gene Expression

Standardowe metody badań przedklinicznych dla nowych terapii przeciwbakteryjnych stosowanych w leczeniu przewlekłych infekcji płuc u osób z mukowiscydozą nie odzwierciedlają warunków środowiskowych wrogiej niszy płucnej. Obecne redukcjonistyczne warunki testowania mogą prowadzić do progresji związków wzdłuż procesu przedklinicznego bez dowodów na ich aktywność w warunkach odpowiednich dla niszy płucnej mukowiscydozy. Kilka podejść stosowanych do badania tradycyjnych środków przeciwdrobnoustrojowych może nie być odpowiednich dla alternatyw dla antybiotyków, w tym leków przeciwwirulencyjnych, takich jak środki wykrywające kworum i inhibitory sideroforów. Protokół ten dokumentuje zagregowany model biofilmu Pseudomonas aeruginosa w celu porównania oporności i ekspresji genów istotnych dla infekcji w kulturach jednogatunkowych i wielogatunkowych (Staphylococcus aureus i Candida albicans), badając redukcje jednostek tworzących kolonie (CFU) i zmiany w ekspresji genów, wykorzystując algD jako przykład. Model został zoptymalizowany pod kątem małych, statycznych objętości kultur bakteryjnych, aby umożliwić badanie nowych związków w fazie odkrywania w ramach procesu opracowywania leków, w której ilości związków mogą być ograniczone. Jednogatunkowe biofilmy P. aeruginosa tworzono w syntetycznym pożywce dla mukowiscydozy 2 (SCFM2) przez 24 godziny przed podaniem meropenemu w różnych stężeniach (1, 16 i 256 μg/ml) przez kolejne 24 godziny. Biofilmy wielodrobnoustrojowe powstały poprzez hodowlę Staphylococcus aureus i Candida albicans razem w SCFM2, a następnie inokulację P. aeruginosa przez dodatkowe 24 godziny i leczenie meropenemem. Brak bezpośredniego związku między miarami skuteczności związków w badaniach przedklinicznych a wynikami badań klinicznych poddał w wątpliwość możliwość zastosowania obecnych narzędzi laboratoryjnych badań przesiewowych. Model ten pozwala nam zrozumieć wpływ istotnych czynników na ekspresję genu P. aeruginosa, w tym genów przyczyniających się do oporności i zjadliwości, wypełniając w ten sposób tę lukę.

Wyniki przedstawione na Ryc. 1A podkreślają odporność biofilmu jednorodnego gatunkowo Pseudomonas poddanego działaniu meropenemu, ponieważ przy żadnej z badanych dawek nie zaobserwowano istotnego spadku. Kontrola negatywna, która nie była eksponowana na meropenem, wykazała odzysk na poziomie 8,31 ± 0,07 Log10CFU/mL, podczas gdy największa redukcja żywych komórek wystąpiła przy stężeniu 16 µg/mL, co skutkowało odzyskiem 8,06 ± 0,10 Log10CFU/mL. Taki poziom oporności jest jednak spodziewany, gdyż w literaturze wskazano, że biofilmy P. aeruginosa są znacznie bardziej odporne na meropenem niż ich odpowiedniki planktoniczne, a stężenie wymagane do działania bakteriobójczego przeciwko biofilmom wynosi &gt;256 µg/mL25,26, w porównaniu do komórek planktonicznych, których MIC wynosi 2 µg/mL.
Rysunek 1B przedstawia średni procentowy spadek aktywności metabolicznej biofilmów monokultury P. aeruginosa dla każdego stężenia antybiotyku w porównaniu z biofilmem kontrolnym, który nie był eksponowany na meropenem. Spadek fluorescencji przekłada się na niższą aktywność metaboliczną, co uznano za wskaźnik redukcji liczby żywych komórek. Kultury traktowane meropenemem wykazały zwiększoną aktywność metaboliczną (oznaczoną ujemnym procentowym spadkiem), co wskazuje na brak (lub bardzo ograniczoną) aktywność bakteriobójczą.
Zwiększona aktywność metaboliczna bez wzrostu odzysku CFU może wskazywać na odpowiedź metaboliczną bakterii na ekspozycję na antybiotyk. Porównując biofilmy jednowidowe i wielowidowe (Rysunek 2), ogólny wzrost P. aeruginosa różnił się tylko nieznacznie, przy czym odzysk żywych komórek z biofilmu jednowidowego był o 0,74 ± 0,17 Log10CFU/mL wyższy niż w biofilmie polimikrobowym w przypadku braku antybiotyku. S. aureus odzyskano z biofilmu polimikrobowego w ilości 6,95 ± 0,11 Log10CFU/mL, a C. albicans w ilości 1,66 ± 2,88 Log10CFU/mL. C. albicans występuje jednak tylko tam, gdzie nie dodano meropenemu, i nie odzyskano go z żadnego biofilmu, w którym podano antybiotyk. Ponieważ meropenem nie wykazuje bezpośredniego działania na Candida, co wykazano w poprzednich testach MIC przeprowadzonych w laboratorium na monokulturze C. albicans, gdzie wartość MIC dla meropenemu wynosiła &gt;256 µg/mL, prawdopodobne jest, że to bakteryjna odpowiedź stresowa pozostałych współbytujących gatunków, S. aureus oraz P. aeruginosa, na ekspozycję na antybiotyk prowadzi do powstania warunków niekorzystnych dla grzyba.
Ponieważ biofilmy P. aeruginosa, zarówno w monokulturze, jak i w obecności współkolonizujących patogenów, nie wykazują zmniejszenia odzysku żywych komórek przy stężeniach meropenemu do 256 µg/mL, podkreśla to potrzebę zastosowania alternatywnych metod terapeutycznych, takich jak terapie antywirulencyjne, w celu zwalczania takich przewlekłych infekcji w praktyce klinicznej, które mogą działać w połączeniu z lekami przeciwdrobnoustrojowymi, aby skutecznie zredukować ładunek bakteryjny.
algD ekspresja w P. aeruginosa biofilmy jednorodzajowe PAO1 
Ekspresja algD w P. aeruginosa PAO1 poddany działaniu różnych stężeń meropenemu (1, 16 i 256 µg/mLhodowanych w SCFM2, oceniono za pomocą SYBR-Green RT-qPCR. Ekspresję przeanalizowano następnie metodą 2-ΔΔCt, przyjmując 16S użyty jako gen kontrolny (Rysunek 3). Ekspresja algD nie różniło się istotnie pomiędzy zastosowanymi stężeniami meropenemu, co sugeruje, że w przypadku wzrostu w formie biofilmu jednopasościowego, PAO1 algD ekspresja nie jest w znacznym stopniu wpływana przez obecność meropenemu.
algD ekspresja w P. aeruginosa Biofilmy wielogatunkowe z udziałem PAO1 
Ekspresja algD oceniono również w P. aeruginosa PAO1 hodowane w biofilmach składających się z S. aureus SH100 oraz C. albicans CAF2.1 w celu oceny, czy obecność organizmów współkolonizujących wpłynęła na ekspresję algD lub odpowiedzi na meropenem w szczepie PAO1. Nie stwierdzono istotnych różnic w algD obserwowano ekspresję w przedziale 0-16 µg/mL ekspozycji na meropenem. Jednakże, przy 256 µg/mLekspresja algD było znacznie wyższe w porównaniu z pozostałymi stężeniami antybiotyku (0 µg/mL kontra 256 µg/mLp = 0.0075, 1 µg/mL kontra 256 µg/mL p = 0,035, 16 µg/mL kontra 256 µg/mL p = 0,0048) na poziomie około 7-krotnie wyższym niż w warunkach kontrolnych (Rycina 4). Podkreśla to, że w przypadku hodowli w obecności S. aureus i C. albicans, obserwuje się zwiększoną ekspresję algD przy najwyższym stężeniu meropenemu, w porównaniu do sytuacji, gdy P. aeruginosa jest hodowany osobno, co sugeruje wzrost produkcji alginianu w warunkach polimikrobowych. Pomimo wykazania różnic w algD ekspresji pomiędzy biofilmem jednowidgowym a wielwidgowym nie jest jasne, czy ten wzrost ekspresji jest wywołany obecnością konkretnego gatunku (S. aureus lub C. albicans) lub czy za tę zmianę ekspresji genów odpowiadają oddziaływania z udziałem obu mikroorganizmów.
Wyniki te podkreślają znaczenie zrozumienia wpływu terapeutyków i środowiska na ekspresję genów, szczególnie w kontekście przyszłych badań nad lekami ukierunkowanymi na wirulencję.
<img alt="Wykresy słupkowe inhibicji wzrostu bakterii dla P. aeruginosa, S. aureus i C. albicans w zależności od stężenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67477/67477fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Biofilmy jednoproduktowe składające się z Pseudomonas aeruginosa PAO1. Biofilmy hodowano przez 24 h w SCFM2, traktowano DNase I w stężeniu 50 µg/mL przez 1 h, a następnie meropenemem w różnych stężeniach przez kolejne 24 h. (A) Średnia wartość Log10CFU/mL. Linia przerywana oznacza 2-logową redukcję (równoważną redukcji o 99 %) odzysku P. aeruginosa w stosunku do kontroli negatywnej. (B) Procentowa redukcja względnych jednostek fluorescencji. Linia przerywana oznacza 50% redukcję fluorescencji; pierwszy punkt powyżej tej linii jest uznawany za wartość MIC50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/67477fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy przedstawiające zależność wzrostu bakterii (A) oraz redukcję fluorescencji (B) od stężenia meropenemu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67477/67477fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Biofilmy wielogatunkowe składające się z Pseudomonas aeruginosa PAO1, Staphylococcus aureus SH1000 oraz Candida albicans CAF2.1. Biofilmy hodowano przez 24 h w SCFM2, traktowano DNazą I w stężeniu 50 µg/mL przez 1 h, a następnie meropenemem w różnych stężeniach przez kolejne 24 h. Linia przerywana oznacza 2-logową redukcję (odpowiadającą redukcji o 99 %) odzysku P. aeruginosa w stosunku do kontroli negatywnej. Istotność określono za pomocą dwuczynnikowej analizy ANOVA, gdzie **** p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/67477fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy względnej ekspresji w zależności od stężenia (µg/ml), przedstawiający wynik analizy statystycznej (ns)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67477/67477fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ekspresja algD wyekstrahowanego z pojedynczego gatunku składającego się z P. aeruginosa PAO1. Biofilmy hodowano przez 24 h w SCFM2, traktowano DNazą I w stężeniu 50 µg/mL przez 1 h i eksponowano na różne stężenia meropenemu (0, 1, 16, 256 µg/mL). Ekspresję genów analizowano metodą 2-ΔΔCt. W analizie wykorzystano gen housekeeping 16S . Istotność określono za pomocą testu porównań wielokrotnych Tukeya. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/67477fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy względnej ekspresji w funkcji stężenia; istotność statystyczna; analiza ekspresji genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67477/67477fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ekspresja algD wyizolowanego z wielogatunkowych biofilmów składających się z P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000 oraz C. albicans CAF2.1. Biofilmy hodowano w SCFM2, traktowano DNazą I w stężeniu 50 µg/mL przez 1 h, a następnie meropenemem w różnych stężeniach (0, 1, 16, 256 µg/mL) przez kolejne 24 h. Ekspresję genów analizowano metodą 2-ΔΔCt. W analizie wykorzystano gen referencyjny 16S . **p &lt; 0,01 określone za pomocą testu wielokrotnych porównań Tukeya. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/67477fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Objętość na reakcję cDNA (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X mieszanina reakcyjna iScript</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>odwrotna transkryptaza iScript</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od DNaz i RNaz</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5 ng RNA</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita objętość reakcji </td>
			<td>20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Roztwory robocze master mixu do cDNA. Składniki i objętości wymagane na jedną reakcję cDNA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gen</td>
			<td>Starter forward</td>
			<td>Starter odwrotny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>algD</td>
			<td>CGCCGAGATGATCAAGTACA</td>
			<td>TGTAGTAGCGCGACAGGTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16S</td>
			<td>ACCGCATACGTCCTACGG</td>
			<td>CGAAGACCTTCTTCACACACG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: algD oraz 16S forwardowe i reverse'owe primery do qPCR. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Objętość na reakcję (µL)</td>
			<td>algD objętość robocza (µL)</td>
			<td>16S objętość robocza (µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>10</td>
			<td>440</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter forward</td>
			<td>1</td>
			<td>44</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter odwrotny</td>
			<td>1</td>
			<td>44</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od DNaz i RNaz</td>
			<td>6</td>
			<td>264</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suma </td>
			<td>18</td>
			<td>792</td>
			<td>72</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Roztwory robocze master mixu do qPCR. Składniki i objętości wymagane do przygotowania roztworów master mixu do qPCR dla algD i 16S .
Rycina uzupełniająca 1: Biofilmy wielogatunkowe składające się z Pseudomonas aeruginosa LESB58, Staphylococcus aureus SH1000 oraz Candida albicans CAF2.1. Biofilmy hodowano przez 24 h (n = 3) w SCFM2, traktowano DNase I w stężeniu 50 µg/mL przez 1 h, a następnie traktowano meropenemem w różnych stężeniach przez kolejne 24 h. Linia przerywana oznacza 2-logową redukcję (równoważną redukcji o 99%) odzysku P. aeruginsoa w stosunku do kontroli negatywnej. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA). *p=0.0242, ** p=0.0013, **** p &lt;0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67477/Supplementary_Figure_1_RE.tif" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.</a>

To badanie nakreśla ramy dla rozwoju modelu zagregowanego biofilmu wielomikrobiologicznego i optymalizacji protokołu ekstrakcji RNA w celu oceny ekspresji genu Pseudomonas aeruginosa odzwierciedlającej środowisko płuc mukowiscydozy. Zastosowania obejmują ocenę działania przeciwdrobnoustrojowego i badanie alternatyw dla antybiotyków w warunkach istotnych dla mukowiscydozy.

Model zagregowanego biofilmu mukowiscydozy do badania ekspresji genów istotnych dla infekcji

Standard pre-clinical testing methods for novel antimicrobial therapeutics used to treat chronic lung infections in people with cystic fibrosis do not ...

W ramach naszych badań opracowano zagregowany model biofilmu w sztucznej plwocinie w celu odtworzenia infekcji płuc u pacjentów z mukowiscydozą. Model ten pozwala nam analizować zmiany ekspresji genów i zrozumieć, dlaczego bakterie stają się bardziej odporne na terapie w tych warunkach w porównaniu ze standardowymi środowiskami testowania leków. Opracowanie złożonego modelu biofilmu uwypukliło wyzwania związane z rekapitulacją wrogiego środowiska płuc, co utrudnia przewidzenie, czy efekty przeciwdrobnoustrojowe in vitro pokrywają się z wynikami in vivo.Specyficzny dla pacjenta charakter zakażeń płuc związanych z mukowiscydozą dodatkowo komplikuje opracowanie skutecznych modeli laboratoryjnych do testowania środków przeciwdrobnoustrojowych. W ramach tych badań udało nam się stworzyć model biofilmu agregatu wielomikrobiologicznego, który stanowi platformę do testowania środków przeciwdrobnoustrojowych w realistycznym środowisku, pokazuje poziom oporności, który można zaobserwować w tych biofilmach, oraz podkreśla potencjał terapii przeciwwirulencyjnych ukierunkowanych na składniki takie jak alginian. Posiadanie modelu badań przeciwdrobnoustrojowych zaprojektowanego tak, aby naśladować środowisko płuc mukowiscydozy, wypełni lukę istniejącą między badaniami in vivo i in vitro.Co więcej, ocena wiromu bakterii w środowisku, które bardziej naśladuje płuca z mukowiscydozą, pozwoli na opracowanie i przetestowanie leków przeciwwirulentnych. Na początek rozprowadź pojedynczą kulkę pseudomonas aeruginosa PAO1 z zamrożonych kultur bulwarkowych na ślimak bulionu lizogenicznego. Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.W celu przygotowania jednogatunkowego biofilmu należy przygotować nocne kultury pseudomonas aeruginosa PAO1 z pojedynczą kolonią z płytki smugowej i inkubować przez noc przez 18 godzin. Następnie rozcieńczyć kulturę do gęstości optycznej 0,05 przy 600 nanometrach, co odpowiada 1 razy 10 do mocy 8 jednostek tworzących kolonie na mililitr. Ponadto rozcieńczyć tę kulturę od 1 do 100 w pożywce SCFM2.Następnie dodać 180 mikrolitrów inokulum do dołków okrągłodennej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 75 obrotów na minutę przez 24 godziny. Ożywić pseudomonas aeruginosa PAO1 i Staphylococcus aureus SH1000 z zamrożonych kultur perełek, jak wykazano wcześniej.Ożywić Candida albican CAF 2.1 w postaci pojedynczej smugi koralików na agarze dekstrozowym sabouraud i inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotuj nocne kultury gronkowca złocistego i candida albicans z pojedynczymi koloniami z odpowiednich płytek smugowych w 5 mililitrach bulionu lizogenicznego. Rozcieńczyć standaryzowane kultury, aby utworzyć pojedynczy inokulum zawierający oba gatunki w wymaganych stężeniach w SCFM2.Następnie dodać 162 mikrolitry zmieszanego inokulum do dołków 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 75 obrotów na minutę przez 24 godziny, aby umożliwić tworzenie wielogatunkowych biofilmów. Następnie dodaj 14,2 mikrolitra przygotowanej przez noc kultury Pseudomonas aeruginosa do studzienek 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej i ponownie inkubuj płytkę, aby umożliwić tworzenie biofilmu wielodrobnoustrojowego.Na początek należy uzyskać jednogatunkowe i wielogatunkowe biofilmy na 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych. W celu przerwania biofilmu dodać 8,81 mikrolitra osadu DNazy 1 bezpośrednio do studzienek zawierających biofilmy, uzyskując końcowe stężenie 50 mikrogramów na mililitr. Inkubować płytkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 75 obrotów na minutę.Otrzymać podstawowy roztwór meropenemu antybiotyku w stężeniu 2,56 miligrama na mililitr. Wykonuj seryjne rozcieńczenia dwukrotnie, aby uzyskać zakres stężeń od 0,01 miligrama na mililitr do 2,56 miligrama na mililitr. Teraz dodaj 20 mikrolitrów każdego rozcieńczenia miropenemu do biofilmów, uzyskując zakres dawkowania od 1 mikrograma na mililitr do 256 mikrogramów na mililitr.Uszczelnij 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania przezroczystą folią i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny, potrząsając nią z prędkością 75 obrotów na minutę. Biofilmy jednogatunkowe Pseudomonas nie wykazały znaczącego spadku liczby żywotnych komórek po potraktowaniu meropenemem w dowolnej dawce do 256 mikrogramów na mililitr. Odzysk Pseudomonas aeruginosa był o 0,74 log 10 jednostek tworzących kolonie na mililitr wyższy w warunkach jednogatunkowych niż w środowiskach wielodrobnoustrojowych bez antybiotyków.Na początek przygotuj jednogatunkowe i wielogatunkowe biofilmy do ekstrakcji RNA. Po inkubacji przenieść biofilmy z każdej studzienki do mikrolitrowej probówki wirówkowej o pojemności jednego mililitra, łącząc repliki biofilmu dla każdej próbki. Odwirować probówkę o stężeniu 16 000 G przez pięć minut.Jeśli ekstrakcja RNA zostanie przeprowadzona później, usuń supernatant i przechowuj osad w 250 mikrolitrach roztworu stabilizującego RNA w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Później rozmrozić probówkę z granulkami w temperaturze pokojowej i odwirować przy 16 000 G przez pięć minut. Ponownie zawiesić osad w 600 mikrolitrach odczynnika TRIzol i ręcznie go rozbić za pomocą igły 0,2 milimetra przymocowanej do dwumililitrowej strzykawki, zasysając od 5 do 10 razy lub do całkowitego rozpadu pastylki.Postępuj zgodnie z wytycznymi producenta, aby oczyścić RNA z rozerwanych biofilmów. Aby określić ilościowo oczyszczony RNA, należy przygotować roztwór roboczy ze 199 mikrolitrami buforu i jednym mikrolitrem odczynnika na każdą próbkę. Wymieszaj 190 mikrolitrów roztworu roboczego i 10 mikrolitrów standardowego jednego i standardowego dwóch do oddzielnych probówek.Następnie do pojedynczych probówek dodać 199 mikrolitrów roztworu roboczego i 1 mikrolitr próbki RNA. Wiruj przez 30 sekund i przechowuj w ciemnym miejscu przez pięć minut. Następnie na fluorymetrze wybierz RNA, a następnie RNA o szerokim zakresie i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.Po wykonaniu ślepej próby odczytu nanieć pipetą jeden mikrolitr RNA na uchwyt próbki spektrofotometru i zmierzyć absorbancję przy 260 na 280 nanometrów. W celu komplementarnej syntezy DNA należy przygotować mieszaninę reakcyjną w probówkach. Umieść probówki w termocyklerze i uruchom program.CDNA należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Ekspresja algD w jednogatunkowych biofilmach Pseudomonas aeruginosa nie różniła się istotnie w zależności od stężeń meropenemu. W biofilmach wielomikrobiologicznych ekspresja algD była znacznie wyższa i wynosiła 256 mikrogramów na mililitr, co wskazuje na zwiększoną produkcję alginianów w obecności organizmów współkolonizujących.

cystic-fibrosis-aggregate-biofilm-model-to-study-infection-relevant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Beaudoin, T. i inni. Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu osłonowego. J. Vis. Exp. (2016)Ten film prezentuje metodę in vitro do oceny, jak plwocina mukowiscydozy pochodząca od pacjentów wpływa na tworzenie biofilmu bakteryjnego. Za pomocą szkiełek komorowych, barwienia fluorescencyjnego oraz mikroskopii konfokalnej ujawnia się zwiększona grubość, zmieniona architektura oraz wyższa żywotna biomasa w biofilmach hodowanych ze plwociną, podkreślając...

Konfokalne obrazowanie biofilmów bakteryjnych indukowanych przez filtry plwociny u pacjentów z mukowiscydozą

Ten protokół opisuje wizualizację rozwoju biofilmu po ekspozycji na czynniki gospodarza za pomocą modelu komory szkiełkowej. Model ten pozwala na bezpośrednią wizualizację rozwoju biofilmu, a także analizę parametrów biofilmu za pomocą programów komputerowych.

Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu szkła nakrywkowego

Drogi oddechowe pacjentów z mukowiscydozą (CF) są idealnym środowiskiem dla rozwoju patogenów mikrobiologicznych. W manuskrypcie opisano nowatorską metodę badania mikrobiomu płuc mukowiscydozy w środowisku, które naśladuje miejsce, w którym powodują one chorobę i w jaki sposób zmiany warunków chemicznych mogą wpływać na dynamikę drobnoustrojów.

Model WinCF - niedrogi i łatwy w obsłudze mikrokosmos oskrzelika zatkanego śluzem do badania mikrobiologii infekcji płuc

Ten przepływ pracy może być wykorzystany do przeprowadzenia testów wrażliwości na antybiotyki przy użyciu ustalonego modelu ex vivo biofilmu bakteryjnego w płucach osób z mukowiscydozą. Zastosowanie tego modelu może zwiększyć ważność kliniczną testów MBEC (minimalne stężenie eradykacji biofilmu).

Badanie skuteczności antybiotyków w modelu ex vivo biofilmów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus w płucach mukowiscydozy

Ten protokół opisuje czterogatunkowy model wielogatunkowego biofilmu polimikrobiologicznego dla płuc związanego z mukowiscydozą (CF), który może być wykorzystany do zbadania wpływu interakcji międzygatunkowych bakterii.

Hodowla biofilmu wielodrobnoustrojowego istotnego dla mukowiscydozy w celu zbadania fenotypów społeczności

Ta metodologia pozwala na stworzenie modelu wielomikrobiologicznego biofilmu w mukowiscydozie do testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w laboratoriach badawczych i klinicznych. Model ten zapewnia dokładne i wiarygodne wyniki w szerokim zakresie danych wyjściowych.

Opracowanie wielomikrobiologicznego modelu biofilmu kolonijnego do badania środków przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie

Niniejsza procedura opisuje sposób tworzenia pierwotnych kultur komórek krwiotwórczych z szpiku kostnego myszy, po których następuje transfekcja przy użyciu systemu elektroporacji Gene Pulser MXCell.

Przygotowanie pierwotnych kultur komórek hematopoetycznych z szpiku kostnego myszy do elektroporacji

Demonstracja izolacji rdzenia kręgowego noworodka myszy do badań elektrofizjologicznych.

Elektrofizjologia rdzenia kręgowego

Niniejsza procedura przedstawia sposób wykorzystania systemu do elektroporacji Gene Pulser MXcell w celu szybkiego i łatwego zidentyfikowania optymalnych warunków elektroporacji dla embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) lub innych komórek pierwotnych. W towarzyszącym filmie omówiono również kwestie związane z rozwiązywaniem problemów.

Wykorzystanie systemu elektroporacji Gene Pulser MXcell do wysokowydajnej transfekcji komórek pierwotnych

Niniejsza procedura opisuje szybki i prosty schemat postępowania w celu wprowadzenia siRNA do linii komórkowych trudnych do transfekcji oraz monitorowania ekspresji genów za pomocą real-time PCR. Zastosowanie automatycznego licznika komórek, wielodołkowej płyty do elektroporacji oraz automatycznej stacji elektroforezy pozwala na uzyskanie szybkich i wiarygodnych wyników bez konieczności stosowania kosztownych systemów robotycznych.

Wykorzystanie automatycznego licznika komórek w celu uproszczenia badań nad ekspresją genów: wyciszenie siRNA ekspresji genów zależnych od IL-4 w komórkach Namalwa

Poznaj model zagregowanego biofilmu do badania ekspresji genów w infekcjach płuc związanych z mukowiscydozą. Ta metoda pozwala analizować mechanizmy oporności bakteryjnej i testować terapie antywirulencyjne.

Model zagregowanego biofilmu mukowiscydozy do badania ekspresji genów istotnych dla infekcji

Przeglądaj więcej filmów