Generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów

Naprawa chrząstki w przewlekłej chorobie stawów wymaga zaawansowanych terapii komórkowych, aby skutecznie regenerować uszkodzone tkanki. Protokół ten zapewnia metodę krok po kroku różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w sferoidy oparte na chondrocytach, wspierając zastosowania inżynierii tkankowej i terapii komórkowej. Naprawa chrząstki w przewlekłej chorobie stawów wymaga zaawansowanych terapii komórkowych, aby wystarczająco zregenerować uszkodzoną tkankę.

Protokół ten zapewnia metodę krok po kroku różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w sferoidy oparte na chondrocytach, wspierając zastosowania inżynierii tkankowej i terapii komórkowej. Główne wyzwania to minimalizacja ekspresji kolagenu typu pierwszego w komórkach pochodzących z iPSC w celu zapobiegania chrząstce włóknistej, stworzenie warunków do tworzenia dojrzałej chrząstki highline, ulepszenie metod hodowli 3D w celu zapewnienia stabilności sferoidalnej oraz opracowanie skalowalnych podejść do wytwarzania klinicznych objętości materiału komórkowego. Protokół zapewnia przewagę dzięki wykorzystaniu iPSC jako alternatywnego źródła chondrocytów, co pozwala na skalowalną produkcję bez inwazyjnych procedur.

Zapewnia lepsze utrzymanie fenotypu chondrocytów poprzez hodowlę 3D i naśladuje naturalny rozwój chrząstki, w wyniku czego powstają komórki bardzo przypominające natywne chondrocyty z wysoką ekspresją markerów specyficznych dla chrząstki. Opracowanie skutecznych metod zwiększania dojrzałości i funkcjonalności chondrocytów pochodzących z iPSC, zapewnienie długoterminowej stabilności in vivo, tworzenie zwłóknionych trójwymiarowych materiałów hodowlanych oraz opracowanie skalowalnej produkcji materiału komórkowego do zastosowań klinicznych. Na początek wysterylizuj nożyczki w autoklawie ustawionym na 121 stopni Celsjusza przy 15 funtach na cal kwadratowy przez 30 minut.

Po wyschnięciu nożyczek pokrój probówki wirówkowe w pierścienie o wysokości od siedmiu do ośmiu milimetrów. Teraz rozdrobnij szalki Petriego o niskiej przyczepności, niepoddane obróbce lub mikrobiologiczne na małe kawałki za pomocą odpowiedniego narzędzia do kruszenia. Rozpuść około jednego grama cząstek plastiku w 10 mililitrach chloroformu przez noc w dygestorium.

Sprawdź lepkość płynnego roztworu tworzywa sztucznego, aby upewnić się, że nadaje się do pipetowania. Jeśli roztwór jest zbyt rzadki, dodaj od jednego do trzech gramów dodatkowych cząstek plastiku. Jeśli stanie się zbyt gęsty, rozcieńczyć go około pięcioma mililitrami chloroformu.

Umieść plastikowy pierścień autoklawu na środku 60-milimetrowej szalki Petriego. Następnie nałóż płynny plastik do wnętrza pierścienia, aby utworzyć plastikową gałkę. Pozostaw naczynia do wyschnięcia bez przykrycia w okapie z przepływem laminarnym przez dwie do trzech godzin.

Po wysuszeniu wystawiaj naczynia na działanie promieniowania ultrafioletowego przez 20 do 30 minut. Na początek zdobądź zmodyfikowane szalki Petriego zawierające plastikowe gałki. Dwa dni po pobraniu chrząstki umyj kawałki chrząstki w roztworze Hanka za pomocą 60-milimetrowych szalek Petriego.

Następnie pokrój chrząstkę na fragmenty o średnicy około jednego do dwóch milimetrów za pomocą nożyczek do autoklawu. Przenieś kawałki chrząstki do 15-mililitrowej probówki i traw je w 0,01% roztworze kolagenazy typu dwa w DMEM przez osiem do 12 godzin w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną. Po roztrawieniu dodać fragmenty chrząstki za pomocą DMEM i odwirować probówkę o stężeniu 300 G przez 10 minut.

Po odrzuceniu roztworu do płukania, ponownie zawiesić fragmenty w pożywce do hodowli chondrocytów i wysiać je na lepką kolbę T25 wstępnie pokrytą 0,1% roztworem żelatyny i inkubować. Następnie hoduj indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste na sześciodołkowych płytkach wstępnie pokrytych matrycą zawierającą białka zewnątrzkomórkowe. Aby zainicjować różnicowanie w kierunku linii chondrocytarnej, należy hodować iPSC w pożywce A przez pierwsze dwa dni.

Trzeciego dnia zastąp pożywkę A roztworem, który wyklucza CHIR-99021 i inhibitor kinazy rho, pozostawiając wszystkie inne składniki bez zmian. W dniu 10 przenieś komórki podobne do chondrocytów do pożywki B sformułowanej w celu ułatwienia chondrogenezy, a następnie rozpuść 1,5% argarozy w kuchence mikrofalowej przez około 60 do 90 sekund przy mocy 700 watów. Po upłynnieniu dodaj 75 mikrolitrów agarozy do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli zawiesiny komórek i pozwól jej stwardnieć w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów DMEM do każdej studzienki i inkubuj płytkę w inkubatorze dwutlenku węgla przez co najmniej 12 godzin. W dniu 12 obserwuj zmiany fenotypowe związane z androgenezą, aby przejść do inicjacji sferoidalnej. Odłącz komórki przy 80% zbiegu od płytki za pomocą 0,05% roztworu trypsyny.

Po dodaniu równych objętości DMEM z 10% FBS, przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 200 G przez pięć minut. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki B i przenieść je do kolby do hodowli komórek o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych wstępnie pokrytej 0,1% roztworem żelatyny. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji jako monowarstwę, odłącz je ponownie za pomocą trypsyny i ponownie umieść w pożywce B. Teraz dozuj komórki do 96-dołkowej płytki pokrytej 1,5% agarozą o gęstości 100 000 komórek na dołek, wraz ze 150 mikrolitrami pożywki B. Inkubuj komórki przez co najmniej jeden dzień i maksymalnie trzy dni, aż utworzą się sferoidy.

Następnie przenieś sferoidy z dołków za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety z przyciętym końcem do 15-mililitrowej probówki. Pozwól sferoidom osiąść na dwie do trzech minut i usuń supernatant. Teraz zanurz sferoidy w świeżo rozmrożonym, nierozcieńczonym roztworze matrycy membrany podstawnej, hartowanym w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po 30 minutach odwirować probówkę o stężeniu 100 G przez jedną minutę, aby zebrać sferoidy. Na koniec przenieś sferoidy do przygotowanych mini bioreaktorów i dodaj sześć mililitrów pożywki B. Umieść mini bioreaktor w inkubatorze dwutlenku węgla. Po 19 dniach różnicowania 99% komórek wykazywało ekspresję markerów chondrogennych: aggrekanu, kolagenu typu pierwszego, kolagenu typu drugiego i SOX9.

Wysokiej jakości chondrosfery zidentyfikowano jako te, w których ekspresja markerów genów chondrocytarnych wynosi co najmniej 90 do 95%, oceniana za pomocą analizy ekspresji genów w 30. dniu różnicowania. Dojrzałe sferoidy wykazywały spójną morfogenezę, osiągając typową średnicę od jednego do dwóch milimetrów po dwóch miesiącach, przy czym większe sferoidy wykazywały centralne strefy z ubytkami lub martwicą.