Name: Generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę generowania sferoid chondrocytowych z iPSC w warunkach niskiej przyczepności przy użyciu mini-bioreaktorów. Ta technika wspiera inżynierię tkankową i terapie komórkowe w leczeniu chorób stawów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania zostały wsparte alokacją #22-15-00250 przez Rosyjską Fundację Naukową.

​Badanie zostało przeanalizowane i zatwierdzone przez Komisję Etyczną LOPUKHIN FRCC PCM (protokół nr 2019/02 z dnia 9 kwietnia 2019 r.). Wszystkie próbki od dawców pobrano zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Od wszystkich uczestników i/lub ich opiekunów prawnych uzyskano świadomą zgodę.
UWAGA: Przez cały czas trwania protokołu należy zachować technikę sterylną. Wszystkie pożywki i roztwory należy podgrzać do 37 °C przed podaniem ich komórkom lub sferoidom. Komórki należy hodować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 80% wilgotności. Schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1.
<img alt="Schemat hodowli iPSC w celu tworzenia komórek chondrocytopodobnych; metoda różnicowania komórek macierzystych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67481/67481fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Protokół wytwarzania chondrosfer z linii iPSC IPSRG4S. (A) Początkowo iPSC są hodowane w pośrodku dla pluripotencjalnych komórek macierzystych do momentu osiągnięcia 80% konfluencji. (B) Aby indukować różnicowanie w kierunku linii chondrocytycznej, iPSC są następnie hodowane w pośrodku A przez 2 dni. Następnie pośrodki zastępuje się formulacją pozbawioną Chir 99021 oraz inhibitora kinazy Rho, a komórki hoduje się przez kolejne 6 dni, zmieniając pośrodki co 2 dni. (C) Następnie komórki przenosi się do pośrodka B, aby promować chondrogenezę przez kolejne 10 dni. (D) Po osiągnięciu odpowiedniej liczby komórek proces przechodzi do etapu produkcji sferoidów. (E) Komórki są agregowane w sferoidy w warunkach niskiej adhezji pod wpływem grawitacji. (F) Powstałe sferoidy są hodowane w mini-bioreaktorach z pośrodkiem B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67481/67481fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
1. Przekształcenie szalek Petriego w minibioreaktory
UWAGA: Szczegóły znajdują się w poprzednim artykule5.
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnych nożyczek do autoklawowania potnij probówki wirówkowe na pierścienie o wysokości 7-8 mm (parametry autoklawowania: 121 °C (250 °F), 15 psi, 30 min, a następnie suszenie po autoklawowaniu przez 20 min).</li>
	<li>Rozdrobnij naczynia Petri o niskiej adhezji, nieobrobione lub mikrobiologiczne na małe kawałki. Rozpuść około 1 g cząsteczek plastiku w 10 mL chloroformu przez noc, aby przygotować ciekły roztwór plastiku. Procedurę tę należy przeprowadzić w dygestorium.</li>
	<li>Sprawdź, czy ciekły plastik jest wystarczająco lepki do pipetowania. Upewnij się, że krople zachowują kształt sferyczny, a nie rozprzestrzeniają się po powierzchni. Jeśli roztwór jest zbyt rzadki, dodaj więcej cząsteczek plastiku (zazwyczaj wymagane jest 1-3 g). Jeśli jest zbyt gęsty, dodaj dodatkowy chloroform (zazwyczaj do 5 mL).</li>
	<li>Uformuj plastikowy wypustek w centrum sterylnego naczynia Petri o średnicy 60 mm i ultra-niskiej adhezji, korzystając z jednej z dwóch opisanych poniżej skutecznych metod.
	<ol>
		<li>Opcja 1: Umieść autoklawowany plastikowy pierścień w centrum naczynia Petri, a następnie nanieś do wnętrza pierścienia ciekły plastik; jedna kropla będzie wymagała około 100-200 µL ciekłego plastiku.</li>
		<li>Opcja 2: Nanieś taką samą liczbę kropli ciekłego plastiku bezpośrednio do centrum naczynia Petri, nie używając plastikowego pierścienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostaw naczynia do wyschnięcia bez przykrycia przez 2-3 h w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Po wysuszeniu naświetlaj naczynia promieniowaniem ultrafioletowym przez 20-30 min.</li>
</ol>
2. Powlekanie szalek hodowlanych żelatyną
<ol>
	<li>Przygotować 0,1% roztwór żelatyny, rozpuszczając żelatynę w proszku w wodzie destylowanej w temperaturze 95 °C. Przeprowadzić roztwór kolejno przez filtry membranowe 0,45 µm i 0,25 µm, a następnie przechowywać filtrat w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Bezpośrednio przed ponownym wysianiem chondrocytów, nanieść 3 mL roztworu żelatyny do kolby 25 cm2 (zaleca się użycie do 15 g tkanki chrzestnej na jedną kolbę T25). Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 min, usunąć żelatynę, przemyć dwukrotnie PBS i przystąpić do wysiewania komórek.</li>
</ol>
3. Izolacja i hodowla chondrocytów
UWAGA: Chondrocyty są izolowane z obszarów chrząstki niepodlegającej obciążeniom u pacjentów poddawanych całkowitej endoprotezoplastyce stawu kolanowego. Wszystkie próbki należy pobrać w warunkach sterylnych i przechowywać w sterylnych probówkach wypełnionych DMEM zawierającym 200 U/mL roztworu penicyliny/streptomycyny. Tkankę chrzęstną należy przechowywać w lodówce w temperaturze 2-8 °C.
<ol>
	<li>Obróbkę enzymatyczną należy rozpocząć w ciągu 2 dni od pobrania chrząstki. Kawałki chrząstki należy przemyć w roztworze Hanksa w szalkach Petriego o średnicy 60 mm, a następnie pociąć na fragmenty o średnicy około 1-2 mm za pomocą autoklawowanych nożyczek.</li>
	<li>Kawałki chrząstki należy przenieść do probówek o pojemności 15 mL i poddać trawieniu w 0,01% roztworze kolagenazy typu II w DMEM (około 1 mL na 1 g chrząstki) przez 8-12 h w inkubatorze CO2 ustawionym na 37 °C z 5% CO2 i 100% wilgotnością, przy ciągłym mieszaniu na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150-200 rpm.</li>
	<li>Po trawieniu fragmenty chrząstki należy przemyć, dodając DMEM do probówki 15 mL, a następnie odwirować przy 300 × g przez 10 min. Fragmenty należy resuspendować w pożywce do hodowli chondrocytów (Supplementary Table 1) i wysiać do przylegającej kolby T25 uprzednio pokrytej 0,1% roztworem żelatyny.</li>
	<li>Pasażowanie chondrocytów należy przeprowadzić po osiągnięciu 80% konfluencji.
	<ol>
		<li>W celu pasażowania chondrocyty należy przemyć roztworem Hanksa, a następnie inkubować komórki z 0,25% roztworem trypsyny w 37 °C przez 5 min.</li>
		<li>Aby dezaktywować trypsynę, należy dodać równą objętość DMEM + 10% FBS. Chondrocyty należy resuspendować w świeżej pożywce hodowlanej, a następnie rozdzielić w stosunku 1:3, wysiewając 20 000-30 000 komórek na 1 cm2.</li>
		<li>Kolbę z hodowlą należy umieścić w inkubatorze w 37 °C z 5% CO2 i 100% wilgotnością.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Hodowla pluripotencjalnych komórek macierzystych
UWAGA: We współpracy z Laboratorium Komórek Macierzystych Grupy Badań nad Cząsteczkową Budową Mózgu, Katedry Neurobiologii, Instytutu A.I. Virtanena, Uniwersytetu Finlandii Wschodniej w Kuopio w Finlandii, w poprzednim badaniu8 pomyślnie wygenerowano linię iPSCs IPSRG4S.
<ol>
	<li>Hodować iPSC w płytkach 6-dołkowych uprzednio pokrytych matrycą zawierającą białka zewnątrzkomórkowe (Rysunek 1A). Stosować pożywkę dla pluripotencjalnych komórek macierzystych (Tabela uzupełniająca 1).</li>
	<li>Przesiewać komórki przy 80% konfluencji, zachowując stosunek 1:4 (50 000-75 000 komórek na 1 cm2). Około 2-3 h przed odszczepieniem przenieść iPSC do pożywki dla pluripotencjalnych komórek macierzystych zawierającej inhibitor kinazy Rho Y27632 w stężeniu końcowym 1 µM na 1 dzień.</li>
	<li>Przemyć iPSC roztworem Hanksa i inkubować w 37 °C z 0,05% roztworem trypsyny. Aby dezaktywować trypsynę, dodać równą objętość DMEM + 10% FBS. Odwirować zawiesinę komórkową przy 200 x g przez 5 min w probówkach 15 mL.</li>
	<li>Odlać nadsącz i resuspendować komórki w świeżej pożywce dla pluripotencjalnych komórek macierzystych. Aby zwiększyć żywotność komórek, dodać do pożywki inhibitor kinazy Rho Y27632 w stężeniu końcowym 1 µM na 1 dzień. Umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze CO2 ustawionym na 37 °C z 5% CO2 i 100% wilgotnością.</li>
</ol>
5. Różnicowanie chondrogeniczne iPSC
<ol>
	<li>Rozpocząć różnicowanie w kierunku linii chondrocytów poprzez hodowlę komórek w Medium A (Supplementary Table 1) przez pierwsze 2 dni. W dniu 3. zastąpić Medium A roztworem bez zawartości Chir 99021 i inhibitora Rho kinazy, pozostawiając wszystkie pozostałe składniki bez zmian. Wymieniać medium co 2 dni od dnia 3. do dnia 9. (Figure 1B).</li>
	<li>W dniu 10. przenieść komórki chondrocytopodobne do Medium B (Supplementary Table 1), sformułowanego w celu usprawnienia chondrogenezy. Wymieniać medium co 2 dni przez 10 dni (Figure 1C).</li>
	<li>Przygotować wcześniej 96-dołkową płytkę do hodowli zawiesiny komórek, pokrywając każdy dołek 1,5% agarozą w wodzie destylowanej. Roztopić agarozę w kuchence mikrofalowej do momentu wrzenia (około 60-90 s przy 700 W). Po upłynnieniu agarozy dodać 75 µL agarozy do każdego dołka i pozostawić do stwardnienia w RT (około 15 min).</li>
	<li>Dodać 150 µL medium DMEM do każdego dołka i inkubować płytkę w inkubatorze CO2 przez co najmniej 12 h. 
	UWAGA: Przygotowane płytki można przechowywać do 1 miesiąca w inkubatorze CO2 w 37 °C, pod warunkiem uzupełniania medium w każdym dołku w celu zrekompensowania odparowania.</li>
	<li>W dniu 12., po zaobserwowaniu zmian fenotypowych związanych z chondrogenezą, rozpocząć formowanie sferoidów z wykorzystaniem wygenerowanych komórek chondrocytopodobnych. 
	UWAGA: Na tym etapie zaleca się analizę ekspresji kluczowych markerów chondrocytarnych za pomocą immunocytochemii (ICC) i ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej (qPCR) z zastosowaniem metody 2-ΔΔCT9, aby potwierdzić pomyślne różnicowanie chondrogenne iPSC. Podczas pasażowania z płytki 6-dołkowej do kolby hodowlanej o powierzchni 75 cm2, niewielką część komórek można wysiać do płytki 48-dołkowej, dostosowując liczbę dołków do liczby analizowanych markerów. Przeprowadzić analizę ICC tych próbek w celu weryfikacji ekspresji genów.</li>
</ol>
6. Tworzenie sferoidów z komórek pochodnych iPSC o fenotypie chondrocytarnym
<ol>
	<li>Po uzyskaniu pochodnych przypominających chondrocyty, pasażuj komórki przy 80% konfluencji. Odklej komórki z płytek 6-dołkowych, używając 0,05% roztworu trypsyny. Aby inaktywować trypsynę, dodaj równą objętość DMEM + 10% FBS, a następnie przenieś komórki do probówki 15 mL i wiruj przy 200 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usuń nadosad, resuspenduj komórki w 1 mL Medium B i przenieś do kolby hodowlanej 75 cm2 uprzednio pokrytej 0,1% roztworem żelatyny (Rysunek 1D). Gdy komórki osiągną 80% konfluencji jako monowarstwa, ponownie odklej je za pomocą trypsyny i resuspenduj w Medium B w opisany sposób.</li>
	<li>Przenieś komórki na płytkę 96-dołkową pokrytą 1,5% agaroza z gęstością 100 000 komórek na dołek. Hoduj w Medium B, dodając 150 µL pełnej pożywki na dołek (Rysunek 1D, 3A).</li>
	<li>Utrzymuj komórki na płytce 96-dołkowej pokrytej 1,5% agarozą przez minimum 1 dzień i maksymalnie 3 dni, aż do czasu utworzenia sferoidów (Rysunek 2B). Przenieś sferoidy z dołków za pomocą końcówki pipety 1 mL z przyciętym końcem, a następnie przenieś je do probówki 15 mL. Pozostaw sferoidy do osadzenia na 2-3 min i usuń nadosad.</li>
	<li>Zanurz sferoidy w świeżo rozmrożonym, nierozcieńczonym roztworze matrycy błony podstawnej utrzymywanym w temperaturze 4 °C. Po 30 min zbierz sferoidy poprzez sedymentację pasywną w probówce 15 mL lub przez delikatne wirowanie przy 100 x g przez 1 min. 
	UWAGA: Matrycę należy rozmrażać przez noc na lodzie w lodówce o temperaturze 2-8 °C. Po pierwszym rozmrożeniu przygotowuje się jednorazowe alikwoty matrycy, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Należy używać probówek z polipropylenu lub innych probówek odpornych na zamrażanie i przechowywać je w temperaturze -70 °C lub -20 °C. Należy zwracać uwagę na datę ważności partii, która wynosi 2 lata od daty produkcji.</li>
	<li>Przenieś sferoidy do mini-bioreaktorów i dodaj 6 mL Medium B. Umieść mini-bioreaktor na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze CO2 ustawionym na 37 °C z 5% CO2, 100% wilgotnością i prędkością wytrząsania 70-75 rpm (Rysunek 1F).</li>
	<li>Wymieniaj pożywkę co tydzień lub w zależności od zużycia pożywki bądź zmiany barwy wskaźnika kwasowo-zasadowego. Aby to zrobić, pozwól sferoidom osadzić się grawitacyjnie w probówce 15 mL, a następnie ostrożnie usuń nadosad. Dodaj do probówki świeże Medium B i przenieś sferoidy z powrotem do mini-bioreaktorów.</li>
</ol>

<ol><li>Cieza, A., Causey, K., Kamenov, K., Hanson, S. W., Chatterji, S., Vos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+the+need+for+rehabilitation+based+on+the+Global+Burden+of+Disease+study+2019%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global estimates of the need for rehabilitation based on the Global Burden of Disease study 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> Lancet. 396, e10267(2021).</li>
<li>Hua, C., Buttgereit, F., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+in+rheumatoid+arthritis%3A+Current+status+and+future+studies%5BTitle%5D)+AND+%22RMD+Open%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids in rheumatoid arthritis: Current status and future studies.</a> RMD Open. 6 (1), e000536(2020).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Articular+cartilage+repair+biomaterials%3A+Strategies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Articular cartilage repair biomaterials: Strategies and applications.</a> Materials Today Bio. 24, e100948(2024).</li>
<li>Lee, N., Bayaraa, O., Zechu, Z., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials-assisted+spheroid+engineering+for+regenerative+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Biomaterials-assisted spheroid engineering for regenerative therapy.</a> BMB Rep. 54 (7), 356-367 (2021).</li>
<li>Eremeev, A., Pikina, A., Ruchko, E., Sidorov, V., Ragozin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+cartilage+tissue+substitutes+from+cells+with+induced+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Extrem+Situat%22%5BJournal%5D)">Fabrication of cartilage tissue substitutes from cells with induced pluripotency.</a> Med Extrem Situat. 4, 30-41 (2022).</li>
<li>Rodríguez Ruiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+from+human-induced+pluripotent+stem+cells%3A+comparison+with+neo-cartilage+from+chondrocytes+and+bone+marrow+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cartilage from human-induced pluripotent stem cells: comparison with neo-cartilage from chondrocytes and bone marrow mesenchymal stromal cells.</a> Cell Tissue Res. 386, 309-320 (2021).</li>
<li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoid+generation+from+induced+pluripotent+stem+cells+in+homemade+mini+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in homemade mini bioreactors.</a> J Vis Exp. 178, e62987(2021).</li>
<li>Holmqvist, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+library+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+Parkinsonian+patients%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Creation of a library of induced pluripotent stem cells from Parkinsonian patients.</a> NPJ Parkinsons Dis. 2, e16009(2016).</li>
<li>Livak, K., Schmittgen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25 (40), 402-408 (2001).</li>
<li>De Kinderen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+into+chondrocytes%3A+Methods+and+applications+for+disease+modeling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of induced pluripotent stem cells into chondrocytes: Methods and applications for disease modeling and drug discovery.</a> J Bone Miner Res. 37 (3), 397-410 (2022).</li>
<li>Ali, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSCs+chondrogenic+differentiation+for+personalized+regenerative+medicine%3A+a+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">iPSCs chondrogenic differentiation for personalized regenerative medicine: a literature review.</a> Stem Cell Res Ther. 15 (1), 185(2024).</li>
<li>Reina-Mahecha, A., Beers, M., van der Veen, H., Zuhorn, I., van Kooten, T., Sharma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+the+role+of+bioreactors+for+iPSCs-based+tissue-engineered+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">A Review of the role of bioreactors for iPSCs-based tissue-engineered articular cartilage.</a> Tissue Eng Regen Med. 20 (7), 1041-1052 (2023).</li>
<li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+bioreactors+for+cartilage+tissue+engineering%3A+Advances%2C+limitations%2C+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">The application of bioreactors for cartilage tissue engineering: Advances, limitations, and future perspectives.</a> Stem Cells Int. 2021, 6621806(2021).</li>
<li>Castro-Viñuelas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tips+and+tricks+for+successfully+culturing+and+adapting+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Tips and tricks for successfully culturing and adapting human induced pluripotent stem cells.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 23, 569-581 (2021).</li>
<li>Endo, K., Fujita, N., Nakagawa, T., Nishimura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fibroblast+growth+factor-2+and+serum+on+canine+mesenchymal+stem+cell+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effect of fibroblast growth factor-2 and serum on canine mesenchymal stem cell chondrogenesis.</a> Tissue Eng Part A. 25 (11-12), 901-910 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Komórki iPS stanowią przełomowe narzędzie w medycynie regeneracyjnej, oferujące potencjał do generowania specyficznych dla pacjenta chondrocytów do naprawy chrząstki. Obecne protokoły wykorzystują ukierunkowane różnicowanie poprzez szlaki mezodermalne, a kluczowe cząsteczki sygnałowe, takie jak TGF-β i BMP-2, promują zaangażowanie linii chondrocytarnej. Metody te mają na celu odtworzenie rozwoju chrząstki embrionalnej, umożliwiając produkcję składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen typu II i aggrekan, n...

Rozpowszechnienie chorób stawów prowadzi do znacznych obciążeń ekonomicznych ze względu na rosnącą liczbę niepełnosprawnych pacjentów i koszty związane z ich opieką. Chrząstka szklista to bezczynna tkanka łączna o ograniczonym potencjale regeneracyjnym1. Długotrwałe stosowanie niektórych niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ), glikokortykosteroidów oraz chemioterapii lub radioterapii może jeszcze bardziej zmniejszyć zdolność regeneracyjną chrząstki, prawie eliminując jej zdolność do gojenia2. To sprawia, że uzyskanie autologicznych komórek chrząstki do terapii komórkowej jest trudne.
Technologia trójwymiarowej (3D) hodowli komórek, w tym chondrocytów, od dawna jest uznawana za rozwijający się obszar badań o dużym potencjale. Te struktury 3D są badane pod kątem zastosowań zarówno w podstawowych badaniach biologicznych, jak i medycynie regeneracyjnej. Sferoidy pochodzące z autologicznych chondrocytów są obiecujące terapeutycznie w leczeniu zwyrodnienia tkanki chrzęstnej, schorzenia, które obecnie cieszy się dużym zainteresowaniem na całym świecie3.
sferoidy pochodzące z chondrocytów różniących się od iPSC stanowią obiecującą alternatywę dla pierwotnych chondrocytów, oferując znaczące korzyści dla naprawy chrząstki. iPSC zapewniają prawie nieograniczoną zdolność do samoodnawiania się i posiadają szeroki potencjał różnicowania, co pozwala na produkcję chondrocytów w ilościach wystarczających do zastosowań klinicznych bez inwazyjnych procedur pobierania komórek4. Co więcej, przejście z tradycyjnych dwuwymiarowych (2D) kultur chondrocytów do systemów hodowli 3D, takich jak chondrosfery, dodatkowo zwiększa żywotność i funkcjonalność tych komórek, tworząc bardziej fizjologicznie odpowiednie środowisko. Badania pokazują, że chondrocyty hodowane w sferoidach 3D lepiej utrzymują swój fenotyp, wykazując niższe wskaźniki odróżnicowania i wyższe poziomy ekspresji kluczowych markerów chrząstki szklistej II, takich jak kolagen typu II i agrekan5.
Pomimo potencjału chondrosfer pochodzących z iPSC, standardowe protokoły generowania wysokiej jakości chondrosfer pozostają ograniczone. Zmienność protokołów w różnych badaniach często prowadzi do niespójności w jakości chondrocytów i składzie macierzy zewnątrzkomórkowej, wpływając na ich skuteczność w zastosowaniu terapeutycznym6. W tym miejscu przedstawiono udoskonalony protokół, który standaryzuje wytwarzanie sferoid z chondrocytów pochodzących z iPSC przy użyciu niedrogich, niestandardowych mini-bioreaktorów. Faza hodowli w mini-bioreaktorze jest niezbędna, ponieważ zapewnia kontrolowane ustawienie o niskiej przyczepności, które optymalizuje dystrybucję składników odżywczych, dojrzewanie ECM i zagęszczenie sferoidalne7. Ta faza sprzyja silnej ekspresji niezbędnych markerów chondrocytów, w tym kolagenu typu II, agrekanu i SOX9, wraz z kompozycją ECM, która bardzo przypomina natywną chrząstkę. Regularna wymiana pożywek i staranna kontrola warunków środowiskowych - temperatury, CO2 i prędkości obrotowej - dodatkowo zapewniają żywotność i dojrzewanie sferoid chondrocytów. Protokół ten został zoptymalizowany w celu stworzenia wysokiej jakości chondrosfer z silną ekspresją markerów chrząstki szklistej w opłacalny i skalowalny sposób, odpowiedni do zastosowań badawczych i klinicznych w naprawie chrząstki.

<table><tbody><tr><td>0,05% roztwór trypsyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>0,25% roztwór trypsyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12 Podłoże Eagle's</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne Aggrecan</td><td>Invitrogen</td><td>AHP0022</td><td>Gospodarz: Mysz; Rozcieńczenie: 1/500</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td>50 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>B-27 suplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>1x lub 2%</td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol</td><td>Serva</td><td>28625</td><td>90 mM</td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-110-922</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-103-926</td><td>10 &mu; M</td></tr><tr><td>COL1A1 (E6A8E) Przeciwciało monoklonalne</td><td>CellSignalling</td><td>39952</td><td>Gospodarz: Królik; Rozcieńczenie: 1/800</td></tr><tr><td>COL2A1 (M2139) Przeciwciało monoklonalne</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-52658</td><td>Gospodarz: Mysz; Rozcieńczenie: 1/50</td></tr><tr><td>Roztwór kolagenazy typu II&nbsp;</td><td>PanEco</td><td>P011-2</td><td>0,01%</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td>1 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>pożywki DMEM bez glutaminy</td><td>PanEco</td><td>?420?</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>10%</td></tr> <tr><td>roztwór Hanksa&nbsp;</td><td>PanEco</td><td>?020?</td><td></td></tr><tr><td>Hybris 8 medium</td><td>PanEco</td><td>?780?/?780</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór insuliny-transferyny-selenu</td><td>PanEco</td><td>?065</td><td>1x roztwór ma następujące stężenia: Insulina: 10 &mikro; g/ml; Transferyna: 5,5 i mikro; g/ml; Selen 5 ng/ml</td></tr><tr><td>L-alanylo-L-glutamina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>BD</td><td>354277</td><td>300 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>roztworu penicyliny-streptomycyny</td><td>PanEco</td><td>?063?</td><td>100 j./ml</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-117-339</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Inhibitor kinazy Rho Y27632</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-103-922&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe Kozioł anty-mysie IgG (H+L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A21422</td><td>Gospodarz: Koza; Rozcieńczenie: 1/500</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe Kozioł anty-królicze IgG (H+L) Wysoce adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>?32732</td><td>Gospodarz: Koza; Rozcieńczenie: 1/500</td></tr><tr><td>Sox9 (D8G8H) Przeciwciało monoklonalne</td><td>CellSignalling</td><td>82630</td><td>Gospodarz: Rb; Rozcieńczenie: 1/400</td></tr><tr><td>TeSR-1 medium</td><td>STEMCELL technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-095-067</td><td>10 ng/ml</td></tr></tbody></table>

generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

Naprawa chrząstki w przewlekłych chorobach stawów wymaga zaawansowanych terapii komórkowych, aby skutecznie zregenerować uszkodzone tkanki. Protokół ten zapewnia krok po kroku metodę różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w sferoidy oparte na chondrocytach, wspierając zastosowania inżynierii tkankowej i terapii komórkowej. Proces różnicowania jest starannie zorganizowany, aby promować zaangażowanie linii chondrogennej, zaczynając od iPSC hodowanych w określonych pożywkach, które sekwencyjnie prowadzą komórki przez krytyczne etapy różnicowania. Początkowo iPSC są ekspandowane w celu osiągnięcia optymalnej konfluencji przed indukcją w kierunku linii chondrogennej przy użyciu serii zdefiniowanych zmian pożywki. Do 10 dnia komórki są przenoszone do pożywki promującej chondrogenezę, która zwiększa tworzenie komórek podobnych do chondrocytów, wyrażających kluczowe markery dojrzałych chondrocytów. Dalsza agregacja w 96-dołkowych płytkach pokrytych agarozą prowadzi do powstania trójwymiarowych sferoid, które są następnie hodowane w niestandardowych mini-bioreaktorach zaprojektowanych do symulacji mikrośrodowiska, które sprzyja odkładaniu się macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Umożliwiając skalowalną produkcję sferoid chondrocytów, które naśladują natywne cechy chrząstki, podejście to oferuje obiecujące, powtarzalne rozwiązanie do opracowywania komórkowych metod leczenia wad chrząstki, zapewniając szerokie zastosowanie w zastosowaniach klinicznych i badawczych w medycynie regeneracyjnej układu mięśniowo-szkieletowego.

Opisany protokół został przedstawiony na Rysunku 1. Metodologia ta wykorzystuje dwa odrębne media hodowlane w celu indukowania różnicowania iPSC w sferoidy chondrocytów przez okres co najmniej 1 miesiąca (Rysunek 2). Proces różnicowania rozpoczyna się, gdy iPSC osiągną 75%-90% konfluencji (Rysunek 1B). Wczesne oznaki różnicowania chondrogennego pojawiają się około 9-10 dnia hodowli w medium A, co obj...

To badanie opisuje metodę wytwarzania sferoid chondrocytarnych poprzez agregację komórek w sferoidy w warunkach niskiej adhezji przy użyciu grawitacji, a następnie hodowlę powstałych sferoid w mini-bioreaktorach.

Generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów

Cartilage repair in chronic joint diseases demands advanced cell-based therapies to regenerate damaged tissues effectively. This protocol provides a ...

Naprawa chrząstki w przewlekłej chorobie stawów wymaga zaawansowanych terapii komórkowych, aby skutecznie regenerować uszkodzone tkanki. Protokół ten zapewnia metodę krok po kroku różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w sferoidy oparte na chondrocytach, wspierając zastosowania inżynierii tkankowej i terapii komórkowej. Naprawa chrząstki w przewlekłej chorobie stawów wymaga zaawansowanych terapii komórkowych, aby wystarczająco zregenerować uszkodzoną tkankę.Protokół ten zapewnia metodę krok po kroku różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w sferoidy oparte na chondrocytach, wspierając zastosowania inżynierii tkankowej i terapii komórkowej. Główne wyzwania to minimalizacja ekspresji kolagenu typu pierwszego w komórkach pochodzących z iPSC w celu zapobiegania chrząstce włóknistej, stworzenie warunków do tworzenia dojrzałej chrząstki highline, ulepszenie metod hodowli 3D w celu zapewnienia stabilności sferoidalnej oraz opracowanie skalowalnych podejść do wytwarzania klinicznych objętości materiału komórkowego. Protokół zapewnia przewagę dzięki wykorzystaniu iPSC jako alternatywnego źródła chondrocytów, co pozwala na skalowalną produkcję bez inwazyjnych procedur.Zapewnia lepsze utrzymanie fenotypu chondrocytów poprzez hodowlę 3D i naśladuje naturalny rozwój chrząstki, w wyniku czego powstają komórki bardzo przypominające natywne chondrocyty z wysoką ekspresją markerów specyficznych dla chrząstki. Opracowanie skutecznych metod zwiększania dojrzałości i funkcjonalności chondrocytów pochodzących z iPSC, zapewnienie długoterminowej stabilności in vivo, tworzenie zwłóknionych trójwymiarowych materiałów hodowlanych oraz opracowanie skalowalnej produkcji materiału komórkowego do zastosowań klinicznych. Na początek wysterylizuj nożyczki w autoklawie ustawionym na 121 stopni Celsjusza przy 15 funtach na cal kwadratowy przez 30 minut.Po wyschnięciu nożyczek pokrój probówki wirówkowe w pierścienie o wysokości od siedmiu do ośmiu milimetrów. Teraz rozdrobnij szalki Petriego o niskiej przyczepności, niepoddane obróbce lub mikrobiologiczne na małe kawałki za pomocą odpowiedniego narzędzia do kruszenia. Rozpuść około jednego grama cząstek plastiku w 10 mililitrach chloroformu przez noc w dygestorium.Sprawdź lepkość płynnego roztworu tworzywa sztucznego, aby upewnić się, że nadaje się do pipetowania. Jeśli roztwór jest zbyt rzadki, dodaj od jednego do trzech gramów dodatkowych cząstek plastiku. Jeśli stanie się zbyt gęsty, rozcieńczyć go około pięcioma mililitrami chloroformu.Umieść plastikowy pierścień autoklawu na środku 60-milimetrowej szalki Petriego. Następnie nałóż płynny plastik do wnętrza pierścienia, aby utworzyć plastikową gałkę. Pozostaw naczynia do wyschnięcia bez przykrycia w okapie z przepływem laminarnym przez dwie do trzech godzin.Po wysuszeniu wystawiaj naczynia na działanie promieniowania ultrafioletowego przez 20 do 30 minut. Na początek zdobądź zmodyfikowane szalki Petriego zawierające plastikowe gałki. Dwa dni po pobraniu chrząstki umyj kawałki chrząstki w roztworze Hanka za pomocą 60-milimetrowych szalek Petriego.Następnie pokrój chrząstkę na fragmenty o średnicy około jednego do dwóch milimetrów za pomocą nożyczek do autoklawu. Przenieś kawałki chrząstki do 15-mililitrowej probówki i traw je w 0,01% roztworze kolagenazy typu dwa w DMEM przez osiem do 12 godzin w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną. Po roztrawieniu dodać fragmenty chrząstki za pomocą DMEM i odwirować probówkę o stężeniu 300 G przez 10 minut.Po odrzuceniu roztworu do płukania, ponownie zawiesić fragmenty w pożywce do hodowli chondrocytów i wysiać je na lepką kolbę T25 wstępnie pokrytą 0,1% roztworem żelatyny i inkubować. Następnie hoduj indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste na sześciodołkowych płytkach wstępnie pokrytych matrycą zawierającą białka zewnątrzkomórkowe. Aby zainicjować różnicowanie w kierunku linii chondrocytarnej, należy hodować iPSC w pożywce A przez pierwsze dwa dni.Trzeciego dnia zastąp pożywkę A roztworem, który wyklucza CHIR-99021 i inhibitor kinazy rho, pozostawiając wszystkie inne składniki bez zmian. W dniu 10 przenieś komórki podobne do chondrocytów do pożywki B sformułowanej w celu ułatwienia chondrogenezy, a następnie rozpuść 1,5% argarozy w kuchence mikrofalowej przez około 60 do 90 sekund przy mocy 700 watów. Po upłynnieniu dodaj 75 mikrolitrów agarozy do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli zawiesiny komórek i pozwól jej stwardnieć w temperaturze pokojowej.Następnie dodaj 150 mikrolitrów DMEM do każdej studzienki i inkubuj płytkę w inkubatorze dwutlenku węgla przez co najmniej 12 godzin. W dniu 12 obserwuj zmiany fenotypowe związane z androgenezą, aby przejść do inicjacji sferoidalnej. Odłącz komórki przy 80% zbiegu od płytki za pomocą 0,05% roztworu trypsyny.Po dodaniu równych objętości DMEM z 10% FBS, przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 200 G przez pięć minut. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki B i przenieść je do kolby do hodowli komórek o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych wstępnie pokrytej 0,1% roztworem żelatyny. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji jako monowarstwę, odłącz je ponownie za pomocą trypsyny i ponownie umieść w pożywce B. Teraz dozuj komórki do 96-dołkowej płytki pokrytej 1,5% agarozą o gęstości 100 000 komórek na dołek, wraz ze 150 mikrolitrami pożywki B. Inkubuj komórki przez co najmniej jeden dzień i maksymalnie trzy dni, aż utworzą się sferoidy.Następnie przenieś sferoidy z dołków za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety z przyciętym końcem do 15-mililitrowej probówki. Pozwól sferoidom osiąść na dwie do trzech minut i usuń supernatant. Teraz zanurz sferoidy w świeżo rozmrożonym, nierozcieńczonym roztworze matrycy membrany podstawnej, hartowanym w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po 30 minutach odwirować probówkę o stężeniu 100 G przez jedną minutę, aby zebrać sferoidy. Na koniec przenieś sferoidy do przygotowanych mini bioreaktorów i dodaj sześć mililitrów pożywki B. Umieść mini bioreaktor w inkubatorze dwutlenku węgla. Po 19 dniach różnicowania 99% komórek wykazywało ekspresję markerów chondrogennych: aggrekanu, kolagenu typu pierwszego, kolagenu typu drugiego i SOX9.Wysokiej jakości chondrosfery zidentyfikowano jako te, w których ekspresja markerów genów chondrocytarnych wynosi co najmniej 90 do 95%, oceniana za pomocą analizy ekspresji genów w 30. dniu różnicowania. Dojrzałe sferoidy wykazywały spójną morfogenezę, osiągając typową średnicę od jednego do dwóch milimetrów po dwóch miesiącach, przy czym większe sferoidy wykazywały centralne strefy z ubytkami lub martwicą.

generating-spheroids-from-various-chondrocytes-using-low-adhesive

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano trójwymiarowy system hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w wysokim stężeniu płynu stawowego. Płyn stawowy odzwierciedla najbardziej naturalne mikrośrodowisko dla chrząstki stawowej, a jego pozyskanie i przechowywanie są łatwe. System ten może zatem być wykorzystywany do badania regeneracji chrząstki oraz do przesiewu terapeutyków stosowanych w leczeniu zapalenia stawów.

System 3D do hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie stawowym

Biosynteza chrzęstnej macierzy pozakomórkowej przez chondrocyty może ulegać zmianom pod wpływem bodźców mechanicznych. Niniejsza metoda opisuje technikę aplikowania dynamicznych odkształceń ściskających do chondrocytów zamkniętych w konstrukcjach 3D oraz ocenę indukowanych zmian w metabolizmie chondrocytów.

Mechaniczna stymulacja hydrożeli z chondrocytów i agarozy

Naprawa chrząstki stanowi niespełnione wyzwanie medyczne, a oparte na komórkach podejścia do inżynierii ludzkiej chrząstki stawowej są obiecującym rozwiązaniem. W tym miejscu opisujemy trójwymiarowe (3D) hydrożele biomimetyczne jako idealne narzędzie do ekspansji i dojrzewania chondrocytów stawowych człowieka.

Rusztowania hydrożelowe 3D do hodowli chondrocytów stawowych i wytwarzania chrząstek

Stres mechaniczny może indukować chondrogenne różnicowanie komórek macierzystych, dostarczając potencjalnego podejścia terapeutycznego do naprawy uszkodzonej chrząstki. Przedstawiamy protokół indukowania chondrogennego różnicowania komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) za pomocą grawitacji odśrodkowej (CG). Indukowana przez CG regulacja w górę SOX9 powoduje rozwój fenotypów chondrogennych.

Indukcja różnicowania chondrogennego komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej przez grawitację odśrodkową

Ten artykuł zawiera szczegółowe metody wytwarzania i charakteryzowania pneumatycznie uruchamiającego urządzenia mikroprzepływowego do kompresji chondrocytów.

Platforma mikroprzepływowa do stymulacji chondrocytów za pomocą dynamicznej kompresji

Prezentujemy napędzane silnikiem odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe, które może hodować sferoidy komórek. Za pomocą tego urządzenia sferoidy jednego lub wielu typów komórek mogą być łatwo hodowane w warunkach wysokiej grawitacji.

Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

Tutaj opisujemy produkcję na dużą skalę sferoidów zrębu/komórek macierzystych (ASC) pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu automatycznego systemu pipetowania do zasiewania zawiesiny komórkowej, zapewniając w ten sposób jednorodność wielkości i kształtu sferoidy. Te sferoidy ASC mogą być używane jako elementy budulcowe dla podejść do biodruku 3D.

Wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoid komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację chondrocytów, chondroprogenitorów pochodzących z testu adhezji fibronektyny (FAA-CPs) i migrujących chondroprogenitorów (MCP) z ludzkiej chrząstki stawowej. Obejmuje trawienie enzymatyczne, adhezję fibronektyny i testy oparte na migracji w celu wyizolowania i scharakteryzowania tych komórek.

Izolacja chondrocytów i chondroprogenitorów za pomocą adhezji fibronektyny i testu migracyjnego

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Poznaj metodę generowania sferoid chondrocytowych z iPSC w warunkach niskiej przyczepności przy użyciu mini-bioreaktorów. Ta technika wspiera inżynierię tkankową i terapie komórkowe w leczeniu chorób stawów.

Generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów

Przeglądaj więcej filmów