Szybki i prosty proces oznaczania ilościowego zewnętrznych struktur dorosłego osobnika Drosophila

Nasze laboratorium jest zainteresowane zrozumieniem, w jaki sposób wewnątrzkomórkowa dynamika pH moduluje zachowania komórkowe. Interesują nas zachowania, które przyczyniają się do progresji raka, ponieważ wiemy, że wewnątrzkomórkowe pH jest podwyższone w większości nowotworów. Przeprowadzamy wiele badań mikroskopowych i opracowujemy protokoły do ilościowego określania danych z tych obrazów.

Dowiadujemy się więcej o szlakach i procesach komórkowych, które są regulowane przez pH. Większość linii komórek rakowych ma wyższe wewnątrzkomórkowe pH, a wiele z nich wykazuje zwiększony poziom autofagii, ale nie wiedzieliśmy, że jest to powiązane. Niedawno wykazaliśmy, że wyższe pH wewnątrzkomórkowe w genetycznie normalnych komórkach jest wystarczające do zwiększenia autofagii.

Nasze laboratorium jest jednym z niewielu laboratoriów badających, w jaki sposób wewnątrzkomórkowe pH lub PHI reguluje zachowania komórek w całym modelu zwierzęcym. Odkryliśmy, że zwiększone PHI sprzyja zwiększonej proliferacji komórek, inwazyjnej migracji komórek i dezorganizacji tkanek. Ostatnio odkryliśmy, że wyższe PHI sprzyja autofagii, która jest formą kanibalizmu komórkowego.

Zajmujemy się luką powstałą w wyniku wysokich kosztów i złożoności przygotowania próbek do SEM, co ogranicza ich dostępność dla wielu laboratoriów. W stanie San Jose brakuje nam zasobów na SEM. Opracowaliśmy więc bardziej dostępny i przystępny cenowo protokół, który pozwolił nam rejestrować obrazy w wysokiej rozdzielczości bez konieczności korzystania z drogiego sprzętu.

Protokół ten łączy tradycyjne techniki stosowane w entomologii i stanowi opłacalną i przyjazną dla użytkownika alternatywę dla skaningowej mikroskopii elektronowej. Można go łatwo dostosować do przechwytywania obrazów o wysokiej rozdzielczości różnych części muchy lub różnych okazów. Aby rozpocząć, wybierz żądany szczep Drosophila i umieść go w fiolce zawierającej pokarm dla much.

Inkubować fiolkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż muchy urosną, a dorosłe osobniki będą blisko. Następnie znieczul dorosłe muchy dwutlenkiem węgla i umieść je na podkładce z dwutlenkiem węgla. Przygotuj sortownik much z piór, przycinając gęsie pióro tak, aby pasowało do zwężającego się końca jednomililitrowej pipety serologicznej.

Posortuj muchy piórem i wybierz osobniki z prostymi skrzydłami. Następnie dodaj jeden mililitr 70% etanolu do 1,7 mililitra mikroprobówki wirówkowej. Przenieś wybrane muchy do rurki i umieść rurkę na lodzie.

Za pomocą specjalistycznego stempla punktowego. Wytnij małe trójkątne punkty z 65-funtowego kartonu archiwalnego. Następnie użyj kleszczyków Dumont numer pięć z cienką końcówką, aby zgiąć końcówkę każdego punktu pod kątem 90 stopni.

Usuń muchy z mikroprobówki wirówkowej za pomocą kleszczyków Dumont numer pięć z cienką końcówką. Delikatnie osusz muchy niestrzępiącą się chusteczką, aby usunąć nadmiar etanolu. Umieść każdą muchę na lewym boku na karcie indeksowej pod mikroskopem preparacyjnym.

Za pomocą pipety transferowej wymieszaj jedną lub dwie krople kleju do skóry z jedną lub dwiema kroplami wody dejonizowanej na karcie indeksowej. Podnieś pęczkami przygotowany punkt kartonowy na szerokim końcu i włóż wygiętą końcówkę do mieszanki wodnej kleju, aby nałożyć niewielką ilość kleju. Przyłóż zgiętą końcówkę punktu karty do przedniej strony prawego brzucha muchy wokół segmentów brzucha drugiego i trzeciego.

Zanim klej wyschnie, wyreguluj muchę tak, aby jej przednia tylna oś była prostopadła do zgiętej końcówki punktu karty. Włóż kołek montażowy numer trzy do szerokiego końca końcówki karty i przymocuj go do bloku do przypinania owadów. Oznacz każdą szpilkę lub rząd szpilek odpowiednim genotypem.

Aby uzyskać zdjęcia w wysokiej rozdzielczości oczu drosophila montowanych punktowo, włącz system obrazowania piętrowego. Następnie skonfiguruj korpus lustrzanki cyfrowej z teleobiektywem o średnicy od 70 do 200 milimetrów przymocowanym do obiektywu mikroskopu Apo o powiększeniu 20x za pomocą adaptera obiektywu o średnicy 77 milimetrów. Upewnij się, że próbka jest oświetlona lampą błyskową przez dyfuzor.

Kontroluj położenie Z aparatu za pomocą kontrolera StackShot i szyny makro. Ustaw muchę zamontowaną punktowo na uniwersalnym gimbalu scenicznym z okiem skierowanym w stronę obiektywu. Dostosuj pozycję głowy, ostrożnie używając kleszczyków w celu optymalnego wyrównania.

Przymocuj kamerę do laptopa i dostosuj ustawienia akwizycji. Ustaw powiększenie na 20x, czas otwarcia migawki, 1/200 sekundy, przysłonę f/2.8 i ISO 400. Następnie ustaw lokalizację zapisywania wynikowego stosu obrazów w żądanym folderze plików.

Teraz dostosuj ustawienia stosu ostrości w jednostce sterującej StackShot w trybie automatycznej odległości. Ustaw rozmiar kroku na pięć mikrometrów i oblicz liczbę kroków, ustawiając pozycję początkową i końcową stosu ostrości. Wyświetl preparat w trybie podglądu na żywo, gdy aparat jest w trybie automatycznego fotografowania.

Przesuń szynę tak, aby najbliższa część próbki była ostra. Następnie przejdź do najdalszej interesującej Cię funkcji i dostosuj ostrość. Przywróć aparat z powrotem do trybu fotografowania ręcznego i rozpocznij akwizycję obrazu z jednostki sterującej StackShot.

Po obrazowaniu otwórz uzyskane pliki obrazów w przywoływanym oprogramowaniu do ustawiania ostrości. Wybierz opcję Stos, a następnie wyrównaj i ułóż wszystko lub Pmax, aby wygenerować obraz piętrowy. Następnie kliknij Plik i zapisz obraz wyjściowy, aby zapisać końcowy obraz ułożony w stos jako plik tif.

Po zobrazowaniu oczu drosophila zamontowanych na szpilce, wybierz obraz piętrowy do analizy, w którym oko jest wyśrodkowane i wyrównane z odpowiednim oświetleniem i minimalnym rozmyciem obwodowym. Otwórz obraz podziałki o długości 500 mikrometrów w oprogramowaniu Fiji. Zmierz długość podziałki liniowej za pomocą narzędzia Linia prosta

Kliknij przycisk Analizuj i mierz, aby zarejestrować odległość pikseli, która odpowiada 500 mikrometrom. Następnie oblicz piksele na mikron i użyj tego do przekształcenia pomiarów pikseli na pomiary mikrometryczne. Otwórz plik obrazu w stosie na Fidżi.

Wybierz lupę z paska narzędzi, aby powiększyć obszar ostrości. Wypełnij ekran okiem i otaczającym go naskórkiem głowy. Następnie z paska narzędzi wybierz narzędzie do zaznaczania odręcznego i obrysuj obszar siatkówki zgodnie z najbardziej zewnętrznym rzędem ommatidia.

Aby usunąć część zaznaczenia, przytrzymaj przycisk opcji i wybierz piksele do usunięcia. Aby dodać coś do zaznaczenia, przytrzymaj przyciski Option i Shift, a następnie wybierz piksele, które chcesz dodać. Aby obliczyć powierzchnię, wybierz opcję Analizuj i mierz.

W nowym oknie zostaną wyświetlone parametry powierzchni, średnia, minimalna i maksymalna. Skopiuj dane i wklej je do arkusza kalkulacyjnego w celu dokumentacji i konwersji z pomiarów pikseli na mikrometryczne. Nadmierna ekspresja DNhe2 u much GMR-DNhe2 skutkowała znacznie mniejszymi oczami dorosłych w porównaniu z dorosłymi muchami typu dzikiego.

Muchy GMR-DNhe2 wykazały 41% zmniejszenie powierzchni oczu w porównaniu z muchami typu dzikiego i 48% zmniejszenie w porównaniu z muchami GMRGAL4 heterozygotycznymi. Rozmiar oka został przywrócony u muszek GMR-DNhe2 heterozygotycznych pod względem allelu 3 Atg1, zwiększając go do 129,9 mikrometrów kwadratowych z 74,28 mikrometrów kwadratowych.