Organotypowe systemy modelowania tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro

Biofilmy płytek dentystycznych składają się z setek mikroorganizmów, które mogą wywoływać stan zapalny w nabłonku jamy ustnej, prowadząc do chorób, takich jak zapalenie dziąseł. Chcemy lepiej zrozumieć te interakcje, wykorzystując organotypowe modele tkanek. Systemy te stanowią użyteczne platformy do oceny alternatywnych metod leczenia w kontrolowany sposób.

Tak więc postęp technologii sekwencjonowania w ostatnich latach przekształca dziedzinę biologii zakażeń. Technologie te pozwalają nam naprawdę badać interakcje patogenów gospodarza, wykorzystując wiele technik OMIC poprzez ocenę sygnatur gospodarza i drobnoustrojów na poziomie proteomicznym, transkryptomicznym i metabolomicznym. Nasze ostatnie badania podkreśliły znaczenie interakcji międzydomenowych i wielodrobnoustrojowych w infekcjach związanych z biofilmem.

Dzięki zastosowaniu systemów modelowych in vitro byliśmy w stanie zbadać interakcje biofilmu gospodarza, przetestować nowe terapie przeciw biofilmowi i profilować społeczności drobnoustrojów, wykorzystując innowacyjne technologie, takie jak pamięć RAM i spektroskopia. Przyszłe badania, wykorzystujące te organotypowe modele tkankowe, będą miały na celu osiągnięcie wielo-OMICZNEJ sygnatury i profilowania mikroorganizmu oraz tkanki i kultury gospodarza. Mamy nadzieję, że uda nam się odkryć i rozwikłać złożone interakcje między gospodarzem a konkretnymi gatunkami bakterii i grzybów w naszych modelach biofilmu.

Na początek usuń zamrożone łodygi porowatych kulek zawierających gatunki paciorkowców z 80 stopni Celsjusza. Ożyw gatunki paciorkowców na płytkach podstawy świdra do krwi Columbia, zawierających 5% sterylnej zdefibrynowanej krwi końskiej. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny.

Następnego dnia przenieś trzy do czterech kolonii z talerza na 10 mililitrów pożywki bulionowej sojowej z tryptonem. Hoduj bulion w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 16 do 18 godzin. Po inkubacji odwirować zawiesiny komórek o stężeniu 3 000 G przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Umyj granulki komórek 10 mililitrami sterylnego PBS. Ponownie zawiesić granulki w 10 mililitrach PBS i standaryzować zawiesinę każdego gatunku paciorkowców indywidualnie za pomocą spektrofotometru ustawionego na 550 nanometrów. Po standaryzacji rozcieńczyć każdą zawiesinę paciorkowców, od jednego do 10, aby osiągnąć stężenie jeden razy 10 do mocy siedmiu komórek na mililitr w mieszaninie jeden do jednego bulionu Todda Hewitta i pożywki Roswell Park Memorial Institute.

Odpipetować 500 mikrolitrów rozcieńczonych zawiesin komórkowych na 24-dołkową płytkę do mikromiareczkowania, zawierającą 13-milimetrowy krążek hydroksyapatytu. Inkubować kulturę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić tworzenie biofilmu. W podobny sposób hodowla mikroorganizmów beztlenowych na wybrednej beztlenowej podstawie ślimakowej, zawierającej 5% sterylnej defibrynowanej krwi końskiej.

Standaryzuj każdy mikroorganizm beztlenowy do określonej absorbancji i rozcieńcz je w mieszaninie jeden do jednego bulionu Todda Hewitta i pożywki Roswell Park Memorial Institute. Po dojrzewaniu biofilmu paciorkowców ostrożnie usuń z dołków nieprzylegające komórki i zużyte pożywki. Dodaj 500 mikrolitrów standaryzowanych jeden razy 10 do mocy siedmiu komórek na mililitr zawiesin czterech mikroorganizmów beztlenowych do każdej studzienki.

Inkubować biofilmy przez 24 godziny w warunkach beztlenowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń nieprzylegające komórki i zużyte pożywki ze studzienek. Dodaj 500 mikrolitrów sterylnej mieszanki jeden do jednego bulionu Todd Hewitt i pożywki Roswell Park Memorial Institute.

Hodować biofilmy w warunkach beztlenowych przez 24 godziny. W siódmym dniu przemyj biofilmy dwukrotnie 500 mikrolitrami sterylnego PBS do kohodowli. Aby rozpocząć, rozpakuj i przenieś ludzki nabłonek jamy ustnej lub tkankę i pożywkę HOE do szafki bezpieczeństwa klasy drugiej.

Dodać jeden mililitr pożywki konserwacyjnej dostarczonej z tkanką do każdego dołka płytki 12-dołkowej. Za pomocą sterylnej pęsety usuń wkładki poliwęglanowe zawierające tkankę HOE ze ślimaka odżywczego i 24-dołkowej płytki transportowej. Przenieś tkankę na przygotowaną płytkę 12-dołkową.

Inkubuj modele tkankowe przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby zaaklimatyzować je do warunków laboratoryjnych. W międzyczasie, aby usunąć biofilmy z krążków hydroksyapatytu, użyj igły o rozmiarze 19 i pęsety, aby podnieść krążki z dna płytki 24-dołkowej. Przenieść krążki do pojemnika zawierającego jeden mililitr sterylnego DPBS.

Sonikować dyski w 35 kilohercach przez 10 minut w kąpieli wodnej sonikacji. Po aklimatyzacji użyj pęsety, aby usunąć wkładki tkankowe z płytki 12-dołkowej. Pipetować 100 mikrolitrów zawiesiny sonikacji biofilmu bezpośrednio na modele tkankowe.

Przenieś wkładki na inną 12-dołkową płytkę zawierającą jeden mililitr świeżej pożywki konserwacyjnej. Inkubuj modele tkanek przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Do przetwarzania tkanek przygotuj 350 mikrolitrów buforu do lizy RLT, zawierającego 1% wiązki merkaptoetanolu w dwumililitrowej probówce z nakrętką O-ring

Dodaj do probówki około 100 mikrolitrów 0,5 milimetra szklanych kulek przemytych kwasem. Za pomocą pęsety usuń wkładki zawierające tkankę z podłoża i wyrzuć pozostałą zawiesinę mikrobiologiczną z wkładki. Przytrzymaj wkładkę odwróconą na wysokości oczu, a następnie użyj igły o rozmiarze 19, aby ostrożnie przeciąć tkankę i błonę od spodu wkładki.

Przenieść tkankę i błonę do przygotowanego buforu RLT. Homogenizuj tkankę przez 30 sekund za pomocą laboratoryjnego homogenizatora ze zlewką kulkową. Wyekstrahuj RNA z powstałego lizatu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi zestawu do ekstrakcji RNA.

Zbierz pozostałe zużyte podłoża tkankowe do analiz proteomicznych, stosując metodologie o niskiej i wysokiej przepustowości. Ekspresja genów biomarkerów stanu zapalnego w tkance HOE była znacznie zwiększona po ekspozycji na sonicate biofilmu, w porównaniu z kontrolą niestymulowaną. Największe zmiany krotności zaobserwowano dla CCL2, CXCL1 i CSF3.

Ekspresja mRNA IL8 w tkance HOE wzrosła 8,67-krotnie po stymulacji sonikatem biofilmu, w porównaniu z tkanką kontrolowaną. Poziomy białka IL8 w zużytej pożywce wzrosły z 1,005 nanograma na mililitr w tkance kontrolnej do 4,245 nanogramów na mililitr w tkance stymulowanej biofilmem.