Name: Organotypowe systemy modelowania tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj organotypowe modele tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro z wykorzystaniem ludzkiego nabłonka jamy ustnej. Ta metoda pozwala oceniać odpowiedzi zapalne i testować nowe terapie przeciwbiofilmowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Haleon za wsparcie finansowe dla Saeeda Alqahtaniego w prowadzeniu powiązanych projektów związanych z opisanymi modelami tkanek, a także Ministerstwu Edukacji Arabii Saudyjskiej za sfinansowanie doktoratu Muhanny Alshehri.

Następujący protokół obejmuje przygotowanie wielogatunkowego biofilmu reprezentatywnego dla zapalenia dziąseł, zawierającego w sumie 7 gatunków (spp.)7,30. Trzy Streptococcus spp., Streptococcus mitis (NCTC 12261), Streptococcus intermedius (DSM 20753) i Streptococcus oralis (NTCC 11427) są włączone w celu naśladowania zdrowia jamy ustnej, działając jako początkowe kolonizatory błonki ślinowej. Następnie dodano cztery mikroorganizmy beztlenowe związane z przejściem od zdrowia jamy ustnej do choroby: Veillonella dispar (NCTC 11831), Actinomyces naeslundii (DSM 17233) i dwa podgatunki Fusobacterium spp. Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953) i Fusobacterium nucleatum (subspp.) vincentii (DSM 19507). Wszystkie związane z tym czynności są przeprowadzane aseptycznie przy płomieniu lub w komorze bezpieczeństwa klasy II. Wszystkie pożywki i sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) stosowane w preparatach mikrobiologicznych są sterylizowane w autoklawie przed użyciem, a sterylność jest oceniana w regularnych odstępach czasu podczas protokołu. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu używanego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie zbiorowisk mikroorganizmów do kokultury
UWAGA: Ten protokół przedstawia generowanie wielogatunkowego biofilmu reprezentatywnego dla konsorcjów związanego z zapaleniem tkanki dziąseł, znanym również jako zapalenie dziąseł. Taki model został wykorzystany do oceny odpowiedzi gospodarza w zakresie zdrowia i choroby jamy ustnej, jak opisano wcześniej3.
<ol>
	<li>Ożywić wszystkie trzy gatunki Streptococcus na płytkach agaru z krwią (baza Columbia Blood Agar zawierająca 5% sterylnej, zdefibrynowanej krwi końskiej) z zamrożonych zapasów porowatych kulek (uzyskanych w handlu) zawierających mikroorganizmy przechowywane w temperaturze -80°C. Osiąga się to za pomocą pętli zaszczepiającej i techniki smugowo-płytkowej.
	<ol>
		<li>Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , a następnie wyizolować 3-4 kolonie do rozmnażania w 10 ml pożywki z bulionu sojowego z tryptonem. Wywary hodowlane przez 16-18 h w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku patogenów pośrednich ożywić V. dispar, A. naeslundii, F. nucleatum i F. nucleatum subspp. vincentii beztlenowo na podłożu Fastidious Anaaerobic Agar zawierającym 5% sterylnej defibrynowanej krwi końskiej przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, przed hodowlą w bulionie Schaedlera przez dodatkowe 24-48 godzin w tych samych warunkach.</li>
	<li>Po wzroście, zawiesiny komórek osadu przez wirowanie przez 5 minut, w temperaturze 20 °C przy 3000 x g, a następnie przemyć granulki w 10 ml sterylnego PBS (pH 7,2-7,6). Zawiesiny komórek osadu ponownie przez wirowanie przez 5 minut, w temperaturze 20 °C przy 3000 x g, a następnie powtórzyć etapy mycia po raz drugi. Ponownie zawiesić umyte komórki w 10 ml sterylnego PBS w celu standaryzacji.</li>
	<li>Standaryzować wszystkie trzy Streptococcus spp. indywidualnie za pomocą spektrofotometru przy długości fali 550 nm. Wartości absorbancji 0,50 (dopuszczalny zakres od 0,45 do 0,55) wskazują na liczbę komórek ~1 x 108 komórek/ml, jak wcześniej określono przy użyciu techniki liczenia komórek Milesa i Misry31. Aby osiągnąć ten odczyt absorbancji, należy dodatkowo rozcieńczyć 10 ml przemytych zawiesin komórek w sterylnym PBS.</li>
	<li>Po standaryzacji rozcieńczyć wszystkie Streptococcus spp. 1:10 do 1 x 107 komórek/ml w mieszaninie 1:1 bulionu Todda Hewitta (THB) i pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej przez pipetowanie do 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej z mikromiareczkowym pojemnikiem, zawierającej krążek hydroksyapatytu o średnicy 13 mm. Pozostawić biofilmy do dojrzewania na 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 
	UWAGA: Biofilmy wielogatunkowe mogą być hodowane na różnych podłożach istotnych dla jamy ustnej, takich jak szkliwo, zębina 32 i powierzchnie protez z poli(metakrylanu metylu)33,34. W tych modelach można również zastosować alternatywne podłoża, takie jak sztuczna lub syntetyczna ślina, chociaż należy dokładnie rozważyć w zależności od zastosowanych konsorcjów mikroorganizmów: badania wykazały, że wybór pożywki wzrostowej ma ważne implikacje dla wzrostu biofilmu w społeczności mieszanej35,36.</li>
	<li>Następnego dnia standaryzuj cztery mikroorganizmy beztlenowe w sposób podobny do powyższego (kroki 1.2-1.4). Zawiesiny komórek osadu, przemyć dwukrotnie, a następnie standaryzować V. dispar do 0,50 absorbancji (zakres od 0,45-0,55), a trzy pozostałe mikroorganizmy do 0,20 absorbancji (zakres od 0,18-0,22). Po standaryzacji należy dodatkowo rozcieńczyć wszystkie zawiesiny w stosunku 1:10 do 1 x 107 komórek/ml w mieszaninie THB i RPMI w proporcji 1:1.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć nieprzylegające komórki i zużyte podłoża i wyrzucić je z biofilmów Streptococcus za pomocą pipetowania. Zastąp studzienki na płytce do mikromiareczkowania 500 μl standaryzowanych zawiesin 1 x 107 komórek/ml czterech beztlenowców. Hodowla biofilmów przez 24 godziny w warunkach beztlenowych w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 24 godzinach usunąć nieprzylegające komórki i zużyte pożywki z 7-gatunkowych biofilmów i zastąpić 500 μl sterylnej mieszaniny 1:1 pożywki THB: RPMI. Biofilmy pozostawia się do dojrzewania beztlenowego w temperaturze 37 °C przez 4 dni, przy czym pożywki są codziennie usuwane i uzupełniane (w sumie cztery zmiany pożywki).</li>
	<li>W 7 dniu wielogatunkowy biofilm jest w pełni dojrzały i gotowy do dalszych eksperymentów. Przemyć biofilmy dwukrotnie 500 μl sterylnego PBS do stosowania w kokulturze. 
	UWAGA: Biofilmy mogą być profilowane przy użyciu szeregu metodologii biologicznych, takich jak qPCR (do oceny składu) i profilowanie mikroskopowe za pomocą mikroskopii konfokalnej lub elektronowej, jak opisano wcześniej3.</li>
</ol>
2. Postępowanie z tkankami organotypowymi i konfiguracja eksperymentalna
UWAGA: Opisana poniżej konfiguracja eksperymentalna obejmuje tkankę ludzkiego nabłonka jamy ustnej (HOE) składającą się z komórek TR146 hodowanych na obojętnym filtrze membranowym z poliwęglanu. Istnieją inne modele, w tym modele naskórka, pęcherza moczowego, przełyku, rogówki, dziąseł i nabłonka pochwy. Wszystkie modele są obsługiwane i przygotowywane w sposób podobny do opisanego poniżej w celu zbadania interakcji gospodarz-patogen.
<ol>
	<li>Po przybyciu na miejsce rozpakuj i przenieś chusteczki i pożywki HOE do szafy bezpieczeństwa klasy II. Dodać łącznie 1 ml pożywki konserwacyjnej dostarczonej z tkanką do płytek 12-dołkowych.</li>
	<li>Usuń wkładki poliwęglanowe zawierające HOE za pomocą sterylnej pęsety z płytek 24-dołkowych i agaru odżywczego używanych do transportu i przenieś je na płytki 12-dołkowe zawierające pożywkę, upewniając się, że pod tkanką nie pozostały pęcherzyki powietrza. Upewnij się, że nadmiar agaru przymocowany do boków lub spodu wkładek został ostrożnie usunięty za pomocą dodatkowej pęsety lub bibuły.</li>
	<li>Inkubować modele tkanek przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przed przygotowaniem doświadczalnym w celu aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych po wysyłce. Warto zauważyć, że dostępne są dodatkowe podłoża do konserwacji lub pożywki wzrostowe w celu dłuższej konserwacji lub dalszego dojrzewania modeli tkankowych.</li>
	<li>Można teraz przeprowadzać eksperymenty z kokulturą. Dla podanego tutaj przykładu, usuń 7-gatunkowe biofilmy utworzone jak powyżej (kroki 1.1-1.9) z ich substratów za pomocą sonikacji. Aby to osiągnąć, należy usunąć krążki kwasu hialuronowego zawierające biofilmy z dna płytek 24-dołkowych za pomocą igły 19 G i pęsety, a następnie przenieść biżux zawierający 1 ml sterylnego PBS firmy Dulbecco. Sonikować przy 35 kHz przez 10 minut w sonikacyjnej łaźni wodnej.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć wkładki zawierające modele tkanek za pomocą pęsety z nocnej aklimatyzacji i dodać 100 μl zawiesiny sonikacji biofilmu bezpośrednio do tkanki za pomocą pipetowania. Do celów porównawczych należy używać niestymulowanych tkanek kontrolnych. W przypadku tych kontrolnych wkładek tkankowych dodać 100 μl sterylnego PBS Dulbecco bez zawiesiny biofilmu. 
	UWAGA: Komórki planktonowe, zużyte supernatanty biofilmu zawierające rozproszone komórki lub całe biofilmy mogą być wykorzystane do modelu kokultury zamiast sonicate'a biofilmu. Różne zastosowania tych modeli gospodarz-patogen wykorzystujących różne stymulanty mikrobiologiczne są schematyczne w Rysunek 1, jak udokumentowano gdzie indziej3,5,6,8,13,37,38.</li>
	<li>Po dodaniu przenieś wkładki na inną 12-dołkową płytkę zawierającą 1 ml świeżej pożywki konserwacyjnej, ponownie upewniając się, że pod wkładkami nie ma pęcherzyków powietrza. Inkubować płytki zawierające modele tkanek przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przed przetworzeniem tkanek do dalszych zastosowań. 
	UWAGA: Dostawcy tkanek mogą dostarczyć dodatkowe podłoża w celu wsparcia ciągłej hodowli tkanki po ekspozycji na sonikowane agregaty lub biofilmy. W tym celu opublikowano kilka wcześniejszych modeli badających przedłużoną inokulację biofilmu tkankowego21,28,39. Aby osiągnąć podobne wyniki przy użyciu obecnego modelu organotypowego, należy poddać sonikę (jak wyżej, krok 2.6) i pozostawić mikroorganizmy do przyczepienia się na 24 godziny. Odrzucić pozostałą zawiesinę mikrobiologiczną i kontynuować hodowlę na granicy faz powietrze-ciecz przez wymagany przebieg doświadczenia w czasie.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie tkanek dla wyników eksperymentalnych
UWAGA: Po wspólnej hodowli, modele tkankowe są przetwarzane na wyniki eksperymentalne. Poniższe kroki dokumentują, w jaki sposób RNA jest ekstrahowane z tkanki w celu profilowania transkrypcji oraz jak zużyte pożywki tkankowe są wykorzystywane do wykrywania białek. Tkanka może być również utrwalona w formalinie, paraformaldehydzie lub podobnym utrwalaczu do oceny histologicznej, jak opisano wcześniej3,6.
<ol>
	<li>Najpierw przygotuj 350 μl buforu do lizy RLT w 2,0 ml zakręcanych probówkach O-Ring zawierających 1% β-merkaptoetanolu i ~100 μl ekwiwalentu 0,5 mm szklanych kulek przemytych kwasem.</li>
	<li>Usuń wkładki zawierające tkankę z podłoża za pomocą pęsety i wyrzuć pozostałą zawiesinę mikrobiologiczną z wkładki. Następnie przytrzymaj, odwrócony, na wysokości oczu, dla ułatwienia. Za pomocą igły 19 G ostrożnie przeciąć tkankę i błonę od spodu wkładki i przenieść do buforu RLT.
	<ol>
		<li>Homogenizować tkankę w czasie 30 s za pomocą laboratoryjnego homogenizatora bijakowego, a następnie wyekstrahować RNA z lizatu zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Wyekstrahowany RNA służy do syntezy cDNA w celu profilowania ekspresji genów cytokin i chemokiny jako markerów stanu zapalnego za pomocą ilościowego PCR (qPCR) lub sekwencjonowania RNA. qPCR uzyskuje się za pomocą macierzy multipleksowych, takich jak matryca profilująca RT2 PCR zawierająca dołki z gotowymi starterami dla określonych genów lub odczynnik na bazie zielonej SYBR z zaprojektowanymi przez siebie sekwencjami starterów i wolnymi od nukleaz ddH2O3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz pozostałe zużyte pożywki tkankowe (~850-900 μl) do analiz proteomicznych przy użyciu metodologii nisko- i wysokoprzepustowych, takich jak ELISA, multipleksowe testy immunologiczne lub multipleksowa analiza biomarkerów białkowych7.</li>
	<li>Korzystając ze zużytych pożywek tkankowych, oceń szereg markerów związanych ze stanem zapalnym na poziomie białka. Zużyte pożywki mogą być bezpośrednio wykorzystane do powyższych metodologii (krok 3.3) lub przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C. W przypadku takich analiz należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania pożywki. 
	UWAGA: Pożywka może wymagać rozcieńczenia w stosunku 1:10 w zależności od stymulatora tkankowego w celu dokładnego profilowania proteomicznego za pomocą testów ELISA.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisano metodologie tworzenia złożonego, wielogatunkowego modelu biofilmu reprezentatywnego dla zapalenia dziąseł do jednoczesnej hodowli z tkanką HOE w celu oceny odpowiedzi gospodarza na stymulację mikrobiologiczną. Protokół ten może być zaadaptowany do wykorzystania w badaniu interakcji gospodarz-patogen między komórkami planktonowymi, biofilmami jedno-, dwu- lub mieszanymi lub komórkami rozproszonymi biofilmem z tkanką nabłonkową z różnych nisz ekologicznych w ludzkim ciele. Wykorzystanie modeli tkankowych do badania interakcji gospodarz-patogen stanowi ważny postęp w porównaniu z poprzednimi systemami kohodowli, które są ograniczone do monowarstw 2D, które nie zawsze naprawdę oddają sytuację in vivo, w której tkanka nabłonkowa zawiera wiele warstw komórkowych 16,17,18. Co więcej, istnieje wiele wyzwań związanych z hodowlą in vitro wielowarstwowych modeli tkankowych, z wykorzystaniem wielu linii komórkowych i/lub wzrostem warstw komórkowych na granicy faz powietrze-ciecz podatnych na zanieczyszczenie. Jak pokazano w poprzednichpublikacjach, dostępne na rynku tkanki stanowią powtarzalną platformę z modelami o niezmiennie wysokiej jakości, które są porównywalne między kontrpróbami i partiami.
W sekcji "przygotowanie zbiorowisk drobnoustrojów do wspólnej hodowli" wybrano włączenie tych mikroorganizmów do modelu 7-gatunkowego zapalenia dziąseł na podstawie powszechnie zidentyfikowanych komensalów i patogenów związanych z przejściem od zdrowia jamy ustnej do choroby. Podobnie jak w przypadku wszystkich złożonych systemów modelowania biofilmu in vitro, włączenie mikroorganizmów jest kierowane badaniami mikrobiomu odnoszącymi się do konkretnej zdrowej lub chorej niszy ekologicznej. W tym celu my i inni poinformowaliśmy o zastosowaniu modelu biofilmu związanego ze zdrowiem jamy ustnej zawierającego mikroorganizmy komensalne (np. Streptococcus i Rothia spp.)3,40,41. Co więcej, do tych modeli można dodać dodatkowe patogeny, aby stworzyć biofilmy związane z innymi chorobami. Na przykład, trzy mikroorganizmy można dodać do opisanych tutaj 7 gatunków, aby stworzyć model choroby związany z zapaleniem przyzębia3, podczas gdy patogen grzybiczy Candida albicans można dodać w celu zwiększenia polidrobnoustrojowości, a także dodać warstwę złożoności międzykrólestwa33. Rzeczywiście, promowanie interakcji grzyb-bakteria może mieć ogromne implikacje dla różnych wyników eksperymentów z wykorzystaniem takich modeli biofilmu in vitro w porównaniu z biofilmami zawierającymi wyłącznie bakterie42. Ostatecznie zdecydowanie zaleca się dokładne rozważenie tego procesu podczas tworzenia nowego modelu wielogatunkowego biofilmu do takich badań. Podczas gdy włączone mikroorganizmy powinny być łatwe do zidentyfikowania na podstawie obszernych poszukiwań w literaturze, w przypadku większości nisz i/lub chorób mogą one nie integrować się dobrze ze złożonym modelem in vitro z różnych powodów. Poniżej przedstawiono kilka innych potencjalnych kwestii, które należy wziąć pod uwagę:
Dynamika tworzenia biofilmu Tworzenie biofilmu in vivo często wiąże się z wczesną, pośrednią i późną kolonizacją przez określone mikroorganizmy. Tworzenie się naddziąsłowej i poddziąsłowej płytki nazębnej silnie charakteryzuje się początkowym przyczepieniem się błonki ślinowej znajdującej się na szkliwie przez gatunki pionierskie (np. gatunki Streptococcus ), z pośrednimi i późniejszymi patogenami wymagającymi ich jako rusztowania do kolonizacji43. Podobne zjawisko zaproponowano w środowisku pochwy podczas bakteryjnego zapalenia pochwy, przy czym uważa się, że Gardnerella vaginalis jest początkowym kolonizatorem, a następnie następują beztlenowce44. Należy jednak pamiętać, że może to nie dotyczyć innych chorób w innych niszach ekologicznych.
Gęstość wysiewu dla każdego mikroorganizmu Mikroorganizmy będą miały różne rozmiary i/lub dynamikę wzrostu, gdy będą hodowane in vitro; Dlatego ważne jest, aby wziąć to pod uwagę podczas procesu standaryzacji. Na przykład C. albicans jest 100-150 razy większy od komórek bakteryjnych45,46, dlatego może wymagać dodania w niższym stężeniu, np. 1 x 106 komórek/ml, do takich modeli biofilmu.
Antagonizm gatunkowy Niektóre mikroorganizmy (w tym te same gatunki, ale różne izolaty, szczepy laboratoryjne i/lub kliniczne) wykorzystane w tych modelach mogą konkurować z innymi podczas tworzenia biofilmu, prowadząc do zahamowania wzrostu niektórych gatunków drobnoustrojów47. Badanie przeprowadzone przez Sadiqa i wsp. podkreśliło, w jaki sposób różne kombinacje mikroorganizmów mogą wpływać na biomasę biofilmu wynikającą z synergii (lub antagonizmu) mikroorganizmów48. Chociaż badanie takich interakcji w modelu biofilmu może być interesujące dla grup badawczych (np. testowanie leczenia prebiotycznego lub probiotycznego), inne mogą nie uwzględniać takiego antagonizmu, co może mieć wpływ na złożoność wielogatunkową podczas tworzenia modelu.
Czas dojrzewania biofilmu Bardzo ważne jest zoptymalizowanie ram czasowych dojrzewania biofilmu, ponieważ może to zależeć od dynamiki wzrostu zawartych mikroorganizmów i systemu modelowego (w tym substratów) zastosowanego do hodowli. Dłuższy czas dojrzewania może skutkować lepszą kolonizacją późniejszych patogenów, ale większą śmiercią komórek w modelach, szczególnie wcześniejszych kolonizatorów. I odwrotnie, krótszy czas inkubacji może być ważny, jeśli chcesz zbadać wpływ niedojrzałych modeli biofilmu na gospodarza. Badanie przeprowadzone przez Browna i wsp. opisało, w jaki sposób ten sam 10-gatunkowy model biofilmu rany miał różne profile zapalne w ludzkich komórkach THP-1, gdy dojrzewały przez 24 godziny, 48 godzin i 72 godziny, co sugeruje, że im mniej dojrzały biofilm, tym bardziej jest prozapalny7. Podobne wyniki można było zaobserwować w wielowarstwowych modelach tkankowych. Ważne jest również, aby pamiętać, że regularna codzienna zmiana pożywki jest koniecznością, aby zminimalizować śmierć komórek w biofilmie, chociaż można to zmienić w zależności od trwających schematów leczenia, np. w przypadku oceny skutków przedłużonych interwencji przeciwdrobnoustrojowych.
W przypadku sekcji "obchodzenie się z tkankami organotypowymi, konfiguracja eksperymentalna i przetwarzanie tkanek" ramy czasowe inkubacji można dostosować do potrzeb badacza. Interakcje gospodarz-patogen można badać we wcześniejszych punktach czasowych, np. 1-12 godzin, do późniejszych punktów czasowych 48 godzin i 72 godzin, w zależności od pytania badawczego. Po drugie, dostarczane są wszystkie pożywki konserwacyjne zawierające antybiotyki; W związku z tym przy składaniu zamówienia należy zwrócić się do firmy z prośbą o ich usunięcie, w zależności od projektu eksperymentalnego. Chociaż podłoże znajdujące się pod wkładką nie ma bezpośredniego kontaktu z górnym obwodem tkanki, chyba że w modelu 6,8 zostanie zadana rana, usunięcie antybiotyków może zasługiwać na rozważenie w przypadku badania inwazji drobnoustrojów w tkance.
Materiał mikrobiologiczny używany do stymulacji kokultur może być również zmieniany, jak omówiono powyżej, w zakresie oceny planktonu, zużytych supernatantów biofilmu (filtrowanych i niefiltrowanych), całych biofilmów lub inkubacji sonikacji biofilmu z tkanką. Na przykład wcześniejsze dowody wykazały, że modele tkankowe, takie jak te dostarczone przez EpiSkin, dostarczają użytecznych modeli do badania interakcji grzyb-gospodarz planktonowy: wykazano, że komórki C. albicans, Candida auris, Malassezia furfur i Trichophyton rubrum przyczepiają się i oddziałują z warstwami tkanek obwodowych w HOE, zrekonstruowanym ludzkim naskórku (RHE) lub ludzkim nabłonku pochwy, przy czym niektóre z tych badań wykazują stymulację odpowiedzi gospodarza po zakażeniu grzybiczym 1,5,6,11,12,49. Istnieją podobne publikacje dotyczące interakcji bakteria-gospodarz, np. tworzenie się biofilmu u Cutibacterium acnes, powszechnego patogenu związanego z mikrobiotą skóry głowy w łupieżu, badano na powierzchni RHE, gdy jest hodowany samodzielnie i z organizmem grzybowym skóry, Malassezia restricta10. Inni badali zdolność Staphylococcus spp. do przyłączania się do RHE, mierząc fizykochemiczne i mikrobiologiczne cechy tej interakcji bakteria-gospodarz50. N'Diaye i współautorzy zbadali, w jaki sposób neuropeptyd pochodzenia ludzkiego, peptyd związany z genem kalcytoniny, wpłynął na zjadliwość Staphylococcus aureus w modelu tkankowym RHE51. Inni badali ochronne działanie interwencji probiotycznych na zakażenie Pseudomonas aeruginosa ludzkiego nabłonka rogówki14. Tymczasem, z perspektywy wielomikrobiologicznej, różne grupy badały wpływ biofilmów mieszanych gatunków na różne podłoża tkankowe 2,3,7,13.
Ogólnie rzecz biorąc, te protokoły i badania, o których mowa powyżej, dokumentują szeroki wachlarz zastosowań organotypowych modeli tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen. Chociaż badania wykazały, że modele EpiSkin, w szczególności model skóry RHE, mają dobrą przydatność do testowania produktów kosmetycznych pod kątem korozji/podrażnienia 52,53,54,55, istnieją pewne ograniczenia między nimi a rzeczywistymi eksplantatami tkanek ex vivo lub innymi dostawcami dostępnych na rynku tkanek56,57. Jednym z oczywistych ograniczeń byłoby to, że wszystkie dostępne na rynku modele tkanek są generowane z linii komórkowych w sterylnym, "wolnym od zarazków" środowisku, co oznacza, że tkanka nigdy nie była narażona na zaburzenia mikrobiologiczne: może to zaostrzyć każdą reakcję zapalną u gospodarza, znacznie wykraczającą poza to, co można by zaobserwować in vivo lub po stymulacji eksplantatów tkanek ex vivo 57. I odwrotnie, te systemy modeli laboratoryjnych nie będą zawierały leżących pod spodem warstw łącznych ani naczyń krwionośnych, które można by kojarzyć z tkankami in vivo, cech, które można zachować podczas eksplantacji tkanek ex vivo, oraz cech wpływających na reakcje zapalne. Rzeczywiście, niedawny przegląd systematyczny podkreślił, że należy dokładnie rozważyć wykorzystanie modeli tkanek z odpowiednim unaczynieniem, stworzonych przy użyciu różnych technologii inżynieryjnych, w tym biomateriałów58. Na przykład w jednym z ostatnich badań wykorzystano matrycę opartą na fibrynie osadzoną w fibroblastach dziąseł i komórkach śródbłonka mikronaczyniowego w celu stworzenia unaczynionego odpowiednika tkanki dziąsełowej. Autorzy opisali zróżnicowaną odpowiedź zapalną w modelu po ekspozycji na mikroorganizmy związane ze zdrowiem lub chorobą59. Z komercyjnego punktu widzenia istnieją obecnie bardziej złożone modele, takie jak "model T-Skin", który zawiera tkankę o pełnej grubości składającą się ze skóry właściwej składającej się z fibroblastów pokrytych naskórkiem. Ciekawie byłoby zobaczyć, jak takie złożone modele wypadają w porównaniu z systemami opartymi wyłącznie na naskórku.
Chociaż żaden model nie jest doskonały, organotypowe modele tkanek stanowią obiecującą alternatywę dla badań przedklinicznych, dostosowując się do ram nakreślonych przez trzy R, dotyczące wymiany, redukcji i udoskonalenia w podejmowaniu badań na zwierzętach. W tym celu, chociaż modele zwierzęce dostarczają ważnych informacji na temat złożonej patofizjologicznej natury chorób człowieka związanych z biofilmem, mają one oczywiste wady. Te modele 3D są łatwe do manipulowania, co pozwala na duże, subtelne zmiany w dochodzeniach bez zgody etyki. Połączenie tych modeli z istniejącymi złożonymi systemami biofilmu opisanymi powyżej może znacznie poprawić naszą wiedzę na temat interakcji gospodarz-patogen i lepiej przewidywać powodzenie nowych terapii przed badaniami in vivo .

Systemy modeli in vitro dostarczają doskonałych warunków do badania interakcji gospodarz-patogen. Te systemy organotypowe mają na celu podsumowanie mikrośrodowiska różnych nisz ekologicznych podatnych na perturbacje mikrobiologiczne. Opublikowano szereg artykułów naukowych, w których wykorzystano modele tkanek EpiSkin (dawniej SkinEthic) do oceny interakcji gospodarz-patogen w jamie ustnej1,2,3,4,5, bariera skórna6,7,8,9,10,11, oraz błona śluzowa pochwy5,12,13, między innymi14,15. W przeciwieństwie do "dwuwymiarowej" lub "dwuwymiarowej" hodowli komórkowej, która opiera się na wykorzystaniu monowarstw nabłonkowych linii komórkowych narażonych na działanie mikroorganizmów, te dostępne na rynku modele składają się z wielu warstw zróżnicowanych komórek hodowanych na granicy faz powietrze-ciecz. Chociaż systemy hodowli 2D są tańsze i często uważane za bardziej powtarzalne, są podatne na uszkodzenia komórek, gdy są hodowane z mikroorganizmami, które nie zawsze dokładnie reprezentują bariery nabłonkowe lub błony śluzowej in vivo16,17.
Ostatnie dowody pokazują, że techniki hodowli "trójwymiarowej" lub "3D" stają się coraz bardziej popularne w różnych dyscyplinach naukowych, w tym w naukach o raku, badaniach nad komórkami macierzystymi i odkrywaniu leków16,18. W kontekście biologii zakażeń modele tkanek 3D mogą być wykorzystywane do badań nad interakcjami gospodarz-bakteria, grzyb lub mieszany gatunek na granicy faz nabłonka lub bariery śluzówkowej w kontrolowanym mikrośrodowisku in vitro. Modele te mają wiele zalet w porównaniu z systemami hodowli 2D, pozwalając na ocenę kolonizacji tkanek i/lub inwazji organizmów chorobotwórczych lub złożonych zbiorowisk biofilmu17 oraz ocenę odpowiedzi gospodarza na poziomie wieloskładnikowym dla różnych biomarkerów, gdzie modele 2D są czasami ograniczone przez ich profile transkrypcyjne lub proteomiczne16,17,18. Ostatecznie, przedkliniczne zastosowania takich systemów 3D są ogromne, dostarczając ważnych danych eksploracyjnych, które można wykorzystać w modelach in vivo lub badaniach klinicznych.
W kontekście zdrowia i chorób jamy ustnej, zrozumienie szlaków zapalnych zaangażowanych na powierzchni błony śluzowej jamy ustnej jest ważne dla klinicystów, ponieważ może to ukierunkować metody leczenia. Wcześniejsze badania wykazały, że biofilmy "związane ze zdrowiem" mogą wywoływać minimalne reakcje zapalne3,19,20,21. Może to wynikać z mniejszego obciążenia biologicznego mikrobiologicznego związanego ze zdrowiem jamy ustnej lub ze względu na skład biofilmu ze Streptococcus spp. powszechnie uważanym za immunomodulatory22,23. Z drugiej strony, biofilmy składające się z mikroorganizmów związanych z chorobą, takich jak Fusobacterium nucleatum i Porphyromonas gingivalis, mają charakter prozapalny3,20,24,25,26,27. Przegląd przeprowadzony przez Mountcastle i in. w 2020 r. opisał wszystkie istotne modele kokultur, które istniały w tym czasie dla mikrośrodowiska jamy ustnej17. Chociaż takich modeli organotypowych jest mnóstwo, a kilka z nich zostało wyprodukowanych od28,29, nadal istnieje wiele trudnych przeszkód związanych z tworzeniem takich modeli 3D. Aby wymienić tylko kilka, modele te wymagają znacznej optymalizacji, a ich produkcja jest wysoce pracochłonna i zasobożerna; Odtwarzalność może być również bardzo zmienna, chyba że jest dokładnie kontrolowana16,17. Dostępne na rynku modele pozwalają obejść te problemy, zapewniając platformy do badania interakcji gospodarz-patogen w jamie ustnej i w innych niszach ekologicznych w ludzkim ciele.
Podsumowując, obecny protokół ma na celu nakreślenie zastosowania modeli tkanek organotypowych do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro w kontekście zdrowia i chorób jamy ustnej. W szczególności opisany system modelowy wykorzystuje wielowarstwowy, dostępny na rynku nabłonek jamy ustnej wystawiony na działanie zdefiniowanej społeczności biofilmu reprezentatywnego dla choroby zapalnej jamy ustnej, zapalenia dziąseł.

<table><tbody><tr><td>Krążki hydroksyapatytu (HA) 13 mm</td><td>Plasma Biotal Limited</td><td>n/a (na zamówienie)</td><td>Podłoże do tworzenia biofilmu w jamie ustnej, naśladujące powierzchnię zęba</td></tr><tr><td>Igła 19 G (40 mm)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>613-2028</td><td>Służy do pomocy w usuwaniu krążków kwasu hialuronowego z płytek i wycinaniu tkanki z wkładek</td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki do mikromiareczkowania z płaskim dnem poddane obróbce TC z pokrywkami&nbsp;</td><td>Materiały do laboratoriów naukowych</td><td>3524 (opakowanie 100 szt.)</td><td>Płytki do hodowli biofilmów i eksperymentów z kokulturą tkankową</td></tr><tr><td>Koraliki szklane płukane kwasem (425-600 &mu; m)</td> <td>Merck: Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>Do lizy tkanek w celu poprawy wydajności ekstrakcji RNA&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Actinomyces naeslundii DSM 17233&nbsp;</td><td>Instytut Leibniza DSMZ</td><td>n/a</td><td>Jeden z mikroorganizmów wykorzystywanych w złożonym modelu biofilmu</td></tr><tr><td>Homogenizator Bead Mill 24 (lub równoważny)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-163</td><td>Do lizy tkanek w celu poprawy wydajności ekstrakcji RNA&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Bijouxes&nbsp; (7 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>189170 (700 w opakowaniu)</td><td>Służy do sonikacji biofilmu&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA (o dużej pojemności)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368814 (na 200 reakcji)</td><td>synteza cDNA z tkanki RNA</td></tr><tr><td>na bazie agaru Columbia Blood Agar (CBA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CM0331B (na 500 gramów)</td><td>Służy do przygotowania płytek CBA do hodowli mikroorganizmów tlenowych</td></tr><tr><td>Defibrynowana krew końska</td><td>E& O Laboratories</td><td>DHB</td><td>Służy do uzupełniania płytek CBA i FAA do hodowli mikroorganizmów tlenowych i beztlenowych</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (dPBS: bez CaCl2 i MgCl2)</td><td>Merck: Sigma-Aldrich</td><td>DB537</td><td>dPBS do kohodowli komórek z sonikatem biofilmu</td></tr><tr><td>Fusobacterium nucleatum ATCC 10953</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>n/a</td><td>Jeden z mikroorganizmów wykorzystywanych w złożonym modelu biofilmu</td></tr><tr><td>Fusobacterium nucleatum subspecies (subspp.) vincentii DSM 19507</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>n/a</td><td>Jeden z mikroorganizmów wykorzystywanych w złożonym modelu biofilmu</td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Version 10)</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>n/a</td><td>Do tworzenia wykresów i analizy danych&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw ELISA Human IL-8 (niepowlekany zestaw ELISA z płytkami)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>88-8086-86 (do testów 10 x 96)</td><td>Zestaw ELISA i płytki do oceny białek w zużytych pożywkach tkankowych</td></tr><tr><td>Nabłonek jamy ustnej człowieka (HOE)&nbsp;</td><td>Episkin</td><td>n/a (na zamówienie)</td><td>Tkanka nabłonkowa wykorzystana w systemie modelu kohodowli</td></tr><tr><td>Pętle inokulacyjne (jednorazowe, 10 i mikro; L lub odpowiednik)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12870155 (opakowanie 1000 szt.)</td><td>Do hodowli mikrobiologicznej w podłożach stałych i płynnych</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Reaction 96-dołkowe płytki qPCR (0,1 ml)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907 (na 10 płytek)</td><td>Do profilowania ekspresji genów qPCR w tkankach</td></tr><tr><td>Kulki mikrobankowe</td><td>Pro-Lab Diagnostics</td><td>PL.170</td><td>Przechowywanie i cyrokonserwacja mikroorganizmów&nbsp;</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9935 (10 x 1,5 mL)</td><td>Woda klasy RT-PCR do eksperymentów qPCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Szalki Petriego (90 mm)</td><td>Fisher Scientific (Sterilin)&nbsp;</td><td>11309283 (opakowanie 500 szt.)</td><td>Służy do przygotowania płytek agarowych do hodowli drobnoustrojów</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>18912014 (opakowanie 100 tabletek)</td><td>PBS do standaryzacji mikroorganizmów i etapów płukania biofilmu</td></tr><tr><td>Mini zestaw Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74106 (na 250 reakcji)</td><td>Kolumnowy zestaw do ekstrakcji RNA do tkanek&nbsp;</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 średni</td><td>Merck: Sigma-Aldrich</td><td>R7755-10L (na 10 L)&nbsp;</td><td>Pożywki do hodowli biofilmu&nbsp;</td></tr><tr><td>Matryca profilująca RT2</td><td>Qiagen</td><td>330171 (na zamówienie)</td><td>Tablica qPCR zawierająca gotowe startery do profilowania ekspresji genów</td></tr><tr><td>Baza agaru beztlenowego Schaedler</td><td>Merck: Sigma-Aldrich (Millipore)</td><td>91019 (na 500 g)</td><td>Służy do przygotowania płytek agarowych Fastdious Anerob Agar&nbsp;</td></tr><tr><td>Rosół beztlenowy Schaedler</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>CM0497B (na 500 g)</td><td>Płynne podłoża do rozwoju mikroorganizmów beztlenowych</td></tr><tr><td>Nakrętka Beadbug O-Ring tube&nbsp;</td><td>Materiały do laboratoriów naukowych</td><td>Z763837-1000EA (opakowanie 1000 szt)</td><td>Do stosowania w homogenizatorze Bead Mill 24, do lizy tkanek</td></tr><tr><td>Kąpiel sonikacyjna</td>, <td>Fisher Scientific (Fisherbrand)</td><td>n/a</td><td>Do sonikacji biofilmów z krążków HA&nbsp;</td></tr><tr><td>Streptococcus intermedius DSM 20753&nbsp;</td><td>Instytut Leibniza DSMZ</td><td>n/a</td><td>Jeden z mikroorganizmów użytych w złożonym modelu biofilmu</td></tr><tr><td>Streptococcus mitis NCTC 12261</td><td>Krajowa kolekcja kultur typu</td><td>n/a</td><td>Jeden z mikroorganizmów użytych w złożonym modelu biofilmu</td></tr><tr><td>Streptococcus oralis NTCC 11427&nbsp;</td><td>Krajowa Kolekcja Kultur Typu</td><td>n/a</td><td>Jeden z mikroorganizmów wykorzystywanych w modelu złożonego biofilmu</td></tr><tr><td>SYBR-green (qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX)</td><td>PCR Biosystems</td><td>PB20.12</td><td>SYBR-green mix do qPCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Rosół Todda Hewitta</td><td>Merck: Sigma-Aldrich</td><td>T1438&nbsp;</td><td>Pożywki do hodowli biofilmu&nbsp;</td></tr><tr><td>Bulion sojowy z tryptonem (TSB) średni</td><td>Merck: Sigma-Aldrich</td><td>22092 (na 500 g)</td><td>Płynne podłoże do wzrostu mikroorganizmów tlenowych</td></tr><tr><td>Pęseta (150 mm, stal nierdzewna, ząbkowana)</td><td>RS-Pro&nbsp;</td><td>545-187</td><td>Służy do przemieszczania krążków HA i wkładek tkankowych/ekstraktów tkankowych</td></tr><tr><td>Rurki uniwersalne&nbsp; (30 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>201150 (400 za worek)</td><td>Naczynia do hodowli mikroorganizmów w płynnych kulturach&nbsp;</td></tr><tr><td>Veillonella dispar NCTC 11831</td><td>Krajowa kolekcja kultur typu</td><td>n/a'Jeden</td> <td>z mikroorganizmów wykorzystywanych do złożonego modelu biofilmu</td></tr> <tr><td>i beta;-metakaptoetanolu</td> Merck: <td>Dezaktywacja RNazy</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td> w próbkach tkanek</tr></tbody></table>

organotypowe systemy modelowania tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro

Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro

Rekapitulacja interfejsu gospodarz-patogen na barierze nabłonkowej lub śluzówkowej in vitro pozostaje wyzwaniem dla biologów zajmujących się infekcjami. Podczas gdy monowarstwy nabłonka 2D hodowane we własnym zakresie nie są wiernie odwzorowane w warunkach in vivo, dostępne na rynku modele tkanek są często pomijane ze względu na ich koszt i praktyczność. Jednak przy starannym planowaniu takie modele zapewniają powtarzalne platformy dla szerokiej gamy różnych zastosowań. W tym miejscu informujemy o zastosowaniu modeli nabłonkowych, które można wykorzystać do wielu różnych celów eksperymentalnych w celu zbadania interakcji gospodarz-patogen w różnych niszach ekologicznych, takich jak jama ustna, skóra i błona śluzowa pochwy. Od prostych komórek planktonowych po złożone współhodowle biofilmu, modele nabłonkowe są wykorzystywane do oceny przylegania i inwazji drobnoustrojów oraz do oceny odpowiedzi gospodarza na poziomie transkrypcji i/lub białka, z możliwością bardziej szczegółowego profilowania przy użyciu różnych podejść omicznych. Co więcej, te systemy biologiczne mogą być wykorzystywane jako dokładniejsze stanowiska testowe do oceny konwencjonalnej i nowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej w złożonym mikrośrodowisku gospodarz-patogen in vitro. Opisane w niniejszym dokumencie protokoły dokumentują, w jaki sposób modele są traktowane po przybyciu i przygotowywane w laboratorium do stymulacji wspólnej hodowli ze społecznościami biofilmu. Metody szczegółowo opisują, w jaki sposób wyniki eksperymentów są uzyskiwane z systemów modelowych, w tym przetwarzanie tkanki, konfiguracja kohodowli i generowanie danych. Eksperymenty te obejmują ekspresję genów gospodarza poprzez jedno- i multipleksowe analizy qPCR oraz wykrywanie białek zapalnych za pomocą testów ELISA. Podsumowując, modele nabłonkowe stanowią użyteczne systemy in vitro do przedklinicznych badań badawczych nad prostymi lub złożonymi interakcjami gospodarz-patogen.

W tym eksperymencie HOE poddano działaniu sonikatu biofilmu składającego się z 7 gatunków, zawierającego organizmy reprezentatywne dla przejścia ze stanu zdrowia jamy ustnej do stanu zapalnego dziąseł (znanego jako zapalenie dziąseł). Choroba ta wynika z zapalenia tkanki dziąsłowej lub nabłonka jamy ustnej spowodowanego zaburzeniami mikrobiologicznymi wynikającymi z gromadzenia się płytki nazębnej na powierzchni zęba. Po stymulacji tkanka oraz zużyte medium zostały wykorzystane do analiz transkrypcyjnych i proteomicznych, zgodnie z powyższym opisem. W ramach tego eksperymentu wykryto ekspresję genów panelu biomarkerów zapalnych w tkance po stymulacji sonikatem biofilmu (Rysunek 2). Osiągnięto to przy użyciu niestandardowej macierzy profilera RT2 PCR zawierającej 16 różnych genów; ekspresję genów przedstawiono jako krotność zmiany w stosunku do tkanki niestymulowanej po normalizacji względem genu housekeepingowego GAPDH. Stymulacja mikrobiologiczna zwiększyła ekspresję wszystkich genów z wyjątkiem CXCL5, przy czym różnice statystyczne odnotowano dla NFKB, CCL2, CXCL1, CXCL3, CSF2, CSF3, TNF, IL1A, IL1B oraz TLR4 (Rysunek 2A). Największą krotność zmiany zaobserwowano dla CCL2, CXCL1 i CSF3, z odpowiednio wzrostami rzędu 16,9, 10,3 i 15,1 (Rysunek 2B).
Zużyte pożywka HOE wykorzystano do analiz proteomicznych w celu wykrycia białek produkowanych i uwalnianych przez tkankę po stymulacji. Jest to przydatne do ustalenia, czy ekspresja genów koreluje z produkcją białek. W tym celu oceniono ekspresję genu IL8 oraz uwalnianie białka IL-8 w tkance kontrolnej i tkance stymulowanej sonikatem biofilmu (Rysunek 3). Ekspresję genów oceniono za pomocą qPCR z wykorzystaniem SYBR-green i starterów dla IL8 oraz GAPDH, zgodnie z wcześniejszym opisem3. Ekspresja mRNA IL8 w HOE wzrosła 8,67-krotnie po stymulacji sonikatem biofilmu (Rysunek 3A). Na poziomie białka poziom IL-8 ilościowo określono za pomocą zestawu ELISA dla IL-8. Stężenie IL-8 w zużytej pożywce wzrosło z ~1,005 ng/mL w tkance kontrolnej do ~4,245 ng/mL w tkance stymulowanej sonikatem biofilmu (Rysunek 3B).
<img alt="Schemat procesu separacji bakterii, obejmujący sonikację, filtrację membranową i sedymentację." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67487/67487fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Różne zastosowania modeli kokultury tkanek organotypowych. Standaryzowane zawiesiny mikroorganizmów są nakładane bezpośrednio na tkankę w celu zbadania interakcji między gatunkiem a gospodarzem (A). Są one często wykorzystywane do oceny kolonizacji mikrobiologicznej w krótkim odstępie czasu (np. &lt;24 h). Złożone biofilmy poddawane są sonikacji, aby zbadać wpływ rozproszonych komórek lub agregatów biofilmu na tkanki (B). Jest to istotne, ponieważ wcześniej wykazano, że takie komórki posiadają unikalne fenotypy w porównaniu do ich odpowiedników planktonicznych lub biofilmu; w tym celu nienaruszone biofilmy mogą być bezpośrednio dodawane do tkanki przy użyciu dodatkowych mniejszych insertów, aby stworzyć sąsiednią ekspozycję z gospodarzem (C). Na koniec, komórki planktoniczne są dodawane do tkanki w odpowiednich pożywkach hodowlanych w celu oceny kolonizacji mikrobiologicznej, tworzenia biofilmu oraz dynamiki wzrostu na tkance (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67487/67487fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="zmiana krotności mRNA w genach; wykresy słupkowe porównujące kontrolę z biofilmem; zaznaczono istotność statystyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67487/67487fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ekspresja genów w tkance HOE po stymulacji sonikatem biofilmu składającego się z 7 gatunków. Zmiana krotności ekspresji mRNA dla łącznie 15 genów zapalnych, znormalizowana do genu referencyjnego, GAPDH, w tkance HOE w próbkach kontrolnych, niestymulowanych oraz w próbkach eksponowanych na 100 µL sonikatu biofilmu z 7 gatunków (A). Trzy geny (CCL2, CXCL1, CSF3) z najwyższymi zmianami ekspresji mRNA przedstawiono w (B). Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą parametrycznego nieparzystego T-test, przy czym istotne zmiany zaznaczono odpowiednio jako *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01 i ***p &lt; 0.001. Dane zostały wykreślone i przeanalizowane przy użyciu oprogramowania statystycznego i graficznego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67487/67487fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza ekspresji genów: wykresy słupkowe przedstawiające poziomy mRNA i białka IL-8 w grupie kontrolnej w porównaniu z biofilmem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67487/67487fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Rysunek 3: Ekspresja genu IL8 i poziomy białka IL-8 produkowanego przez tkankę HOE. Krotność zmiany ekspresji mRNA IL8 w tkance HOE określona za pomocą qPCR z zastosowaniem SYBR-green (A) oraz poziomy białka IL-8 ilościowo określone w zużytej pożywce tkankowej przy użyciu metody ELISA (B). Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą parametrycznego nieparzystego T-test, gdzie istotne zmiany oznaczono odpowiednio jako *p &lt; 0,05 i ****p &lt; 0,0001. Dane wykreślono i przeanalizowano przy użyciu oprogramowania statystycznego i graficznego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67487/67487fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Obecny protokół opisuje zastosowanie organotypowych modeli tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro. W szczególności opisany system modelowy wykorzystuje wielowarstwowy nabłonek jamy ustnej narażony na działanie mikroorganizmów związanych z biofilmami (płytką nazębną) w kontekście zdrowia jamy ustnej w porównaniu z chorobą.

Organotypowe systemy modelowania tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While ...

Biofilmy płytek dentystycznych składają się z setek mikroorganizmów, które mogą wywoływać stan zapalny w nabłonku jamy ustnej, prowadząc do chorób, takich jak zapalenie dziąseł. Chcemy lepiej zrozumieć te interakcje, wykorzystując organotypowe modele tkanek. Systemy te stanowią użyteczne platformy do oceny alternatywnych metod leczenia w kontrolowany sposób.Tak więc postęp technologii sekwencjonowania w ostatnich latach przekształca dziedzinę biologii zakażeń. Technologie te pozwalają nam naprawdę badać interakcje patogenów gospodarza, wykorzystując wiele technik OMIC poprzez ocenę sygnatur gospodarza i drobnoustrojów na poziomie proteomicznym, transkryptomicznym i metabolomicznym. Nasze ostatnie badania podkreśliły znaczenie interakcji międzydomenowych i wielodrobnoustrojowych w infekcjach związanych z biofilmem.Dzięki zastosowaniu systemów modelowych in vitro byliśmy w stanie zbadać interakcje biofilmu gospodarza, przetestować nowe terapie przeciw biofilmowi i profilować społeczności drobnoustrojów, wykorzystując innowacyjne technologie, takie jak pamięć RAM i spektroskopia. Przyszłe badania, wykorzystujące te organotypowe modele tkankowe, będą miały na celu osiągnięcie wielo-OMICZNEJ sygnatury i profilowania mikroorganizmu oraz tkanki i kultury gospodarza. Mamy nadzieję, że uda nam się odkryć i rozwikłać złożone interakcje między gospodarzem a konkretnymi gatunkami bakterii i grzybów w naszych modelach biofilmu.Na początek usuń zamrożone łodygi porowatych kulek zawierających gatunki paciorkowców z 80 stopni Celsjusza. Ożyw gatunki paciorkowców na płytkach podstawy świdra do krwi Columbia, zawierających 5% sterylnej zdefibrynowanej krwi końskiej. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny.Następnego dnia przenieś trzy do czterech kolonii z talerza na 10 mililitrów pożywki bulionowej sojowej z tryptonem. Hoduj bulion w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 16 do 18 godzin. Po inkubacji odwirować zawiesiny komórek o stężeniu 3 000 G przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Umyj granulki komórek 10 mililitrami sterylnego PBS. Ponownie zawiesić granulki w 10 mililitrach PBS i standaryzować zawiesinę każdego gatunku paciorkowców indywidualnie za pomocą spektrofotometru ustawionego na 550 nanometrów. Po standaryzacji rozcieńczyć każdą zawiesinę paciorkowców, od jednego do 10, aby osiągnąć stężenie jeden razy 10 do mocy siedmiu komórek na mililitr w mieszaninie jeden do jednego bulionu Todda Hewitta i pożywki Roswell Park Memorial Institute.Odpipetować 500 mikrolitrów rozcieńczonych zawiesin komórkowych na 24-dołkową płytkę do mikromiareczkowania, zawierającą 13-milimetrowy krążek hydroksyapatytu. Inkubować kulturę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić tworzenie biofilmu. W podobny sposób hodowla mikroorganizmów beztlenowych na wybrednej beztlenowej podstawie ślimakowej, zawierającej 5% sterylnej defibrynowanej krwi końskiej.Standaryzuj każdy mikroorganizm beztlenowy do określonej absorbancji i rozcieńcz je w mieszaninie jeden do jednego bulionu Todda Hewitta i pożywki Roswell Park Memorial Institute. Po dojrzewaniu biofilmu paciorkowców ostrożnie usuń z dołków nieprzylegające komórki i zużyte pożywki. Dodaj 500 mikrolitrów standaryzowanych jeden razy 10 do mocy siedmiu komórek na mililitr zawiesin czterech mikroorganizmów beztlenowych do każdej studzienki.Inkubować biofilmy przez 24 godziny w warunkach beztlenowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń nieprzylegające komórki i zużyte pożywki ze studzienek. Dodaj 500 mikrolitrów sterylnej mieszanki jeden do jednego bulionu Todd Hewitt i pożywki Roswell Park Memorial Institute.Hodować biofilmy w warunkach beztlenowych przez 24 godziny. W siódmym dniu przemyj biofilmy dwukrotnie 500 mikrolitrami sterylnego PBS do kohodowli. Aby rozpocząć, rozpakuj i przenieś ludzki nabłonek jamy ustnej lub tkankę i pożywkę HOE do szafki bezpieczeństwa klasy drugiej.Dodać jeden mililitr pożywki konserwacyjnej dostarczonej z tkanką do każdego dołka płytki 12-dołkowej. Za pomocą sterylnej pęsety usuń wkładki poliwęglanowe zawierające tkankę HOE ze ślimaka odżywczego i 24-dołkowej płytki transportowej. Przenieś tkankę na przygotowaną płytkę 12-dołkową.Inkubuj modele tkankowe przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby zaaklimatyzować je do warunków laboratoryjnych. W międzyczasie, aby usunąć biofilmy z krążków hydroksyapatytu, użyj igły o rozmiarze 19 i pęsety, aby podnieść krążki z dna płytki 24-dołkowej. Przenieść krążki do pojemnika zawierającego jeden mililitr sterylnego DPBS.Sonikować dyski w 35 kilohercach przez 10 minut w kąpieli wodnej sonikacji. Po aklimatyzacji użyj pęsety, aby usunąć wkładki tkankowe z płytki 12-dołkowej. Pipetować 100 mikrolitrów zawiesiny sonikacji biofilmu bezpośrednio na modele tkankowe.Przenieś wkładki na inną 12-dołkową płytkę zawierającą jeden mililitr świeżej pożywki konserwacyjnej. Inkubuj modele tkanek przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Do przetwarzania tkanek przygotuj 350 mikrolitrów buforu do lizy RLT, zawierającego 1% wiązki merkaptoetanolu w dwumililitrowej probówce z nakrętką O-ring.Dodaj do probówki około 100 mikrolitrów 0,5 milimetra szklanych kulek przemytych kwasem. Za pomocą pęsety usuń wkładki zawierające tkankę z podłoża i wyrzuć pozostałą zawiesinę mikrobiologiczną z wkładki. Przytrzymaj wkładkę odwróconą na wysokości oczu, a następnie użyj igły o rozmiarze 19, aby ostrożnie przeciąć tkankę i błonę od spodu wkładki.Przenieść tkankę i błonę do przygotowanego buforu RLT. Homogenizuj tkankę przez 30 sekund za pomocą laboratoryjnego homogenizatora ze zlewką kulkową. Wyekstrahuj RNA z powstałego lizatu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi zestawu do ekstrakcji RNA.Zbierz pozostałe zużyte podłoża tkankowe do analiz proteomicznych, stosując metodologie o niskiej i wysokiej przepustowości. Ekspresja genów biomarkerów stanu zapalnego w tkance HOE była znacznie zwiększona po ekspozycji na sonicate biofilmu, w porównaniu z kontrolą niestymulowaną. Największe zmiany krotności zaobserwowano dla CCL2, CXCL1 i CSF3.Ekspresja mRNA IL8 w tkance HOE wzrosła 8,67-krotnie po stymulacji sonikatem biofilmu, w porównaniu z tkanką kontrolowaną. Poziomy białka IL8 w zużytej pożywce wzrosły z 1,005 nanograma na mililitr w tkance kontrolnej do 4,245 nanogramów na mililitr w tkance stymulowanej biofilmem.

organotypic-tissue-model-systems-for-investigating-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Source: Alshehri, M. et. al., Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates a co-culture model using multi-species oral biofilms and human oral epithelium. It highlights epithelial immune activation and enables the downstream analysis of host-pathogen interaction.

A Transwell Tissue Model for Studying Interactions Between Human Oral Biofilms and Epithelium

W tym filmie opisujemy metodologię tworzenia systemu hodowli narządów jelitowych ex vivo w celu zbadania interakcji między fragmentami tkanki jelitowej myszy a specyficznymi bakteriami jelitowymi. Urządzenie składa się z dwóch par portów wejścia-wyjścia, z których pierwszy łączy światło tkanki jelitowej i dostarcza do niej specyficzną zawiesinę bakteryjną, a drugi w sposób ciągły dostarcza pożywkę do studzienek urządzenia w celu utrzymania żywotności tkanek ex vivo.

System hodowli narządów jelitowych ex vivo do badania interakcji między gospodarzem a mikrobiotą

Podczas gdy badania in vitro interakcji gospodarz-patogen pozwalają na scharakteryzowanie specyficznych odpowiedzi immunologicznych, modele in vivo są wymagane do obserwacji efektów złożonych odpowiedzi. Wykorzystując ekspozycję na Candida albicans, a następnie infekcję płuc za pośrednictwem Pseudomonas aeruginosa, ustaliliśmy mysi model interakcji mikrobiologicznych zaangażowanych w patogenność zapalenia płuc związaną z respiratorem.

Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza

Hodowla narządów ex vivo pozwala na badanie procesów biologicznych w kontekście nienaruszonej architektury tkanki. Tutaj przedstawiamy metodę hodowli ex vivo okrężnicy myszy, którą można wykorzystać do badania odporności wrodzonej i obrony przeciwdrobnoustrojowej gospodarza w jelicie.

Hodowla narządów jelita grubego ex vivo i jej zastosowanie w badaniach nad obroną przeciwdrobnoustrojową gospodarza

Interakcje między gospodarzem a mikroorganizmem jelitowym zostały ocenione przy użyciu nowatorskiego podejścia łączącego syntetyczną społeczność doustną, trawienie in vitro przewodu pokarmowego i model nabłonka jelita cienkiego. Przedstawiamy metodę, którą można zaadaptować do oceny inwazji komórek patogenów i biofilmów wielogatunkowych, a nawet do badania przeżywalności preparatów probiotycznych.

Ocena żywotności konsorcjum bakterii syntetycznych na granicy faz gospodarz-mikroorganizm w jelitach in vitro

Opisujemy zarówno testy infekcji in vitro, jak i in vivo, które mogą być użyte do analizy aktywności czynników kodujących gospodarza.

Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Ten artykuł przedstawia unikalną metodę analizy interakcji gospodarz-mikrobiom przy użyciu nowatorskiego systemu hodowli narządów jelitowych do eksperymentów ex vivo.

System hodowli jelit i narządów do analizy interakcji między gospodarzem a mikrobiotą

Tutaj opisujemy konstrukcję podstawowego, trójwymiarowego (3D) modelu linii komórkowej jelitowej oraz protokołu osadzania parafiny do mikroskopowej oceny stałych jelitowych odpowiedników. Barwienie wybranych białek umożliwia analizę wielu parametrów wzrokowych z jednego eksperymentu do potencjalnego wykorzystania w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków.

Podstawowy trójwymiarowy (3D) model jelitowy z komponentem odpornościowym

Enteroidy pojawiają się jako nowy model do badania fizjologii i patofizjologii tkanek, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu opisujemy system hodowli 2D enteroidów pochodzących z komórek pierwotnych bydła, który umożliwia kohodowlę z odpowiednimi typami komórek tkankowych. Model ten oferuje przewagę translacyjną w modelowaniu badań żołądkowo-jelitowych.

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

Protokół ten opisuje generowanie modelu mięśni prostaty wyhodowanego w 2D. Obejmuje dysocjację organoidów, zasiewanie komórek, różnicowanie, ocenę integralności nabłonka oraz zakażenie in vitro uropatogenicznym Escherichia coli. Model zapewnia dostępność wierzchołkową i nadaje się do badania interakcji gospodarz-patogen, przezwyciężając ograniczenia tradycyjnych trójwymiarowych systemów organoidalnych.

Opracowanie modelu opartego na organoidzie prostaty myszy do badania interakcji gospodarz-patogen

Badanie przedstawia metodę badania in vitro infekcji bakteryjnej z wykorzystaniem organoidów pochodzenia tkankowego z komórek macierzystych. Protokół opisuje, jak hodować i różnicować organoidy w dwóch wymiarach, zakażać je adherentno-inwazyjnymi Escherichia coli oraz oceniać kluczowe odczyty, w tym przełamanie bariery nabłonkowej, obrazowanie infekcji oraz odpowiedź RNA nabłonkowego.

Dwuwymiarowa hodowla organoidów na inwazynie lub wyciągu z błony podstawowej do badania interakcji gospodarz-bakteria

Poznaj organotypowe modele tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro z wykorzystaniem ludzkiego nabłonka jamy ustnej. Ta metoda pozwala oceniać odpowiedzi zapalne i testować nowe terapie przeciwbiofilmowe.

Organotypowe systemy modelowania tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro

Przeglądaj więcej filmów