Ocena osadzania się żelaza w mózgach myszy 5xFAD za pomocą barwienia Perls/DAB

Celem tego protokołu jest opisanie sposobu oceny ilości i rozkładu odkładania się żelaza w mózgach myszy z AD. W tym protokole używamy ośmiomiesięcznych myszy transgenicznych 5xFAD jako mysiego modelu AD i porównaliśmy je z myszami typu dzikiego w tym samym wieku. Dołączamy szczegółowe informacje na temat procedur przygotowania odczynnika chemicznego, podziału mózgu, wykonywania barwienia Perls/DAB i analizy uzyskanych obrazów.

Odpowiednio znieczulij mysz i sprawdź głębokość znieczulenia i znieczulenia. Odsłoń jego serce, a następnie rozetnij prawe przedsionek. Wstrzyknąć kolejno 20 mililitrów PBS i 4% PFA z lewej komory.

Zauważ, że należy obserwować drżenie fiksacji. Odetnij głowę myszy i wydobyj jej mózg. Następnie utrwal mózg w 4% PFA na 12 do 24 godzin.

Zanurz mózg w 15% i 30% sacharozie na 12 do 24 godzin. Przetnij mózg strzałkowo od środka i użyj jednej połowy do cięcia. Zamontuj mózg na gałce, umieść pierścień z folii aluminiowej wokół mózgu i dodaj do niego OCT, aby osadzić mózg.

Ustaw grubość sekcji i temperaturę kriostatu. Następnie wytnij mózg. Jeśli sekcje się składają, użyj miękkich szczotek, aby je rozłożyć.

Zbierz każdą sekcję do szkiełek za pomocą PBS, a następnie wyeliminuj bąbelki na sekcji. Wybierz szkiełko z nienaruszoną tkanką mózgową i umieść je w plastikowym pudełku do barwienia wypełnionym PBS. Umieść pudełko na wytrząsarce obrotowej ustawionej na niską prędkość na pięć minut, aby dokładnie spłukać resztki związku OCT.

Przygotuj 20 mililitrów 2% żelazocyjanku potasu i równą objętość 2% kwasu solnego. Następnie wymieszaj je w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Zabezpiecz szkiełko w probówce za pomocą kleszczy i inkubuj mieszaninę w podgrzanej łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Umyj szkiełko PBS i zetrzyj nadmiar płynu za pomocą bibuły. Połóż szkiełko płasko na stole laboratoryjnym, a nawet nałóż roztwór DAB na tkankę za pomocą pipety. Inkubuj przez 10 minut, aby wzmocnić barwienie perli.

Usuń nadmiar roztworu DAB i spłucz chusteczki, przemywając je trzykrotnie PBS. Odwodnić sekcję sekwencyjnie w stopniowanych roztworach alkoholu i ksylenu przez trzy minuty każdy. Przykryj sekcje neutralną gumą i szkiełkiem nakrywkowym.

Następnie pozwól im wyschnąć w dygestorium. Włącz mikroskop. Dostosuj jasność źródła światła.

Skoncentruj się na sekcji mózgu pod obiektywem z 4-krotnym powiększeniem. Przesuń stolik mikroskopu, aby skupić się na obszarach o wysokich sygnałach barwienia Perls/DAB, zwłaszcza na hipokampie i korze mózgowej. i rób zdjęcia.

Otwórz obraz obiektywu w powiększeniu 10, a następnie przekonwertuj format obrazu na 8-bitową skalę szarości. Wartości szarości obrazu zostały przekonwertowane na wartości OD, a następnie użyto funkcji progowej do pokrycia obszarów dodatnich barwienia Perls/DAB. Wybierz następujące opcje konfiguracji, a co najważniejsze, wybierz opcję Ogranicz do progu, aby wykluczyć szum tła.

Na koniec wybierz pomiary, aby uzyskać wyniki do analizy statystycznej. Aby zbadać rozkład i akumulację żelaza w mysim modelu AD, przeprowadziliśmy barwienie Perls/DAB strzałkowych odcinków mózgu. Wysokie sygnały Perls / DAB zaobserwowano w hipokampie i korze, szczególnie w subiculum hipokampa myszy 5xFAD, podczas gdy mózgi zarówno dwumiesięcznych, jak i ośmiomiesięcznych myszy typu dzikiego wykazywały słabszy sygnał.

Pod powiększeniem 40 plus sygnał u myszy 5xFAD pojawia się w strukturach przypominających blaszki A-beta, zgodnie z wcześniejszymi badaniami. Wyniki te pokazują skuteczność pozycji Perls/DAB jako techniki histochemicznej do wykrywania żelaza. Pokazujemy również dwa przypadki nieudanego barwienia.

W takich przypadkach spowoduje to nadmierne pokrycie lub nieodpowiednie odwodnienie. Barwienie Perls/DAB zapewnia silniejszy sygnał i lepszy kontrast tła niż konwencjonalne barwienie Perls, dzięki czemu wykrywanie żelaza jest bardziej czułe i dokładne. Ponadto wykrywa żelazo w luźno związanych kompleksach białkowych.

Żelazo, które jest silnie związane, jak w hemoglobinie, nie będzie reagować. Jest to znacznie zmniejszone niepożądane sygnały spowodowane przez żelazo w czerwonych krwinkach i hemoglobinie. Ogólnie rzecz biorąc, barwienie Perls/DAB jest odpowiednie do eksperymentów na zwierzętach i badań patologicznych, które wymagają specyficzności i czułości przyśrodkowej.

Dostarcza naukowcom metody wizualizacji i ilościowego określania akumulacji żelaza kosztem mniejszego czasu i kosztów.