Name: Ocena osadzania się żelaza w mózgach myszy 5xFAD za pomocą barwienia Perls/DAB (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T12:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj metodę barwienia Perls/DAB do oceny osadzania się żelaza w mózgach myszy 5xFAD z chorobą Alzheimera. Technika ta umożliwia wykrywanie żelaza w hipokampie i korze mózgowej z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podczas przygotowywania tej pracy autorzy korzystali z DeepSeek w celu poprawy języka i czytelności. Po skorzystaniu z tego narzędzia/usługi autorzy przejrzeli i zredagowali treść zgodnie z potrzebami oraz biorą pełną odpowiedzialność za treść publikacji.

Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego Xuzhou oraz chińskimi przepisami rządowymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Perfuzja zwierząt
<ol>
	<li>Przygotować utrwalacz: Rozpuścić 4% paraformaldehydu (PFA) w 1× soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Znieczulić mysz przez wstrzyknięcie dootrzewnowe ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (15 mg/kg). Gdy mysz zostanie znieczulona, przymocuj ją do tacki do operacji perfuzyjnej za pomocą czterech kołków, aby zabezpieczyć kończyny. 
	UWAGA: Aby zapewnić prawidłowe znieczulenie, sprawdź, czy nie ma utraty reakcji na szczypanie palców u stóp, rozluźnienie mięśni kończyn oraz głęboki, powolny i stały oddech.</li>
	<li>Rozetnij klatkę piersiową nożyczkami, aby odsłonić serce i przeciąć prawe przedsionek. Wstrzyknąć 20 ml 1× PBS do lewej komory za pomocą strzykawki, aby przepłukać krew. Następnie wstrzyknąć 20 ml 4% PFA w celu utrwalenia. 
	UWAGA: Kontroluj głębokość i kierunek igły, aby uniknąć przebicia przegrody międzykomorowej. Pamiętaj, że optymalna perfuzja charakteryzuje się bladą wątrobą i sztywnymi kończynami po początkowym drżeniu.</li>
	<li>Odetnij głowę perfundowanej myszy, przetnij kość wokół czaszki cienkimi nożyczkami, ostrożnie podnieś czaszkę za pomocą kleszczy i wyciągnij mózg. Następnie namocz mózg w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Uważaj na 4% PFA, który jest silnym środkiem drażniącym drogi oddechowe. Załóż odpowiednią maskę i wykonaj tę czynność w dygestorium. 
	UWAGA: Metoda eutanazji została zatwierdzona przez IACUC Programu Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego Xuzhou Wytyczne dotyczące eutanazji: myszy / szczury.</li>
</ol>
2. Kriosekcja mózgu
<ol>
	<li>Odwodnić mózg stopniowanymi roztworami sacharozy (15% i 30%) w temperaturze 4 °C przez 24 godziny na każdym etapie. Mózg powinien w końcu opaść na dno roztworu sacharozy.</li>
	<li>Hemisekcję mózgu wzdłuż szczeliny międzypółkulowej za pomocą skalpela. Umieść lewą połowę w probówce mikrowirówki o pojemności 5 ml wypełnionej 1 ml 30% roztworu sacharozy i równą objętością związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), aby poprawić kontakt między OCT a mózgiem.</li>
	<li>Przytnij obce tkanki z lewej półkuli żyletką i przenieś je na platformę OCT.</li>
	<li>Osadź tkankę w OCT przy wsparciu okrągłej ścianki wykonanej z folii aluminiowej.</li>
	<li>Zamrozić tkankę w mikrotomie kriostatu w temperaturze -22 °C przez co najmniej 1 godzinę i ustawić temperaturę głowicy tnącej na −19 °C. 
	UWAGA: Pamiętaj o wstępnym schłodzeniu szkła antyrolkowego i szczotek w kriostacie wraz z próbką.</li>
	<li>Zamontuj zamrożony blok tkanki. Ponownie przytnij blok tkanki do odpowiedniej pozycji w zależności od obszaru zainteresowania, a następnie zacznij dzielić mózg na skrawki strzałkowe o grubości 20 μm. 
	UWAGA: Jeśli sekcje się składają, użyj miękkich szczotek, aby je rozłożyć.</li>
	<li>Zbierz każdą sekcję na szkiełkach pokrytych żelatyną i rozsmaruj na niej kroplę 1× PBS. Odwróć sekcję mózgu za pomocą cienkiej szczotki, a następnie szybko zamontuj sekcję na szkiełku.</li>
	<li>Zebrane skrawki wysuszyć przez noc w temperaturze pokojowej i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany na okres do 2 tygodni. Dłuższy czas przechowywania może mieć negatywny wpływ na jakość tkanki, a tym samym na wynik eksperymentu.</li>
</ol>
3. Barwienie Perls'/DAB
<ol>
	<li>Przygotować następujące roztwory: 2% żelazocyjanek potasu (K4[Fe(CN)6]·3H2O), 2% kwas solny (HCI) i 20× roztwór DAB (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Umieść szkiełko zawierające skrawki w słoiku do barwienia wypełnionym 1× PBS i umieść słoik na wytrząsarce orbitalnej na 5 minut, aby wypłukać OCT z tkanki. 
	UWAGA: Ostrożnie wyreguluj prędkość wytrząsarki orbitalnej (zalecana prędkość: 20 obr./min), aby uniknąć spadania tkanki ze szkiełka przy dużych prędkościach.</li>
	<li>Zmieszać 20 ml 2% roztworu żelazocyjanku potasu i równą objętość 2% kwasu solnego w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Za pomocą plastikowych kleszczyków przenieś szkiełko do probówki o pojemności 50 ml, a następnie podgrzewaj probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Przepłukać szkiełko 1× PBS i zetrzeć nadmiar roztworu bibułą.</li>
	<li>Za pomocą pipety dodaj 50 μl roztworu DAB do każdej sekcji mózgu i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać nadmiar roztworu DAB za pomocą pipety, a następnie umyć szkiełko 3 razy w PBS.</li>
	<li>Odwodnić skrawki stopniowanymi roztworami alkoholu (50%, 70%, 95%, 100%) i ksylenem (100%, 100%). Inkubuj szkiełka przez 3 minuty każde.</li>
	<li>Uszczelnij sekcje neutralnym gum22, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Wysuszyć szkiełka w dygestorium przez 24 godziny przed przechowywaniem ich w pudełku na szkiełka mikroskopowe.</li>
</ol>
4. Obrazowanie
<ol>
	<li>Włącz mikroskop, dostosuj jasność źródła światła i skup się na części mózgu pod obiektywem o powiększeniu 4×.</li>
	<li>Przechwyć obraz za pomocą oprogramowania sterującego aparatem i dostosuj ustawienia parametrów, aby zapobiec prześwietleniu. Konkretne ustawienia (cel 10×, 40×) są pokazane w Rysunek 1. 
	UWAGA: Unikaj używania automatycznego balansu bieli, aby zapewnić ten sam czas naświetlania dla każdego obrazu.</li>
	<li>Przełącz się na obiektyw o powiększeniu 10×, przesuń stolik mikroskopu, aby ustawić ostrość na obszarach o wysokich sygnałach barwienia Perls/DAB, zwłaszcza na hipokampie i korze mózgowej, i uchwyć obrazy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Przełącz się na obiektyw z 40-krotnym powiększeniem, aby rejestrować obrazy z wyraźnymi sygnałami barwienia.</li>
	<li>Zapisz każdy obraz jako 8-bitowy plik TIFF i wyeksportuj obrazy do dalszej analizy.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
<ol>
	<li>W ImageJ/Fiji wybierz w menu Wtyczki > zszywania > Zszywanie siatki/kolekcji, a następnie wybierz Nieznana pozycja, aby wybrać obrazy przeznaczone do zszycia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Wybierz Plik > Zapisz jako > Tiff, aby zapisać gotowy obraz jako TIFF (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Użyj ImageJ/Fiji, aby otworzyć obraz i upewnij się, że format obrazu to Kolor RGB (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C).</li>
	<li>Wybierz z menu Plugins > IHC Profiler Image, a następnie wybierz Mode > Cytoplasmic Stained Image (Tryb obrazu barwionego cytoplazmatycznie i domyślną dekonwolucję kolorów) H DAB (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2D). Następnie przekonwertuj format obrazu na 8-bitową skalę szarości.</li>
	<li>Przekonwertuj wartości szarości obrazu na wartości OD, wybierając opcję Analizuj > Kalibruj > Nieskalibrowany OD (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Użyj funkcji Próg, aby wybrać obszar dodatniego barwienia Perls/DAB, a następnie dostosuj poziome paski przewijania, aż wszystkie brązowe plamy sygnałowe zostaną pokryte kolorem czerwonym (Rysunek 2F).</li>
	<li>Kliknij przycisk Analizuj > Ustaw pomiary, a następnie wybierz opcje Obszar, Średnia wartość szarości, Gęstość zintegrowana i, co najważniejsze, Ogranicz do progu, aby wykluczyć szum tła (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G).</li>
	<li>Wybierz opcję Analizuj > Mierz, aby uzyskać tabelę wyników (Rysunek 2H).</li>
	<li>Grupuj wyniki i korzystaj z oprogramowania statystycznego do przeprowadzania analiz statystycznych. W naszym przypadku porównaliśmy akumulację żelaza w hipokampie i korze myszy transgenicznych 5xFAD z akumulacją w grupie kontroli negatywnej (myszy typu dzikiego). W przypadku porównań trzech grup zastosowano jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA) dla danych z rozkładu Gaussa o tym samym odchyleniu standardowym.</li>
</ol>

<ol><li>Karlawish, J., Jack, C. R., Rocca, W. A., Snyder, H. M., Carrillo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+The+next+frontier-special+report+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Dement%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: The next frontier-special report 2017.</a> Alzheimer's Dement. 13 (4), 374-380 (2017).</li>
<li>Praticò, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+hypothesis+in+Alzheimer%27s+disease%3A+A+reappraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress hypothesis in Alzheimer's disease: A reappraisal.</a> Trends in Pharmacol Sci. 29 (12), 609-615 (2008).</li>
<li>Sayre, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+oxidative+catalysis+by+neurofibrillary+tangles+and+senile+plaques+in+alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In situ oxidative catalysis by neurofibrillary tangles and senile plaques in alzheimer's disease.</a> J. Neurochem. 74 (1), 270-279 (2001).</li>
<li>Urrutia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+alters+the+expression+of+dmt1%2C+fpn1+and+hepcidin%2C+and+it+causes+iron+accumulation+in+central+nervous+system+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Inflammation alters the expression of dmt1, fpn1 and hepcidin, and it causes iron accumulation in central nervous system cells.</a> J. Neurochem. 126 (4), 541-549 (2013).</li>
<li>Hardy, J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+Progress+and+problems+on+the+road+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: Progress and problems on the road to therapeutics.</a> Science. 297 (5580), 353-356 (2002).</li>
<li>Scheltens, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 397 (10284), 1577-1590 (2021).</li>
<li>Ficiarà, E., Munir, Z., Boschi, S., Caligiuri, M. E., Guiot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+iron+concentration+in+alzheimer%27s+disease+as+a+possible+diagnostic+biomarker+unveiling+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Alteration of iron concentration in alzheimer's disease as a possible diagnostic biomarker unveiling ferroptosis.</a> Int J Mol Sci. 22 (9), 4479(2021).</li>
<li>Yang, W. S., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferroptosis%3A+Death+by+lipid+peroxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ferroptosis: Death by lipid peroxidation.</a> Trends in Cell Biol. 26 (3), 165-176 (2016).</li>
<li>Lane, D. J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+Alzheimer%27s+disease%3A+An+update+on+emerging+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Iron and Alzheimer's disease: An update on emerging mechanisms.</a> J Alzheimers Dis. 64 (s1), S379-S395 (2018).</li>
<li>Meadowcroft, M. D., Connor, J. R., Smith, M. B., Yang, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mri+and+histological+analysis+of+beta-amyloid+plaques+in+both+human+Alzheimer%27s+disease+and+app%2Fps1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson+Imaging%22%5BJournal%5D)">Mri and histological analysis of beta-amyloid plaques in both human Alzheimer's disease and app/ps1 transgenic mice.</a> J Magn Reson Imaging. 29 (5), 997-1007 (2009).</li>
<li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+iron+and+hydrogen+peroxide%3A+The+Fenton+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Lett%22%5BJournal%5D)">Toxicity of iron and hydrogen peroxide: The Fenton reaction.</a> Toxicol Lett. 82-83, 969-974 (1995).</li>
<li>Silvestri, L., Camaschella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+pathogenetic+role+of+iron+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">A potential pathogenetic role of iron in Alzheimer's disease.</a> J Cell Mol Med. 12 (5a), 1548-1550 (2008).</li>
<li>Gamblin, T. C., King, M. E., Kuret, J., Berry, R. W., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+regulation+of+fatty+acid-induced+tau+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidative regulation of fatty acid-induced tau polymerization.</a> Biochemistry. 39 (46), 14203-14210 (2000).</li>
<li>Meguro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonheme-iron+histochemistry+for+light+and+electron+microscopy%3A+A+historical%2C+theoretical+and+technical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Nonheme-iron histochemistry for light and electron microscopy: A historical, theoretical and technical review.</a> Arch Histol Cytol. 70 (1), 1-19 (2007).</li>
<li>Lehéricy, S., Roze, E., Goizet, C., Mochel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mri+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mri of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> Curr Opin Neurol. 33 (4), 462-473 (2020).</li>
<li>Nabuurs, R. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-field+MRI+of+single+histological+slices+using+an+inductively+coupled%2C+self-resonant+microcoil%3A+Application+to+ex+vivo+samples+of+patients+with+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">High-field MRI of single histological slices using an inductively coupled, self-resonant microcoil: Application to ex vivo samples of patients with Alzheimer's disease.</a> NMR Biomed. 24 (4), 351-357 (2010).</li>
<li>Perl, D. P., Good, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+techniques+for+determining+cellular+iron+distribution+in+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Comparative techniques for determining cellular iron distribution in brain tissues.</a> Ann Neurol. 32 (S1), S76-S81 (1992).</li>
<li>Riemer, J., Hoepken, H. H., Czerwinska, H., Robinson, S. R., Dringen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+ferrozine-based+assay+for+the+quantitation+of+iron+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Colorimetric ferrozine-based assay for the quantitation of iron in cultured cells.</a> Anal Biochem. 331 (2), 370-375 (2004).</li>
<li>Luterotti, S., Kordić, T., Dodig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+iron+and+copper+in+children%27s+sera+by+FAAS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of iron and copper in children's sera by FAAS.</a> Acta Pharm. 61 (1), 93-102 (2011).</li>
<li>Hill, J. M., Switzer, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regional+distribution+and+cellular+localization+of+iron+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The regional distribution and cellular localization of iron in the rat brain.</a> Neuroscience. 11 (3), 595-603 (1984).</li>
<li>Meguro, R., Asano, Y., Iwatsuki, H., Shoumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-perls+and+-turnbull+methods+supplemented+by+dab+intensification+for+nonheme+iron+histochemistry%3A+Demonstration+of+the+superior+sensitivity+of+the+methods+in+the+liver%2C+spleen%2C+and+stomach+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Perfusion-perls and -turnbull methods supplemented by dab intensification for nonheme iron histochemistry: Demonstration of the superior sensitivity of the methods in the liver, spleen, and stomach of the rat.</a> Histochem Cell Biol. 120 (1), 73-82 (2003).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-nitrosylation+of+divalent+metal+transporter+1+enhances+iron+uptake+to+mediate+loss+of+dopaminergic+neurons+and+motoric+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">S-nitrosylation of divalent metal transporter 1 enhances iron uptake to mediate loss of dopaminergic neurons and motoric deficit.</a> J Neurosci. 38 (39), 8364-8377 (2018).</li>
<li>Guillemot, J., Canuel, M., Essalmani, R., Prat, A., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+the+proprotein+convertases+in+iron+homeostasis%3A+Proprotein+convertase+7+sheds+human+transferrin+receptor+1+and+furin+activates+hepcidin%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Implication of the proprotein convertases in iron homeostasis: Proprotein convertase 7 sheds human transferrin receptor 1 and furin activates hepcidin.</a> Hepatology. 57 (6), 2514-2524 (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+light+chain+interacts+with+pen-2+and+affects+%CE%B3-secretase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Ferritin light chain interacts with pen-2 and affects γ-secretase activity.</a> Neurosci Lett. 548, 90-94 (2013).</li>
<li>Jin Jung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+inactivation+of+protein+phosphatase+2a%2C+promoting+proinflammatory+nf-%CE%BAb+in+aged+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces inactivation of protein phosphatase 2a, promoting proinflammatory nf-κb in aged rat kidney.</a> Free Radic Biol Med. 61, 206-217 (2013).</li>
<li>Connor, J. R., Menzies, S. L., Martin, S. M. S., Mufson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+distribution+of+transferrin%2C+ferritin%2C+and+iron+in+normal+and+aged+human+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular distribution of transferrin, ferritin, and iron in normal and aged human brains.</a> J Neurosci Res. 27 (4), 595-611 (2004).</li>
</ol>

Badania te były wspierane przez ogólny projekt Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych (numer grantu: 32271010).

Odkładanie się żelaza jest ściśle związane z chorobą Alzheimera. Z jednej strony może prowadzić do produkcji Aβ poprzez wiele mechanizmów, w tym zwiększoną ekspresję białka prekursorowego amyloidu, a także zwiększoną aktywność γ-sekretazy, co może prowadzić do przyspieszonej produkcji Aβ24; Z drugiej strony, peroksydacja lipidów indukowana przez zwiększoną ilość żelaza może sprzyjać polimeryzacji Tau, co może również prowadzić do zwiększonej nieprawidłowej fosforylacji biał...

Choroba Alzheimera (AD) jest najczęstszym schorzeniem neurodegeneracyjnym i stała się poważnym problemem społecznym. Częstość występowania AD gwałtownie wzrasta wraz z wiekiem1,2,3,4. Główne cechy patologiczne choroby Alzheimera (AD) obejmują odkładanie się blaszek z β-amyloidu (Aβ) oraz splotów neurofibrylarnych (NFTs) wynikających z aberrantnej fosforylacji białek tau. Aβ powstaje w wyniku sekwencyjnego rozszczepiania białka prekursorowego amyloidu (APP) przez enzymy β-sekretaza i γ-sekretaza. Zaburzenia w produkcji lub usuwaniu Aβ prowadzą do jego akumulacji w mózgu, tworząc blaszki amyloidowe, które są uznawane za jeden z najwcześniejszych markerów patologicznych AD. Blaszki te nie tylko powodują bezpośrednie uszkodzenia neuronów, ale także inicjują kaskadę szkodliwych efektów, w tym neurostan zapalny, stres oksydacyjny i dysfunkcję synaptyczną. Wspólnie procesy te przyczyniają się do śmierci neuronów i postępującego upośledzenia funkcji poznawczych obserwowanego w AD5. Pomimo dziesięcioleci badań ukierunkowanych głównie na cechy patologiczne choroby Alzheimera (AD), w tym na odkładanie się blaszek amyloid-β i agregację hiperfosforylowanego białka tau, klinicznie istotne przełomy terapeutyczne pozostają nieuchwytne, a istniejące interwencje wykazują ograniczoną skuteczność w modyfikowaniu postępu choroby6.
Żelazo jest istotnym metalem dla utrzymania funkcji mózgu i bierze udział w transporcie tlenu, syntezie DNA, oddychaniu mitochondrialnym, syntezie mieliny, syntezie neurotransmiterów oraz w metabolizmie. Jednak żelazo staje się szkodliwe, gdy jego stężenia przekroczą zdolności sekwestracji komórkowej6,7,8. Zwiększone odkładanie żelaza, zazwyczaj współwystępujące z blaszkami Aβ, zaobserwowano zarówno w obszarach korowych, jak i w hipokampie mózgu u pacjentów z AD9,10. Poprzez reakcję Fentona11 wewnątrzkomórkowe wolne żelazo może generować rodniki hydroksylowe (•OH) oraz reaktywne formy tlenu. Substancje te nie tylko indukują neurostan zapalny poprzez aktywację komórek glejowych, ale także atakują biomolekuły komórki poprzez stres oksydacyjny, zaburzając prawidłowe funkcje komórkowe i prowadząc do dysfunkcji synaptycznej8,12. Co więcej, zwiększone stężenie żelaza jest bezpośrednio zaangażowane w rozwój oznak patologicznych AD: żelazo przyczynia się do produkcji Aβ12, a także zwiększa dysfunkcję białka tau, prowadząc do powstawania splotów neurofibrylarnych13.
Opracowano szereg technik pozwalających na ocenę zawartości żelaza w mózgu, w tym obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) oraz metody chemiczne i histochemiczne.14. In vivo ilościowe określanie poziomu żelaza wewnątrz mózgowa za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI) ma istotne znaczenie kliniczne w przypadku pacjentów z procesami starzenia oraz neurodegeneracją15Obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) charakteryzuje się zaletą nieinwazyjności i wysokiej czułości: pozwala na wykrycie odkładania się żelaza we wczesnych stadiach choroby. W szczególności technika zależnego od pola wzrostu R2 (FDRI) umożliwia rozróżnienie między różnymi formami żelaza, takimi jak żelazo ferrytynowe i żelazo hemowe.16Jednakże MRI nie pozwala na wykrycie akumulacji żelaza na poziomie komórkowym i jest kosztowne, dlatego znajduje zastosowanie głównie w badaniach klinicznych.17.
Pomiar kolorymetryczny to metoda chemiczna służąca do wyznaczania stężenia substancji (np. żelaza) poprzez pomiar intensywności barwy powstającej w wyniku reakcji substancji w roztworze z czynnikiem chromogenicznym.18Metoda ta jest łatwa w wykonaniu i wykorzystuje niedrogie odczynniki oraz instrumentację, co czyni ją odpowiednią dla laboratoriów z ograniczonym budżetem.18Dokładność i czułość tej metody są jednak bardzo ograniczone, ponieważ wyniki podlegają wpływowi czynników środowiskowych, czasu rozwoju barwy oraz subiektywnej oceny operatora. Inną metodą, którą można wykorzystać do oceny poziomu żelaza, jest płomieniowa spektrometria absorpcyjna (FAAS).19W tej metodzie uzyskuje się klarowny roztwór próbki poprzez spalanie analizowanej tkanki w piecu wysokotemperaturowym. Następnie próbkę rozpuszcza się w kwasie solnym, a następnie wyznacza stężenie żelaza w roztworze. poprzez spektrometria absorpcji atomowej. Metoda ta charakteryzuje się wysoką czułością i jest odpowiednia dla wszystkich rodzajów próbek biologicznych19Proces ten jest jednak czasochłonny i wymaga kosztownej aparatury, co ogranicza jego zastosowanie.
Barwienie metodą Perls'a/DAB w celu wykrywania niehemowego żelaza jonowego (III) jest najczęściej stosowaną metodą wykrywania żelaza ze względu na wysoką swoistość i łatwość wykonania w porównaniu z innymi metodami histochemicznymi14. W przeciwieństwie do analizy kolorymetrycznej, barwienie metodą Perls'a jest jakościową metodą barwienia histochemicznego, która opiera się na reakcji jonów żelaza z żelazocyjankiem potasu w celu wytworzenia niebieskiego osadu. Jest ona wykorzystywana do mikroskopowej wizualizacji obecności i rozmieszczenia żelaza w tkankach. Ponadto metoda ta pozwala na rozróżnienie złogów żelaza w różnych typach komórek oraz obserwację ich rozmieszczenia wewnątrzkomórkowego, co stanowi narzędzie do badania choroby Alzheimera (AD)20. Barwienie metodą Perls'a wykrywa przede wszystkim niehemowe żelazo jonowe (III) i opiera się na tworzeniu kompleksu błękitu pruskiego:
<img alt="Równanie chemiczne: powstawanie błękitu pruskiego z udziałem Fe³⁺, [Fe(CN)₆]⁴⁻, Fe₄[Fe(CN)₆]₃·xH₂O." src="/files/ftp_upload/67501/67501eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">
(Błękit pruski)
Jednakże tradycyjne barwienie metodą Perla jest nieskuteczne w wykrywaniu lokalizacji żelaza przy niskim jego stężeniu. Po dodaniu diaminobenzydyny (DAB) wchodzi ona w reakcję z heksacyjanożelazianem(III), tworząc brunatny związek, co zwiększa specyficzność analizy21.
Celem niniejszego protokołu jest opisanie sposobu oceny ilości i rozmieszczenia złogów żelaza w mózgach mysiego modelu choroby Alzheimera (AD). W protokole tym jako model AD wykorzystano 8-miesięczne myszy transgeniczne 5×FAD (C57BL/6J), które porównano z myszami typu dzikiego w tym samym wieku. Przedstawiono tutaj szczegóły procedur przygotowania odczynnika chemicznego, sekcjonowania mózgu, wykonywania barwienia Perls'/DAB oraz analizy obrazów uzyskanych po barwieniu.

<table><tbody><tr><td>0,1 M PBS</td><td>biosharp</td><td>BL601A</td><td>Dodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać roztwór</td></tr><tr><td>4% PFA&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>P0099</td><td>Przywróć w 4 & stopni; C do stosowania</td></tr><tr><td>20X roztwór DAB</td><td>Bioss</td><td>C-0003</td><td>Mix 10 &mu; l roztwór A, 10 &mu; l roztwór B i 180 &mu; l</td></tr><tr><td>PBS Alcohol</td><td>Supelco</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>7647-01-0</td><td>Dodaj wodę destylowaną do 50 ml</td></tr><tr><td>ketaminy&nbsp;</td><td>Chińskie Narodowe Leki</td><td>H20193336</td><td>100 mg/kg do znieczulenia</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CX43</td><td></td></tr><tr><td>Związek o optymalnej temperaturze skrawania (OCT)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>roztwór żelazocynidu potasu</td><td>Sigma</td><td>14038-43-8</td><td>Dodaj wodę destylowaną do 50 ml</td></tr><tr><td>sacharozy</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>ksylazyna& nbsp;</td><td>Y-S Biotechnology</td><td>YS-(BC)-2842</td><td>15 mg/kg do znieczulania</td></tr><tr><td>Ksyleny</td><td>Sigma</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena osadzania się żelaza w mózgach myszy 5xfad za pomocą barwienia perls/dab

Assessing Iron Deposition in the Brains of 5xFAD Mice by Perls'/DAB Staining

Choroba Alzheimera (AD), powszechna choroba neurodegeneracyjna, jest główną przyczyną demencji u osób starszych. Odkładanie się żelaza jest ściśle związane z patogenezą choroby Alzheimera. W mózgu osoby z chorobą Alzheimera podwyższony poziom żelaza jest silnie skorelowany z charakterystycznymi patologiami AD, w tym blaszkami β-amyloidowymi, splątkami neurofibrylarnymi tau i apoptozą. Coraz więcej dowodów sugeruje, że stres oksydacyjny, spowodowany rozregulowanym metabolizmem żelaza, odgrywa ważną rolę w patofizjologii choroby Alzheimera. Zrozumienie roli akumulacji żelaza w patologii choroby Alzheimera ma zatem kluczowe znaczenie w leczeniu choroby Alzheimera. Kompleksowy protokół barwienia żelaza jest niezbędny do wykrycia ekspresji i dystrybucji żelaza w mózgu. Protokół ten ma na celu opisanie metody oceny ilości i rozkładu odkładania się żelaza w mózgu. Opisujemy procesy związane z przygotowaniem odczynników, leczeniem myszy i przygotowaniem wycinków mózgu. Ponadto przedstawiamy szczegółowy protokół krok po kroku do histochemicznego wykrywania żelaza w skrawkach tkanki mózgowej, któremu towarzyszą systematyczne ramy analityczne integrujące zarówno ocenę ilościową, jak i ocenę morfologiczną, aby zapewnić kompleksową interpretację wyników barwienia. Ten eksperymentalny protokół pomoże naukowcom zrozumieć odkładanie się żelaza w mózgu i wesprze badania nad chorobą Alzheimera.

Aby zbadać rozkład i akumulację żelaza w mysim modelu AD, przeprowadzono barwienie Perls'/DAB w przekrojach strzałkowych 8-miesięcznych myszy 5xFAD. Jak pokazano na Rysunku 3, sygnały barwienia Perls'/DAB zaobserwowano u 8-miesięcznych myszy 5xFAD i typu dzikiego oraz u 2-miesięcznych myszy typu dzikiego. U myszy 5xFAD silne sygnały barwienia Perls'/DAB zaobserwowano w hipokampie i korze, szczególnie w subiculum hipokampa. Myszy typu dzikiego posłużyły jako zwalidowane kontrole negatywne; ob...

Ten protokół przedstawia metody oceny rozkładu i ilości odkładania się żelaza w tkankach, zwłaszcza w mózgu. Protokół szczegółowo opisuje procedury przygotowania próbek, barwienia Perls/DAB, przechwytywania obrazu i analizy danych.

Ocena osadzania się żelaza w mózgach myszy 5xFAD za pomocą barwienia Perls/DAB

Alzheimer's disease (AD), a common neurodegenerative disease, is the leading cause of dementia in the elderly. Iron deposition is closely linked to the ...

Celem tego protokołu jest opisanie sposobu oceny ilości i rozkładu odkładania się żelaza w mózgach myszy z AD. W tym protokole używamy ośmiomiesięcznych myszy transgenicznych 5xFAD jako mysiego modelu AD i porównaliśmy je z myszami typu dzikiego w tym samym wieku. Dołączamy szczegółowe informacje na temat procedur przygotowania odczynnika chemicznego, podziału mózgu, wykonywania barwienia Perls/DAB i analizy uzyskanych obrazów.Odpowiednio znieczulij mysz i sprawdź głębokość znieczulenia i znieczulenia. Odsłoń jego serce, a następnie rozetnij prawe przedsionek. Wstrzyknąć kolejno 20 mililitrów PBS i 4% PFA z lewej komory.Zauważ, że należy obserwować drżenie fiksacji. Odetnij głowę myszy i wydobyj jej mózg. Następnie utrwal mózg w 4% PFA na 12 do 24 godzin.Zanurz mózg w 15% i 30% sacharozie na 12 do 24 godzin. Przetnij mózg strzałkowo od środka i użyj jednej połowy do cięcia. Zamontuj mózg na gałce, umieść pierścień z folii aluminiowej wokół mózgu i dodaj do niego OCT, aby osadzić mózg.Ustaw grubość sekcji i temperaturę kriostatu. Następnie wytnij mózg. Jeśli sekcje się składają, użyj miękkich szczotek, aby je rozłożyć.Zbierz każdą sekcję do szkiełek za pomocą PBS, a następnie wyeliminuj bąbelki na sekcji. Wybierz szkiełko z nienaruszoną tkanką mózgową i umieść je w plastikowym pudełku do barwienia wypełnionym PBS. Umieść pudełko na wytrząsarce obrotowej ustawionej na niską prędkość na pięć minut, aby dokładnie spłukać resztki związku OCT.Przygotuj 20 mililitrów 2% żelazocyjanku potasu i równą objętość 2% kwasu solnego. Następnie wymieszaj je w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Zabezpiecz szkiełko w probówce za pomocą kleszczy i inkubuj mieszaninę w podgrzanej łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut.Umyj szkiełko PBS i zetrzyj nadmiar płynu za pomocą bibuły. Połóż szkiełko płasko na stole laboratoryjnym, a nawet nałóż roztwór DAB na tkankę za pomocą pipety. Inkubuj przez 10 minut, aby wzmocnić barwienie perli.Usuń nadmiar roztworu DAB i spłucz chusteczki, przemywając je trzykrotnie PBS. Odwodnić sekcję sekwencyjnie w stopniowanych roztworach alkoholu i ksylenu przez trzy minuty każdy. Przykryj sekcje neutralną gumą i szkiełkiem nakrywkowym.Następnie pozwól im wyschnąć w dygestorium. Włącz mikroskop. Dostosuj jasność źródła światła.Skoncentruj się na sekcji mózgu pod obiektywem z 4-krotnym powiększeniem. Przesuń stolik mikroskopu, aby skupić się na obszarach o wysokich sygnałach barwienia Perls/DAB, zwłaszcza na hipokampie i korze mózgowej. i rób zdjęcia.Otwórz obraz obiektywu w powiększeniu 10, a następnie przekonwertuj format obrazu na 8-bitową skalę szarości. Wartości szarości obrazu zostały przekonwertowane na wartości OD, a następnie użyto funkcji progowej do pokrycia obszarów dodatnich barwienia Perls/DAB. Wybierz następujące opcje konfiguracji, a co najważniejsze, wybierz opcję Ogranicz do progu, aby wykluczyć szum tła.Na koniec wybierz pomiary, aby uzyskać wyniki do analizy statystycznej. Aby zbadać rozkład i akumulację żelaza w mysim modelu AD, przeprowadziliśmy barwienie Perls/DAB strzałkowych odcinków mózgu. Wysokie sygnały Perls / DAB zaobserwowano w hipokampie i korze, szczególnie w subiculum hipokampa myszy 5xFAD, podczas gdy mózgi zarówno dwumiesięcznych, jak i ośmiomiesięcznych myszy typu dzikiego wykazywały słabszy sygnał.Pod powiększeniem 40 plus sygnał u myszy 5xFAD pojawia się w strukturach przypominających blaszki A-beta, zgodnie z wcześniejszymi badaniami. Wyniki te pokazują skuteczność pozycji Perls/DAB jako techniki histochemicznej do wykrywania żelaza. Pokazujemy również dwa przypadki nieudanego barwienia.W takich przypadkach spowoduje to nadmierne pokrycie lub nieodpowiednie odwodnienie. Barwienie Perls/DAB zapewnia silniejszy sygnał i lepszy kontrast tła niż konwencjonalne barwienie Perls, dzięki czemu wykrywanie żelaza jest bardziej czułe i dokładne. Ponadto wykrywa żelazo w luźno związanych kompleksach białkowych.Żelazo, które jest silnie związane, jak w hemoglobinie, nie będzie reagować. Jest to znacznie zmniejszone niepożądane sygnały spowodowane przez żelazo w czerwonych krwinkach i hemoglobinie. Ogólnie rzecz biorąc, barwienie Perls/DAB jest odpowiednie do eksperymentów na zwierzętach i badań patologicznych, które wymagają specyficzności i czułości przyśrodkowej.Dostarcza naukowcom metody wizualizacji i ilościowego określania akumulacji żelaza kosztem mniejszego czasu i kosztów.

assessing-iron-deposition-brains-5xfad-mice-perls-dab

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Jedną z patologicznych cech AD jest tworzenie się blaszek neurytowych wykazujących obecność białka amyloid β. W niniejszym protokole opisujemy dwie metody wykrywania blaszek neurytowych u myszy w transgenicznym modelu AD: detekcję immunohistochemiczną z wykorzystaniem metody ABC i DAB oraz detekcję fluorescencyjną z zastosowaniem barwienia tioflawiną S.

Wykrywanie blaszek neurytycznych w modelu mysim choroby Alzheimera

Źródło: Mukherjee, K., et. al. Analiza mitochondriów mózgu za pomocą seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej. J. Vis. exp. (2016)Ten film pokazuje przygotowanie,  obrazowanie i analiza tkanki mózgowej myszy przy użyciu seryjnego skaningowego mikroskopu elektronowego z blokową powierzchnią czołową (SBFSEM) w celu wizualizacji ultrastruktury mitochondriów, umożliwiając precyzyjne mapowanie ich morfologii i rozmieszczenia przestrzennego w aksonalnych i dendrytycznych przedziałach...

 Obrazowanie mitochondriów neuronalnych za pomocą seryjnego skaningowego mikroskopu elektronowego typu block-face

Ten manuskrypt opisuje procedurę śledzenia przebudowy układu naczyniowo-mózgowego podczas gromadzenia się blaszek amyloidowych in vivo za pomocą podłużnej mikroskopii dwufotonowej. Preparat z rozcieńczoną czaszką umożliwia wizualizację barwników fluorescencyjnych w celu oceny postępu uszkodzenia naczyń mózgowych w mysim modelu choroby Alzheimera.

Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN

Ilościowe mapowanie metali w tkance za pomocą ablacji laserowej - plazma sprzężona indukcyjnie - spektrometria mas (LA-ICP-MS) to czuła technika analityczna, która może dostarczyć nowego wglądu w to, jak metale uczestniczą w normalnych funkcjach i procesach chorobowych. W tym miejscu opisujemy protokół ilościowego obrazowania metali w cienkich odcinkach tkanki neurologicznej myszy.

Obrazowanie metali w tkance mózgowej metodą ablacji laserowej - Plazma sprzężona indukcyjnie - Spektrometria mas (LA-ICP-MS)

W tym badaniu prezentujemy łatwą i efektywną procedurę oceny uszkodzenia bariery krew-mózg w stanach neurodegeneracyjnych. Aby osiągnąć nasz cel, wstrzyknęliśmy albuminę o wysokiej masie cząsteczkowej izotiocyjanianu fluoresceiny znakowanej (FITC) do żyły szyjnej myszy i oceniliśmy jej wyciek do miąższu mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez dożylną infuzję albuminy znakowanej FITC w mysim modelu choroby neurodegeneracyjnej

Ten protokół opisuje skuteczne i powtarzalne podejście do badań histologicznych mózgu myszy, w tym perfuzję, sekcję mózgu, swobodne barwienie immunologiczne, montowanie tkanek i obrazowanie.

Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy

Ten artykuł pokazuje, jak przygotować i podawać nieradioaktywne izotopowe żelazo związane z transferyną do badań nad transportem żelaza w ciąży myszy. Opisano również podejście do ilościowego oznaczania izotopowego żelaza w przedziałach płodowo-łożyskowych.

Kwantyfikacja transportu żelaza przez łożysko myszy in vivo przy użyciu nieradioaktywnych izotopów żelaza

Tutaj dostępny jest protokół pomiaru zawartości żelaza niehemowego w tkankach zwierzęcych, przy użyciu prostego, dobrze znanego testu kolorymetrycznego, który można łatwo wdrożyć w większości laboratoriów.

Pomiar zawartości żelaza niehemowego w tkankach za pomocą testu kolorymetrycznego na bazie batofenantroliny

Obecny protokół opisuje i porównuje procedurę przeprowadzania analizy całego regionu lub podregionu zainteresowania odcinków mózgu myszy strzałkowej w celu ilościowego określenia obciążenia beta-amyloidu w transgenicznym mysim modelu choroby Alzheimera APP/PS1.

Pełna, kontra subregionalna kwantyfikacja obciążenia beta-amyloidem w wycinkach mózgu myszy

Wcześniaki (poród &lt; 37. tygodniu) to pilny globalny problem zdrowotny z nieoptymalnymi opcjami profilaktyki i leczenia. Przedstawiamy myszy model wcześnianego porodu wywołanego infekcją bakteryjną pochwy oraz opisujemy, jak analizować wynikającą z tego chorobność i śmiertelność noworodków.

Modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy

Poznaj metodę barwienia Perls/DAB do oceny osadzania się żelaza w mózgach myszy 5xFAD z chorobą Alzheimera. Technika ta umożliwia wykrywanie żelaza w hipokampie i korze mózgowej z wysoką czułością.

Ocena osadzania się żelaza w mózgach myszy 5xFAD za pomocą barwienia Perls/DAB

Przeglądaj więcej filmów