Optymalizacja reakcji transkrypcji in vitro do produkcji mRNA z wykorzystaniem chromatograficznego monitorowania at-line
4 kwietnia 2025
Optymalizacja transkrypcji in vitro (IVT) jest kluczowa dla opłacalnej produkcji mRNA. Protokół ten szczegółowo opisuje analityczną metodę chromatograficzną do analizy at-line reakcji IVT, monitorowania zubożenia NTP i produkcji mRNA w trybie wsadowym lub wsadowym, mającą zastosowanie do różnych modalności RNA, zwiększającą wydajność i obniżającą koszty.
Opracowaliśmy szybką metodę chromatograficzną, która rozdziela składniki reakcji IVT i może być stosowana do monitorowania zużycia NTP i produkcji mRNA. Dzięki tej metodzie możemy zoptymalizować reakcję IVT, zmaksymalizować wydajność mRNA przy jednoczesnej minimalizacji powstawania zanieczyszczeń procesowych i kosztu reakcji. Nasza metodologia była pionierska w dziedzinie mRNA, pokazując, w jaki sposób sprzężenie danych analitycznych reakcji IVT może prowadzić do wyższych plonów i niższych kosztów.
W tej dziedzinie prowadzone są obecnie badania nad innymi narzędziami analitycznymi do procesów inline, takimi jak spektroskopia Ramana, ale chromatografia nadal zajmuje kluczowe miejsce ze względu na swoją zdolność rozdzielczą i dużą szybkość. Pokazaliśmy, jak uchwycić wysokoprzepustowe narzędzia analityczne wraz z projektem oprogramowania eksperymentalnego, aby dokonać kompleksowej optymalizacji reakcji IVT. Doprowadziło to do najwyższego odnotowanego wyniku reakcji IVT wynoszącego 25 gramów na litr.
Nasza metoda pozwala na jednoczesne monitorowanie zarówno stężeń mRNA, jak i NTP z krótkimi czasami odczytu, dlatego nadaje się do monitorowania IVT w czasie zbliżonym do rzeczywistego. Dziedzina mRNA zmierza obecnie w kierunku kontynuacji produkcji mRNA, a my oczywiście opracowujemy narzędzia nowej generacji, aby wesprzeć tę transformację. Na początek rozmrozić i podgrzać wszystkie odczynniki, z wyjątkiem enzymów, w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut w bloku termicznym ustawionym na 300 obrotów na minutę.
Oznacz każdą probówkę wyznaczonym numerem transkrypcji in vitro lub IVT i punktem czasowym. Podczas rozmrażania odczynników odpipetuj dwa mikrolitry 100-milimolowego EDTA do sterylnych probówek o pojemności 0,5 mililitra. Teraz wyjmij enzymy z zamrażarki i przechowuj je tymczasowo w lodówce.
Przygotować od 50 do 100 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej z odpowiednimi objętościami odczynników IVT. Dodaj polimerazę RNA T7 jako ostatni odczynnik, gdy wszystkie odczynniki IVT zostaną wymieszane. Natychmiast pobrać dwa mikrolitry mieszaniny IVT i odpipetować ją do wcześniej przygotowanych probówek o pojemności 0,5 mililitra zawierających dwa mikrolitry EDTA.
Umieścić probówki reakcyjne zawierające mieszaniny IVT w bloku termicznym i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W każdym żądanym punkcie czasowym usunąć dwa mikrolitry próbki IVT z mieszaniny reakcyjnej i pipetować do probówek zawierających EDTA. Po analizie chromatograficznej potwierdzonej całkowitym wyczerpaniu NTP, należy wygasić masowe reakcje IVT z EDTA do końcowego stężenia 50 milimolów.
W przypadku reakcji IVT Fed-Batch wymieszaj zapasy każdego NTP i chlorku magnezu. Po ustawieniu reakcji, gdy stężenie NTP spadnie poniżej 10%, dodaj odpowiednią objętość paszy do masowej reakcji IVT. Po osiągnięciu pożądanej produkcji mRNA należy dezaktywować całą reakcję z EDTA do końcowego stężenia 50 milimolów.
W przypadku kondycjonowania w kolumnie, należy zrównoważyć 0,1 mililitra kolumny analitycznej w temperaturze pokojowej przez 12 godzin przed analizą. Przymocować kolumnę do układu chromatograficznego, postępując zgodnie z kierunkiem wskazanym na obudowie kolumny. Następnie przepłukać kolumnę 50 objętościami kolumny podwójnie destylowanej wody, a następnie 50 objętościami kolumny MPA przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę.
Następnie uruchom co najmniej trzy ślepe próbki, wstrzykując tylko MPA przed analizą, aby ustalić linię bazową. Teraz przystąp do analizy próbki testowej przydatności systemu i próbek krzywej kalibracyjnej. W teście przydatności systemu połącz odczynnik zamykający NTP, matrycę plazmidowego DNA i mRNA.
Teraz utwórz wzorzec kalibracyjny, używając rozcieńczonej, oczyszczonej próbki mRNA o znanym stężeniu z ruchomą fazą A. W razie potrzeby utwórz wzorce o końcowych stężeniach NTP 0,5, dwóch, pięciu, 10, 15 i 20 mikromolów w celu wygenerowania krzywej kalibracyjnej dla wszystkich NTP. Określ minimalne rozcieńczenie potrzebne dla próbek IVT za pomocą wzoru. Przed rozcieńczeniem do analizy chromatograficznej należy odwirować i odwirować schłodzoną próbkę IVT.
Odpipetować MPA i chlorek sodu do stożkowej szklanej fiolki, a następnie dodać stłumioną próbkę IVT. Zwirować przygotowaną próbkę i załadować ją do automatycznego podajnika próbek o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wstrzyknąć 25 mikrolitrów rozcieńczonej próbki do kolumny analitycznej i zmierzyć absorbancję przy 260 i 280 nanometrach dla każdej próbki IVT.
Po zakończeniu analizy wszystkich próbek IVT należy ponownie wstrzyknąć wzorzec testu przydatności systemu, aby potwierdzić stabilność systemu. Szybka analityka at-line pozwala monitorować produkcję mRNA w czasie. W tym eksperymencie porównaliśmy wpływ składu buforu IVT na kinetykę IVT.
IVT przeprowadzone z buforem A spowodowało najwyższą szybkość produkcji mRNA, a następnie buforu B i buforu C. Reakcja IVT może być również przeprowadzona jako Fed-Batch. Monitorowanie zużycia NTP pozwala na regulację stężenia poprzez podawanie NTP i chlorku magnezu do reakcji. Ponieważ dodatki paszowe rozcieńczają reakcję IVT, stężenie mRNA w IVT spada przy każdym wydaniu paszy.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szybką metodę chromatograficzną służącą do optymalizacji transkrypcji in vitro (IVT) mRNA. Metoda ta umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym wyczerpywania się NTP oraz produkcji mRNA, co zwiększa wydajność i obniża koszty.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biotechnologia
- Biologia molekularna
- Chemia analityczna
Wstęp
- Transkrypcja in vitro jest niezbędna do produkcji mRNA.
- Monitorowanie zużycia NTP jest kluczowe dla optymalizacji reakcji IVT.
- Chromatografia jest potężnym narzędziem do analizy składników reakcji.
- Wysoko wydajne metody analityczne mogą poprawić efektywność IVT.
Cel badania
- Opracowanie metody monitorowania reakcji IVT w czasie rzeczywistym.
- Maksymalizacja wydajności mRNA przy jednoczesnym ograniczeniu zanieczyszczeń.
- Redukcja kosztów związanych z produkcją mRNA.
Zastosowane metody
- Chromatograficzne rozdzielanie składników IVT.
- Jednoczesne monitorowanie stężeń NTP i mRNA.
- Oprogramowanie do planowania eksperymentów w celu optymalizacji.
- Układ reakcji IVT w trybie fed-batch do ciągłego monitorowania.
Główne wyniki
- Osiągnięto najwyższą raportowaną wydajność mRNA na poziomie 25 g/L.
- Skład buforu znacząco wpłynął na kinetykę IVT.
- Analityka w czasie rzeczywistym poprawiła kontrolę i wydajność procesu.
- Skuteczna integracja danych analitycznych doprowadziła do redukcji kosztów.
Wnioski
- Opracowana metoda zwiększa wydajność i opłacalność procesu IVT.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym jest możliwe i korzystne dla produkcji mRNA.
- Dalsze prace skupią się na narzędziach nowej generacji do wytwarzania mRNA.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Efektywna transkrypcja in vitro (IVT) ma kluczowe znaczenie dla skalowalnej produkcji substancji leczniczej w postaci mRNA, gdzie koszt odczynników i wydajność procesu bezpośrednio wpływają na rentowność portfolio. Chromatograficzny monitoring at-line umożliwia uzyskanie wglądu w kinetykę w czasie rzeczywistym, co wspiera szybką optymalizację i przejście z trybu IVT okresowego (batch) na tryb z dożywianiem (fed-batch). Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną w punkcie zwrotnym rozwoju procesu, prowadząc do redukcji kosztów i wzrostu przepustowości na poziomie przedsiębiorstwa.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną kwantyfikację syntezy mRNA w celu funkcjonalnej analizy celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie wpływu poszczególnych odczynników IVT na kinetykę reakcji.
- Ułatwia szybką iterację i selekcję warunków IVT w celu opracowania stabilnego procesu.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane, ilościowe odczyty zużycia NTP oraz wydajności mRNA w celu standaryzacji testu.
- Poprawia powtarzalność i skalowalność procesów opartych na IVT dzięki analityce w czasie zbliżonym do rzeczywistego.
- Umożliwia przygotowanie zoptymalizowanych systemów IVT do późniejszych badań przesiewowych i zastosowań wysokoprzepustowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje wyniki procesu IVT do wymagań produkcyjnych w skali translacyjnej dla terapeutyków mRNA.
- Zapewnia ciągłość przejścia od syntezy w skali odkrywczej do przedklinicznej produkcji partii.
- Zmniejsza ryzyko niepowodzenia procesu na późniejszym etapie poprzez dostarczenie praktycznych danych kinetycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Chromatograficzny monitoring on-line pozycjonuje optymalizację IVT na styku rozwoju procesu i skalowania produkcji, łącząc wczesny etap odkryć z produkcją przedkliniczną.
- Biologia odkrywcza: Dostarcza danych kinetycznych do testowania hipotez dotyczących wpływu odczynników i wydajności reakcji.
- Przesiewy: Zapewniają szybkie, ilościowe wyniki służące do porównywania warunków i wyboru procesu.
- Analityka: Umożliwia jednoczesny pomiar zużycia NTP i akumulacji mRNA dla rzetelnej analizy statystycznej.
- Badania translacyjne: Wspierają transfer procesu i skalowanie poprzez zapewnienie powtarzalności oraz spójności wydajności.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy analityczną platformę możliwości, którą można dostosować do różnych konstruktów mRNA i protokołów IVT.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie wydajności procesu IVT oraz optymalizacji uzysku.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji, powtarzalności i wysokoprzepustowej analityce procesowej.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) oraz efektywne pod kątem kapitałowym opracowywanie procesów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów mRNA z uwzględnieniem ryzyka oraz gotowość do skalowalnej produkcji.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w opracowywaniu metod chromatograficznych oraz interpretacji danych kinetycznych.
- Wymaga dostępu do systemów wysokorozdzielczej chromatografii cieczowej i infrastruktury analitycznej at-line.
- Konieczne jest uzgodnienie międzyzespołowe standardów pobierania próbek, rejestracji danych oraz kontroli procesu.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych matryc IVT i systemów buforowych przy zastosowaniu odpowiedniej kalibracji.
- Przepustowość i obsługa próbek mogą być ograniczone przez wydajność aparatury oraz integrację przepływu pracy.
