Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek

Przedmiotem badań jest patogeneza białaczki. Naszym celem jest zidentyfikowanie genów krytycznych dla nieprawidłowej proliferacji HSPC poprzez połączenie z CRISPR/Cas9 z testami CCK-8, ujawniając ich rolę w nowotworze i potencjał jako celów leków.

Edycja genów oparta na CRISPR/Cas-9 zapewnia proste i skuteczne podejście do osiągnięcia nokautu genów w komórkach eukariotycznych. Obecnym wyzwaniem eksperymentalnym jest dalsze zwiększenie wydajności nokautowania CRISPR/Cas-9.

Nasz protokół wykorzystuje myszy Cas-9 do dostarczania komórkom szpiku kostnego konsultacyjnej ekspresji Cas-9, a tym samym wirusowego dostarczania SGI do komórek, co znacznie poprawia wydajność eksperymentów.

[Prezenter] Na początek pobierz kość udową i piszczel od uśpionej myszy eksperymentalnej. Natychmiast po usunięciu przenieś kość udową i piszczelową do okapu z przepływem laminarnym, aby zachować sterylność. Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra przepłucz jamę szpiku kostnego PBS zawierającym 2% FBS w celu pobrania komórek szpiku kostnego. Pipetuj komórki szpiku kostnego w górę i w dół od 30 do 50 razy, aby rozproszyć je na pojedyncze komórki. Przenieś mieszaninę komórek do 50-mililitrowej probówki i wiruj, aby dobrze wymieszać. Dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do 40 mikrolitrów buforu do lizy erytrocytów i umieść go na lodzie na pięć minut w celu lizy erytrocytów. Następnie dodaj 50 mikrolitrów roztworu błękitu trypanowego. Dobrze wymieszaj i policz żywotne komórki. Następnie odwirować komórki o sile 800 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odessać supernatant. Następnie ponownie zawiesić komórki w stężeniu od jednego do dwóch razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr w szpiku kostnym, podłożu do wstępnej stymulacji. I wsyp 10 mililitrów zawiesiny do 10-centymetrowego naczynia. Inkubuj naczynie przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby zebrać wstępnie stymulowane komórki następnego dnia, dodaj od pięciu do 10 mililitrów PBS zawierającego 2% FBS i energicznie przepłucz płytkę. Przenieś komórki do świeżej probówki i dodaj do nich błękit trypanowy. Policz żywe komórki w mieszaninie. Następnie odwirować komórki w temperaturze 800 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w świeżo przygotowanym roztworze do dezynfekcji w stężeniu około 10 do potęgi sześciu komórek na mililitr. Wysiew cztery mililitry zawiesiny do każdego dołka na płytce sześciodołkowej. Uszczelnić płytkę parafilmem i odwirować ją w stężeniu 1 500 G przez 90 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu delikatnie ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety, nie zmieniając pożywki. Inkubuj płytkę przez cztery do sześciu godzin. Przy pierwszej transfekcji należy zassać około trzech mililitrów pożywki sklarowanej nad osadem z każdej studzienki do probówki i dodać równą objętość pożywki do wstępnej stymulacji szpiku kostnego. Jeśli komórki zostaną przypadkowo zassane, powtórz etapy wirowania i ponownego zawieszania, jak opisano wcześniej. W przypadku wtórnej transfekcji, następnego dnia, usuń od dwóch do trzech mililitrów pożywki z każdej studzienki i dodaj równą objętość świeżo rozmrożonego retrowirusowego roztworu podstawowego wraz z odpowiednimi ilościami hepas i polygreen. Odwirować płytkę o sile 1 500 G przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu delikatnie ponownie zawiesić komórki i kontynuować inkubację przez cztery do sześciu godzin. Teraz zastąp podłoże zgodnie z wcześniejszym opisem i inkubuj przez 24 godziny. Umyć płytkę PBS zawierającą 2% FBS i zebrać komórki. Przefiltruj komórki przez sito o średnicy 70 mikrometrów przed policzeniem żywych komórek za pomocą błękitu trypanowego. Następnie odwirować komórki w temperaturze 800 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawieś komórki w DMEM zawierające 10% FBS i mysią interleukinę-3, interleukinę-6 i czynnik komórek macierzystych. Odwirować około 0,5 do 1x10 do mocy sześciu komórek o stężeniu 800 G przez pięć minut i odrzucić supernatant. Przechowuj osad komórkowy w temperaturze -80 stopni Celsjusza w celu ekstrakcji genomowego DNA. Teraz dodaj 1x10 do mocy czterech komórek na studzienkę do 96-dołkowej płytki, tworząc sześć powtórzonych dołków na grupę. Następnie dodaj 100 mikrolitrów sterylnego PBS do otaczających studzienek i inkubuj do różnych punktów czasowych 0, 24, 48 i 72 godzin. Zassać pożywkę w każdym punkcie czasowym i dodać 110 mikrolitrów pożywki zawierającej 1/10 objętości roztworu CCK-8 do studzienek. Inkubuj mieszaninę przez godzinę. Na koniec zmierz absorbancję przy 450 nanometrach za pomocą spektrofotometru z mikropłytkami. Nokaut Trp53 znacznie zwiększył zdolność proliferacyjną mysich, krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych w porównaniu z grupą kontrolną po 24, 48 i 72 godzinach, mierzonych za pomocą testu CCK-8. Wydajność edycji Trp53 oszacowano na 7,3% przy użyciu analizy TIDE. Sekwencjonowanie nowej generacji ujawniło mutacje występujące w różnych pozycjach genu.