Name: Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Poznaj metodę oceny genów wpływających na proliferację hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu CRISPR/Cas9 i testu CCK-8. Technika ta umożliwia identyfikację potencjalnych celów terapeutycznych w leczeniu białaczki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Uniwersytetowi Medycyny Chińskiej w Pekinie za korzystanie z jego wspólnych usług w celu przeprowadzenia tych badań. Praca ta była wspierana przez Fundusz Młodych Naukowców Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31701280 J. Zhanga).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzone zgodnie z tym protokołem zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Dobrostanu Zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Pekinie.
1. Budowa plazmidów sgRNA ukierunkowanych na geny kandydujące (4 - 5 dni)
<ol>
	<li>Zaprojektuj docelowe sgRNA za pomocą narzędzi do projektowania sgRNA online. Wprowadź docelową sekwencję genomowego DNA do internetowego narzędzia do projektowania sgRNA (np. https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public). Wybierz odpowiednie cele sgRNA i uporządkuj niezbędne oligonukleotydy.</li>
	<li>Przygotuj wstawki oligonugologiczne sgRNA. Zawiesić górną i dolną nić zaprojektowanych oligonukleotydów dla każdego sgRNA (krok 1.1) do końcowego stężenia 100 μM. Przygotować mieszaniny zgodnie z tabelą 1 w celu fosforylacji i wyżarzania oligonukleotydów sgRNA. Stosować następujące parametry termocyklingu: 37 °C przez 30 min; 95 °C przez 5 min; obniżyć do 25 °C przy 5 °C min−1.</li>
	<li>Dodać 1 μl fosforylowanych i wyżarzonych oligonukleinydów do 199 μl ddH2O o temperaturze pokojowej, aby uzyskać rozcieńczony stosunek 1:200.</li>
	<li>Linearyzuj plazmid wektorowy.
	<ol>
		<li>Korzystając z przywoływanego wektora szkieletowego (patrz Tabela materiałów), trawić plazmid wektorowy za pomocą enzymu restrykcyjnego Esp3I (BsmBI). Ustawić reakcje zgodnie z tabelą 1 i inkubować w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Dodać 0,5 μl fosfatazy alkalicznej krewetek (rSAP) do tej samej probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo autokoniugacji liniowego plazmidu.</li>
		<li>Sprawdź, czy linearyzacja się powiodła. Załaduj zlinearyzowane plazmidy i nieoszlifowane plazmidy do elektroforezy na 0,8-1% (w/v) żelu agarozowym.</li>
		<li>Oczyść zlinearyzowany plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania PCR, eluuj w 20 μl ddH2O i określ ilościowo stężenie DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sklonuj oligonukleotydy sgRNA do plazmidu wektorowego, ustawiając reakcje ligacji dla każdego sgRNA zgodnie z tabelą 1. Inkubować w temperaturze 16 °C przez 4 godziny.</li>
	<li>W celu przemiany dodać 10 μl produktu z etapu 1,5 do 50 μl lodowatych, kompetentnych komórek Stbl3, inkubować mieszaninę na lodzie przez 30 minut, szokować ją termicznie w temperaturze 42 °C przez 90 s, a następnie niezwłocznie przywrócić do lodu na 2 minuty. Dodać 200 μl pożywki LB wolnej od antybiotyków do tej samej probówki, Wytrząsać z prędkością 220 obr./min przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie ułożyć płytkę LB zawierającą 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnego dnia zbadaj płytki pod kątem wzrostu kolonii. Z każdej płytki wybierz 6-8 kolonii i sprawdź, czy sgRNA jest prawidłowo wstawione za pomocą colony PCR. Wybierz dodatnie kolonie i zaszczep poszczególne kolonie w 5 ml pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny za pomocą sterylnej końcówki pipety. Inkubować i wstrząsać kulturą w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Wyizoluj plazmidowe DNA z kultur za pomocą mini zestawu do oczyszczania plazmidowego DNA. Sekwencja z promotora U6, aby upewnić się, że sekwencja prowadząca 20-nt jest prawidłowo włożona.</li>
</ol>
2. Opakowanie lentiwirusowe (2 - 3 dni)
<ol>
	<li>Hodowla komórek HEK 293T w pożywce DMEM uzupełniona 10% (v/v) płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% (v/v) roztworem penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Przeprowadź przez HEK293T komórki, odsysając starą pożywkę z szalki Petriego i delikatnie umyj naczynie 2x 3 ml PBS. Dodać 1 ml trypsyny do 10 cm naczynia i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 minutę. Dodaj 3 ml ciepłej pożywki DMEM do naczynia, aby dezaktywować trypsynę, zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml i wiruj w temperaturze 800 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki i w razie potrzeby umieścić komórki w nowych szalkach. 
	UWAGA: Do produkcji lentiwirusa należy użyć komórek HEK 293T z mniej niż 10 pasażami.</li>
	<li>Szesnaście do 24 godzin przed transfekcją wysiewaj HEK293T komórki na 10 cm szalki o gęstości 2-4 × 106 komórek na talerzu. Upewnij się, że używany DMEM jest wolny od antybiotyków.</li>
	<li>Upewnij się, że komórki są zlewane w 70-80% w dniu transfekcji. Przekształć 10-15 μg plazmidu na 10 cm naczynie i utrzymuj stosunek molowy plazmidu do PEI 1:3. Przygotować Mix 1 i Mix 2 do transfekcji zgodnie z Tabelą 2.</li>
	<li>Odstaw Mix 2 na 5 minut. Dodaj Mix 2 do Mix 1 (uważaj, aby nie odwrócić kolejności dodawania), dokładnie wymieszaj, a następnie odstaw na 15-20 minut.</li>
	<li>Dodać kompleks (krok 2.5) do komórek, delikatnie wstrząsnąć naczyniem do wymieszania i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Sześć do 8 godzin później zastąp pożywkę podłożem DMEM (zawierającym 10% FBS).</li>
	<li>Dwa dni po rozpoczęciu transfekcji lentiwirusa zbierz supernatanty lentiwirusa z szalek. Wirować przy 4 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przefiltrować przez membranę mikrofiltracyjną 0,45 μm. Dozować lentiwirusa i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Pobrany lentiwirus można zagęścić w zależności od potrzeb. Unikaj zmniejszania miana wirusa z powodu wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja i hodowla komórek szpiku kostnego (12 - 13 dni)
UWAGA: Wszystkie linie myszy były utrzymywane w czystym genetycznym tle C57BL/6. Myszy LSL-Cas9 (T002249) skrzyżowano z myszami Mx1-Cre13 w celu wygenerowania LSL-Cas9/+; Myszy Mx1-Cre/+. Tutaj pobraliśmy komórki szpiku kostnego z Mx1-Cre/+; Myszy LSL-Cas9/+ i ich rodzeństwo z miotu.
<ol>
	<li>Aby wywołać ekspresję rekombinazy Cre, należy wstrzyknąć myszom (w wieku 8-12 tygodni) dootrzewnowo 150 μl poliinozyno-polycytidylu (1,5 mg / ml) w dniu 1 i 3. W 6. dniu należy wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 5-fluorouracyl (5-FU, 150 mg/kg). 
	UWAGA: Transgeniczne myszy Mx1-Cre są zaprojektowane do ekspresji rekombinazy Cre pod kontrolą indukowalnego promotora Mx113. Dootrzewnowe wstrzyknięcie poliinozyno-polycytydylu może skutecznie aktywować promotor Mx1 i indukować ekspresję rekombinazy Cre14. Wstrzyknięcie 5-FU jest wykorzystywane do zubożenia komórek proliferujących w szpiku kostnym, indukując w ten sposób HSC do cyklu komórkowego i powodując względną obfitość HSPCs15. Po leczeniu 5-FU można pobrać około 2-4 × 106 komórek szpiku kostnego na mysz.</li>
	<li>W dniu 11 poświęć myszy przez uduszenie CO2. Weź kość udową i piszczelową myszy, przepłucz jamę szpiku kostnego PBS zawierającym 2% FBS za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml i zbierz komórki szpiku kostnego zgodnie z opisem Gavrilescu i wsp.16. 
	UWAGA: Przenieś kości do okapu z przepływem laminarnym, gdy tylko kość piszczelowa i strzałkowa zostaną usunięte z myszy, aby zachować sterylność podczas pobierania komórek szpiku kostnego.</li>
	<li>Pipetuj komórki szpiku kostnego w górę iw dół (30-50x), aby rozproszyć je na pojedyncze komórki, a następnie przenieś mieszaninę komórek do probówki o pojemności 50 ml i wiruj, aby dobrze wymieszać.</li>
	<li>Dodać 10 μl zawiesiny komórkowej do 40 μl buforu do lizy erytrocytów i umieścić na lodzie na 5 minut, aby umożliwić lizę erytrocytów. Dodaj 50 μl roztworu błękitu trypanowego, dobrze wymieszaj i policz żywotne komórki.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 800 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić komórki w stężeniu 1-2 × 106 komórek/ml w pożywce do prestymulacji szpiku kostnego, jak opisano w Tabeli 3. Wysiewaj komórki w 10-centymetrowych szalkach, 10 ml / talerz i inkubuj przez 24 godziny.</li>
</ol>
4. Transfekcja lentiwirusowa komórek szpiku kostnego (2 - 3 dni)
<ol>
	<li>Następnego dnia zbierz komórki z wstępnie stymulowanych płytek. Energicznie przepłukać płytkę 5--10 ml PBS zawierającego 2% FBS. Policz żywotne komórki, dodając błękit trypanowy, jak opisano w kroku 3.4.</li>
	<li>Odwirować komórki z stężeniem 800 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować roztwór do infekcji wirusowej zgodnie z opisem w Tabeli 4.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w świeżo przygotowanym roztworze do dezynfekcji (∼106 komórek/ml). Wysiewaj zawieszone komórki na 6-dołkową płytkę, 4 ml na dołek. Uszczelnić płytkę 6-dołkową parafilmem i odwirować płytkę o masie 1 500 × g przez 90 minut w temperaturze 32 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu ponownie zawiesić komórki delikatnie pipetą (ale nie zmieniać pożywki), a następnie inkubować płytkę przez 4-6 godzin w inkubatorze.</li>
	<li>Przy pierwszej transfekcji należy ostrożnie odessać jak najwięcej pożywki supernatantowej z każdej studzienki (~3 ml) i dodać równą objętość pożywki do prestymulacji szpiku kostnego. Jeśli niektóre komórki zostaną przypadkowo odessane podczas zabiegu, odwirować przy 800 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzuć supernatant, ponownie zamieszaj komórki niewielką ilością pożywki do prestymulacji, a następnie dodaj je z powrotem do studzienki.</li>
	<li>W przypadku wtórnej transfekcji, następnego dnia, usunąć 2-3 ml pożywki z każdej studzienki i dodać równą objętość świeżo rozmrożonego roztworu podstawowego retrowirusa wraz z odpowiednimi ilościami HEPES i polibrenu, jak opisano w Tabeli 4. Odwirować płytkę w temperaturze 1 500 × g przez 90 minut, w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu delikatnie ponownie zawiesić komórki i kontynuować inkubację płytki w inkubatorze przez 4-6 godzin.</li>
	<li>Wymień podłoże jak w kroku 4.5. Inkubować przez 24 godziny.</li>
</ol>
5. Wykonaj test in vitro CCK-8 (3 - 4 dni)
<ol>
	<li>Energicznie przepłucz studzienki, aby zebrać komórki szpiku kostnego. Przemyć płytkę PBS zawierającym 2% FBS, aby uzyskać maksymalną liczbę komórek. Przefiltrować komórki przez sito o wielkości 70 μm i policzyć żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego, jak opisano w kroku 3.4.</li>
	<li>Odwirować komórki o masie 800 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki z DMEM zawierającym 10% FBS i mIL-3, mIL-6 (10 ng / ml), mSCF (100 ng / ml) na 1 × 105 komórek/ml. Weź ~0,5-1 × 106 komórek i odwiruj przy 800 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i przechowywać osad komórkowy w temperaturze -80 °C w celu ekstrakcji genomowego DNA.</li>
	<li>Dodaj komórki do 96-dołkowych płytek o gęstości 1 × 104 komórek na dołek. Wykonaj sześć powtórzonych studzienek dla każdej grupy. Dodaj 100 μl sterylnego PBS do kręgu studzienek wokół dołków, w których wysiewane są komórki. Inkubować przez 0, 24, 48 i 72 godziny.</li>
	<li>Ostrożnie odessać pożywkę z płytki 96-dołkowej w odpowiednim punkcie czasowym. Dodać 110 μl pożywki zawierającej 1/10 objętości CCK-8 do studzienek. Skonfiguruj pustą grupę (tylko nośnik i CCK-8, bez komórek). Inkubować w inkubatorze przez 1 godzinę.</li>
	<li>Odczytać wartość absorbancji 450 nm za pomocą spektrofotometru mikropłytkowego.</li>
	<li>Użyj oprogramowania statystycznego do analizy danych eksperymentalnych i wyraź dane eksperymentalne jako średnią ± odchylenie standardowe (średnia ± SD). Przeanalizuj różnice między dwiema grupami za pomocą testu t dla prób niezależnych, gdzie P < 0,05 oznacza statystycznie istotną różnicę.</li>
</ol>
6. Weryfikacja edycji genów (5 - 7 dni)
<ol>
	<li>Wyodrębnij genomowe DNA (krok 5.3) za pomocą zestawu do oczyszczania genomowego DNA zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Zaprojektuj startery, które wzmacniają region od 200 do 500 pz skoncentrowany wokół miejsca cięcia sgRNA (Tabela 5).</li>
	<li>W przypadku sekwencjonowania Sangera należy przygotować mieszaninę zgodnie z tabelą 6 dla PCR. Amplifikować docelowe fragmenty genów za pomocą termocyklera w następujący sposób: 95 °C przez 5 minut, 40 cykli (95 °C przez 30 s, 58 °C przez 30 s, 72 °C przez 9 s), 72 °C przez 10 min, 4 °C ∞, 
	UWAGA: Edycję genów można również zweryfikować za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS), a produkt PCR musi zostać oczyszczony za pomocą zestawu do oczyszczania NGS.</li>
	<li>Przeanalizuj wyniki sekwencjonowania Sangera na stronie internetowej TIDE (http://tide.nki.nl). Oblicz wydajność edycji sgRNA, wprowadzając sekwencję sgRNA i wyniki sekwencjonowania zarówno z grupy eksperymentalnej, jak i kontrolnej do tego narzędzia online. 
	UWAGA: Przeanalizuj wyniki NGS za pomocą CRISPREsso2 (http://crispresso.pinellolab.org/submission)17. Odczyty wejściowe z parowanym końcem (dwa pliki) lub odczyty z jednym końcem (pojedynczy plik) w formacie fastq lub fastq.gz z eksperymentu z głębokim sekwencjonowaniem, wraz z sekwencją referencyjną i sekwencją sgRNA. Oprogramowanie oceni i określi ilościowo docelową mutagenezę.</li>
</ol>

<ol><li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nat Rev Genet. 21 (9), 541-554 (2020).</li>
<li>Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells%3A+Concepts%2C+definitions%2C+and+the+new+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells: Concepts, definitions, and the new reality.</a> Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).</li>
<li>Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell%3A+Self-renewal+versus+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).</li>
<li>Vetrie, D., Helgason, G. V., Copland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leukaemia+stem+cell%3A+Similarities%2C+differences+and+clinical+prospects+in+cml+and+aml%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The leukaemia stem cell: Similarities, differences and clinical prospects in cml and aml.</a> Nat Rev Cancer. 20 (3), 158-173 (2020).</li>
<li>Chopra, M., Bohlander, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+of+origin+and+the+leukemia+stem+cell+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">The cell of origin and the leukemia stem cell in acute myeloid leukemia.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (12), 850-858 (2019).</li>
<li>Cox, C. V., Diamanti, P., Evely, R. S., Kearns, P. R., Blair, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD133+on+leukemia-initiating+cells+in+childhood+all%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of CD133 on leukemia-initiating cells in childhood all.</a> Blood. 113 (14), 3287-3296 (2009).</li>
<li>González-García, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7R+is+essential+for+leukemia-initiating+cell+activity+of+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-7R is essential for leukemia-initiating cell activity of T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 134 (24), 2171-2182 (2019).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-rna-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-rna-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Porteus, M. H., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+nucleases+stimulate+gene+targeting+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells.</a> Science. 300 (5620), 763-763 (2003).</li>
<li>Wang, S. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+applications+and+future+perspective+of+CRISPR%2FCas9+gene+editing+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer.</a> Mol Cancer. 21 (1), (2022).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIT-Cas9%3A+A+CRISPR%2Fcas9+genome-editing+device+under+tight+and+effective+drug+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">HIT-Cas9: A CRISPR/cas9 genome-editing device under tight and effective drug control.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 13, 208-219 (2018).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Kühn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li>
<li>Arnheiter, H., Skuntz, S., Noteborn, M., Chang, S., Meier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+intracellular+immunity+to+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with intracellular immunity to influenza virus.</a> Cell. 62 (1), 51-61 (1990).</li>
<li>Randall, T. D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+changes+induced+at+the+clonal+level+in+hematopoietic+stem+cells+after+5-fluorouracil+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional changes induced at the clonal level in hematopoietic stem cells after 5-fluorouracil treatment.</a> Blood. 89 (10), 3596-3606 (1997).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Murine retroviral bone marrow transplantation models for the study of human myeloproliferative disorders. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGavrilescu%2C+LC+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22">Curr Protoc Pharmacol</a>. Chapter 14 (Unit 14.10), (2008).</li>
<li>Pinello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+CRISPR+genome-editing+experiments+with+CRISPResso%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Analyzing CRISPR genome-editing experiments with CRISPResso.</a> Nat Biotechnol. 34 (7), 695-697 (2016).</li>
<li>Cai, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+long+noncoding+RNA+CRISPRi+screen+identifies+PRANCR+as+a+novel+regulator+of+epidermal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A genome-wide long noncoding RNA CRISPRi screen identifies PRANCR as a novel regulator of epidermal homeostasis.</a> Genome Res. 30 (1), 22-34 (2020).</li>
<li>Ng, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modeling+and+functional+validation+of+candidate+tumor+suppressor+genes+in+small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modeling and functional validation of candidate tumor suppressor genes in small cell lung cancer.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117 (1), 513-521 (2020).</li>
<li>Crowther, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+CRISPR-Cas9+screening+reveals+ubiquitous+T+cell+cancer+targeting+via+the+monomorphic+MHC+class+i-related+protein+MR1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide CRISPR-Cas9 screening reveals ubiquitous T cell cancer targeting via the monomorphic MHC class i-related protein MR1.</a> Nat Immunol. 21 (2), 178-185 (2020).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+labeling+of+genomic+loci+with+dCas9+and+engineered+sgRNAs+using+CRISPRainbow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 528-530 (2016).</li>
<li>Szlachta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knockout+screening+identifies+combinatorial+drug+targets+in+pancreatic+cancer+and+models+cellular+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">CRISPR knockout screening identifies combinatorial drug targets in pancreatic cancer and models cellular drug response.</a> Nat Commun. 9 (1), 4275(2018).</li>
<li>Baeten, J. T., Liu, W., Preddy, I. C., Zhou, N., Mcnerney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crispr+screening+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+reveals+an+enrichment+for+tumor+suppressor+genes+within+chromosome+7+commonly+deleted+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Crispr screening in human hematopoietic stem and progenitor cells reveals an enrichment for tumor suppressor genes within chromosome 7 commonly deleted regions.</a> Leukemia. 36 (5), 1421-1425 (2022).</li>
<li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+crispr-cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using crispr-cas9.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 192-198 (2016).</li>
<li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancy+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Technologia CRISPR/Cas9 jest szeroko stosowana w badaniach biomedycznych ze względu na jej przyjazny dla użytkownika charakter i wysoką wydajność, ułatwiając takie zastosowania, jak badania przesiewowe funkcji genów18, modelowanie chorób19, immunoterapia20 oraz znakowanie i obrazowanie żywych komórek21. W ostatnich badaniach przeprowadzono zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe CRISPR w celu zidentyfikowania nowych cel...

Hematopoeza, która wytwarza wszystkie linie komórek krwi przez całe życie, jest utrzymywana przez małą populację zwaną hematopoetycznymi komórkami macierzystymi (HSC). HSC utrzymują się poprzez samoodnawianie i wytwarzają różnych zaangażowanych przodków, którzy dają początek w pełni zróżnicowanym funkcjonalnym komórkom krwi1,2,3. Proces ten jest ściśle regulowany. Jednak akumulacja mutacji nowotworowych w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) utrudnia normalne różnicowanie, nadaje nieprawidłową zdolność proliferacyjną i ostatecznie przekształca HSPC w komórki inicjujące białaczkę (LIC)4,5,6,7. Identyfikacja i potwierdzenie mutacji białaczkowych nadal pozostaje dużym wyzwaniem dla badań nad rakiem.
Ostatnio opracowano system CRISPR/białko 9 (Cas9) związany z regularnymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi/CRISPR, który stał się efektywną i precyzyjną metodą edycji genów, składającą się z nukleazy Cas9 i jednoprowadnicowego RNA (sgRNA)8. sgRNA kieruje kompleks Cas9-sgRNA do określonej lokalizacji genomowej poprzez komplementarność RNA-DNA, gdzie nukleaza Cas9 indukuje pęknięcia podwójnej nici. Uszkodzone DNA jest poddawane endogennym mechanizmom edycji genów albo poprzez precyzyjną naprawę kierowaną homologią w obecności szablonów homologii, albo podatne na niedopasowanie, niehomologiczne łączenie końców, co prowadzi do małych insercji lub delecji9. Obecnie system CRISPR/Cas9 stał się potężnym narzędziem do ukierunkowanej edycji genów i regulacji transkrypcji10.
Tutaj użyliśmy technologii CRISPR/Cas9 do wprowadzenia zmian genetycznych w HSPC, a następnie przeprowadziliśmy test Cell Counting Kit-8 (CCK-8), aby zbadać, czy wprowadzone mutacje były krytyczne dla nieprawidłowej proliferacji HSPC. W szczególności, komórki szpiku kostnego wzbogacone o HSPC zostały pobrane od myszy Cas9, a następnie transfekcja wirusa z sgRNA ukierunkowanymi na geny kandydujące. Następnie przeprowadzono test CCK-8 w celu ustalenia, czy mutacje nadawały zwiększoną zdolność proliferacyjną transfekowanym HSPC. Wreszcie, mutacje wprowadzone przez CRISPR/Cas9 zostały potwierdzone przez Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)11 lub targeted deep sequence12. Protokół ten stanowi potężne narzędzie do oceny mutacji nowotworowych i potencjalnych celów terapeutycznych w białaczce.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m membrana mikrofiltracyjna</td><td>Sartoriu</td><td>16533K-1</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka</td><td>EP LABLEAD</td><td>MCT-150-CLD-1</td><td></td></tr><tr><td>10 cm miska</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówka</td><td>LABLEAD</td><td>LXG1500</td><td></td></tr><tr><td>1 mL sterylna strzykawka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x Accurate Taq Master Mix (dye plus)</td><td>Dokładna</td><td>biologia AG11010</td><td>Do PCR kolonii</td></tr><tr><td>Probówka 50 ml</td><td>LABLEAD</td><td>LXG5000</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluorouracyl</td><td>Sigma</td><td>F6627-1</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m sito komórkowe</td><td>Falcon&reg;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>ACK Bufor do lizy</td><td>Leagene</td><td>CS0001</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BIODEE</td><td>DE0010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Solarbio</td><td>A8180</td><td></td></tr><tr><td>Stosowane termocyklery Biosystems do PCR</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>Bimake</td><td>B34304</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>eppendorf</td><td>Wirówka 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean& Koncentrator-5</td><td>ZYMO</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Krew & Zestaw Tissure</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I (BsmbI)</td><td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>ExCell</td><td>FSP500</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9.3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T</td><td>ATCC; Wirginia, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>V900477</td><td></td></tr><tr><td>KOD-Plus-Neo</td><td>TOYOBO</td><td>KOD-401</td><td></td></tr><tr><td>lentiGuide-Puro</td><td>Addgene</td><td>52963</td><td>wektor szkieletowy</td></tr><tr><td>LSL-Cas9</td><td>myszy Model Animal Centrum Badawcze UNIWERSYTET NANJING&nbsp;</td><td></td><td></td>T002249</tr><tr><td>spektrofotometr absorbancji mikropłytek</td><td>BIO-RAD</td><td>xMark&trade;</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Rhawn</td><td>R019772</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Proteintech</td><td>B600070</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100x</td><td>plazmid Solarbio</td><td>P1400</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Beyotime</td><td>C0351</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa kwasu poliinozynowo-policytydylowego</td><td>Sigma</td><td>P1530</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>RecombinantMurineIL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13-10ug</td><td></td></tr><tr><td>RecombinantMurineIL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16-2ug</td><td></td></tr><tr><td>RecombinantMurineSCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03-10ug</td><td></td></tr><tr><td>Regularna agaroza</td><td>BIOWEST</td><td>BY-R0100</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna z krewetkami (rSAP)</td><td>NEB</td><td>M0371S</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax QuickDrop Ultra-Micro Spektrofotometr</td><td>URZĄDZENIA MOLEKULARNE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 Kompetentne komórki</td><td>BioMed</td><td>BC108-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa T4</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4-Ligaza</td><td>Takara</td><td>2011B</td><td></td></tr><tr><td>TIANprep Szybki zestaw mini plazmidów</td><td>TIANGEN</td><td>DP105-03</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>LABLEAD</td><td>C0040-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>WEHI-CM</td><td>Biotechnologia Nanjing Fuksai&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CBP50079 EKSTRAKT DROŻDŻOWY</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii crispr/cas9 ze zliczaniem komórek

Evaluation of Abnormal Growth-related Genes of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells by Combining CRISPR/Cas9 Technology with Cell Counting

Hematopoetyczne komórki macierzyste posiadają zdolność do długotrwałej samoodnowy i potencjał do różnicowania się w różne typy dojrzałych komórek krwi. Jednak nagromadzenie mutacji nowotworowych w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) może blokować normalne różnicowanie, indukować nieprawidłową proliferację i ostatecznie prowadzić do białaczki. Aby zidentyfikować i/lub ocenić mutacje nowotworowe, połączyliśmy technologię CRISPR/Cas9 z testem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) w celu zbadania modelowego genu Trp53, który jest niezbędny do nieprawidłowej zdolności proliferacyjnej HSPC. W szczególności komórki szpiku kostnego wzbogacone o HSPC od myszy Cas9 zostały pobrane, a następnie poddane transfekcji wirusowej z jednoprowadnicowymi RNA (sgRNA) ukierunkowanymi na jeden lub kilka genów kandydujących w celu wprowadzenia zmian genetycznych w HSPC. Następnie przeprowadzono test CCK-8 w celu zbadania zdolności proliferacyjnej transfekowanych HSPC. Skuteczność celowania w sgRNA została potwierdzona za pomocą testu Tracking of Indels by Decomposition. Te zidentyfikowane geny mogą odgrywać kluczową rolę w białaczce i mogą służyć jako potencjalne cele terapeutyczne.

Wpływ nokautu genu Trp53 na zdolność proliferacyjną mysich HSPC 
W niniejszym protokole jako przykład zastosowano nokaut genu Trp53. Aby zbadać wpływ nokautu Trp53 na zdolność proliferacyjną mysich HSPC, wykorzystano transfekcję lentiwirusową w celu wprowadzenia sgRNA dla Trp53 do komórek szpiku kostnego wykazujących ekspresję Cas9, wzbogaconych w HSPC po zastosowaniu 5-FU. Równocześnie do komórek szpiku kostnego od rzutników (litte...

Tutaj prezentujemy protokół, który integruje technologię CRISPR/Cas9 z testem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) w celu identyfikacji genów kandydujących, które są kluczowe dla nieprawidłowej zdolności proliferacyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek

Hematopoietic stem cells possess the ability for long-term self-renewal and the potential to differentiate into various types of mature blood cells. ...

Przedmiotem badań jest patogeneza białaczki. Naszym celem jest zidentyfikowanie genów krytycznych dla nieprawidłowej proliferacji HSPC poprzez połączenie z CRISPR/Cas9 z testami CCK-8, ujawniając ich rolę w nowotworze i potencjał jako celów leków.Edycja genów oparta na CRISPR/Cas-9 zapewnia proste i skuteczne podejście do osiągnięcia nokautu genów w komórkach eukariotycznych. Obecnym wyzwaniem eksperymentalnym jest dalsze zwiększenie wydajności nokautowania CRISPR/Cas-9.Nasz protokół wykorzystuje myszy Cas-9 do dostarczania komórkom szpiku kostnego konsultacyjnej ekspresji Cas-9, a tym samym wirusowego dostarczania SGI do komórek, co znacznie poprawia wydajność eksperymentów.[Prezenter] Na początek pobierz kość udową i piszczel od uśpionej myszy eksperymentalnej. Natychmiast po usunięciu przenieś kość udową i piszczelową do okapu z przepływem laminarnym, aby zachować sterylność. Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra przepłucz jamę szpiku kostnego PBS zawierającym 2% FBS w celu pobrania komórek szpiku kostnego. Pipetuj komórki szpiku kostnego w górę i w dół od 30 do 50 razy, aby rozproszyć je na pojedyncze komórki. Przenieś mieszaninę komórek do 50-mililitrowej probówki i wiruj, aby dobrze wymieszać. Dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do 40 mikrolitrów buforu do lizy erytrocytów i umieść go na lodzie na pięć minut w celu lizy erytrocytów. Następnie dodaj 50 mikrolitrów roztworu błękitu trypanowego. Dobrze wymieszaj i policz żywotne komórki. Następnie odwirować komórki o sile 800 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odessać supernatant. Następnie ponownie zawiesić komórki w stężeniu od jednego do dwóch razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr w szpiku kostnym, podłożu do wstępnej stymulacji. I wsyp 10 mililitrów zawiesiny do 10-centymetrowego naczynia. Inkubuj naczynie przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby zebrać wstępnie stymulowane komórki następnego dnia, dodaj od pięciu do 10 mililitrów PBS zawierającego 2% FBS i energicznie przepłucz płytkę. Przenieś komórki do świeżej probówki i dodaj do nich błękit trypanowy. Policz żywe komórki w mieszaninie. Następnie odwirować komórki w temperaturze 800 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w świeżo przygotowanym roztworze do dezynfekcji w stężeniu około 10 do potęgi sześciu komórek na mililitr. Wysiew cztery mililitry zawiesiny do każdego dołka na płytce sześciodołkowej. Uszczelnić płytkę parafilmem i odwirować ją w stężeniu 1 500 G przez 90 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu delikatnie ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety, nie zmieniając pożywki. Inkubuj płytkę przez cztery do sześciu godzin. Przy pierwszej transfekcji należy zassać około trzech mililitrów pożywki sklarowanej nad osadem z każdej studzienki do probówki i dodać równą objętość pożywki do wstępnej stymulacji szpiku kostnego. Jeśli komórki zostaną przypadkowo zassane, powtórz etapy wirowania i ponownego zawieszania, jak opisano wcześniej. W przypadku wtórnej transfekcji, następnego dnia, usuń od dwóch do trzech mililitrów pożywki z każdej studzienki i dodaj równą objętość świeżo rozmrożonego retrowirusowego roztworu podstawowego wraz z odpowiednimi ilościami hepas i polygreen. Odwirować płytkę o sile 1 500 G przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu delikatnie ponownie zawiesić komórki i kontynuować inkubację przez cztery do sześciu godzin. Teraz zastąp podłoże zgodnie z wcześniejszym opisem i inkubuj przez 24 godziny. Umyć płytkę PBS zawierającą 2% FBS i zebrać komórki. Przefiltruj komórki przez sito o średnicy 70 mikrometrów przed policzeniem żywych komórek za pomocą błękitu trypanowego. Następnie odwirować komórki w temperaturze 800 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawieś komórki w DMEM zawierające 10% FBS i mysią interleukinę-3, interleukinę-6 i czynnik komórek macierzystych. Odwirować około 0,5 do 1x10 do mocy sześciu komórek o stężeniu 800 G przez pięć minut i odrzucić supernatant. Przechowuj osad komórkowy w temperaturze -80 stopni Celsjusza w celu ekstrakcji genomowego DNA. Teraz dodaj 1x10 do mocy czterech komórek na studzienkę do 96-dołkowej płytki, tworząc sześć powtórzonych dołków na grupę. Następnie dodaj 100 mikrolitrów sterylnego PBS do otaczających studzienek i inkubuj do różnych punktów czasowych 0, 24, 48 i 72 godzin. Zassać pożywkę w każdym punkcie czasowym i dodać 110 mikrolitrów pożywki zawierającej 1/10 objętości roztworu CCK-8 do studzienek. Inkubuj mieszaninę przez godzinę. Na koniec zmierz absorbancję przy 450 nanometrach za pomocą spektrofotometru z mikropłytkami. Nokaut Trp53 znacznie zwiększył zdolność proliferacyjną mysich, krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych w porównaniu z grupą kontrolną po 24, 48 i 72 godzinach, mierzonych za pomocą testu CCK-8. Wydajność edycji Trp53 oszacowano na 7,3% przy użyciu analizy TIDE. Sekwencjonowanie nowej generacji ujawniło mutacje występujące w różnych pozycjach genu.

evaluation-abnormal-growth-related-genes-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ukierunkowana edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 znacznie ułatwiła zrozumienie biologicznych funkcji genów. W tym przypadku wykorzystujemy metodologię CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej.

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Ten manuskrypt opisuje metodę opartą na CRISPR-Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) do prostego i szybkiego badania roli wielu genów kandydujących w równoległej proliferacji komórek ostrej białaczki szpikowej (AML). Technika ta jest skalowalna i może być stosowana również w innych liniach komórek nowotworowych.

Badanie zależności genetycznych za pomocą testów konkurencji opartych na CRISPR-Cas9

Biblioteka CRISPR/sgRNA została zastosowana do badania genów kodujących białka. Jednak wykonalność biblioteki sgRNA w celu odkrycia funkcji granicy CTCF w regulacji genów pozostaje niezbadana. W tym miejscu opisujemy bibliotekę sgRNA specyficzną dla loci HOX, aby wyjaśnić funkcję granic CTCF w loci HOX.

PRZEKĄTNA TERENU Badania przesiewowe biblioteki CRISPR/sgRNA skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice CTCF

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Bezpośrednie dostarczanie wstępnie złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9/przewodnikowego RNA to szybki i skuteczny sposób na edycję genomu w komórkach krwiotwórczych. Tutaj wykorzystujemy to podejście do usunięcia tłumika intronowego RUNX1 i zbadania odpowiedzi transkrypcyjnych w komórkach białaczkowych OCI-AML3.

Badanie transkrypcyjnej roli tłumika intronowego RUNX1 przez rybonukleoproteinę CRISPR/Cas9 w komórkach ostrej białaczki szpikowej

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w celu solidnego wszczepienia komórek z edytowanymi genami in vivo.

Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

Nowatorskie strategie wiernego modelowania mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) są niezbędne do lepszego badania biologii hematopoetycznych komórek macierzystych i nowotworów hematologicznych. W tym miejscu opisano protokół modelowania heterozygotycznych mutacji typu gain-of-function w HSPC poprzez połączenie użycia CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji dawcy rAAV.

Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Opracowaliśmy zoptymalizowany protokół przesiewowy CRISPR-Cas9 dla pierwotnych komórek CAR T. Poprzez redukcję przenoszenia gDNA poprzez trawienie enzymatyczne i pulldown kasety sgRNA, podejście to minimalizuje artefakty PCR, zapewniając dokładne wykrywanie sgRNA i solidną identyfikację funkcjonalnych celów genowych.

Ulepszanie ekranów CRISPR-Cas9 w komórkach CAR T: udoskonalona metoda przygotowania biblioteki

Poznaj metodę oceny genów wpływających na proliferację hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu CRISPR/Cas9 i testu CCK-8. Technika ta umożliwia identyfikację potencjalnych celów terapeutycznych w leczeniu białaczki.

Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek (Wideo) | JoVE Journal

Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek

Przeglądaj więcej filmów