Name: Równoosiowe urządzenie rozciągające do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek o dużym powiększeniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj równoosiowe rozciąganie komórek w mechanobiologii przy użyciu pneumatycznego urządzenia do mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda pozwala badać odpowiedzi komórek na bodźce mechaniczne w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została wsparta przez fundusze Fundacji "la Caixa" (grant 406 LCF/PR/HR20/52400004 dla X.T., J.V.R. i P.R.-C. oraz stypendia LCF/BQ/DR19/11740009 do 407 I.G.-M. i LCF/BQ/DR19/11740009 dla M.M.J.), hiszpańskiego Ministerstwa Nauki i Innowacji 408 (PID2022-142672NB-I00 dla P.R.-C., PID2021-128635NB-I00 do X.T. i PID2022-141040NA-I00 409 do I.A.), Generalitat de Catalunya (2021 SGR 01425 do X.T. i P.R.-C.), Nagroda "ICREA 410 Academia" za doskonałość w badaniach naukowych dla P.R.-C., Fundació la Marató de TV3 (201936-30-31 do 411 P.R.-C.), Unii Europejskiej (ERC, MECHANOSYNTH, grant 101097753 dla P.R-C. i ERC, Adv-412 883739 Epifold do X.T.). Wyrażone poglądy i opinie są jednak wyłącznie poglądami i opiniami autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy i opinie Unii Europejskiej lub Agencji Wykonawczej Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych. Ani Unia Europejska, ani organ przyznający pomoc nie mogą być za nie pociągnięte do odpowiedzialności. A.E.M.B. był wspierany przez Sir Henry Wellcome Fellowship (210887/Z/18/Z). Autorzy potwierdzają finansowanie ze stypendium Juan de La Cierva wspieranego przez MCIU/AEI/10.13039/501100011033 oraz Europejski Fundusz Społeczny Plus (FSE+) (JDC2023-051559-I do V.V.). IBEC jest laureatem nagrody Severo 415 Ochoa Award of Excellence przyznawanej przez firmę MINCIN. Dziękujemy V González-Tarragó za pomoc w tworzeniu systemu stretch oraz Evelyn Coderch za wsparcie techniczne. Chcielibyśmy również podziękować za wsparcie udzielone przez Unitat de Criomicroscòpia Electrònica TEM/SEM (Centres Científics i Tecnològics de la Universitat de Barcelona, CCiTUB) oraz MicroFabSpace and Microscopy Characterization Facility, Unit 7 ICTS "NANBIOSIS" z CIBER-BBN w IBEC. Dziękujemy również Marii Garcia Parajo za ułatwienie komunikacji z warsztatem mechanicznym ICFO i firmą Tecnifill za sprawną pomoc w inżynierii części.

<ol><li>Huang, L., Mathieu, P. S., Helmke, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stretching+device+for+high-resolution+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A stretching device for high-resolution live-cell imaging.</a> Ann Biomed Eng. 38 (5), 1728-1740 (2010).</li>
<li>Meza, D., Abejar, L., Rubenstein, D. A., Yin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shearing-stretching+device+that+can+apply+physiological+fluid+shear+stress+and+cyclic+stretch+concurrently+to+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">A shearing-stretching device that can apply physiological fluid shear stress and cyclic stretch concurrently to endothelial cells.</a> J Biomech. Eng. 138 (3), 4032550(2016).</li>
<li>Constantinou, I., Bastounis, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-stretching+devices%3A+advances+and+challenges+in+biomedical+research+and+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-stretching devices: advances and challenges in biomedical research and live-cell imaging.</a> Trends Biotechnol. 41 (7), 939-950 (2023).</li>
<li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelasticity+of+human+alveolar+epithelial+cells+subjected+to+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Viscoelasticity of human alveolar epithelial cells subjected to stretch.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287 (5), L1025-L1034 (2004).</li>
<li>Kaunas, R., Nguyen, P., Usami, S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+effects+of+Rho+and+mechanical+stretch+on+stress+fiber+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cooperative effects of Rho and mechanical stretch on stress fiber organization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (44), 15895-15900 (2005).</li>
<li>Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+measurements+in+cultured+vascular+smooth+muscle+cells+subjected+to+mechanical+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation.</a> Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).</li>
<li>Wipff, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+covalent+attachment+of+adhesion+molecules+to+silicone+membranes+for+cell+stretching+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications.</a> Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).</li>
<li>Wen, H., Blume, P. A., Sumpio, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+integrins+and+focal+adhesion+kinase+in+the+orientation+of+dermal+fibroblasts+exposed+to+cyclic+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Wound+J%22%5BJournal%5D)">Role of integrins and focal adhesion kinase in the orientation of dermal fibroblasts exposed to cyclic strain.</a> Int Wound J. 6 (2), 149-158 (2009).</li>
<li>Chu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+induces+hair+regeneration+through+the+alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch induces hair regeneration through the alternative activation of macrophages.</a> Nat. Commun. 10 (1), 1524(2019).</li>
<li>Le Roux, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanochemical+feedback+between+curved+membranes+and+BAR+protein+self-organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanochemical feedback between curved membranes and BAR protein self-organization.</a> Nat. Commun. 12 (1), 6550(2021).</li>
<li>Kosmalska, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+of+membrane+remodelling+during+cell+mechanoadaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Physical principles of membrane remodelling during cell mechanoadaptation.</a> Nat. Commun. 6 (1), 7292(2015).</li>
<li>Quiroga, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanosensing+mechanism+controls+plasma+membrane+shape+homeostasis+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A mechanosensing mechanism controls plasma membrane shape homeostasis at the nanoscale.</a> Elife. 12, e72316(2023).</li>
<li>Casares, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydraulic+fracture+during+epithelial+stretching%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydraulic fracture during epithelial stretching.</a> Nat Mater. 14 (3), 343-351 (2015).</li>
<li>Beedle, A. E. M., et al. Fibrillar adhesion dynamics govern the timescales of nuclear mechano-response via the vimentin cytoskeleton. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeedle%2C+AEM+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2023).</li>
<li>Kechagia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laminin-keratin+link+shields+the+nucleus+from+mechanical+deformation+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">The laminin-keratin link shields the nucleus from mechanical deformation and signalling.</a> Nat Mater. 22 (11), 1409-1420 (2023).</li>
<li>Andreu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+force+loading+rate+drives+cell+mechanosensing+through+both+reinforcement+and+cytoskeletal+softening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">The force loading rate drives cell mechanosensing through both reinforcement and cytoskeletal softening.</a> Nat. Commun. 12 (1), 4229(2021).</li>
<li>Phuyal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+strain+stimulates+COPII+-dependent+secretory+trafficking+via+Rac1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical strain stimulates COPII -dependent secretory trafficking via Rac1.</a> EMBO J. 41 (18), e110596(2022).</li>
<li>Oria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+loading+explains+spatial+sensing+of+ligands+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Force loading explains spatial sensing of ligands by cells.</a> Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).</li>
<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
<li>Faure, M. L., Gómez-González, M., Baguer, O., Comelles, J., Martínez, E., Arroyo, M., Trepat, X., Roca-Cusachs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Micropatterned+Traction+Force+Microscopy%3A+A+Technique+to+Control+3D+Cell+Shape+While+Measuring+Cell-Substrate+Force+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">3D Micropatterned Traction Force Microscopy: A Technique to Control 3D Cell Shape While Measuring Cell-Substrate Force Transmission.</a> Advanced Science. 46, 2406932(2024).</li>
<li>Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fading+media+for+live+cell+GFP+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Anti-fading media for live cell GFP imaging.</a> PLoS One. 7 (12), 53004(2012).</li>
<li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> EMBO J. 37 (1), 139-159 (2018).</li>
<li>Kopek, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+protocols+for+correlative+super-resolution+fluorescence+imaging+and+electron+microscopy+of+chemically+fixed+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples.</a> Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).</li>
<li>Balachandran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+strain+induces+dual-mode+endothelial+to+mesenchymal+transformation+of+the+cardiac+valve%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cyclic strain induces dual-mode endothelial to mesenchymal transformation of the cardiac valve.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (50), 19943-19948 (2011).</li>
<li>Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+stretching+devices+as+research+tools%3A+Engineering+and+biological+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell stretching devices as research tools: Engineering and biological considerations.</a> Lab Chip. 16 (17), 3193-3203 (2016).</li>
<li>Jorba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+elasticity+of+the+lung+extracellular+microenvironment+is+regulated+by+macroscale+tissue+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Nonlinear elasticity of the lung extracellular microenvironment is regulated by macroscale tissue strain.</a> Acta Biomater. 92, 265-276 (2019).</li>
<li>Mayer, C. R., Arsenovic, P. T., Bathula, K., Denis, K. B., Conway, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+3D+printed+stretching+devices+for+imaging+force+transmission+in+live-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of 3D printed stretching devices for imaging force transmission in live-cells.</a> Cell Mol Bioeng. 12 (4), 289-300 (2019).</li>
</ol>

Nie deklarujemy konfliktu interesów.

Do mechanicznego rozciągania próbek biologicznych użyto dużej liczby urządzeń do rozciągania, naśladując warunki fizjologiczne w organizmie24,25. W literaturze dostępnych jest wiele konfiguracji, a obserwacja reakcji próbki jest zwykle wykonywana przez sprzęganie urządzeń rozciągających z siłą atomową26 lub mikroskopią fluorescencyjną27,11.
Przedstawiona...

Cienkie, odkształcalne membrany polidimetylosiloksanu (PDMS) są szeroko stosowane w różnych niestandardowych urządzeniach do rozciągania 1,2,3, ponieważ PDMS jest dobrze znanym biokompatybilnym materiałem obojętnym kompatybilnym kompatybilnym z obrazowaniem mikroskopowym. Tutaj, podobnie jak w wielu innych 4,5,6,7,8,9, prosta koncepcja zastosowania próżni jest wykorzystywana do odkształcenia membrany w celu zmontowania solidnego i kontrolowanego urządzenia do rozciągania równoosiowego. Poprzez zaciśnięcie membrany wewnątrz okrągłego pierścienia i uszczelnienie pierścienia na "słupku rozciągającym" (rysunek 1A-C), uzyskuje się równomierne i izotropowe odkształcenie. Próbka biologiczna znajduje się w środku pierścienia na wolnostojącej membranie PDMS, co umożliwia obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W tym miejscu zaprezentowane są dwie niestandardowe konfiguracje, kompatybilne z dwoma modelami stolików mikroskopowych (ryc. 1D-F) i bardzo wszechstronne pod względem zastosowań biologicznych. Chociaż ogólny projekt jest prosty i można go przenieść na inne etapy, wymiary zestawu muszą być starannie dobrane, aby pasowały do wymagań obrazowania. Po osiągnięciu tego poziomu, profil odkształcenia urządzenia musi zostać scharakteryzowany i zwalidowany.
Oprócz samej konfiguracji przedstawiono prostą metodę wraz z kodem Matlab do charakteryzowania wielkości odkształcenia, jednorodności i izotropii. Urządzenie rozciągające może być następnie wykorzystane do przyłożenia równoosiowych naprężeń rozciągających do układów syntetycznych10, pojedynczych komórek11,12 lub monowarstw13, jednocześnie rejestrując z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną odpowiedź biologiczną próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Błona może być pokryta różnymi białkami adhezyjnymi macierzy zewnątrzkomórkowej14,15. Dodatkowe funkcje mogą być dodawane zgodnie z potrzebami badania biologicznego. Na przykład żele poliakrylamidowe mogą być wiązane z membraną PDMS w celu dostrojenia sztywności podłoża podczas rozciągania13,16, a membrany PDMS mogą być wytwarzane z siatką referencyjną o numerze do późniejszego obrazowania tego samego obszaru zainteresowania w próbce12. Utrwalone próbki można również przetworzyć przez barwienie immunologiczne, a następnie ponownie rozciągnąć w celu obrazowania fluorescencyjnego17. Zastosowany wzór rozciągania może być kontrolowany, od pojedynczego natychmiastowego impulsu rozciągania do cyklicznego odkształcenia o różnych wielkościach, częstotliwościach lub kształtach14,16.

<table><tbody><tr><td>Maska octanowa</td><td>Zdjęcie JD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Biorad</td><td>161-0140</td><td>40% roztwór akryloamidu</td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678 (wersja angielska)</td><td>Nadsiarczan amonu do elektroforezy, &ge; 98%</td></tr><tr><td>Aptes powiedział:</td><td>Sigma Aldrich</td><td>281778</td><td>(3-aminopropylo)trietoksysilan</td></tr><tr><td>Autonomiczna pompa mikroprzepływowa</td><td>Elveflow Kobalt</td><td>Kobaltowy podwójny</td><td>Kobaltowy podwójny</td></tr><tr><td>Bisakryloamid</td><td>Biorad</td><td>161-0142</td><td>2% roztwór bis</td></tr><tr><td>Ostrze</td><td>Fisher Naukowy</td><td>11733919</td><td>Grupa Dydaktyczna Hoja zrobiła &aaacute; ctica X100 LAME BISTOURI STERYLNE N&deg; 23&nbsp; LAMD23&nbsp;</td></tr><tr><td>Klipy</td><td>Sprintis (Sprintis)</td><td>AKXX000001</td><td>Bull Dog Clips, 32 mm, wykonany z metalu, pojemność 10 mm, niklowany</td></tr><tr><td>Obróbka koronowa</td><td>Produkty elektrotechniczne</td><td>BD-20AC, kod produktu:12051A</td><td>BD-20AC LABORATORYJNA OBRÓBKA KORONOWA</td></tr><tr><td>Filiżanek</td><td>Firma VWR</td><td>611-1368</td><td>VWR - Kubki na zlewki, jednorazowe, 250 ml</td></tr><tr><td>DAPI (interfejs DAPI)</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>Barwienie DAPI</td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>Panreac Qu&iacute; mika, SLU</td><td>131085-1212</td><td>Etanol 96% v/v na aaaostry; lisis, ACS- 2,5 L</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma</td><td>F0895 powiedział:</td><td>Fibronektyna, z ludzkiego osocza, płyn&nbsp; 0.1%</td></tr><tr><td>FluoSpheres Mikrosfery modyfikowane karboksylanem, 0,1 i mikro; m</td><td>Technologia życiowa</td><td>F8801, F8803</td><td>Żółte, zielone i czerwone koraliki fluorescencyjne do oceny rozdzielczości</td></tr><tr><td>FluoSpheres Mikrosfery modyfikowane karboksylanem, 0,2 i mikro; m</td><td>Fisher Naukowy</td><td>F8809, F8810</td><td>Żółte, zielone i czerwone koraliki fluorescencyjne do kalibracji szczepu</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6403 powiedział:</td><td>Roztwór aldehydu glutarowego 50% w klasie H<font="font6">2O</td></tr><tr><td>Interferometr</td><td>Veeco&nbsp;</td><td>Wyko NT1100</td><td>Interferometr do pomiaru grubości membran PDMS</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Panreac Qu&iacute; mika, SLU</td><td>Numer katalogowy: 131090-1212&nbsp;</td><td>2-Propanol (Reag. Ph. Eur.) para an&aacute; lisis, ACS, ISO</td></tr><tr><td>Laiton waży</td><td></td><td></td><td>Wykonane na zamówienie</td></tr><tr><td>Chusteczki niestrzępiące się</td><td>Berkshire</td><td>DURX670, DR670090920</td><td>Włókniny-chusteczki</td></tr><tr><td>Smar (wazelina)</td><td>Sigma</td><td>16415</td><td>Wazelina</td></tr><tr><td>Nakładka maski</td><td>S&uuml; ss MicroTec&nbsp;</td><td>MJB4&nbsp;</td><td>Wyrównywacz masek do fotolitografii na płytach PMMA</td></tr><tr><td>Mówił</td><td>Calbiochem - Merck</td><td>475904</td><td>MOWIOL 4-88 Odczynnik</td></tr><tr><td>Mikroskop NIKON wirujący dysk konfokalny</td><td>Nikon</td><td>Zaćmienie Ti-E/B</td><td>wyposażony w aparat Nikon Ti-S-ER&nbsp; scena</td></tr><tr><td>Mikroskop NIKON pionowy</td><td>Nikon</td><td>Zaćmienie Ni-E</td><td>wyposażony w stopień Nikon NI-SH-E</td></tr><tr><td>Obiektyw 60x</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo NIR 60X W</td><td>NIR Apo 60X/1.0w DIC N2 WD 2.8</td></tr><tr><td>Rozwiązanie PBS</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>14200067</td><td>DPBS, 10x</td></tr><tr><td>PDMS (system zarządzania zasobami ludzkimi)</td><td>Dow Corning</td><td>2401673921</td><td>Sylgard - 184 Zestaw elastomerów silikonowych DN 109</td></tr><tr><td>Osłona pierścienia szalki Petriego (duża)</td><td>Szczepionka</td><td>93060</td><td>Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177925 diametro 100</td></tr><tr><td>Osłona pierścienia szalki Petriego (mała)</td><td>Szczepionka</td><td>93060</td><td>Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177924</td></tr><tr><td>Czyścik plazmowy</td><td>Harrick&nbsp;</td><td>PDC-002 (wersja CDC-002)</td><td>Generator plazmy tlenowej</td></tr><tr><td>Płyty i pierścienie z PMMA</td><td></td><td></td><td>Zobacz tabelę specyfikacji programu Excel w dokumentach uzupełniających</td></tr><tr><td>Przedłużać</td><td>Invitrogen</td><td>P36930 /P36934</td><td>Odczynnik zapobiegający blaknięciu ProLong Gold</td></tr><tr><td>Odpychanie-silan</td><td>GE Opieka zdrowotna</td><td>17-1332-01</td><td>PlusOne Repel-Silane ES</td></tr><tr><td>Pierścienie / gumowy pierścień</td><td>Tecnifil powiedział:</td><td></td><td>Wykonane na zamówienie</td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Laur</td><td>WS-650Sz</td><td>Powlekarka wirowa</td></tr><tr><td>SPY650-DNA</td><td>Spirochrom</td><td>Zobacz materiał SC 501</td><td>SPY650-DNA</td></tr><tr><td>Łyżka sterująca</td><td>Firma VWR</td><td>231-0416</td><td>Szpatułka jednorazowa eko krótka, dwustronna łyżka i szufelka, dodatek PP i EcoPure</td></tr><tr><td>Żywica SU8 2100</td><td>Mikrochemia</td><td>Y111075</td><td>SU8-2100 powiedział:</td></tr><tr><td>Deweloper SU8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>Octan eteru monometylowego glikolu propylenowego</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-50ML</td><td>N,N,N',N'-Tetrametyloetylenodiamina, odpowiedni odczynnik. Odczynnik do elektroforezy</td></tr><tr><td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931</td><td>&nbsp; Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>IESMAT</td><td>T5039&nbsp;</td><td>Pęseta Dumont HP 7 ze stali nierdzewnej. Końcówka 0,17 x 0,10 mm. (Agar Scientific Ltd)</td></tr><tr><td>Regulator podciśnienia</td><td>GARCAP/Parker</td><td>&nbsp; 990-005203-005&nbsp;</td><td>Controlador de vacio&nbsp;</td></tr><tr><td>Płynny regulator podciśnienia</td><td>Biegły</td><td>LU-FEZ-N800</td><td>LineUp Flow EZ (n800mbar)</td></tr><tr><td>Biały papier na ławkę</td><td>Raima powiedział:</td><td>931.1001</td><td>&nbsp; Papier Raima 42 x 52</td></tr></tbody></table>

równoosiowe urządzenie rozciągające do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek o dużym powiększeniu

Equibiaxial Stretching Device for High Magnification Live-Cell Confocal Fluorescence Microscopy

Komórki są stale narażone na działanie sił mechanicznych w sytuacjach fizjologicznych i patologicznych, w tym na różne naprężenia rozciągające i ściskające. Prowadzone są bardzo aktywne badania nad tym, w jaki sposób komórki i tkanki reagują i przystosowują się do takich stresów oraz jak te reakcje integrują się z sygnalizacją mechanochemiczną. Spowodowało to zapotrzebowanie na zaawansowane narzędzia kompatybilne ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych i metodami mikroskopowymi, odtwarzające stresy fizjologiczne w badaniach in vitro. W pracy przedstawiono konstrukcję, działanie i charakterystykę urządzenia do rozciągania kompatybilnego z mikroskopią optyczną i fluorescencyjną o wysokiej rozdzielczości. Opracowano i zastosowano w terenie liczne urządzenia do rozciągania, zarówno pneumatyczne, jak i silnikowe. Przedstawiamy szczegółowo jeden z tych systemów, w tym wytyczne projektowe, różnorodne aplikacje i wszystkie narzędzia do wytworzenia podobnej konfiguracji. System oparty jest na odkształcalnej membranie polidimetylosiloksanu (PDMS), rozciąganej równoosiowo po zastosowaniu próżni, co zapewnia jednorodny, powtarzalny i kontrolowany szczep próbki. Zapewnia różnorodne naprężenia rozciągające, od punktowego i natychmiastowego rozciągania po powtarzające się cykle rozciągania i zwalniania o kontrolowanej amplitudzie i częstotliwości. Powlekanie podłoża białkami adhezyjnymi umożliwia wysiewanie komórek z fluorescencyjnymi reporterami w urządzeniu rozciągającym i wykonywanie obrazowania na żywo tych komórek po rozciągnięciu za pomocą mikroskopów fluorescencyjnych o dużym powiększeniu. Naprężenia ściskające można również zastosować, pozwalając próbce dostosować się do rozciągania, a następnie zwalniając ją lub umieszczając próbkę na wstępnie rozciągniętym podłożu przed zwolnieniem rozciągliwym. Dodatkowe wzorce topograficzne podłoża PDMS umożliwiają obrazowanie tej samej próbki w różnych trybach mikroskopii (takich jak mikroskopia fluorescencyjna i elektronowa). Żele poliakrylamidowe mogą być również przyłączane do membrany PDMS, co powoduje rozciąganie komórek wysianych na podłożach o różnej sztywności. Ogólnie rzecz biorąc, dzięki zastosowaniu kontrolowanych naprężeń rozciągających na żywych próbkach, to urządzenie rozciągające, w połączeniu z wysokiej jakości mikroskopią fluorescencyjną, może odpowiedzieć na wiele różnych pytań z zakresu mechanobiologii.

Kalibracja i radialność 
Odpowiednia charakterystyka uzyskanego odkształcenia jest gwarancją powtarzalności i kontroli eksperymentów. Chociaż do każdej próbki można dodać fluorescencyjne kuleczki w celu precyzyjnego zarejestrowania odkształcenia, wcześniejszy etap kalibracji zapewnia właściwe zaplanowanie eksperymentu, pozwalając poznać wielkość odkształcenia, jaką badacz chce przyłożyć do próbki przed faktycznym rozciąganiem. Odkształcenie nie będzie zależeć wyłącznie od przyłożonej próżni, ale będzi...

Tutaj prezentujemy wszechstronne urządzenie do rozciągania równoosiowego, które jest uruchamiane pneumatycznie i kompatybilne z mikroskopią o wysokiej rozdzielczości.

Równoosiowe urządzenie rozciągające do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek o dużym powiększeniu

Cells are continuously exposed to mechanical forces in physiological and pathological situations, including a variety of tensile and compressive stresses. ...

Badamy, jak komórki reagują i przystosowują się do bodźców mechanicznych w kontekście fizjologicznym i patologicznym. W tym celu używamy urządzenia rozciągającego, aby przyłożyć siły zewnętrzne, w tym przypadku odkształcenie, do komórek.Odkryliśmy, w jaki sposób komórki i tkanki komórkowe reagują na określone bodźce mechaniczne i jak mechanicznie reagują na inne sygnały biologiczne.Nasze urządzenie do rozciągania jest bardzo wszechstronne w porównaniu z innymi, ponieważ oferuje możliwość rozciągania komórek hodowanych na żelach poliakrylamidowych o różnej sztywności lub wykonywania eksperymentów kompresyjnych.[Narrator] Aby rozpocząć, umieść pierścienie PMMA na arkuszu białego papieru stołowego. Ostrożnie obejdź krawędź płytki pokrytej PDMS za pomocą ostrza, aby zapewnić czyste cięcie na całym obwodzie. Za pomocą pęsety podnieś membranę na jednej krawędzi, a następnie delikatnie oderwij ją kciukiem, aby równomiernie oderwać połowę membrany od płytki. Palcami równomiernie rozprowadź 96% etanolu na całej górnej powierzchni pierścienia PMMA. Ostrożnie zdejmij membranę PDMS z płyty, podnosząc ją z wcześniej podniesionej krawędzi. Następnie umieść go symetrycznie na pierścieniu PMMA pokrytym etanolem, upewniając się, że nie ma zmarszczek, a jednocześnie unika rozciągania. Następnie weź kolejny pusty pierścień PMMA i umieść go na pierścieniu montażowym. Użyj metalowych klipsów, aby uszczelnić je razem, umieszczając membranę PDMS między dwoma pierścieniami. Umieść dolną połowę pierścienia rozciągającego na wsporniku montażowym. Umieść pierścień PDMS umieszczony na pierścieniu rozciągliwym i mocno dociśnij go w dół, aż zostanie całkowicie osadzony, upewniając się, że uszczelka jest prawidłowo umieszczona. Umieść okrągłe mosiężne ciężarki na górze próbki. Następnie umieść górną połowę metalowego pierścienia rozciągającego na górze, wyrównując otwory na. Włóż wszystkie i dokręć je. Delikatnie przetnij PDMS wokół pierścienia za pomocą ostrza. Przykryj zespół szalką Petriego, aby chronić membranę przed kurzem. Przygotować jedno rozcieńczenie 250 000 kulek fluorescencyjnych o średnicy 0,2 mikrometra w PBS przy użyciu rozcieńczania szeregowego. I umieść kroplę o objętości od 10 do 30 mikrolitrów roztworu kulek na środku PDMS. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze nie wyższej niż 40 stopni Celsjusza, aby uniknąć problemów zakłócających po utwardzeniu. Teraz zamontuj urządzenie do rozciągania na uchwycie stolika mikroskopu i przymocuj drążek do rozciągania na mikroskopie. Obficie nałóż smar na okrągły obszar słupka. Zamontuj przygotowany pierścień rozciągający na słupku rozciągającym i przykręć górną nakrętkę, aby uszczelnić zespół. Następnie podłącz tylną część skrzynki sterowniczej podciśnienia do źródła podciśnienia, a następnie przód skrzynki do słupka rozciągliwego. Aby przeprowadzić kalibrację odkształcenia, wybierz pole zainteresowania o dużej gęstości ściegu i rozpoznawalnych dla użytkownika grudkach ściegów. Uzyskujesz obraz w spoczynku wybranego pola view i zapisz pozycję. Zastosuj rozciąganie przy niskim poziomie podciśnienia minus 20 milibarów, powodując ruch we wszystkich kierunkach. Teraz ponownie ustaw ostrość na płaszczyźnie Z i przesuń stolik w kierunkach XY, aby zlokalizować ten sam obszar zainteresowania i uzyskać obraz w stanie rozciągniętym. Następnie uwolnij napięcie i powtórz kroki z wyższym poziomem podciśnienia. Przechowuj uzyskane obrazy w folderze uporządkowanym według przykładów. Nazwa, obraz koralika referencyjnego uzyskany bez rozciągania w miarę reference_str1 oraz obrazy rozciągane przy rosnących poziomach próżni w miarę stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3 i tak dalej. Aby określić ilościowo szczep, otwórz MATLAB i załaduj kod szczepu żelu. Po ustawieniu parametrów zdefiniuj rodzica, a także ścieżki folderu eksperymentu i uruchom kod. Następnie otwórz stretched_str1 zgodnie z żądaniem kodu, a następnie reference_str1. Teraz oblicz macierz odkształceń mediany dla każdego poziomu próżni. Po powtórzeniu tego procesu dla co najmniej trzech próbek, należy wykreślić medianę macierzy odkształcenia w funkcji poziomu próżni, aby uzyskać krzywą kalibracyjną. Aby pokryć pierścień PDMS, sterylizuj go w świetle ultrafioletowym przez 15 minut. Pod szafką bezpieczeństwa biologicznego przepłukać płytkę pod maską sterylnym PBS. Po zaessaniu całego PBS użytego do przepłukania płytki. Umieść kroplę roztworu o pojemności od 100 do 200 mikrolitrów na środku pierścienia. Narysuj obwód kropli za pomocą markera permanentnego od spodu membrany PDMS i inkubuj ją. W dniu eksperymentu przemyj białko adhezyjne PBS. Po próbie pupsynizacji komórek przystąp do liczenia komórek. Wysiewaj odpowiednią liczbę komórek w małej objętości około 20 do 50 mikrolitrów standardowymi pożywkami komórkowymi, aby ułatwić przyczepianie i inkubuj je w inkubatorze dwutlenku węgla z kontrolą wilgotności. Po 20 do 30 minutach delikatnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki na wierzch komórek i włóż płytkę z powrotem do inkubatora, aby umożliwić dalsze rozprzestrzenianie się komórek. W przypadku pojedynczego cyklu zwalniania rozciągania i obrazowania, zamontuj pierścień rozciągliwy na stoliku mikroskopu, jak pokazano wcześniej. Po zlokalizowaniu interesującej komórki zapisz jej położenie i uchwyć obraz wstępnie rozciągniętej komórki. Zastosuj żądany poziom próżni odpowiadający wymaganemu odkształceniu podłoża w oparciu o krzywą kalibracyjną, aby rozciągnąć ogniwo. Aby zlokalizować komórkę rozciągania, najpierw ponownie ustaw ostrość na płaszczyźnie Z. Następnie przesuń się w kierunkach XY, aby wyśrodkować komórkę w polu widzenia. Nagrywaj obrazy przez żądany czas. Przejdź do pierwotnej pozycji komórki i aktywuj tryb akwizycji mikroskopu, aby upewnić się, że przechwytywanie obrazu rozpocznie się natychmiast po ponownym ustawieniu ostrości. Zwolnij odcinek i szybko ręcznie ustaw ostrość w płaszczyźnie Z. Przechwytuj obrazy zwolnionej komórki przez wymagany czas, ręcznie dostosowując ostrość przez cały czas akwizycji. W celu obróbki końcowej otwórz Fidżi i załaduj obrazy uzyskane w spoczynku i podczas wysiłku. Użyj dopasowania szablonu wtyczki Fidżi, aby wybrać region komórki do wyrównania. Kalibracja zapewniła odtwarzalność i kontrolę nad zastosowanym odkształceniem, potwierdzając niemal liniową zależność między próżnią a odkształceniem do 20%. Analiza przemieszczenia promieniowego wykazała izotropię i jednorodność odkształcenia na membranie PDMS. Obrazowanie fluorescencyjne komórek fibroblastów pod wpływem rozciągania żywych komórek ujawniło wgłębienia błony po uwolnieniu rozciągania, które ponownie wchłonęły się w ciągu trzech do pięciu minut. Ponowne rozciąganie utrwalonych komórek umożliwiło obrazowanie w stanie rozciągniętym, zapobiegając sztucznemu fałdowaniu. Membrana PDMS z wzorzystą siatką ułatwiła obrazowanie multimodalne, umożliwiając lokalizację tych samych komórek w fluorescencji i skaningowej mikroskopii elektronowej. Komórki osadzone na miękkich żelach PAA pokrytych fibronektyną tworzyły zrosty ogniskowe tylko wtedy, gdy zostały poddane określonym cyklicznym cyklom rozciągania w porównaniu z komórkami nierozciągniętymi.

equibiaxial-stretching-device-for-high-magnification-live-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Ilustrujemy zastosowanie osiowych pęset optycznych o stałej sile do badania właściwości mechanicznych krótkich cząsteczek DNA. Poprzez rozciąganie DNA wzdłuż osi minimalizujemy zawady steryczne oraz artefakty występujące w konwencjonalnej manipulacji bocznej, co pozwala nam badać cząsteczki DNA o długości nawet ~100 nm.

Rozciąganie krótkich sekwencji DNA za pomocą osiowych pęset optycznych o stałej sile

Prezentujemy w tym artykule nowatorską platformę rozciągającą, która może być wykorzystana do badania reakcji pojedynczych komórek na złożone anizotropowe dwuosiowe deformacje mechaniczne i ilościowego określania właściwości mechanicznych tkanek biologicznych.

Nowatorska platforma do rozciągania do zastosowań w mechanobiologii komórek i tkanek

Nowatorski protokół obrazowania został opracowany przy użyciu niestandardowego mechanicznego siłownika napędzanego silnikiem, aby umożliwić pomiar reakcji w czasie rzeczywistym na mechaniczne naprężenia w żywych komórkach. Istotny z punktu widzenia mechanobiologii system może nanosić szczepy do 20%, umożliwiając jednocześnie obrazowanie w czasie zbliżonym do rzeczywistego za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii sił atomowych.

Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

Nowe narzędzia do badań mechanobiologii są potrzebne, aby zrozumieć, jak stres mechaniczny aktywuje szlaki biochemiczne i wywołuje reakcje biologiczne. W tym artykule prezentujemy nową metodę selektywnej stymulacji mechanicznej unieruchomionych zwierząt za pomocą pułapki mikroprzepływowej, umożliwiającej obrazowanie odpowiedzi komórkowych w wysokiej rozdzielczości.

Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości

Korzystając z wcześniej zaprojektowanego urządzenia do mechanicznego obciążania przylegających komórek, ten artykuł opisuje przeprojektowaną geometrię podłoża i dostosowane urządzenie do obrazowania pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości z obiektywem 100x zanurzenia w olejku.

Obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego

Prezentowany jest tutaj protokół techniki Conpokal, która łączy mikroskopię konfokalną i mikroskopię sił atomowych w jedną platformę instrumentów. Conpokal zapewnia tę samą komórkę, ten sam region, prawie równoczesne obrazowanie konfokalne i mechaniczną charakterystykę żywych próbek biologicznych.

Niemal równoczesna skaning laserowy Mikroskopia konfokalna i mikroskopia sił atomowych (Conpokal) na żywych komórkach

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.

Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

Tutaj opisujemy narzędzia i metody obliczeniowe, które umożliwiają wizualizację i analizę trzy- i czterowymiarowych danych obrazowych zarodków myszy w kontekście osiowego wydłużania i segmentacji, uzyskanych przez optyczną tomografię projekcyjną in toto oraz przez obrazowanie na żywo i barwienie immunofluorescencyjne w całości za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

Mikroskopia superrozdzielcza może dostarczyć szczegółowych informacji na temat organizacji komponentów w kompleksie synaptonemalnym w mejozie. Tutaj demonstrujemy protokół rozwiązywania poszczególnych białek kompleksu synaptonemalnego Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

Przedstawiamy tutaj nowatorskie urządzenie, które stosuje fale izotropowe i jednoosiowe odkształcenia na komórkach, wspierając hodowlę na substratach o regulowanej sztywności i konfigurowalnych macierzach białkowych. Ta prosta, ekonomiczna platforma umożliwia badaczom badanie, jak mechaniczne sygnały regulują funkcjonowanie komórek zarówno w badaniach podstawowych, jak i w kontekstach związanych z chorobą.

Nowatorska platforma do rozciągania i obrazowania komórkowego in vitro

Poznaj równoosiowe rozciąganie komórek w mechanobiologii przy użyciu pneumatycznego urządzenia do mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda pozwala badać odpowiedzi komórek na bodźce mechaniczne w czasie rzeczywistym.

Równoosiowe urządzenie rozciągające do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek o dużym powiększeniu

Przeglądaj więcej filmów