Równoosiowe urządzenie rozciągające do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek o dużym powiększeniu

Badamy, jak komórki reagują i przystosowują się do bodźców mechanicznych w kontekście fizjologicznym i patologicznym. W tym celu używamy urządzenia rozciągającego, aby przyłożyć siły zewnętrzne, w tym przypadku odkształcenie, do komórek.

Odkryliśmy, w jaki sposób komórki i tkanki komórkowe reagują na określone bodźce mechaniczne i jak mechanicznie reagują na inne sygnały biologiczne.

Nasze urządzenie do rozciągania jest bardzo wszechstronne w porównaniu z innymi, ponieważ oferuje możliwość rozciągania komórek hodowanych na żelach poliakrylamidowych o różnej sztywności lub wykonywania eksperymentów kompresyjnych.

[Narrator] Aby rozpocząć, umieść pierścienie PMMA na arkuszu białego papieru stołowego. Ostrożnie obejdź krawędź płytki pokrytej PDMS za pomocą ostrza, aby zapewnić czyste cięcie na całym obwodzie. Za pomocą pęsety podnieś membranę na jednej krawędzi, a następnie delikatnie oderwij ją kciukiem, aby równomiernie oderwać połowę membrany od płytki. Palcami równomiernie rozprowadź 96% etanolu na całej górnej powierzchni pierścienia PMMA. Ostrożnie zdejmij membranę PDMS z płyty, podnosząc ją z wcześniej podniesionej krawędzi. Następnie umieść go symetrycznie na pierścieniu PMMA pokrytym etanolem, upewniając się, że nie ma zmarszczek, a jednocześnie unika rozciągania. Następnie weź kolejny pusty pierścień PMMA i umieść go na pierścieniu montażowym. Użyj metalowych klipsów, aby uszczelnić je razem, umieszczając membranę PDMS między dwoma pierścieniami. Umieść dolną połowę pierścienia rozciągającego na wsporniku montażowym. Umieść pierścień PDMS umieszczony na pierścieniu rozciągliwym i mocno dociśnij go w dół, aż zostanie całkowicie osadzony, upewniając się, że uszczelka jest prawidłowo umieszczona. Umieść okrągłe mosiężne ciężarki na górze próbki. Następnie umieść górną połowę metalowego pierścienia rozciągającego na górze, wyrównując otwory na. Włóż wszystkie i dokręć je. Delikatnie przetnij PDMS wokół pierścienia za pomocą ostrza. Przykryj zespół szalką Petriego, aby chronić membranę przed kurzem. Przygotować jedno rozcieńczenie 250 000 kulek fluorescencyjnych o średnicy 0,2 mikrometra w PBS przy użyciu rozcieńczania szeregowego. I umieść kroplę o objętości od 10 do 30 mikrolitrów roztworu kulek na środku PDMS. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze nie wyższej niż 40 stopni Celsjusza, aby uniknąć problemów zakłócających po utwardzeniu. Teraz zamontuj urządzenie do rozciągania na uchwycie stolika mikroskopu i przymocuj drążek do rozciągania na mikroskopie. Obficie nałóż smar na okrągły obszar słupka. Zamontuj przygotowany pierścień rozciągający na słupku rozciągającym i przykręć górną nakrętkę, aby uszczelnić zespół. Następnie podłącz tylną część skrzynki sterowniczej podciśnienia do źródła podciśnienia, a następnie przód skrzynki do słupka rozciągliwego. Aby przeprowadzić kalibrację odkształcenia, wybierz pole zainteresowania o dużej gęstości ściegu i rozpoznawalnych dla użytkownika grudkach ściegów. Uzyskujesz obraz w spoczynku wybranego pola view i zapisz pozycję. Zastosuj rozciąganie przy niskim poziomie podciśnienia minus 20 milibarów, powodując ruch we wszystkich kierunkach. Teraz ponownie ustaw ostrość na płaszczyźnie Z i przesuń stolik w kierunkach XY, aby zlokalizować ten sam obszar zainteresowania i uzyskać obraz w stanie rozciągniętym. Następnie uwolnij napięcie i powtórz kroki z wyższym poziomem podciśnienia. Przechowuj uzyskane obrazy w folderze uporządkowanym według przykładów. Nazwa, obraz koralika referencyjnego uzyskany bez rozciągania w miarę reference_str1 oraz obrazy rozciągane przy rosnących poziomach próżni w miarę stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3 i tak dalej. Aby określić ilościowo szczep, otwórz MATLAB i załaduj kod szczepu żelu. Po ustawieniu parametrów zdefiniuj rodzica, a także ścieżki folderu eksperymentu i uruchom kod. Następnie otwórz stretched_str1 zgodnie z żądaniem kodu, a następnie reference_str1. Teraz oblicz macierz odkształceń mediany dla każdego poziomu próżni. Po powtórzeniu tego procesu dla co najmniej trzech próbek, należy wykreślić medianę macierzy odkształcenia w funkcji poziomu próżni, aby uzyskać krzywą kalibracyjną. Aby pokryć pierścień PDMS, sterylizuj go w świetle ultrafioletowym przez 15 minut. Pod szafką bezpieczeństwa biologicznego przepłukać płytkę pod maską sterylnym PBS. Po zaessaniu całego PBS użytego do przepłukania płytki. Umieść kroplę roztworu o pojemności od 100 do 200 mikrolitrów na środku pierścienia. Narysuj obwód kropli za pomocą markera permanentnego od spodu membrany PDMS i inkubuj ją. W dniu eksperymentu przemyj białko adhezyjne PBS. Po próbie pupsynizacji komórek przystąp do liczenia komórek. Wysiewaj odpowiednią liczbę komórek w małej objętości około 20 do 50 mikrolitrów standardowymi pożywkami komórkowymi, aby ułatwić przyczepianie i inkubuj je w inkubatorze dwutlenku węgla z kontrolą wilgotności. Po 20 do 30 minutach delikatnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki na wierzch komórek i włóż płytkę z powrotem do inkubatora, aby umożliwić dalsze rozprzestrzenianie się komórek. W przypadku pojedynczego cyklu zwalniania rozciągania i obrazowania, zamontuj pierścień rozciągliwy na stoliku mikroskopu, jak pokazano wcześniej. Po zlokalizowaniu interesującej komórki zapisz jej położenie i uchwyć obraz wstępnie rozciągniętej komórki. Zastosuj żądany poziom próżni odpowiadający wymaganemu odkształceniu podłoża w oparciu o krzywą kalibracyjną, aby rozciągnąć ogniwo. Aby zlokalizować komórkę rozciągania, najpierw ponownie ustaw ostrość na płaszczyźnie Z. Następnie przesuń się w kierunkach XY, aby wyśrodkować komórkę w polu widzenia. Nagrywaj obrazy przez żądany czas. Przejdź do pierwotnej pozycji komórki i aktywuj tryb akwizycji mikroskopu, aby upewnić się, że przechwytywanie obrazu rozpocznie się natychmiast po ponownym ustawieniu ostrości. Zwolnij odcinek i szybko ręcznie ustaw ostrość w płaszczyźnie Z. Przechwytuj obrazy zwolnionej komórki przez wymagany czas, ręcznie dostosowując ostrość przez cały czas akwizycji. W celu obróbki końcowej otwórz Fidżi i załaduj obrazy uzyskane w spoczynku i podczas wysiłku. Użyj dopasowania szablonu wtyczki Fidżi, aby wybrać region komórki do wyrównania. Kalibracja zapewniła odtwarzalność i kontrolę nad zastosowanym odkształceniem, potwierdzając niemal liniową zależność między próżnią a odkształceniem do 20%. Analiza przemieszczenia promieniowego wykazała izotropię i jednorodność odkształcenia na membranie PDMS. Obrazowanie fluorescencyjne komórek fibroblastów pod wpływem rozciągania żywych komórek ujawniło wgłębienia błony po uwolnieniu rozciągania, które ponownie wchłonęły się w ciągu trzech do pięciu minut. Ponowne rozciąganie utrwalonych komórek umożliwiło obrazowanie w stanie rozciągniętym, zapobiegając sztucznemu fałdowaniu. Membrana PDMS z wzorzystą siatką ułatwiła obrazowanie multimodalne, umożliwiając lokalizację tych samych komórek w fluorescencji i skaningowej mikroskopii elektronowej. Komórki osadzone na miękkich żelach PAA pokrytych fibronektyną tworzyły zrosty ogniskowe tylko wtedy, gdy zostały poddane określonym cyklicznym cyklom rozciągania w porównaniu z komórkami nierozciągniętymi.