Przechwytywanie typowych delikatnych uszkodzeń miejsc za pomocą natywnego γH2A. X ChIP

Nasz luksus skupia się na utracie datowania, roli powszechnej kruchej niestabilności miejsca w jive w regenezie guza. Spróbuj zidentyfikować ruchliwość wirusa w komórkach onkogenu raka gyronowego, które można wykorzystać terapeutycznie. W przeciwnym razie obrazowanie i technologie sekwencjonowania, takie jak sympatia pojedynczej komórki i obrazowanie żywych komórek, zapewniają mapowanie w wysokiej rozdzielczości niestabilności genomu w masie.

Regionalne modele in vivo, w tym szum, genetycznie modyfikowane modele myszy i systemy bazowe CRISPR wokół nas, aby szczegółowo zbadać mechanizmy niestabilności genomu onkogenu. Długoterminowe zainteresowanie naszego laboratorium polega na identyfikacji konkretnych słabych punktów w komórkach nowotworowych, które mogą być strategicznie leczone pod kątem leczenia zakażenia, z naciskiem na minimalizację szkód dla normalnych komórek. Obejmuje to badanie podatności genetycznych i epigenetycznych w celu odkrycia normalnych możliwości terapeutycznych.

Na początek potraktuj limfocyty T HEK 293 dekoliną etylową DMSO i hydroksymocznikiem na trzech różnych płytkach przez 24 godziny. Po dwukrotnym umyciu komórek PBS, odwirować je w temperaturze 500 G cztery, pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach świeżo przygotowanego zimnego buforu A i inkubować na lodzie przez pięć do 10 minut.

Obserwuj postęp lizy pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić całkowitą lizę komórek. Po lizie odwirować zawiesinę komórkową w stężeniu 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesić osad jąder w 500 mikrolitrach zimnego buforu A. Ponownie odwirować i ponownie zawiesić nienaruszone jądra za pomocą 100 mikrolitrów buforu nukleazy mikrokokowej, pipetując od pięciu do 10 razy. Natychmiast dodaj do próbek z góry określoną ilość nukleazy mikrokokowej.

Umieść rurki na rotatorze na pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Natychmiast umieść probówki z lodem i dodaj EDTA, aby zakończyć trawienie. Po wirowaniu dodaj 500 mikrolitrów buforu B i pipetuj w górę iw dół do mieszania.

Inkubować probówkę na lodzie przez pięć minut, aby rozpuścić białka. Aby granulować nierozpuszczalny materiał, należy odwirować próbki z maksymalną prędkością przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś przezroczysty supernatant do nowych 1,5 mililitrowych probówek, oznaczonych jako natywna frakcja chromatyny.

Aby zweryfikować fragmentację chromatyny, podwielokrotność 10 mikrolitrów supernatantu do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Wymieszać sklarowany osad z 20 mikrolitrami wody destylowanej i 30 mikrolitrami fenolowego chloroformu izoamylowego. Po energicznym wirowaniu odwirować probówki o sile 20 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i obserwować trzy wyraźne warstwy: przezroczystą warstwę górną, białą warstwę środkową i żółtą warstwę dolną.

Ostrożnie przenieś 20 mikrolitrów górnej fazy wodnej zawierającej DNA do świeżej probówki. Oddziel oczyszczone DNA w 1,5% żelu agarozowym przez 30 minut przy napięciu 100 woltów. Wizualizuj wzorce trawienia, upewniając się, że rozmiar fragmentów chromatyny wynosi głównie od 200 do 1 000 par zasad.

Przenieść 20 mikrolitrów strawionej chromatyny do każdej probówki, zawierającej 180 mikrolitrów buforu elucyjnego. Oznacz probówki jako próbki wejściowe i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Dodaj 400 mikrolitrów strawionej chromatyny do innej 1,5 mililitrowej probówki do immunoprecypitacji chromatyny lub chipa.

Przenieś przeciwciało gamma H2 AX do próbki poddanej działaniu DMSO, potraktowanej dekoliną etylową i próbki potraktowanej hydroksymocznikiem. Umieść probówki na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza na pięć godzin, a najlepiej na noc. W międzyczasie, używając końcówek z szerokimi otworami, wlej 100 mikrolitrów białka magnetycznego AG klasy chipowej do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra.

Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na jedną minutę, a następnie ostrożnie wylej płyn. Następnie ponownie zawieś kulki w jednym mililitrze PBS zawierającym 0,5% BSA. Obracaj rurkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery godziny.

Umieść probówkę z powrotem na stojaku magnetycznym na jedną minutę i wyrzuć supernatant. Po drugim płukaniu ponownie zawiesić wstępnie zakodowane kulki w 100 mikrolitrach buforu B. Dodać 25 mikrolitrów wstępnie zakodowanej zawiesiny kulek magnetycznych do każdej probówki z próbką wiórów. Obracaj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny, a następnie umieść rurki z wiórami na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż koraliki przyczepią się do boku rurki, a roztwór stanie się klarowny.

Odrzucić klarowny supernatant bez naruszania kulek magnetycznych. Ponownie zawieś kulki w jednym mililitrze bufora do mycia i obracaj w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Umieść probówki z powrotem na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny, zanim wyrzucisz bufor do mycia.

Po ostatnim umyciu krótko odwirować probówki o stężeniu 400 G przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć resztki płynu. Umieść probówki z powrotem na stojaku magnetycznym i ostrożnie usuń pozostały płyn z dna tuby. Po sprawdzeniu skuteczności ściągania przeciwciał chipowych, za pomocą western blot, dodaj 50 mikrolitrów buforu elucyjnego do każdej z pozostałych próbek chipa.

Umieść probówki na mikserze Therma i potrząsaj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umieść probówki na uchwycie magnetycznym na jedną minutę i zbierz eluit do nowych probówek. Dodać 100 mikrolitrów buforu elucyjnego do każdej próbki elucji chipowej i 180 mikrolitrów buforu elucyjnego do każdej próbki wejściowej.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów fenolowo-chloroformowego alkoholu izoamylowego do każdej próbki i energicznie wymieszaj probówki, aby wymieszać. Po odwirowaniu próbek ostrożnie przenieść górną warstwę wodną do probówek zawierających 19 mikrolitrów trzech molowych octanów sodu i dwa mikrolitry roztworu glikogenu. Wymieszaj, wirując rurki.

Dodaj 500 mikrolitrów 100% etanolu do każdej próbki i dokładnie wymieszaj. Umieść probówki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na dwie godziny lub na noc, aby wytrącić DNA. Następnie odwirować probówki przed odrzuceniem supernatantu i ponownym zawieszeniem osadu w jednym mililitrze 70% etanolu.

Po usunięciu pozostałości etanolu przez odwirowanie, wysusz granulki DNA na powietrzu przez dwie do trzech minut przed ponownym zawiesieniem ich w 400 mikrolitrach buforu TE. Wyższe stężenia nukleazy mikrokokowej prowadziły do intensywniejszego trawienia chromatyny, co skutkowało przewagą fragmentów mononukleosomów. Natomiast przy niższych stężeniach nukleazy mikrokokowej większość fragmentów chromatyny była większa, często przekraczająca jeden kilogram zasady.

Poziomy Gamma H2 AX były znacznie podwyższone w komórkach poddanych stresowi replikacyjnemu, potraktowanych dekoliną etylową, w porównaniu z kontrolami traktowanymi DMSO, jak pokazano w próbkach wejściowych zarówno dla chipa natywnego, jak i usieciowanego.