Mechaniczne mapowanie sferoidów za pomocą spektroskopii Brillouina

Stosujemy spektroskopię Brillouina do nieinwazyjnej oceny mechaniki komórek, aby zrozumieć rolę mechanobiologii w postępie choroby. Technologie nieinwazyjne, takie jak spektroskopia Brillouina, pozwalają nam charakteryzować mechanikę w trzech wymiarach, ale bez zakłócania próbki. Na początek należy wstępnie obrobić dołki płytki mikrodołkowej, dodając do każdej jamki 500 mikrolitrów roztworu antyadherencyjnego.

Wirówkuj płytę w temperaturze 1 300 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu pęcherzyków powietrza usuń z otworów roztwór antyadhezyjne. Następnie dodaj jeden mililitr PBS do każdego dołka i całkowicie go zasysaj.

Po powtórzeniu płukania PBS określ liczbę komórek na sferoidę oraz liczbę sferoidów na żel zgodnie z projektem eksperymentalnym. Rozpuszczaj komórki i zawiesuj je w jednym mililitrze uzupełnionego DMEM. Następnie dodaj jeden mililitr tej zawiesiny komórkowej do jednego dołka na mikropłytkę i dobrze wymieszaj.

Wiruj płytę w 100 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Obserwuj płytkę mikrodołek pod mikroskopem, aby potwierdzić równomierny rozkład komórek i to, że osiadają one na dnie dołków. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny, aby umożliwić powstanie sferoidów.

Aby zebrać sferoidy, delikatnie i powoli usuwaj podłoże hodowlane, nie naruszając ich sferoidów. Wytnij końcówkę pipety pokrytą PBS/FBS, aby poszerzyć otwór i dodaj 500 mikrolitrów PBS do każdego dołka, aby usunąć sferoidy. Zbierz PBS zawierający sferoidy do rurki.

Następnie przeniesiono 50 mikrolitrów zawiesiny sferoidowej do jednego dołku płyty z 96 dołkami. Aby ułatwić liczenie, narysuj krzyżyk na dnie dołka markerem permanentnym i policzysz liczbę sferoidów w tej objętości pod mikroskopem. Użyj równania, aby obliczyć całkowitą liczbę sferoidów.

Otwórz oprogramowanie SpectraLok i poczekaj, aż wykryją wszystkie podłączone urządzenia. Następnie wybierz kamerę spektrometru. Zamontuj akrylową kostkę na uchwyt na próbkę mikroskopu tak, że przezroczysta strona będzie skierowana do obiektywu.

Opuść obiektyw tak bardzo, jak to możliwe, i wycentruj kostkę pod nią. Upewnij się, że ścieżka optyczna w mikroskopie jest ustawiona tak, aby kamera spektrometru była naświetlona, przekręcając selektor portu obrotowego, aby L.In okno kamery SpectraLok, ustaw czas ekspozycji sensora na 500 milisekund, a wzmocnienie oprogramowania na 100. Naciśnij Capture i powoli przesuwaj soczewkę obiektywu do góry.

Kontynuuj podnoszenie soczewki, aż piki Brillouina staną się widoczne i ich intensywność się ustabilizuje, co wskazuje, że punkt ogniskowy znajduje się wewnątrz akrylowego sześcianu. Teraz otwórz okno sterowania Pump Killer, czyli PK. Przybliż jedno z najjaśniejszych zamówień Brillouina i dostosuj pozycję siłownika ciśnienia w krokach po 100 mikrometrów, klikając rel ruchu, aby zminimalizować szczytową intensywność Rayleigha.

Jeśli sygnał Rayleigha wzrośnie, kliknij Reverse (Cofnij), aby zmienić kierunek regulacji. Gdy szczytowa intensywność Rayleigha maleje, precyzyjnie dostosowuj ciśnienie etalona w mniejszych odstępach po 10 mikrometrów. W oknie Kamera przybliż jedno z poleceń Brillouina.

Naciśnij S, aby zwizualizować pasy, na których LUT jest nakładany na obraz kamery. Otwórz okno Ustawienia i naciśnij Szybką kalibrację, aby automatycznie przeliczyć optymalny poziomy przesunięcie pasków. Po weryfikacji ustawienia pasków należy wyregulować osie soczewek kolimatora, aby zmaksymalizować efektywność sprzężenia światła z Pump Killer ze spektrometrem.

Następnie otwórz okno Spectrum i kliknij Odwijaj, aby pobrać spektrum. W jednorodnej akrylowej kostce celuj w całkowite tłumienie sygnału Rayleigha i dostosuj sygnał do wyraźnej widoczności sygnału Brillouina. Aby zapisać zoptymalizowane parametry, kliknij Odśwież wszystko, a następnie Zapisz wszystko w oknie sterowania PK.

Na koniec, w głównym oknie, kliknij Zapisz w sekcji File I/O, aby zapisać konfigurację. Po otwarciu oprogramowania skanującego zainstaluj szklaną miskę Petriego zawierającą próbkę hydrogelowego sferoidu zamiast kostki akrylowej. Zdejmij pokrywkę z szalki Petriego, dodaj wystarczająco dużo materiału, by zanurzyć żel, i nałóż na wierzch pokrywkę, aby zapobiec przemieszczaniu się żelu.

Zlokalizuj sferoid, najpierw blokując wiązkę lasera. Przełącz ścieżkę optyczną mikroskopu na okular i włącz oświetlenie białym światłem. Za pomocą joysticka ręcznie steruj etapem próbki, aby zlokalizować i skupić się na sferoidze.

Uzyskaj obraz w świetle sferoidy i reguluj jasność oświetlenia, obracając koło sterujące. Zmień ścieżkę optyczną na R, aby naświetlić kamerę mikroskopową i ustaw czas naświetlania według potrzeb. Następnie ustaw port mikroskopu na L i przechwyć tło z zasłoniętym laserem.

Odblokuj laser i w zależności od pożądanego stosunku sygnału do szumu wybierz czas naświetlania od 200 do 500 milisekund. Spośród nieowiniętych opcji wybierz linię Brillouin Peak Fiting. Dostosuj wartość progową do około połowy szczytowej intensywności Brillouina i wyklucz wszelkie szczyty Brillouina z amplitudą poniżej progu.

Zastosuj korekcję długości fali do lasera zgodnie ze wszystkimi zidentyfikowanymi parami pików Brillouina. Na koniec wybierz geometrię skanu rastrowego, regulując szerokość skanu i rozmiar kroku, a następnie rozpocznij skanowanie, aby zarejestrować pomiary. Reprezentatywne obrazy sferoidu komórek macierzystych mezenchymalnych osadzonych w hydrożelu pokazały wyraźne mapy przesunięcia Brillouina i szerokości linii Brillouina, a także odpowiadające im obrazy fluorescencji z jasnego pola, jąder i filamentów aktyny.

Mapa przesunięcia częstotliwości Brillouina o niskiej rozdzielczości została podzielona na obszary żelowe i sferoidalne na podstawie konturu ręcznie wyznaczonego z obrazu jasnego pola. Niejednoznaczne piksele powstałe w wyniku downsampling zostały wykluczone z analizy, podczas gdy stworzono przezroczyste maski binarne dla regionów żelu i sferoidów do wyodrębnienia wartości BFS. Porównanie map BFS o wysokiej i niskiej rozdzielczości wykazało, że próbkowanie rdzeniowe dostarczało średnich wartości BFS porównywalnych do skanów o wysokiej rozdzielczości, co wskazuje na spójne pomiary mechaniki masy sferoidalnej.

Nasz protokół zapewni platformę, która umożliwi badaczom badanie wielu chorób związanych z mechanobiologią. Ciekawe będzie zobaczyć, czy zmiany w przesunięciu Brillouina, które korelują z właściwościami mechanicznymi komórek, będą skutecznymi markerami dla etapów postępu choroby. Będziemy ocenić, jak leczenie farmakologiczne wpływa na mechanikę sferoidów w skalach czasowych, które naśladują postęp choroby.