Name: Identyfikacja funkcjonalnie istotnych miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Odkryj metodę InSET do identyfikacji funkcjonalnych elementów genomowych w ludzkim genomie przy użyciu mutagenezy insercyjnej opartej na lentiwirusie. Ta technika umożliwia badanie niezbadanych regionów genomu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.X. jest wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32000441), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Fujian w Chinach (2023J01130), Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych Uniwersytetu Huaqiao (ZQN-924) oraz Fundusze Badań Naukowych Uniwersytetu Huaqiao (18BS205). P.K. jest wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32170619), Fundusz Badawczy dla Międzynarodowych Starszych Naukowców z Narodowego Funduszu Przyrodniczego Chińska Fundacja Naukowa (32150710525) oraz Fundacja Nauk Przyrodniczych prowincji Fujian w Chinach (2020J02006).

Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd metody InSET. Aby uzyskać optymalne pokrycie, przygotuj pięć równoległych bibliotek z 1 μg genomowego DNA, a następnie połącz je w celu sekwencjonowania nowej generacji. Ta procedura została pomyślnie zakończona w sposób ciągły w poprzednich testach, chociaż użytkownicy mogą wprowadzać punkty pauzy według własnego uznania. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu wykorzystywanego w tym badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.
1. Przechwytywanie miejsc integracji lentiwirusa w genomie
<ol>
	<li>Użyj genomowego DNA wyizolowanego z biblioteki komórek mutagenezy insercyjnej opartej na lentiwirusie (1 μg), jak opisano w poprzednim badaniu32, jako matrycę do liniowego PCR w reakcji 50 μL zawierającej 1x bufor Taq, polimerazę DNA 2,5 U Taq, 4 μl mieszaniny dNTP (2,5 mM każdy) i 0,3 μM biotynylowanego startera 3-LTR_prime (Tabela 1) w probówce PCR. 
UWAGA: 3-LTR_prime starter wyżarza się do regionu LTR sekwencji lentiwirusa. Jeśli wyżarza się do 5' LTR, amplifikowany fragment zawiera flankującą sekwencję genomową. Jeśli wyżarza się do 3' LTR, amplifikowany fragment zawiera wewnętrzną sekwencję lentiwirusa, której nie można dopasować do genomu gospodarza i dlatego zostanie odfiltrowana podczas dalszej analizy danych sekwencjonowania. Ten starter można również zmodyfikować, aby dostosować się do innych typów wektorów używanych do generowania biblioteki komórek mutagenezy insercyjnej.</li>
	<li>Wykonaj 50 cykli liniowej reakcji PCR w standardowym termocyklerze do PCR, dodając 2,5 j. polimerazy DNA Taq na początku i ponownie natychmiast po 25 cyklach. Warunki PCR są następujące: 94 °C przez 5 min; 50 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; 72 °C przez 5 min. 
	UWAGA: Aby utrzymać aktywność polimerazy DNA Taq podczas przedłużonych reakcji, zaleca się dodanie enzymu zarówno na początku, jak i w środku reakcji.</li>
	<li>Przenieś produkty PCR do nowej, czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj produkty PCR z 10 μl kulek magnetycznych biotyny-streptawidyny.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, wstrząsając z prędkością 400 obr./min w metalowej kąpieli. 
	UWAGA: Wyjmuj probówkę, aby dobrze wymieszać z pipetą co 15 minut.</li>
	<li>Użyj stojaka magnetycznego, aby zebrać koraliki, a następnie ostrożnie usuń supernatant.</li>
	<li>Przemyć kulki 300 μl buforu wiążącego/płuczącego (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween-20) 6 razy i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie 300 μl (65 °C) wody destylowanej wolnej od DNazy/RNaz i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>W przypadku syntezy drugiej nici ponownie zawieś kulki w objętości reakcyjnej 24 μl zawierającej 1x bufor fragmentów Klenowa, 2 μl mieszaniny dNTP (po 2,5 mM) i 6,25 μM startera P5_N6 (Tabela 1) w probówce do PCR. 
	UWAGA: Przygotuj 100 μM roztwór podstawowy P5_N6 podkładu. Starter P5_N6 składa się ze stałej sekwencji adaptera P5 na końcu 5' i losowej sekwencji heksamerowej na końcu 3'. Losowy heksamer może wiązać się z różnorodnym zakresem sekwencji docelowych, dzięki czemu nadaje się do amplifikacji różnych fragmentów DNA generowanych przez liniowy PCR.</li>
	<li>Mieszaninę należy wstępnie inkubować w temperaturze 15 °C przez 20 minut w termocyklerze PCR.</li>
	<li>Dodać 2 j. fragmentu Klenowa (duży fragment polimerazy DNA E.coli).</li>
	<li>Inkubować mieszaniny w termocyklerze PCR w następujących warunkach: powoli narastać w temperaturze 0,5 °C/min od 15 °C do 25 °C, następnie inkubować przez 30 minut; następnie powoli zwiększać temperaturę w temperaturze 0,5 °C/min do 37 °C, a następnie inkubować przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przenieś produkty PCR do nowej, czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Użyj podstawki magnetycznej, aby uchwycić koraliki, a następnie wyrzuć supernatant.</li>
	<li>Delikatnie umyj kulki 300 μl wody destylowanej o temperaturze 4 °C wolnej od DNaz/RNaz. Zebrać koraliki i wyrzucić supernatant.</li>
</ol>
2. Budowa biblioteki NGS z zagnieżdżonym PCR
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić kulki z kroku 1.15 w objętości reakcyjnej 25 μl PCR zawierającej 1x bufor Taq, polimerazę DNA 1,25 U Taq, 0,5 μM startera P5 (tabela 1), 2 μL mieszaniny dNTP (2,5 mM każdy) i 0,5 μM startera 3-LTR_Nest (Tabela 1) w probówce do PCR.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcje PCR w termocyklerze PCR w następujących warunkach: 94 °C przez 3 min; 20 cykli po 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; 72 °C przez 7 min.</li>
	<li>Użyj 5 μl produktów PCR z kroku 2.2 jako matrycy do następnej rundy PCR w objętości 50 μl zawierającej 1x bufor Taq, 2,5 U Taq polimerazę DNA, 4 μl mieszaniny dNTP (2,5 mM każdy), 0,4 μM Illumina_P5 startera (Tabela 1) i 0,4 μM startera Illumina_P7-3LTR (Tabela 1).</li>
	<li>Przeprowadzać reakcje PCR w termocyklerze PCR w następujących warunkach: 94 °C przez 3 min; 15 cykli po 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; 72 °C przez 7 min.</li>
	<li>Przenieś produkty PCR do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Na tym etapie protokół może zostać wstrzymany, a próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Oczyść produkty PCR za pomocą 1,2 raza objętości czystych kulek DNA, doprowadzając końcową objętość do 21 μL. 
	UWAGA: Weź 10 μl produktów PCR z każdej z 5 bibliotek przygotowanych równolegle, połącz je razem i oczyść do końcowej objętości 21 μl. Protokół oczyszczania produktów PCR jest dostosowany do instrukcji producenta dotyczących czystych kulek DNA (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Równowaga kulek od 2-8 °C do temperatury pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj koraliki, odwracając je lub wirując.</li>
		<li>Odpipetować 1,2 raza większą objętość kulek do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodaj produkty PCR do kulek i dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 10 razy.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby umożliwić wiązanie DNA z kulkami.</li>
		<li>Umieścić próbki na stojaku magnetycznym i usunąć supernatant, gdy roztwór będzie klarowny (około 5 minut).</li>
		<li>Dodaj 200 μl 80% etanolu, aby umyć kulki, inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s i usunąć supernatant. 
		UWAGA: 80% etanol powinien być przygotowany na świeżo.</li>
		<li>Powtórz krok 2.6.7 raz.</li>
		<li>Koraliki suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przy otwartej pokrywie przez około 5 minut.</li>
		<li>Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego, dodaj 22 μl wody destylowanej wolnej od DNaz/RNaz, dokładnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół 10 razy i pozostaw w temperaturze pokojowej na 2 minuty.</li>
		<li>Umieść probówkę na stojaku magnetycznym, aż roztwór będzie klarowny (około 2 min), a następnie przenieś 21 μl supernatantu do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: Na tym etapie protokół może zostać wstrzymany, a próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj 1 μl oczyszczonych produktów PCR do pomiaru stężenia za pomocą fluorometru z dostępnym na rynku zestawem do wykrywania fluorescencji dsDNA (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Protokół pomiaru stężenia jest zgodny z instrukcjami producenta zestawu do wykrywania dsDNA.
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór roboczy, mieszając odczynnik i bufor (dostarczone w zestawie) w stosunku 1:200.</li>
		<li>Przygotuj wzorce testu, mieszając 10 μl wzorca #1 i 10 μl wzorca #2 (dostarczonego w zestawie), każdy ze 190 μl roztworu roboczego. Delikatnie mieszaj mieszaninę przez 2-3 sekundy.</li>
		<li>Przygotować próbkę do oznaczenia, mieszając 1 μl oczyszczonych produktów PCR ze 190 μl roztworu roboczego. Delikatnie mieszaj mieszaninę przez 2-3 sekundy.</li>
		<li>Inkubować wzorce do oznaczania i próbki do oznaczania przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem.</li>
		<li>Włącz fluorometr.</li>
		<li>Wybierz program dsDNA High Sensitivity z menu głównego.</li>
		<li>W celu kalibracji włóż Standard #1 do urządzenia, naciśnij przycisk Read standard, aby zmierzyć pierwszy wzorzec, a następnie włóż Standard #2 i naciśnij przycisk Read standard, aby zmierzyć drugi wzorzec.</li>
		<li>Aby zmierzyć próbkę, naciśnij przycisk Uruchom próbki, aby przejść do strony pomiaru próbki. Włóż każdą probówkę zawierającą próbkę testową i naciśnij przycisk Odczyt probówki, aby uzyskać stężenie. 
		UWAGA: Na tym etapie protokół może zostać wstrzymany, a próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonuj NGS na platformach Illumina przy użyciu strategii sparowanego końca 150 pz (PE150) w skali 30 giga (GB). 
	UWAGA: Ten krok jest zwykle zlecany firmom zajmującym się sekwencjonowaniem.</li>
</ol>
3. Analiza danych
UWAGA: Analiza na ludzkich liniach komórkowych została użyta jako przykład w tej sekcji.
<ol>
	<li>Mapowanie miejsc integracji lentiwirusa
	<ol>
		<li>Odfiltruj odczyty sekwencjonowania z ponad 50% podstawami niskiej jakości (wynik Phred <20), więcej niż 15 zasadami "N" lub krótszymi niż 150 zasad za pomocą narzędzia fastp 33 (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Wybieraj tylko odczyty sparowanych końców z odczytem 2 zaczynającym się od tagu LTR "GCCTTGTGTGTGGTAGATCCACAG 
		ATCAAGGATATCTTGTCTTCGTTGGGAGTGAAT 
		TAGCCCTTCCA". 
		UWAGA: Ta sekwencja zależy od sekwencji wektora użytego do wygenerowania biblioteki komórek mutagenezy insercyjnej.</li>
		<li>Przytnij sekwencję znaczników LTR z odczytów wybranych w kroku 3.1.2.</li>
		<li>Dopasuj przycięte odczyty do GRCh37/hg19 za pomocą BWA-MEM 34 (patrz Tabela materiałów) z ustawieniami domyślnymi.</li>
		<li>Zachowaj tylko pary odczytu, w których zarówno odczyt 1, jak i odczyt 2 są jednoznacznie zmapowane do genomu z prawidłową konfiguracją i odstępami, wskazanymi przez FLAG 147 i FLAG 163.</li>
		<li>Zdefiniuj pozycję wstawienia jako pierwszą wyrównaną podstawę przyciętego odczytu 2.</li>
		<li>Znormalizuj liczbę odczytów w każdym unikatowym miejscu wstawiania do łącznej liczby unikatowo wyrównanych odczytów w każdej próbce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja insercji wpływających na sprawność komórkową (IACFs) 
	UWAGA: W analizie statystycznej zaleca się przeprowadzenie porównań parami między trzema powtórzeniami biologicznymi zarówno próbek kontrolnych, jak i poddanych działaniu substancji w celu zidentyfikowania znacznie wzbogaconych lub zubożonych pozycji. Liczba powtórzeń, o których mowa powyżej, jest minimalna. Zaleca się użycie jak największej liczby powtórzeń w celu zapewnienia wiarygodności i dokładności wyników.
	<ol>
		<li>Przekonwertuj znormalizowane liczby odczytów każdej pozycji na rejestr10 wartości.</li>
		<li>Ustawia logarytm10 wartości pozycji z zerem odczytanym jako −5.</li>
		<li>Wykonaj dwustronny sparowany test t-Studenta na wartościach logarytmu10.</li>
		<li>Dostosuj wartości p dla wielokrotnych porównań przy użyciu metody Benjaminiego-Hochberga w środowisku R.</li>
		<li>Wybierz pozycje z progiem False Discovery Rate (FDR) wynoszącym 25% jako IACF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja klastrów wpływających na sprawność komórkową (CACFs) 
	UWAGA: Do tej analizy zalecono trzy powtórzenia biologiczne próbek kontrolnych i poddanych działaniu substancji.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj znacznie wzbogacone lub zubożone klastry insercyjne między próbkami kontrolnymi i poddanymi działaniu substancji za pomocą SICER35 (patrz tabela materiałów) z progiem FDR wynoszącym 1%. Polecenie analizy SICER to "sh $SICER/SICER.sh $InputDir $In $Control $OutputDir hg19 1 10 1 0.8 30 0.01". 
		UWAGA: Znaczenie parametrów w powyższym poleceniu jest następujące: ["InputDir"] ["plik łóżka miejsc wstawiania próbki poddanej obróbce"] ["plik łóżka miejsc wstawiania próbki kontrolnej"] ["OutputDir"] ["gatunek"] ["próg redundancji"] ["rozmiar okna (bp)"] ["rozmiar fragmentu"] ["efektywna frakcja genomu"] ["rozmiar luki (bp)"] ["wartość E"].</li>
		<li>Uzyskaj regiony klastrów wspólne dla co najmniej dwóch powtórzeń biologicznych za pomocą funkcji "przecięcia" BEDTools suite36 (patrz Tabela materiałów) i oznacz te regiony klastrów jako CACF.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

InSET: A Novel Tool for Unbiased Genome-Wide Functional Element Discovery

<ol><li>Kapranov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transcriptional+activity+in+chromosomes+21+and+22%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Large-scale transcriptional activity in chromosomes 21 and 22.</a> Science. 296 (5569), 916-919 (2002).</li>
<li>Bertone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+identification+of+human+transcribed+sequences+with+genome+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global identification of human transcribed sequences with genome tiling arrays.</a> Science. 306 (5705), 2242-2246 (2004).</li>
<li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+landscape+of+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional landscape of the mammalian genome.</a> Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).</li>
<li>Kapranov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+total+nuclear-encoded+non-ribosomal+RNA+in+a+human+cell+is+%27dark+matter%27+un-annotated+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The majority of total nuclear-encoded non-ribosomal RNA in a human cell is 'dark matter' un-annotated RNA.</a> BMC Biol. 8, 149(2010).</li>
<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Kapranov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examples+of+the+complex+architecture+of+the+human+transcriptome+revealed+by+race+and+high-density+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Examples of the complex architecture of the human transcriptome revealed by race and high-density tiling arrays.</a> Genome Res. 15 (7), 987-997 (2005).</li>
<li>Denoeud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prominent+use+of+distal+5%27+transcription+start+sites+and+discovery+of+a+large+number+of+additional+exons+in+encode+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Prominent use of distal 5' transcription start sites and discovery of a large number of additional exons in encode regions.</a> Genome Res. 17 (6), 746-759 (2007).</li>
<li>Mercer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+RNA+sequencing+reveals+the+deep+complexity+of+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted RNA sequencing reveals the deep complexity of the human transcriptome.</a> Nat Biotechnol. 30 (1), 99-104 (2011).</li>
<li>Deveson, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+alternative+splicing+of+non-coding+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Universal alternative splicing of non-coding exons.</a> Cell Syst. 6 (2), 245-255.e5 (2018).</li>
<li>Xu, D., Tang, L., Kapranov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexities+of+mammalian+transcriptome+revealed+by+targeted+RNA+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Complexities of mammalian transcriptome revealed by targeted RNA enrichment techniques.</a> Trends Genet. 39 (4), 320-333 (2023).</li>
<li>Amaral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+status+of+the+human+gene+catalogue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The status of the human gene catalogue.</a> Nature. 622 (7981), 41-47 (2023).</li>
<li>Mattick, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNAs%3A+Definitions%2C+functions%2C+challenges+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNAs: Definitions, functions, challenges and recommendations.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (6), 430-447 (2023).</li>
<li>Bassik, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+mammalian+genetic+interaction+map+reveals+pathways+underlying+ricin+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility.</a> Cell. 152 (4), 909-922 (2013).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nat Biotechnol. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li>
<li>Liu, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi-based+genome-scale+identification+of+functional+long+non-coding+RNA+loci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPRi-based genome-scale identification of functional long non-coding RNA loci in human cells.</a> Science. 355, 6320(2017).</li>
<li>Bester, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+genome-wide+CRISPRa+approach+to+functionalize+lncRNAs+in+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An integrated genome-wide CRISPRa approach to functionalize lncRNAs in drug resistance.</a> Cell. 173 (3), 649-664.e20 (2018).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+screening+for+functional+long+non-coding+RNAs+in+human+cells+by+Cas9+targeting+of+splice+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide screening for functional long non-coding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites.</a> Nat Biotechnol. 36, 1203-1210 (2018).</li>
<li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas13-based+approach+demonstrates+biological+relevance+of+vlinc+class+of+long+non-coding+RNAs+in+anticancer+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas13-based approach demonstrates biological relevance of vlinc class of long non-coding RNAs in anticancer drug response.</a> Sci Rep. 10 (1), 1794(2020).</li>
<li>Noguchi, Y., Matsui, R., Suh, J., Dou, Y., Suzuki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+screening+approaches+for+biochemical+reactions+independent+of+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide screening approaches for biochemical reactions independent of cell growth.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 25 (1), 51-76 (2024).</li>
<li>Recinos, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-dCas13d-based+deep+screening+of+proximal+and+distal+splicing-regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">CRISPR-dCas13d-based deep screening of proximal and distal splicing-regulatory elements.</a> Nat Commun. 15 (1), 3839(2024).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 4 (11), e264(2015).</li>
<li>Stojic, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+RNAi%2C+LNA+and+CRISPRi+as+loss-of-function+methods+in+transcriptional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Specificity of RNAi, LNA and CRISPRi as loss-of-function methods in transcriptional analysis.</a> Nucleic Acids Res. 46 (12), 5950-5966 (2018).</li>
<li>Gao, F., Cai, Y., Kapranov, P., Xu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-genetics+studies+of+lncRNAs-what+we+have+learnt+and+paths+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Reverse-genetics studies of lncRNAs-what we have learnt and paths forward.</a> Genome Biol. 21 (1), 93(2020).</li>
<li>Leoni, C., Volpicella, M., De Leo, F., Gallerani, R., Ceci, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+walking+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Genome walking in eukaryotes.</a> FEBS J. 278 (21), 3953-3977 (2011).</li>
<li>Carette, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haploid+genetic+screens+in+human+cells+identify+host+factors+used+by+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Haploid genetic screens in human cells identify host factors used by pathogens.</a> Science. 326 (5957), 1231-1235 (2009).</li>
<li>Carette, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+disruption+in+human+cells+to+assign+genes+to+phenotypes+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Global gene disruption in human cells to assign genes to phenotypes by deep sequencing.</a> Nat Biotechnol. 29 (6), 542-546 (2011).</li>
<li>Burckstummer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+gene+trap+collection+empowers+haploid+genetics+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A reversible gene trap collection empowers haploid genetics in human cells.</a> Nat Methods. 10 (10), 965-971 (2013).</li>
<li>Carette, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+virus+entry+requires+the+cholesterol+transporter+niemann-pick+c1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ebola virus entry requires the cholesterol transporter niemann-pick c1.</a> Nature. 477 (7364), 340-343 (2011).</li>
<li>Cao, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+haploid+genetic+screen+identifies+regulators+of+glutathione+abundance+and+ferroptosis+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A genome-wide haploid genetic screen identifies regulators of glutathione abundance and ferroptosis sensitivity.</a> Cell Rep. 26 (6), 1544-1556.e8 (2019).</li>
<li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+widespread+existence+of+functional+novel+and+non-canonical+human+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for widespread existence of functional novel and non-canonical human transcripts.</a> BMC Biol. 21 (1), 271(2023).</li>
<li>Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastp%3A+An+ultra-fast+all-in-one+FASTQ+preprocessor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fastp: An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor.</a> Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).</li>
<li>Li, H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with bwa-mem. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+H+%22arXiv+preprint+arXiv%3A1303.3997%22">arXiv preprint arXiv:1303.3997</a>. , (2013).</li>
<li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+chip-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification chip-seq data.</a> Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bedtools%3A+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Bedtools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Pule, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flanking-sequence+exponential+anchored-polymerase+chain+reaction+amplification%3A+A+sensitive+and+highly+specific+method+for+detecting+retroviral+integrant-host-junction+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Flanking-sequence exponential anchored-polymerase chain reaction amplification: A sensitive and highly specific method for detecting retroviral integrant-host-junction sequences.</a> Cytotherapy. 10 (5), 526-539 (2008).</li>
<li>Demeulemeester, J., De Rijck, J., Gijsbers, R., Debyser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+integration%3A+Site+matters%3A+Mechanisms+and+consequences+of+retroviral+integration+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Retroviral integration: Site matters: Mechanisms and consequences of retroviral integration site selection.</a> Bioessays. 37 (11), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Kvaratskhelia, M., Sharma, A., Larue, R. C., Serrao, E., Engelman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+retroviral+integration+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of retroviral integration site selection.</a> Nucleic Acids Res. 42 (16), 10209-10225 (2014).</li>
<li>Ambrosi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimated+comparative+integration+hotspots+identify+different+behaviors+of+retroviral+gene+transfer+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Estimated comparative integration hotspots identify different behaviors of retroviral gene transfer vectors.</a> PLoS Comput Biol. 7 (12), e1002292(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

W analizie genetyki przyszłościowej chodzenie po genomie jest niezbędne do profilowania miejsc integracji w bibliotekach komórkowych mutagenezy insercyjnej. Klasyczne metody chodzenia po genomie, takie jak I-PCR i LAM-PCR, często wymagają trawienia i ligacji enzymów restrykcyjnych, co może zmniejszyć złożoność biblioteki i wprowadzić błędy systematyczne wynikające z zależności od miejsca enzymu 27,28,29. Metoda InSET przezwycięż...

Genomika funkcjonalna pozostaje kluczową i wymagającą dziedziną, nawet w erze postgenomowej, gdzie znaczna część regionów genomowych wciąż nie ma charakterystyki funkcjonalnej. Głównym powodem tych wyzwań jest skomplikowana natura ludzkiego genomu i transkryptomu, które charakteryzują się wszechobecną transkrypcją i uniwersalnym alternatywnym splicingiem zarówno w regionach kodujących białka, jak i niekodujących1,2,3,4,5. Ta złożoność została szeroko podkreślona w badaniach wzbogacania ukierunkowanych na RNA6,7,8,9. Coraz częściej uznaje się, że wiele nowych elementów genomu pozostaje niezmapowanych i funkcjonalnie nieopisanych10,11,12oprócz dobrze opisanych segmentów ludzkiego genomu.
W ostatnich latach zaobserwowano postęp w narzędziach genetyki odwrotnej, takich jak interferencja RNA (RNAi) i systemy CRISPR/Cas13,14,15,16,17,18,19,20,21. Metody te mają jednak znaczące wady, w tym niespecyficzne efekty i wysokie koszty związane z generowaniem złożonych bibliotek krótkich RNA typu hairpin (shRNA) lub pojedynczych przewodnikowych RNA (sgRNAs)22,23,24,25. Ponadto metody te koncentrują się głównie na anotowanych elementach genomu. W przeciwieństwie do tego, genetyka postępowa ma tę zaletę, że pozwala zidentyfikować nowe, nieopatrzone adnotacjami funkcjonalne elementy genomu. Biorąc pod uwagę złożoność ludzkiego genomu i transkryptomu, a także ogromną liczbę nowych elementów genomu, ta zdolność genetyki do przodu ma istotne znaczenie.
Biblioteki komórek genetyki do przodu są często generowane poprzez losową integrację retrowirusową, co sprawia, że skuteczne wykrywanie miejsc integracji całego genomu jest kluczowe dla testu genetycznego do przodu. Wykrywanie tych miejsc integracji zazwyczaj wymaga narzędzi do przeszukiwania genomu26. Chociaż nastąpił znaczny postęp w tych narzędziach, niewiele z nich jest zoptymalizowanych pod kątem zastosowań sekwencjonowania nowej generacji (NGS), a następnie stosowanych w badaniach mutagenezy insercyjnej. Mutageneza insercyjna w liniach komórkowych często wykorzystuje metody takie jak odwrócony PCR (I-PCR) lub liniowy PCR Z UDZIAŁEM AMPLIFIKACJI (LAM-PCR) do wykrywania miejsc integracji27,28,29. Metody te jednak zwykle wymagają etapów trawienia enzymem restrykcyjnym lub ligacji, co może zmniejszyć wydajność i wprowadzić błędy systematyczne w wynikach.
Aby zwiększyć skuteczność wykrywania miejsc integracji całego genomu w badaniach genetycznych, wprowadzono tutaj metodę zwaną metodą InSET (Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts). Integrując chodzenie po genomie z NGS, InSET umożliwia wysokoprzepustową identyfikację miejsc integracji lentiwirusa w bibliotekach mutagenezy insercyjnej opartych na lentiwirusach. W porównaniu z istniejącymi metodami27,28,29, InSET jest stosunkowo prosty i prosty, eliminując etapy trawienia enzymu restrykcyjnego lub ligacji, dzięki czemu jest wygodniejszy i bardziej dostępny. Ponadto, mimo że istniejące badanie genetyczne w komórkach ssaków jest ograniczone do bardzo niewielu haploidalnych lub prawie haploidalnych linii komórkowych27,28,29,30,31, udowodniono, że InSET działa w aneuploidalnych liniach komórkowych32.
To badanie dostarcza szczegółowego, krok po kroku protokołu implementacji metody InSET. Dodatkowo zademonstrowano zastosowanie InSET w badaniach mutagenezy insercyjnej. InSET służy jako potężne narzędzie do identyfikacji nowych eksonów w elementach genomu, obejmujących zarówno kodujące białka, jak i niekodujące RNA w ludzkich liniach komórkowych.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td>Do przygotowania buforu wiążącego/myjącego</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (Ph 8,0)</td><td>Do</td><td>15568025</td><td>Do przygotowania buforu wiążącego/myjącego</td></tr><tr><td>10 razy; Bufor fragmentów Klenowa&nbsp;</td><td>Takara</td><td>2140A</td><td></td></tr><tr><td>10 i razy; Taq Buffer</td><td>Tiangen</td><td>ET101-01-01</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM9659</td><td>Do tworzenia buforu wiążącego/myjącego</td></tr><tr><td>BeaverBeads Streptavidin</td><td>Beaver</td><td>22307-1</td><td>1 &mu; m</td></tr><tr><td>Oprogramowanie BEDTools</td><td></td><td>, oprogramowanie v2</td><td>https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/</td></tr> <tr><td>BWA-MEM</td><td></td><td></td><td>, wersja 0.7.12</td></tr><tr><td>Mieszanina dNTP</td><td>Takara</td><td>4030</td><td>2,5 mM każdy</td></tr><tr><td>Equalbit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Vazyme</td><td>EQ111-02</td><td></td></tr><tr><td>fastp</td><td></td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>HiSeq X Ten</td><td>Illumina</td><td>SY-412-1001</td><td>Platforma Illumina, zlecona Novogene Corporation (Pekin)</td></tr> <tr><td>Klenow Fragment</td><td>Takara</td><td>2140A</td><td></td></tr><tr><td>NovaSeq 6000</td><td>Platforma Illumina</td><td>20012850</td><td>Illumina, zlecona Novogene Corporation (Pekin)</td></tr> <tr><td>Fluorometr Qubit 3.0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>SICER</td><td></td><td></td><td>Software, v1.1</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Taq</td><td>Tiangen</td><td>ET101-01-01</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>HuShi</td><td>30189328</td><td>Do produkcji buforu wiążącego/myjącego</td></tr><tr><td>UltraPure Woda destylowana</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>VAHTS DNA Czyste kulki</td><td>Vazyme</td><td>N411-01</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja funkcjonalnie istotnych miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

Zakres funkcjonalnych sekwencji w ludzkim genomie jest kluczowym, ale dyskutowanym tematem w biologii. Chociaż wysokoprzepustowe odwrócone badania genetyczne poczyniły postępy w badaniu tego zagadnienia, często ograniczają one swój zakres do znanych elementów genomu i mogą wprowadzać efekty niespecyficzne. Podkreśla to pilną potrzebę opracowania nowatorskich narzędzi genomiki funkcjonalnej, które umożliwią głębsze, bezstronne zrozumienie funkcjonalności genomu. Protokół ten wprowadza InSET (InSET) metodę identyfikacji miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej opartej na lentiwirusie. InSET ułatwia wychwytywanie miejsc integracji lentiwirusa w całym genomie, a sekwencjonowanie nowej generacji służy do wykrywania i ilościowego określania sekwencji flankujących. Konstrukcja opracowana w ramach projektu InSET umożliwia analizę zmienności liczebności miejsc integracji w przesiewowych badaniach fenotypowych na dużą skalę, dzięki czemu projekt ten staje się solidnym narzędziem do genetyki przyszłościowej i identyfikacji funkcjonalnych elementów genomu. Kluczową zaletą projektu InSET jest jego zdolność do ujawniania wcześniej niezidentyfikowanych elementów genomu, w tym nowych funkcjonalnych eksonów RNA kodujących białka i niekodujących, niezależnie od wcześniejszej adnotacji. Ogólnie rzecz biorąc, projekt InSET ma znaczącą wartość w badaniu skomplikowanej złożoności ludzkiego genomu i transkryptomu, w którym wiele elementów genomu oczekuje na charakterystykę funkcjonalną.

Ocena kontroli jakości biblioteki NGS, zazwyczaj przeprowadzana przez dostawcę usług sekwencjonowania, służy jako standardowa weryfikacja jakości przed sekwencjonowaniem. Aby zademonstrować wpływ jakości biblioteki, porównano dwie próbki. Biblioteka wysokiej jakości, oznaczona jako s2-20-15, została przygotowana zgodnie ze standardowym protokołem zagnieżdżonej PCR (nested PCR), składającym się z dwóch sekwencyjnych etapów amplifikacji: pierwszego z 20 cyklami, a następnie drugiego z 15 cyklami. W przeciwieństwie do niej,...

Mutageneza insercyjna jest niezbędnym narzędziem w genetyce postępowej do identyfikacji funkcjonalnych elementów genomu. W tym miejscu opisujemy InSET (InSET) badanie przesiewowe oparte na insercji dla funkcjonalnych elementów i transkryptów, metodę wykrywania miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej opartej na lentiwirusie.

Identyfikacja funkcjonalnie istotnych miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens ...

Prowadzimy badania z zakresu genomiki funkcjonalnej z naciskiem na identyfikację i charakterystykę elementów funkcjonalnych w obrębie genomu człowieka. Naszym głównym zainteresowaniem jest zbadanie części genomu, która nie została jeszcze dobrze przydzielona, aby lepiej zrozumieć ich potencjalne role i sposób, w jaki mogą przyczynić się do biologii i chorób człowieka. Obecne narzędzia genetyki odwrotnej mają pewne ograniczenia, takie jak niespecyficzne efekty i wysokie koszty tworzenia złożonych bibliotek SSI lub SGI.Kolejnym wyzwaniem jest to, że metoda ta może być ukierunkowana tylko na przydzielone elementy genomu, pozostawiając dużą część genomu niedostatecznie zbadaną. Opracowany w ten sposób protokół oferuje nowe podejście do identyfikacji nieznanych wcześniej elementów genomu, w tym nowych funkcjonalnych eksonów zarówno w kodowaniu białek, jak i długich oczu kodujących. Na początek użyj genomowego DNA wyizolowanego z biblioteki komórek mutagenezy mutagenezy opartej na lentiwirusie jako matrycy do liniowego PCR w reakcji 50 mikrolitrów. Wtedy.dodać inne wymagane odczynniki pokazane tutaj w probówce PCR. Wykonaj 50 cykli liniowego PCR w standardowym termocyklerze w danych warunkach PCR. Przenieś produkty PCR do nowej, czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.Dokładnie wymieszaj produkty PCR z 10 mikrolitrami kulek magnetycznych biotyny-streptawidyny i inkubuj mieszaninę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, wstrząsając z prędkością 400 obr./min w metalowej kąpieli. Następnie użyj podstawki magnetycznej, aby zebrać koraliki i ostrożnie usunąć supernatant. Przemyć kulki sześciokrotnie 300 mikrolitrami buforu wiążącego lub myjącego, odrzucając supernatant po każdym praniu.W przypadku syntezy drugiej nici ponownie zawieś kulki w objętości reakcyjnej 24 mikrolitrów zawierającej bufor fragmentów Klenowa, mieszaninę DNTP i starter P5N6 w probówce do PCR. Mieszaninę należy wstępnie inkubować w temperaturze 15 stopni Celsjusza przez 20 minut w termocyklerze PCR, a następnie dodać dwie jednostki fragmentu Klenowa do mieszaniny reakcyjnej. Inkubować mieszaniny w termocyklerze PCR w określonych warunkach.Następnie przenieś produkty PCR do nowej czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Użyj podstawki magnetycznej, aby uchwycić koraliki i wyrzucić supernatant. Następnie delikatnie umyj kulki 300 mikrolitrami wody destylowanej wolnej od DNazy i RNaz w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zebrać koraliki i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić kulki w objętości reakcyjnej PCR o objętości 25 mikrolitrów zawierającej bufor Taq, polimerazę DNA Taq, starter P5, mieszaninę DNTP i starter 3-LTR_Nest w probówce do PCR. Wykonaj PCR w termocyklerze z ustawieniami pokazanymi tutaj.Użyj pięciu mikrolitrów produktów PCR jako matrycy do następnej rundy reakcji PCR ze starterem Illumina P5 i starterem Illumina P73-LTR. Wykonaj PCR w termocyklerze w zadanych warunkach. Następnie przenieś produkty PCR do czystej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej.Po wyrównaniu koralików od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza do temperatury pokojowej przez 30 minut, dokładnie wymieszaj koraliki, odwracając lub wirując. Odpipetować 1,2 raza objętość kulek do czystej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj produkty PCR do kulek i dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 10 razy.Inkubuj koraliki, aby DNA mogło się z nimi związać. Następnie umieść próbki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant, gdy roztwór będzie klarowny. Teraz umyj koraliki 200 mikrolitrami 80% etanolu.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 sekund i usunąć supernatant. Wysuszyć koraliki na powietrzu w temperaturze pokojowej z otwartą pokrywką przez około pięć minut. Teraz wyjmij rurkę ze stojaka magnetycznego.Dodaj 22 mikrolitry wody destylowanej wolnej od DNazy i RNaz. Dokładnie wymieszaj, pipetując 10 razy w górę i w dół i pozostaw w temperaturze pokojowej na dwie minuty. Umieść probówkę z powrotem na stojaku magnetycznym, aż roztwór będzie klarowny.Następnie przenieś 21 mikrolitrów supernatantu do czystej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Aby zmierzyć stężenie za pomocą fluorometru, przygotuj roztwór roboczy, mieszając odczynnik i bufor w stosunku jeden do 200. Zmieszać 10 mikrolitrów wzorca jeden i 10 mikrolitrów wzorca dwóch, każdy ze 190 mikrolitrami roztworu roboczego, aby przygotować wzorce testowe.Delikatnie mieszaj mieszaniny przez dwie do trzech sekund. Następnie przygotuj próbkę testową, mieszając jeden mikrolitr oczyszczonych produktów PCR ze 199 mikrolitrami roztworu roboczego. Delikatnie mieszaj mieszaninę przez dwie do trzech sekund.Inkubować wzorce do testów i próbki testowe przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem, a następnie włączyć fluorymetr. Wybierz program do testów dwuniciowego DNA o wysokiej czułości z menu głównego. W celu kalibracji włóż standardowy do urządzenia i naciśnij przycisk odczytu wzorca, aby zmierzyć pierwszy wzorzec.Następnie włóż wzorzec dwa i naciśnij przycisk odczytu wzorca, aby zmierzyć drugi wzorzec. Aby zmierzyć próbkę, naciśnij przycisk uruchom próbki, aby przejść do strony pomiaru próbki. Włóż każdą probówkę zawierającą próbkę do oznaczania i naciśnij przycisk odczytu probówki, aby uzyskać stężenie.W próbce niskiej jakości dominujący pik około 83 par zasad wskazuje na zanieczyszczenie dimerem adaptera. W przeciwieństwie do tego, wysokiej jakości biblioteka NGS wyświetla główne piki między 150 a 1 500 par zasad, odzwierciedlając profil udanej biblioteki.

identification-functionally-relevant-lentivirus-integration-sites-an

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Ten manuskrypt opisuje procedurę eksperymentalną i analizę oprogramowania dla dwukierunkowego testu miejsca integracji, który może jednocześnie analizować DNA połączenia wektor-gospodarz w górę i w dół. Dwukierunkowe produkty PCR mogą być używane na dowolnej platformie sekwencjonowania niższego szczebla. Uzyskane dane są przydatne do wysokoprzepustowego, ilościowego porównania zintegrowanych celów DNA.

Dwukierunkowa metodologia PCR w miejscu integracji retrowirusowej i przepływ pracy analizy danych ilościowych

Tutaj opisujemy protokół mapowania całego genomu miejsc integracji wektorów retrowirusowych opartych na wirusie mysiej białaczki Moloneya w komórkach ludzkich.

Skanowanie retrowirusowe: mapowanie miejsc integracji MLV w celu zdefiniowania regionów regulatorowych specyficznych dla komórki

Opisujemy strategię produkcji wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy (IDLV) jako nośników dostarczania CRISPR/Cas9 do komórek. Dzięki zdolności do pośredniczenia w szybkiej i niezawodnej edycji genów w komórkach, IDLV stanowią bezpieczniejszą i równie skuteczną platformę wektorową do dostarczania genów w porównaniu z wektorami kompetentnymi do integrazy.

Protokół wytwarzania wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy do nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w dzielących się komórkach

Prezentujemy proces inżynierii genomu do generowania nowych modeli in vitro dla zakażenia HIV-1, które podsumowują integrację prowirusową w wybranych miejscach genomu. Ukierunkowanie na osoby zgłaszające pochodzące od wirusa HIV jest ułatwione dzięki manipulacji genomem specyficznej dla danego miejsca za pośrednictwem CRISPR-Cas9. Dostępne są szczegółowe protokoły generowania klonów pojedynczych komórek, badań przesiewowych i weryfikacji prawidłowego celowania.

Inżynieria genomu oparta na CRISPR-Cas9 do generowania modeli reporterowych Jurkat dla zakażenia HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa

Optogenetyczna mutageneza losowa z wykorzystaniem histonów-miniSOG u C. elegans

Przedstawiono strategię generowania mutacji w genach histonów w ich endogennym położeniu u Saccharomyces cerevisiae.

Ukierunkowana mutageneza in situ genów histonów u pączkujących drożdży

Metody generowania dużych bibliotek gRNA powinny być proste, wydajne i opłacalne. Opisujemy protokół produkcji bibliotek gRNA oparty na enzymatycznym trawieniu docelowego DNA. Metoda CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) stanowi alternatywę dla kosztownej, niestandardowej syntezy oligonukleotydów.

Uniwersalny protokół do produkcji bibliotek gRNA na dużą skalę z dowolnego źródła DNA

Zgrupowany, regularnie rozmieszczony, krótki powtórzeń palindromicznych/system białka związanego z CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) stanowi obiecujące narzędzie dla inżynierii genetycznej i otwiera możliwość celowej integracji transgenów. Opisujemy strategię opartą na łączeniu końców za pośrednictwem homologii (HMEJ) dla efektywnej ukierunkowanej integracji DNA in vivo i celowanych terapii genowych przy użyciu CRISPR/Cas9.

Ukierunkowana integracja in vivo za pośrednictwem CRISPR/Cas9 przy użyciu strategii opartej na łączeniu końcowym za pośrednictwem homologii

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię losowej mutagenezy docelowego genu u drożdży rozszczepieniowych. Jako przykład celujemy w rpt4 +, który koduje podjednostkę proteasomu 19S i badamy pod kątem mutacji, które destabilizują heterochromatynę.

Mutageneza losowa ukierunkowana na geny w celu wyselekcjonowania mutantów proteasomów destabilizujących heterochromatynę w drożdżach rozszczepieniowych

Odkryj metodę InSET do identyfikacji funkcjonalnych elementów genomowych w ludzkim genomie przy użyciu mutagenezy insercyjnej opartej na lentiwirusie. Ta technika umożliwia badanie niezbadanych regionów genomu.

Identyfikacja funkcjonalnie istotnych miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej

Przeglądaj więcej filmów