Identyfikacja funkcjonalnie istotnych miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej
January 10th, 2025
Mutageneza insercyjna jest niezbędnym narzędziem w genetyce postępowej do identyfikacji funkcjonalnych elementów genomu. W tym miejscu opisujemy InSET (InSET) badanie przesiewowe oparte na insercji dla funkcjonalnych elementów i transkryptów, metodę wykrywania miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej opartej na lentiwirusie.
Prowadzimy badania z zakresu genomiki funkcjonalnej z naciskiem na identyfikację i charakterystykę elementów funkcjonalnych w obrębie genomu człowieka. Naszym głównym zainteresowaniem jest zbadanie części genomu, która nie została jeszcze dobrze przydzielona, aby lepiej zrozumieć ich potencjalne role i sposób, w jaki mogą przyczynić się do biologii i chorób człowieka. Obecne narzędzia genetyki odwrotnej mają pewne ograniczenia, takie jak niespecyficzne efekty i wysokie koszty tworzenia złożonych bibliotek SSI lub SGI.
Kolejnym wyzwaniem jest to, że metoda ta może być ukierunkowana tylko na przydzielone elementy genomu, pozostawiając dużą część genomu niedostatecznie zbadaną. Opracowany w ten sposób protokół oferuje nowe podejście do identyfikacji nieznanych wcześniej elementów genomu, w tym nowych funkcjonalnych eksonów zarówno w kodowaniu białek, jak i długich oczu kodujących. Na początek użyj genomowego DNA wyizolowanego z biblioteki komórek mutagenezy mutagenezy opartej na lentiwirusie jako matrycy do liniowego PCR w reakcji 50 mikrolitrów. Wtedy.
dodać inne wymagane odczynniki pokazane tutaj w probówce PCR. Wykonaj 50 cykli liniowego PCR w standardowym termocyklerze w danych warunkach PCR. Przenieś produkty PCR do nowej, czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.
Dokładnie wymieszaj produkty PCR z 10 mikrolitrami kulek magnetycznych biotyny-streptawidyny i inkubuj mieszaninę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, wstrząsając z prędkością 400 obr./min w metalowej kąpieli. Następnie użyj podstawki magnetycznej, aby zebrać koraliki i ostrożnie usunąć supernatant. Przemyć kulki sześciokrotnie 300 mikrolitrami buforu wiążącego lub myjącego, odrzucając supernatant po każdym praniu.
W przypadku syntezy drugiej nici ponownie zawieś kulki w objętości reakcyjnej 24 mikrolitrów zawierającej bufor fragmentów Klenowa, mieszaninę DNTP i starter P5N6 w probówce do PCR. Mieszaninę należy wstępnie inkubować w temperaturze 15 stopni Celsjusza przez 20 minut w termocyklerze PCR, a następnie dodać dwie jednostki fragmentu Klenowa do mieszaniny reakcyjnej. Inkubować mieszaniny w termocyklerze PCR w określonych warunkach.
Następnie przenieś produkty PCR do nowej czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Użyj podstawki magnetycznej, aby uchwycić koraliki i wyrzucić supernatant. Następnie delikatnie umyj kulki 300 mikrolitrami wody destylowanej wolnej od DNazy i RNaz w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Zebrać koraliki i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić kulki w objętości reakcyjnej PCR o objętości 25 mikrolitrów zawierającej bufor Taq, polimerazę DNA Taq, starter P5, mieszaninę DNTP i starter 3-LTR_Nest w probówce do PCR. Wykonaj PCR w termocyklerze z ustawieniami pokazanymi tutaj.
Użyj pięciu mikrolitrów produktów PCR jako matrycy do następnej rundy reakcji PCR ze starterem Illumina P5 i starterem Illumina P73-LTR. Wykonaj PCR w termocyklerze w zadanych warunkach. Następnie przenieś produkty PCR do czystej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej.
Po wyrównaniu koralików od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza do temperatury pokojowej przez 30 minut, dokładnie wymieszaj koraliki, odwracając lub wirując. Odpipetować 1,2 raza objętość kulek do czystej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj produkty PCR do kulek i dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 10 razy.
Inkubuj koraliki, aby DNA mogło się z nimi związać. Następnie umieść próbki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant, gdy roztwór będzie klarowny. Teraz umyj koraliki 200 mikrolitrami 80% etanolu.
Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 sekund i usunąć supernatant. Wysuszyć koraliki na powietrzu w temperaturze pokojowej z otwartą pokrywką przez około pięć minut. Teraz wyjmij rurkę ze stojaka magnetycznego.
Dodaj 22 mikrolitry wody destylowanej wolnej od DNazy i RNaz. Dokładnie wymieszaj, pipetując 10 razy w górę i w dół i pozostaw w temperaturze pokojowej na dwie minuty. Umieść probówkę z powrotem na stojaku magnetycznym, aż roztwór będzie klarowny.
Następnie przenieś 21 mikrolitrów supernatantu do czystej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Aby zmierzyć stężenie za pomocą fluorometru, przygotuj roztwór roboczy, mieszając odczynnik i bufor w stosunku jeden do 200. Zmieszać 10 mikrolitrów wzorca jeden i 10 mikrolitrów wzorca dwóch, każdy ze 190 mikrolitrami roztworu roboczego, aby przygotować wzorce testowe.
Delikatnie mieszaj mieszaniny przez dwie do trzech sekund. Następnie przygotuj próbkę testową, mieszając jeden mikrolitr oczyszczonych produktów PCR ze 199 mikrolitrami roztworu roboczego. Delikatnie mieszaj mieszaninę przez dwie do trzech sekund.
Inkubować wzorce do testów i próbki testowe przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem, a następnie włączyć fluorymetr. Wybierz program do testów dwuniciowego DNA o wysokiej czułości z menu głównego. W celu kalibracji włóż standardowy do urządzenia i naciśnij przycisk odczytu wzorca, aby zmierzyć pierwszy wzorzec.
Następnie włóż wzorzec dwa i naciśnij przycisk odczytu wzorca, aby zmierzyć drugi wzorzec. Aby zmierzyć próbkę, naciśnij przycisk uruchom próbki, aby przejść do strony pomiaru próbki. Włóż każdą probówkę zawierającą próbkę do oznaczania i naciśnij przycisk odczytu probówki, aby uzyskać stężenie.
W próbce niskiej jakości dominujący pik około 83 par zasad wskazuje na zanieczyszczenie dimerem adaptera. W przeciwieństwie do tego, wysokiej jakości biblioteka NGS wyświetla główne piki między 150 a 1 500 par zasad, odzwierciedlając profil udanej biblioteki.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia nową metodę identyfikacji funkcjonalnych elementów genomowych za pomocą mutagenezy insercyjnej. Metoda Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET) pozwala na wykrywanie miejsc integracji lentiwirusów w bibliotece komórkowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genomika funkcjonalna
- Identyfikacja elementów genomowych
- Metodologie oparte na lentiwirusach
Tło
- Badania koncentrują się na niezbadanym jeszcze obszarach ludzkiego genomu.
- Obecne narzędzia genetyki odwrotnej mają ograniczenia, w tym wysokie koszty i niespecyficzne efekty.
- Wiele elementów genomowych pozostaje niezbadanym z powodu problemów z ich ukierunkowaniem.
- Celem badania jest zidentyfikowanie nowych funkcjonalnych egzonów zarówno w regionach kodujących białka jak i długich niekodujących.
Cel badania
- Opracowanie nowego podejścia do identyfikacji wcześniej nieznanych elementów genomowych.
- Poprawa zrozumienia funkcjonalnych komponentów ludzkiego genomu.
- Rozwiązanie ograniczeń obecnych narzędzi genetyki odwrotnej.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie genomowej DNA z biblioteki komórkowej opartej na mutagenezie insercyjnej z wykorzystaniem lentiwirusu.
- Linie reakcje PCR do amplifikacji miejsc integracji.
- Wyszukiwanie funkcjonalnych elementów i transkryptów.
- Analiza wzorców integracji lentiwirusu.
Główne wyniki
- Sukces w identyfikacji nowych elementów genomowych.
- Demonstracja efektywności metody InSET.
- Wgląd w role wcześniej niezbadanych regionów genomowych.
- Potencjalne implikacje dla zrozumienia ludzkiej biologii i chorób.
Wnioski
- Metoda InSET zapewnia cennym narzędzie do badań genomiki funkcjonalnej.
- Otwierają nowe drogi do badania ludzkiego genomu.
- Przyszłe badania mogą budować na tym podejściu, aby dalsze wyjaśniać funkcje genomowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Unbiased identification of functionally relevant genomic elements is a critical inflection point in early drug discovery, directly impacting target validation and mechanistic de-risking. The InSET protocol enables genome-wide mapping of lentiviral integration sites, revealing novel exons and regulatory elements beyond annotated regions. This capability strengthens predictive confidence in target selection and supports risk-adjusted portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of uncharacterized genomic regions for functional relevance.
- Supports biological de-risking by uncovering novel exons in both coding and non-coding RNAs.
- Facilitates robust target validation by linking integration site abundance to phenotypic outcomes.
- Improves predictive confidence for downstream target nomination and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated insertional mutagenesis libraries for high-throughput phenotypic screening.
- Standardizes detection of integration sites using next-generation sequencing for quantitative outputs.
- Enables reproducible identification of functional genomic elements across large-scale screens.
- Supports scalable workflows for compound evaluation in genetically diverse backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional genomics findings with disease-relevant transcriptomic features when supported by phenotypic screens.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by mapping novel elements implicated in disease biology.
- De-risks translational progression by clarifying the functional landscape of candidate targets.
Pipeline & Workflow Integration
The InSET protocol integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling unbiased functional genomics screens that inform target selection and mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping integration sites to functional outcomes.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts of insertional events for robust assay development.
- Analytics: Provides high-resolution sequencing data to compare integration site abundance across conditions.
- Translational Research: Connects novel genomic elements to disease-relevant phenotypes when phenotypic screens are applied.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for functional genomics interrogation across diverse cell libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales functional genomics workflows for reproducibility.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by revealing previously uncharacterized functional elements.
Implementation Considerations
- Requires expertise in functional genomics, lentiviral systems, and next-generation sequencing.
- Demands access to high-throughput sequencing and robust bioinformatics infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of library preparation and data analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different cell types or model systems.
- Potential limitations include non-specific integration effects and the need for rigorous quality control of sequencing libraries.
