Skuteczna metoda obrazowania płuc myszy, która zachowuje dynamikę przestrzenną zarodników grzybów w drogach oddechowych

Badania te mają na celu ustanowienie skutecznego protokołu zachowania zawartości dróg oddechowych myszy w modelach infekcji płuc. Rozwijamy zdolność do odpowiedzi na pytanie, gdzie wdychane zarodniki grzybów lądują w płucach. Ostatnio wiele grup zidentyfikowało rolę różnych komórek nabłonka dróg oddechowych w wykrywaniu infekcji i inicjowaniu ochronnych odpowiedzi immunologicznych.

Te komórki nabłonkowe wahają się od komórek maczugowych w oskrzelach do komórek nabłonkowych typu II w końcowych pęcherzykach płucnych. Powszechną techniką przygotowania płuc jest nadmuchanie płuca płynnym utrwalaczem w celu zachowania tkanki płucnej do dalszych analiz histologicznych. Jednak ta technika wypiera zawartość dróg oddechowych, taką jak wdychane zarodniki grzybów.

Nasz protokół zachowuje naturalne położenie wdychanych zarodników grzybów w płucach, zachowując jednocześnie prawidłową morfologię płuc poprzez nadmuchiwanie powietrza i prawidłowe utrwalanie płuc poprzez perfuzję naczyniową. Mamy nadzieję, że wykorzystamy ten protokół do scharakteryzowania połączeń oskrzelowo-pęcherzykowych, w których zarodniki wydają się lądować w naszym modelu, ale wykorzystamy lokalizacje zarodników w pobliżu różnych komórek nabłonka i zbadamy wynikające z tego odpowiedzi immunologiczne. Na początek zabarwić jeden razy 10 do potęgi sześciu zarodników Coccidioides posadasii pięcioma mikromolowymi stężeniami CFSE przez 30 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Po zabarwieniu umyj zarodniki PBS. Odwirować zarodniki przy 12 000 g i ponownie zawiesić osad w 25 mikrolitrach PBS w celu uzyskania inokulum przetrwalnikowego o odpowiednim stężeniu. Przygotować pipetę z 25 mikrolitrami inokulum zarodników.

Po znieczuleniu myszy w słoiku Nalgene, ułóż mysz w pozycji leżącej w jednej ręce i pozwól jej wziąć od trzech do pięciu regularnych oddechów z zadyszką. Umieść końcówkę pipety w tylnej części jamy ustnej i gardła myszy i uwolnij inokulum podczas inhalacji. Poczuj trzaski na tylnej i przedniej stronie klatki piersiowej myszy ręką i kciukiem, aby potwierdzić wdychanie inokulum.

Spryskaj głęboko znieczuloną mysz 70% etanolem. Za pomocą nożyczek ostrożnie odetnij skórę myszy, a następnie rozsuń ją, aby odsłonić otrzewną. Następnie przeciągnij skórę z górnej połowy nad głową myszy, uwalniając ramiona.

Teraz przetnij błonę otrzewnej przy mostku i wzdłuż dolnej części klatki piersiowej, odsłaniając otrzewną. Przesunąć wątrobę niżej, aby odsłonić przeponę. Za pomocą nożyczek ostrożnie odsuń przeponę od miąższu płuca.

Następnie przetnij klatkę piersiową po lewej stronie, aby odsłonić serce. Za pomocą igły o rozmiarze 30 wstrzyknij od pięciu do 10 mililitrów PBS do prawej komory. Po wyjęciu igły użyj nowej igły, aby wstrzyknąć pięć mililitrów 10% neutralnej buforowanej formaliny do prawej komory.

Za pomocą nożyczek usuń przednią połowę klatki piersiowej. Aby odsłonić tchawicę, odetnij górne żebra i obojczyki po prawej i lewej stronie szyi, unikając linii środkowej, w której leży tchawica. Za pomocą kleszczy zapnij pozostałe górne żebra i obojczyki w pobliżu linii środkowej szyi i pociągnij wyżej, aż tchawica zostanie odsłonięta.

Przygotuj 10-centymetrową nić do szwów i przeciągnij ją pod tchawicą. Wstępnie zawiąż luźny węzeł na dolnym końcu odsłoniętej tchawicy. Następnie przygotuj jednomililitrową strzykawkę z powietrzem z cewnikiem o rozmiarze 18.

Za pomocą igły o rozmiarze 18 wykonaj otwór w tchawicy na górnym końcu odsłoniętego obszaru. Teraz włóż cewnik do otworu, upewniając się, że jest ciasno dopasowany, aby zapobiec ucieczce powietrza. Następnie powoli wstrzyknij jeden mililitr powietrza do płuc w ciągu 10 sekund, obserwując napompowanie wszystkich płatów płuc.

Pełne napompowanie powoduje, że płuca lekko owijają się wokół serca i wypełniają objętość zajmowaną w nieprzebitej przeponie. Po odizolowaniu płuc od myszy umieść ją na górnej krawędzi 50-mililitrowej stożkowej rurki wypełnionej 20 mililitrami 10% neutralnej buforowanej formaliny. Umieść nici szwów na zewnątrz rurki, a następnie przykręć nakrętkę.

Na początek przepłucz izolowane płuca myszy w PBS i umieść je w 30% roztworze sacharozy PBS na 72 do 96 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie należy usunąć nadmiar tkanki i umieścić płuca w roztworze Cryomold z pożywką OCT. Zamrozić próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Zrównoważyć próbkę w krioblokach OCT w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez godzinę przed pocięciem bloków o grubości od 20 do 100 mikrometrów. Zbierz skrawki na szklane szkiełko i pozostaw do wyschnięcia na 30 minut do jednej godziny. Umieść szkiełko w kąpieli PBS w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby usunąć OCT z tkanki.

Następnie użyj chusteczki, aby usunąć nadmiar kropelek z obwodu szkiełka wokół próbki tkanki. Narysuj obwód wokół próbki na szkiełku za pomocą hydrofobowego pisaka PAP i pozostaw do wyschnięcia na pięć minut. Następnie dodaj 300 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu blokującego bez zwierząt na szkiełko i inkubuj w temperaturze pokojowej.

Teraz inkubuj szkiełko w 300 mikrolitrach pierwotnego sprzężonego roztworu przeciwciała anty-mysiego EpCAM Alexa Fluor 647 przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia usunąć roztwór przeciwciała i przemyć szkiełko dwukrotnie 300 mikrolitrami PBS przez pięć minut. Po wyschnięciu dodaj jedną kroplę miękko utwardzalnego szkła SlowFade o temperaturze pokojowej do każdego kawałka chusteczki.

Umieść szkiełko nakrywkowe na tkance, upewniając się, że wystaje poza próbkę i obwód markera hydrofobowego. Na początek umieść zaszczepiony zarodnikami grzybów, wydrążony immunologicznie wycinek płuca myszy pod wielokanałowym mikroskopem fluorescencyjnym i wybierz odpowiedni obiektyw. Aby uchwycić cały płat płuca, zbierz wystarczającą liczbę kafelków obrazu i połącz je ze sobą.

Korzystając z oprogramowania mikroskopu, wyeksportuj obraz całego płata płuca do dalszego przetwarzania. W programie QuPath utwórz plik projektu i dodaj do niego obrazy fluorescencyjne. Sklasyfikuj piksele dodatnie EpCAM jako nabłonek, wybierając kolejno opcje Klasyfikuj, Klasyfikacja pikseli i Utwórz próg.

Wybierz rozdzielczość, kanał, sigma wygładzania i wartość progową, aby zidentyfikować region docelowy. Zapisz klasyfikator pod unikatową nazwą i wybierz pozycję Utwórz obiekty. W nowym oknie Utwórz obiekty wybierz opcję Nowy typ obiektu jako Adnotacja.

W przypadku nabłonka płuc ustaw minimalny rozmiar obiektu i minimalny rozmiar otworu na 100 mikrometrów kwadratowych. Po wybraniu przycisku OK adnotacje zostaną utworzone i będzie można je modyfikować za pomocą narzędzia pędzla. Aby sklasyfikować zarodniki, powtórz kroki, jak pokazano dla adnotacji nabłonka płuc.

Następnie w oknie Tworzenie obiektów wybierz Wykrywanie jako nowy typ obiektu. Ustaw minimalny rozmiar obiektu i minimalny rozmiar otworu na zero mikrometrów kwadratowych i wybierz opcję Podziel obiekty. Następnie, aby przeprowadzić sekwencyjną analizę przestrzenną zarodników, wybierz Analizuj, Analiza przestrzenna i oblicz odległość ze znakiem do adnotacji dwuwymiarowych.

Odległości do nabłonka EpCAM-dodatniego zostaną obliczone dla każdego wykrytego zarodnika. Na koniec kliknij Zmierz, a następnie Eksportuj pomiary, aby wyeksportować wyniki. Zarodniki Coccidioides posadasii gromadziły się głównie w dystalnych oskrzelach i pobliskich przestrzeniach pęcherzykowych w napompowanych powietrzem płucach.

Zarodniki wydawały się bardziej rozproszone z dala od oskrzeli w formalnych i napompowanych płynem płucach w porównaniu z płucami napompowanymi powietrzem. Odległość między zarodnikami a nabłonkiem oskrzelików EpCAM-dodatnim była większa w płucach napompowanych cieczą w porównaniu z fizjologicznym nadmuchiwaniem powietrza, co wskazuje na bardziej rozproszone zarodniki.