Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

Nasze badania koncentrują się na charakterystyce pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Echinococcus granulosus i ich roli w interakcjach pasożyt-gospodarz. Badamy wychwyt składu przez komórki dendrytyczne gospodarza i potencjalny wpływ na immunomodulację. Wykazaliśmy, że E. granulosus EV są wychwytywane przez komórki dendrytyczne, wpływając na dojrzewanie i prezentację antygenu. Identyfikujemy również kluczowe białka immunomodulujące i antygenowe w ładunku EV, które mogą wpływać na interakcje pasożyt-gospodarz i odpowiedzi immunologiczne.

Nasz protokół optymalizuje hodowlę pasożytów in vitro w celu zwiększenia produkcji małych EV i zapewnia wysokiej jakości izolację oraz integruje testy komórek dendrytycznych w celu zbadania immunomodulacji. Może być stosowany w całości lub w częściach. Nasze przyszłe badania będą dotyczyły wpływu in vivo EV E. granulosus na odpowiedź immunologiczną, ich potencjał jako składników szczepionek oraz ich wpływ na komórki dendrytyczne, mikrofagi i modele immunologiczne tych komórek.

[Narrator] Na początek oczyść brzuszną powierzchnię uśpionej myszy z chorobą bąblowcową za pomocą 70% alkoholu. Chirurgicznie otwórz jamę otrzewnej, aby usunąć rozwinięte metacestody za pomocą nożyczek i kleszczy. Następnie przenieś masy metacestody na sterylną szalkę Petriego za pomocą kleszczy. W razie potrzeby usuń tkankę łączną za pomocą kleszczy, aby uwolnić torbiele z mas metacestodu. Otrzymane metatastle przemyć uzupełnionym PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz przygotuj pożywkę hodowlaną, używając wszystkich wymaganych składników i delikatnie wymieszaj roztwór przez odwrócenie. Przenieś pięć mililitrów przygotowanej pożywki hodowlanej do każdej probówki Leightona. Dodaj pasożyty do pożywki hodowlanej i inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć dni bez zmiany pożywki. Zbierz pożywkę do hodowli pasożytów z każdej probówki Leightona i przenieś ją do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować zebrane podłoże o stężeniu 300 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść supernatant do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki. Teraz odwiruj supernatant o masie 2000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś powstały supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra za pomocą pipety. Odwiruj probówkę o wadze 10 000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć mniejsze resztki komórek. Za pomocą pipety przenieść supernatant do probówki odpowiedniej do wirnika ultrawirówki. Zaznacz jedną stronę rurki markerem. I umieść rurkę w wirniku zaznaczoną stroną do góry. Odwiruj probówki o wadze 100 000 g przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Szybko odlewać supernatant i pozostawić probówkę do góry dnem na jedną minutę. Przemyj osad co najmniej trzema mililitrami PBS, aby usunąć zanieczyszczające białka. Ponownie zawiesić osad wiele razy za pomocą pipety wzdłuż wszystkich powierzchni probówki, skupiając się na zaznaczonej stronie, po której spodziewana jest osadka. Po powtórzeniu ultrawirowania ponownie zawieś osad w 30 mikrolitrach PBS. Przenieś zawieszoną próbkę do 1,5-mililitrowej probówki i zamroź pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do przechowywania. Spryskaj uśpioną samicę myszy CF-1 eutanazją w wieku od pięciu do ośmiu tygodni etanolem przed umieszczeniem jej w kapturze do hodowli tkankowej. Umieść mysz na desce sekcyjnej w pozycji leżącej. Za pomocą kleszczy i nożyczek preparacyjnych wykonaj pionowe nacięcie w kształcie litery T nad cewką moczową i przedłuż je poziomo do górnej części kończyn dolnych. Za pomocą kleszczy oddziel skórę wzdłuż obu tylnych kończyn, aby odsłonić kości nóg i tkanki. Rękami usuń skórę każdej nogi po odepchnięciu od kostki w kierunku brzucha, ciągnąc skórę na przeciwną stronę, pozostawiając obie nogi wolne od skóry. Teraz ostrożnie usuń kość udową i piszczelową za pomocą nożyczek i kleszczy, upewniając się, że nie ma złamania. Przymocuj końcówkę każdej kości za pomocą kleszczy. I przetnij ścięgna, aby usunąć powięzi mięśniowe wokół kości. Całkowite oczyszczenie tkanki mięśniowej za pomocą papierowych serwetek. Umieść każdą usuniętą kość w sterylnej 50-mililitrowej probówce zawierającej dwa mililitry uzupełnionej kompletnej pożywki RPMI, aby usunąć zanieczyszczenia. Po wyrzuceniu pożywki należy dwukrotnie umyć kości 70% etanolem przez pięć minut za każdym razem. Przenieś umyte kości na sterylną szalkę Petriego i odetnij nasady dwóch kości za pomocą ostrych nożyczek preparacyjnych, aby uzyskać dostęp do komórek szpiku kostnego. Za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do 20-mililitrowej strzykawki zawierającej kompletne podłoże, ostrożnie przepłucz komórki szpiku kostnego z każdej z czterech kości na sterylną szalkę Petriego. Następnie delikatnie homogenizować pożywkę zawierającą wymykający się szpik przez pipetowanie w celu usunięcia tkanki łącznej kości i grudek komórek. Przenieś próbkę do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, przepuszczając komórki przez sterylne sitko do komórek polipropylenowych o długości 70 mikrometrów w celu usunięcia resztek tkanki łącznej i kości. Odwiruj komórki w temperaturze 450 g przez siedem minut w czterech stopniach Celsjusza. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant, upewniając się, że osad pozostaje przyklejony do ścianki probówki. Po inkubacji komórek przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, zawieś je ponownie w 500 mikrolitrach buforu do lizy RBC i zneutralizuj bufor do lizy trzema mililitrami kompletnej pożywki. Odwiruj komórki w temperaturze 450 g przez siedem minut w czterech stopniach Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach kompletnego podłoża. Po przefiltrowaniu próbki, jak pokazano, policz komórki za pomocą hemocytometru. Dodaj 300 nanogramów na mililitr rekombinowanego liganda trzech kinazy tyrozynowej związanej z FMS lub FLT3L do pożywki hodowlanej. Umieść komórki na płytce wielodołkowej o stężeniu jeden razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr. Inkubuj komórki przez siedem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze z 5% dwutlenkiem węgla. Trzeciego dnia usuń jeden mililitr pożywki z każdej studzienki bez naruszania komórek i zastąp ją jednym mililitrem wstępnie podgrzanej, świeżej, kompletnej pożywki, uzupełnionej 150 nanogramami na mililitr rekombinowanego mysiego FLT3L. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) oczyszczone ze stadium larwalnego Echinococcus granulosus były przede wszystkim małymi EV o rozmiarach od 50 do 200 nanometrów, potwierdzonych przez dynamiczne rozpraszanie światła i transmisyjną mikroskopię elektronową. Komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego wykazywały zróżnicowanie morfologiczne w ciągu siedmiu dni, przechodząc od małych, okrągłych komórek krwiotwórczych do komórek gwiaździstych z cytoplazmatycznymi przedłużeniami. Po godzinie inkubacji komórki dendrytyczne wychwyciły znakowane fluorescencyjnie małe EV, które kolokalizowały się z cząsteczkami MHCIII w przedziałach endosomalno-lizosomalnych, co potwierdzono za pomocą mikroskopii konfokalnej.