Name: Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj izolację i wychwyt małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Echinococcus granulosus przez komórki dendrytyczne. Ta metoda pozwala badać immunomodulację i interakcje pasożyt-gospodarz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy uznają Lic. Cecilia Gutiérrez Ayesta (Servicio de Microscopía Electrónica, CONICET, Bahía Blanca, Argentyna) i Lic. Leonardo Sechi i Lic. Eliana Maza (INIFTA, Universidad Nacional de La Plata, Argentyna) za pomoc techniczną w zakresie transmisyjnej mikroskopii elektronowej i dynamicznego rozpraszania światła. Dziękujemy również firmie Dra. Graciela Salerno, Dra. Corina Berón i dr Gonzalo Caló za zastosowanie ultrawirówki w INBIOTEC-CONICET-FIBA, Argentyna. Autorzy z wdzięcznością dziękują Lic. Kelly (SENASA, Mar del Plata, Argentyna) i Lic. H. Núnez García (CONICET, Universidad Nacional de Mar del Plata, Argentyna) za współpracę w ocenie dobrostanu myszy oraz Med. Vet. J. Reyno, Med. Vet. S. Gonzalez i Med. Vet L. Netti za ich wkład w uzyskanie materiału pasożytniczego. Prace te, w tym koszty eksperymentów, odczynników i sprzętu, zostały wsparte przez PICT 2020 nr 1651 finansowany przez ANPCyT.

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Przebieg pracy protokołu dla hodowli pasożytów, izolowania sEV pochodzących od pasożytów, różnicowania komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego i analizy wychwytu sEV przez te komórki przedstawiono na rycinie 1. Celem było szczegółowe opisanie każdej sekcji protokołu, która może być realizowana w całości lub oddzielnie, ze szczególnym uwzględnieniem głównych kwestii gwarantujących wdrożenie metodyki. Analiza populacji EV uzyskanych z kompletnych organizmów pasożytniczych ma konkretny wpływ ...

Echinococcus granulosus to pasożytniczy robak pasożytniczy odzwierzęcy, odpowiedzialny za długotrwałą infekcję znaną jako bąblowica torbielowata1. U żywicieli pośrednich, takich jak zwierzęta gospodarskie i ludzie, zakażenie pasożytem atakuje przede wszystkim wątrobę i płuca, gdzie stadium larwalne rozwija się jako wypełnione płynem torbiele lub metatastle zawierające protoskopety (sama larwa). Podobnie jak wszystkie tasiemce, pasożyt ten nie ma zarówno układu trawiennego, jak i wydalniczego, a zatem wyewoluował aktywne endocytarne i egzocytarne procesy komórkowe regulujące pobieranie i wydalanie metabolitów, a także uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych2,3. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to cząsteczki otoczone dwuwarstwami lipidowymi, wydzielane przez pozornie wszystkie typy komórek. W szczególności małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV), definiowane jako EV mniejsze niż 200 nm, niezależnie od ich pochodzenia biogenezy4, mogą działać jako międzykomórkowe mediatory odpornościowe. Funkcja ta jest szczególnie istotna w przypadku pasożytów, które polegają na immunomodulacji gospodarza, aby zapewnić sobie przetrwanie3. Manipulacja immunologiczna osiąga się poprzez wychwyt sEV przez komórki dendrytyczne gospodarza, jedyne komórki zdolne do aktywacji naiwnych limfocytów T in vivo i zainicjowania adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, która doprowadzi do przewlekłego zakażenia przez te pasożytnicze robaki. Komórki dendrytyczne, profesjonalne komórki wrodzonego układu odpornościowego prezentujące antygen, przetwarzają i ładują peptydy antygenowe do głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I i klasy II (MHC I i MHC II) i wystawiają je na swoich błonach w celu wyłącznego naiwnego pobudzania limfocytów T (odpowiednio limfocyty T CD8 + i CD4 +)<klasa sup = "xref">5. Następujące komórki dendrytyczne indukują ich dojrzewanie poprzez indukcję ekspresji markerów kostymulujących CD80/CD86 i CD40 oraz MHC-II i migrują z tkanek obwodowych do wtórnych narządów limfatycznych po rozpoznaniu obcych antygenów, ładując je do wyłącznego naiwnego primingu limfocytów T6. Tak więc ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie komunikacji pasożyt-gospodarz robaka pasożytniczego w realistyczny sposób, analizując pakowanie i dostarczanie składników pasożytniczych w postaci sEV, które po dotarciu do komórek odpornościowych gospodarza wpływają na rozwój infekcji i postęp przewlekłej choroby pasożytniczej.
Zajęcie się analizą interfejsu helminth-host poprzez badanie sEVs ma kilka zalet. Po pierwsze, powłoka, zewnętrzna powłoka płazińców, jest strukturą podwójnej błony, która stanowi główny punkt przejścia między pasożytem a jego żywicielem, umożliwiając łatwe generowanie lub przenikanie sEV z tej struktury7. Po drugie, sEV są silnie naładowane antygenami białkowymi ze wszystkich etapów cyklu życiowego pasożyta, co stanowi naturalny sposób, w jaki układ odpornościowy gospodarza pobiera próbki antygenów podczas infekcji robakami8,9. Ze względu na ich biologiczną produkcję, łatwość oczyszczania (bez konieczności rozbijania tkanek lub frakcjonowania białek) oraz bezpośrednią interakcję z komórkami gospodarza, robaki pasożytnicze umożliwiają rozwój eksperymentów in vitro w celu symulacji warunków interakcji pasożyt-gospodarz in vivo. Wreszcie, sEV reprezentują możliwość posiadania struktur pasożytniczych, które mogą być fagocytozowane lub internalizowane przez komórki gospodarza, pokonując niemożność zrobienia tego w przypadku całych pasożytów, szczególnie w przypadku otorbionych robaków.
Biorąc pod uwagę wymienione zalety oraz fakt, że robaczyce są powszechnymi i zazwyczaj przewlekłymi chorobami, w których pasożyty przypuszczalnie manipulują układem odpornościowym gospodarza jako strategią przetrwania, izolacja EV pochodzących od pasożytów i ich badanie w interakcji z komórkami dendrytycznymi stanowi cenny framework do zbadania tej immunomodulacji10. W tym sensie opisano, że internalizacja EV od robaków, w tym nicieni i platyhelminthów, takich jak Schistosoma mansoni, Fasciola hepatica, Brugia malayi i E. granulosus, indukuje dojrzewanie i aktywację komórek dendrytycznych9,11,12,13,14,15.
Izolacja EV pochodzących od robaków nie tylko umożliwia badanie interakcji immunologicznych, potencjalnie prowadząc do opracowania szczepionek ochronnych lub środków immunoterapeutycznych dla chorób alergicznych lub autoimmunologicznych, ale także ułatwia eksplorację innych interakcji i funkcji biologicznych8,16,17. W tym kontekście, EV, które odgrywają rolę w naturalnej historii infekcji pasożytniczych, mogą być wykorzystane do badania rozwoju pasożytów i interakcji z określonymi komórkami gospodarza. Co więcej, mogą mieć potencjalne zastosowanie jako wczesne lub różnicowe biomarkery do diagnozowania chorób pasożytniczych, monitorowania odpowiedzi terapeutycznych oraz przyczyniania się do kontroli i leczenia zakażeń pasożytniczych17,18.
Ponadto, jak wcześniej wykazano, stadium larwalne E. granulosus jest podatne na zmiany w stężeniu cytozolowego wapnia, co oprócz odgrywania roli w żywotności pasożyta, kontroluje również wskaźnik egzocytozy19,20. W tym kontekście, wiedząc, że wewnątrzkomórkowe podniesienie poziomu wapnia zwiększa uwalnianie EV, stosowanie wewnątrzkomórkowego wzmacniacza wapnia jako loperamidu może być kluczową strategią zwiększania liczby EV. Podejście to jest szczególnie interesujące w przypadku systemów komórkowych, które wymagają dużych populacji do wygenerowania odpowiedniej ilości pojazdów elektrycznych do analizy ładunku i funkcjonalnej11,21,22. Obecny protokół (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) szczegółowo opisuje metody uzyskiwania czystych kultur w stadium larwalnym E. granulosus oraz warunki, które zwiększają produkcję sEV. Opisano również przebieg izolacji i charakterystyki tych pęcherzyków, a także ich wychwyt przez mysie komórki dendrytyczne, co jest niezbędnym krokiem we wstępnym badaniu modulacji układu odpornościowego gospodarza.

<table><tbody><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>Henso</td><td>N14059</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa&nbsp;</td><td>JetBiofil</td><td>CAP011024</td><td>Polistyren, płaskie dno, sterylna</td></tr><tr><td>płytka 6-dołkowa&nbsp; &nbsp;</td><td>Henso Medical Co., Sp. z o.o.</td><td>N14221</td><td>Płaskie dno, materiał PS, sterylne</td></tr><tr><td>sitko do komórek polipropylenowych 70 mm</td><td>Biologix Group Limited</td><td>15-1070</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>barwnik Alcian blue 8 GX&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-214517B</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny inkubator CO2</td><td>Nuarire</td><td>UN-5100E/G DH</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Laboratorium Wienera</td><td>1443151</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD11c-PECy5&nbsp; &nbsp; 100 &mikro; g</td><td>eBioscience</td><td>15-0114-82</td><td>klon (N418)</td></tr><tr><td>CD40 Przeciwciało monoklonalne-FITC 100 i mikro; g</td><td>eBioscience</td><td>11-0402-82</td><td>klon (HM40-3)</td></tr><tr><td>CD80 Przeciwciało monoklonalne-APC 100 i mikro; g</td><td>eBioscience</td><td>17-0801-82</td><td>klon (16-10A-1)</td></tr><tr><td>CD86 Przeciwciało monoklonalne-FITC&nbsp; 100 &mikro; g</td><td>eBioscience</td><td>11-0862-82</td><td>klon (GL-1)</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>IEC CL31R Wielobiegowy</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td>Nikon Mikroskop konfokalny C1</td><td></td></tr><tr><td>Rurki stożkowe 15 ml o średnicy 17 x 120 mm</td><td>Citotest</td><td>4610-1865</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>107K4034</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Merk</td><td>1.78343</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek&nbsp;</td><td>Anedra</td><td>6646</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodowa 500 ml</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System cytometrii przepływowej</td> 12352207 <td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCanto&trade; II</td><td></td></tr><tr><td>Komórka kapilarna Zeta składana&nbsp;</td><td>Malvern Panalytical</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>Sól siarczanu gentamycyny</td><td>Sigma</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego</td><td>Fluka</td><td>49630</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>Igła podskórna&nbsp; 21 G x 1"25/8</td><td>Weigao</td><td></td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>igła podskórna&nbsp; 25 G x 5/8"</td><td>Weigao</td><td></td><td>sterylny</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony&nbsp;</td><td>Fluo diod LED Leica</td><td>DMIL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Holliday</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd&nbsp; 5 mg</td><td>Invitrogen</td><td>tlrl-rslps</td><td>LPS z bakterii Gram-ujemnych E. coli K12 . TLR2/4 Agoniści</td></tr><tr><td>Chlorowodorek loperamidu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5.08162</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11150059</td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Anedra</td><td>6337</td><td></td></tr><tr><td>MHC klasy I (H2kb) Przeciwciało monoklonalne-PE 100 i mikro; g</td><td>eBioscience</td><td>12-5958-82</td><td>klon (AF6-88.5.5.3)</td></tr><tr><td>MHC klasa II (IA/IE) Przeciwciało monoklonalne-FITC&nbsp; 100 &mikro; g</td><td>eBioscience</td><td>11-5321-82</td><td>klon (M5/114.15.2)</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CX31</td><td></td></tr><tr><td>Mysz rekombinowana mysia Flt3L.</td><td>PrepoTech</td><td>250-31L-10UG</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-One</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Agar Scientific</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa penicyliny G</td><td>Sigma</td><td>P3032-10MU</td><td></td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26</td><td></td></tr><tr><td>Jednozasadowy</td><td>zegar</td><td></td> fosforanu potasu <td>do buforowania fosforanów Bufor do lizy soli fizjologicznej (PBS)</td></tr><tr><td>RBC 100 ml</td><td>Roche</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium&nbsp; 1640 1x 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich (Gibco)</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Kakodylan sodu&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Anedra</td><td>7647-14-5</td><td>Do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (bezwodny) rocznie</td><td>Biopack</td><td>1639.07</td><td>Do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td></tr><tr><td>Sól siarczanu streptomycyny</td><td>Sigma</td><td>S9137</td><td></td>Strzykawka</tr><tr><td>10 ml</td><td>Brema</td><td></td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>grubościenne rurki poliwęglanowe</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>13 x 55 mm, pojemność nominalna 4 mL</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>Jeol</td><td>JEOL JSM 100CX II</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman</td><td>Optima LE-80k&nbsp;</td><td>Wirnik 90 Ti</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Richmond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano&nbsp;</td><td>Malvern&nbsp;</td><td>Nano ZSizer-ZEN3600</td><td>Do wykonywania dynamicznych pomiarów rozpraszania światła i potencjału zeta</td></tr></tbody></table>

izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z echinococcus granulosus

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

Wydzielanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przez tasiemce jest kluczowe dla umożliwienia komunikacji komórkowej nie tylko między pasożytami, ale także z tkankami gospodarza. W szczególności małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV) działają jako nanonośniki przenoszące naturalne antygeny, które mają kluczowe znaczenie dla immunomodulacji gospodarza i przetrwania pasożytów. W artykule przedstawiono krok po kroku protokół izolacji sEV z kultur Echinococcus granulosus w stadium larwalnym i przeanalizowano ich wychwyt przez komórki dendrytyczne uzyskane z mysiego szpiku kostnego, które nabywają adhezję i zdolność prezentacji antygenu w trakcie dojrzewania po tygodniu hodowli in vitro. Niniejszy artykuł zawiera wyczerpujące informacje na temat generowania, oczyszczania i kwantyfikacji sEV za pomocą ultrawirowania wraz z równoległymi analizami dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ponadto przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dotyczący izolowania i hodowli komórek szpiku kostnego myszy oraz stymulowania ich różnicowania w komórki dendrytyczne za pomocą Flt3L. Te komórki dendrytyczne mogą prezentować antygeny naiwnym limfocytom T, modulując w ten sposób rodzaj odpowiedzi immunologicznej in vivo. W związku z tym proponuje się alternatywne protokoły, w tym mikroskopię konfokalną i analizę cytometrii przepływowej, w celu sprawdzenia nabytego fenotypu dojrzewania komórek dendrytycznych wcześniej narażonych na pasożytnicze sEV. Na koniec warto zauważyć, że opisany protokół może być stosowany w całości lub w poszczególnych częściach do przeprowadzenia hodowli pasożytów in vitro, wyizolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, wygenerowania hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego oraz przeprowadzenia testów wychwytu tych komórek.

Schemat blokowy podsumowujący główne etapy utrzymywania czystych kultur stadium larwalnego E. granulosus, izolacji i charakterystyki sEV oraz ich pobierania przez mysie komórki dendrytyczne przedstawiono na Rysunku 1. Aby uzyskać wysoką produkcję sEV z protoskoleksów i metacestod E. granulosus, zastosowano opracowaną wcześniej w laboratorium metodę hodowli in vitro, mającą na celu maksymalizację przeżywalności i homeostazy metabolicznej badanego pasożyta (<strong c...

Tutaj opisujemy warunki hodowli in vitro, izolację i zwiększoną generację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Echinococcus granulosus. Małe pojazdy elektryczne charakteryzowały się dynamicznym rozpraszaniem światła i transmisyjną mikroskopią elektronową. Wychwyt przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego i ich modulację fenotypową badano za pomocą mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

Nasze badania koncentrują się na charakterystyce pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Echinococcus granulosus i ich roli w interakcjach pasożyt-gospodarz. Badamy wychwyt składu przez komórki dendrytyczne gospodarza i potencjalny wpływ na immunomodulację. Wykazaliśmy, że E. granulosus EV są wychwytywane przez komórki dendrytyczne, wpływając na dojrzewanie i prezentację antygenu. Identyfikujemy również kluczowe białka immunomodulujące i antygenowe w ładunku EV, które mogą wpływać na interakcje pasożyt-gospodarz i odpowiedzi immunologiczne.Nasz protokół optymalizuje hodowlę pasożytów in vitro w celu zwiększenia produkcji małych EV i zapewnia wysokiej jakości izolację oraz integruje testy komórek dendrytycznych w celu zbadania immunomodulacji. Może być stosowany w całości lub w częściach. Nasze przyszłe badania będą dotyczyły wpływu in vivo EV E. granulosus na odpowiedź immunologiczną, ich potencjał jako składników szczepionek oraz ich wpływ na komórki dendrytyczne, mikrofagi i modele immunologiczne tych komórek.[Narrator] Na początek oczyść brzuszną powierzchnię uśpionej myszy z chorobą bąblowcową za pomocą 70% alkoholu. Chirurgicznie otwórz jamę otrzewnej, aby usunąć rozwinięte metacestody za pomocą nożyczek i kleszczy. Następnie przenieś masy metacestody na sterylną szalkę Petriego za pomocą kleszczy. W razie potrzeby usuń tkankę łączną za pomocą kleszczy, aby uwolnić torbiele z mas metacestodu. Otrzymane metatastle przemyć uzupełnionym PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz przygotuj pożywkę hodowlaną, używając wszystkich wymaganych składników i delikatnie wymieszaj roztwór przez odwrócenie. Przenieś pięć mililitrów przygotowanej pożywki hodowlanej do każdej probówki Leightona. Dodaj pasożyty do pożywki hodowlanej i inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć dni bez zmiany pożywki. Zbierz pożywkę do hodowli pasożytów z każdej probówki Leightona i przenieś ją do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować zebrane podłoże o stężeniu 300 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść supernatant do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki. Teraz odwiruj supernatant o masie 2000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś powstały supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra za pomocą pipety. Odwiruj probówkę o wadze 10 000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć mniejsze resztki komórek. Za pomocą pipety przenieść supernatant do probówki odpowiedniej do wirnika ultrawirówki. Zaznacz jedną stronę rurki markerem. I umieść rurkę w wirniku zaznaczoną stroną do góry. Odwiruj probówki o wadze 100 000 g przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Szybko odlewać supernatant i pozostawić probówkę do góry dnem na jedną minutę. Przemyj osad co najmniej trzema mililitrami PBS, aby usunąć zanieczyszczające białka. Ponownie zawiesić osad wiele razy za pomocą pipety wzdłuż wszystkich powierzchni probówki, skupiając się na zaznaczonej stronie, po której spodziewana jest osadka. Po powtórzeniu ultrawirowania ponownie zawieś osad w 30 mikrolitrach PBS. Przenieś zawieszoną próbkę do 1,5-mililitrowej probówki i zamroź pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do przechowywania. Spryskaj uśpioną samicę myszy CF-1 eutanazją w wieku od pięciu do ośmiu tygodni etanolem przed umieszczeniem jej w kapturze do hodowli tkankowej. Umieść mysz na desce sekcyjnej w pozycji leżącej. Za pomocą kleszczy i nożyczek preparacyjnych wykonaj pionowe nacięcie w kształcie litery T nad cewką moczową i przedłuż je poziomo do górnej części kończyn dolnych. Za pomocą kleszczy oddziel skórę wzdłuż obu tylnych kończyn, aby odsłonić kości nóg i tkanki. Rękami usuń skórę każdej nogi po odepchnięciu od kostki w kierunku brzucha, ciągnąc skórę na przeciwną stronę, pozostawiając obie nogi wolne od skóry. Teraz ostrożnie usuń kość udową i piszczelową za pomocą nożyczek i kleszczy, upewniając się, że nie ma złamania. Przymocuj końcówkę każdej kości za pomocą kleszczy. I przetnij ścięgna, aby usunąć powięzi mięśniowe wokół kości. Całkowite oczyszczenie tkanki mięśniowej za pomocą papierowych serwetek. Umieść każdą usuniętą kość w sterylnej 50-mililitrowej probówce zawierającej dwa mililitry uzupełnionej kompletnej pożywki RPMI, aby usunąć zanieczyszczenia. Po wyrzuceniu pożywki należy dwukrotnie umyć kości 70% etanolem przez pięć minut za każdym razem. Przenieś umyte kości na sterylną szalkę Petriego i odetnij nasady dwóch kości za pomocą ostrych nożyczek preparacyjnych, aby uzyskać dostęp do komórek szpiku kostnego. Za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do 20-mililitrowej strzykawki zawierającej kompletne podłoże, ostrożnie przepłucz komórki szpiku kostnego z każdej z czterech kości na sterylną szalkę Petriego. Następnie delikatnie homogenizować pożywkę zawierającą wymykający się szpik przez pipetowanie w celu usunięcia tkanki łącznej kości i grudek komórek. Przenieś próbkę do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, przepuszczając komórki przez sterylne sitko do komórek polipropylenowych o długości 70 mikrometrów w celu usunięcia resztek tkanki łącznej i kości. Odwiruj komórki w temperaturze 450 g przez siedem minut w czterech stopniach Celsjusza. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant, upewniając się, że osad pozostaje przyklejony do ścianki probówki. Po inkubacji komórek przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, zawieś je ponownie w 500 mikrolitrach buforu do lizy RBC i zneutralizuj bufor do lizy trzema mililitrami kompletnej pożywki. Odwiruj komórki w temperaturze 450 g przez siedem minut w czterech stopniach Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach kompletnego podłoża. Po przefiltrowaniu próbki, jak pokazano, policz komórki za pomocą hemocytometru. Dodaj 300 nanogramów na mililitr rekombinowanego liganda trzech kinazy tyrozynowej związanej z FMS lub FLT3L do pożywki hodowlanej. Umieść komórki na płytce wielodołkowej o stężeniu jeden razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr. Inkubuj komórki przez siedem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze z 5% dwutlenkiem węgla. Trzeciego dnia usuń jeden mililitr pożywki z każdej studzienki bez naruszania komórek i zastąp ją jednym mililitrem wstępnie podgrzanej, świeżej, kompletnej pożywki, uzupełnionej 150 nanogramami na mililitr rekombinowanego mysiego FLT3L. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) oczyszczone ze stadium larwalnego Echinococcus granulosus były przede wszystkim małymi EV o rozmiarach od 50 do 200 nanometrów, potwierdzonych przez dynamiczne rozpraszanie światła i transmisyjną mikroskopię elektronową. Komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego wykazywały zróżnicowanie morfologiczne w ciągu siedmiu dni, przechodząc od małych, okrągłych komórek krwiotwórczych do komórek gwiaździstych z cytoplazmatycznymi przedłużeniami. Po godzinie inkubacji komórki dendrytyczne wychwyciły znakowane fluorescencyjnie małe EV, które kolokalizowały się z cząsteczkami MHCIII w przedziałach endosomalno-lizosomalnych, co potwierdzono za pomocą mikroskopii konfokalnej.

isolation-dendritic-cell-uptake-small-extracellular-vesicles-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Ten film opisuje metodę opartą na chromatografii wykluczania wielkości (SEC) do izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub EV pochodzących z komórek odpornościowych mózgu - mikrogleju. EV działają jak ładunek molekularny, dostarczając mediatory, które regulują odpowiedź immunologiczną. W związku z tym wyizolowane EV mogą być wykorzystane jako model in vitro do badania wzajemnych oddziaływań mikrogleju i neuronów podczas neuronalnej odpowiedzi immunologicznej.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z mikrogleju oparta na SEC: technika izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek hodowlanych kondycjonowanych mikroglejem

Rośnie zainteresowanie zrozumieniem funkcji immunologicznych określonych subpopulacji komórek w łatach Peyera (PP), głównych miejscach indukcyjnych tkanek limfatycznych związanych z jelitami.  W tym miejscu przedstawiamy równoległe protokoły przygotowania preparatów pojedynczych komórek PP do analizy cytometrii przepływowej i kriosekcji PP do barwienia immunologicznego.

Izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów Peyera

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Opisujemy tutaj metodę izolowania i oczyszczania komórek dendrytycznych z różnych anatomicznych przedziałów w ludzkim żeńskim układzie rozrodczym w celu oceny ich cech fenotypowych i funkcjonalnych. Metodę tę można dostosować do izolowania innych komórek odpornościowych lub komórek dendrytycznych z innych tkanek błony śluzowej.

Izolacja komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego do badań fenotypowych i funkcjonalnych

Tutaj prezentujemy protokół opisujący izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) w pożywce hodowlanej in vitro od dorosłego Schistosoma japonicum.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych dorosłego Schistosoma japonicum

Niniejszy raport podkreśla chronologiczne wymagania dotyczące izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mikrogleju lub makrofagów krwi. EV pochodzące z mikrogleju oceniano jako regulatory wzrostu neurytów, podczas gdy EV pochodzące z makrofagów krwi badano w kontroli inwazji komórek glejaka C6 w testach in vitro. Celem jest lepsze zrozumienie tych funkcji EV jako mediatorów immunologicznych w określonych mikrośrodowiskach.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe

Opisujemy technikę szybkiej transdukcji przejściowej w różnych stadiach rozwojowych Echinococcus granulosus przy użyciu wektorów lentiwirusowych trzeciej generacji.

Przejściowa transdukcja strobilowanych form Echinococcus granulosus

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Proponowany protokół zawiera wytyczne dotyczące unikania zanieczyszczenia endotoksyną podczas izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z supernatantów hodowli komórkowych oraz jak prawidłowo je ocenić.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o niskiej zawartości endotoksyn pochodzących z linii komórek rakowych

Poznaj izolację i wychwyt małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Echinococcus granulosus przez komórki dendrytyczne. Ta metoda pozwala badać immunomodulację i interakcje pasożyt-gospodarz.

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

Przeglądaj więcej filmów