Name: Przeszczep bioinżynieryjnego płuca przy użyciu pozbawionych komórek płuc myszy i pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Poznaj protokół bioinżynierii płuc myszy poprzez dekompozycję komórkową i rekompozycję z użyciem ludzkich komórek śródbłonka. Ta metoda umożliwia skalowalne badania nad przeszczepami narządów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane finansowo przez Grant-in-Aid for Scientific Research / KAKENHI (C) #20K09174, #23K08308, Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B)) #22KK0132 dla TS, JSPS KAKENHI Grant Number 21K08877 dla TW, Leave a Nest Grant Ikeda-Rika award for FT, oraz Grant-in-Aid for JSPS Fellows #21J21515 dla FT. Jesteśmy bardzo wdzięczni Pani Maiko Ueda, personelowi technicznemu w Rdzeniu Badań Biomedycznych Wyższej Szkoły Medycznej Uniwersytetu Tohoku, za jej intensywną pracę w zakresie obserwacji histologicznej. Doceniamy również porady techniczne Pani Yumi Yoshida i Pana Koji Kaji z Centrum Instrumentów Badawczych w IDAC, Uniwersytet Tohoku, za ich wsparcie w zakresie przetwarzania obrazu.

<ol><li>van der Mark, S. C., Hoek, R. A. S., Hellemons, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+lung+transplantation+over+the+past+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+Rev%22%5BJournal%5D)">Developments in lung transplantation over the past decade.</a> Eur Respir Rev. 29 (157), 190132(2020).</li>
<li>Valapour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OPTN%2FSRTR+2022+Annual+Data+Report%3A+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">OPTN/SRTR 2022 Annual Data Report: Lung.</a> Am J Transplant. 24 (2S1), S394-S456 (2024).</li>
<li>Hoffman, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waiting+list+dynamics+and+lung+transplantation+outcomes+after+introduction+of+the+lung+allocation+score+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Direct%22%5BJournal%5D)">Waiting list dynamics and lung transplantation outcomes after introduction of the lung allocation score in the Netherlands.</a> Transplant Direct. 7 (10), e760(2021).</li>
<li>Wilk, A. R., Edwards, L. B., Edwards, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+augmenting+OPTN+data+with+external+death+data+on+calculating+patient+survival+rates+after+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The effect of augmenting OPTN data with external death data on calculating patient survival rates after organ transplantation.</a> Transplantation. 101 (4), 836-843 (2017).</li>
<li>Neizer, H., Singh, G. B., Gupta, S., Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+donor-organ+shortages+using+extended+criteria+in+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Addressing donor-organ shortages using extended criteria in lung transplantation.</a> Ann Cardiothorac Surg. 9 (1), 49-50 (2020).</li>
<li>Oliveira, P., Yamanashi, K., Wang, A., Cypel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+ex+vivo+lung+perfusion+rat+model+for+translational+insights+in+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of an ex vivo lung perfusion rat model for translational insights in lung transplantation.</a> J Vis Exp. (199), e65981(2023).</li>
<li>Anand, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+testing+of+a+humanized+porcine+donor+for+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Design and testing of a humanized porcine donor for xenotransplantation.</a> Nature. 622 (7982), 393-401 (2023).</li>
<li>Shakir, S., Hackett, T. L., Mostaco-Guidolin, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+lungs%3A+An+overview+of+current+methods%2C+requirements%2C+and+challenges+for+constructing+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bioengineering lungs: An overview of current methods, requirements, and challenges for constructing scaffolds.</a> Front Bioeng Biotechnol. 10, 1011800(2022).</li>
<li>Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat Med. 16 (8), 927-933 (2010).</li>
<li>Petersen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li>
<li>Leiby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+engineering+of+lung+alveolar+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Rational engineering of lung alveolar epithelium.</a> NPJ Regen Med. 8 (1), 22(2023).</li>
<li>Kitano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+transplantation+of+human+bioartificial+lung+grafts+in+a+porcine+model%3A+A+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Orthotopic transplantation of human bioartificial lung grafts in a porcine model: A feasibility study.</a> Semin Thorac Cardiovasc Surg. 34 (2), 752-759 (2022).</li>
<li>Ohata, K., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-scale+lung+regeneration+based+on+decellularized+matrix+scaffolds+as+a+biologic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Today%22%5BJournal%5D)">Human-scale lung regeneration based on decellularized matrix scaffolds as a biologic platform.</a> Surg Today. 50 (7), 633-643 (2020).</li>
<li>Ren, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+pulmonary+vasculature+in+decellularized+rat+and+human+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Engineering pulmonary vasculature in decellularized rat and human lungs.</a> Nat Biotech. 33 (10), 1097-1102 (2015).</li>
<li>Doi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+bioengineered+rat+lungs+recellularized+with+endothelial+and+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Transplantation of bioengineered rat lungs recellularized with endothelial and adipose-derived stromal cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 8447(2017).</li>
<li>Stone, K. C., Mercer, R. R., Gehr, P., Stockstill, B., Crapo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allometric+relationships+of+cell+numbers+and+size+in+the+mammalian+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Allometric relationships of cell numbers and size in the mammalian lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 6 (2), 235-243 (1992).</li>
<li>Basil, M. C., Morrisey, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+regeneration%3A+a+tale+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Lung regeneration: a tale of mice and men.</a> Semin Cell Dev Biol. 100, 88-100 (2020).</li>
<li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+structure+and+the+intrinsic+challenges+of+gas+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lung structure and the intrinsic challenges of gas exchange.</a> Compr Physiol. 6 (2), 827-895 (2016).</li>
<li>Tomiyama, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+transplantation+of+the+bioengineered+lung+using+a+mouse-scale+perfusion-based+bioreactor+and+human+primary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Orthotopic transplantation of the bioengineered lung using a mouse-scale perfusion-based bioreactor and human primary endothelial cells.</a> Sci Rep. 14 (1), 7040(2024).</li>
<li>Stoian, A., Adil, A., Biniazan, F., Haykal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+decades+of+advances+and+limitations+in+organ+recellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Issues+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two decades of advances and limitations in organ recellularization.</a> Curr Issues Mol Biol. 46 (8), 9179-9214 (2024).</li>
<li>Crabbe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recellularization+of+decellularized+lung+scaffolds+is+enhanced+by+dynamic+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Recellularization of decellularized lung scaffolds is enhanced by dynamic suspension culture.</a> PLoS One. 10 (5), e0126846(2015).</li>
<li>Daly, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+binding+and+recellularization+of+decellularized+mouse+lung+scaffolds+with+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells.</a> Tissue Eng Part A. 18 (1-2), 1-16 (2012).</li>
<li>Regulations for Animal Experiments and Related Activities. , Tohoku University. at
 <a target="_blank" href=" https://www.clag.med.tohoku.ac.jp/clar/en/"> https://www.clag.med.tohoku.ac.jp/clar/en/</a> (2024).</li>
<li>Sokocevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+age+and+emphysematous+and+fibrotic+injury+on+the+re-cellularization+of+de-cellularized+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of age and emphysematous and fibrotic injury on the re-cellularization of de-cellularized lungs.</a> Biomaterials. 34 (13), 3256-3269 (2013).</li>
<li>Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+non-invasive+assessment+of+cell+viability+and+proliferation+in+bio-engineered+whole+organ+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Ex vivo non-invasive assessment of cell viability and proliferation in bio-engineered whole organ constructs.</a> Biomaterials. 52, 103-112 (2015).</li>
<li>Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+attenuate+ischemia-reperfusion+injury+after+prolonged+cold+ischemia+in+a+mouse+model+of+lung+transplantation%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Today%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells attenuate ischemia-reperfusion injury after prolonged cold ischemia in a mouse model of lung transplantation: a preliminary study.</a> Surg Today. 47 (4), 425-431 (2017).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+IL-17+receptor+A+regulates+LPS-potentiated+acute+and+chronic+murine+lung+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Donor IL-17 receptor A regulates LPS-potentiated acute and chronic murine lung allograft rejection.</a> JCI Insight. 8 (21), e158002(2023).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów w związku z tym manuskryptem.

Bioinżynieria narządów to wymagające przedsięwzięcie. Kosztowny proces selekcji utrudnia cykl badawczo-rozwojowy w tej dziedzinie. Wykorzystując myszy jako platformę eksperymentalną, przestrzeń, komórki i pożywki są znacznie zmniejszone w porównaniu z poprzednio używaną platformą szczurzą. Chociaż pomiar szczegółowych parametrów fizycznych, takich jak wymiana gazowa, opór naczyniowy lub podatność płuc, nie został jeszcze osiągnięty, model płuc myszy pozwala na przyspieszenie czasu badań, ponieważ umożliwia szybką iteracj...

Przeszczep płuc okazał się decydującym lekarstwem dla pacjentów cierpiących na schyłkową fazę choroby płuc1 takich jak idiopatyczne zwłóknienie płuc, gdzie leczenie farmakologiczne jest nieskuteczne w celu powstrzymania pogorszenia funkcji oddechowych. Każdego roku na listę oczekujących dołącza więcej kwalifikujących się pacjentów; Jednak liczba dawców narządów od zmarłych dawców nie nadąża za rosnącą liczbą oczekujących pacjentów2,3. Nawet po poddaniu się przeszczepowi płuc wiele problemów pogorszyłoby funkcję przeszczepionych płuc, w tym dysfunkcja narządów pierwotnych, reaktywny zespół allogeniczny i infekcje, które znacznie obniżają 5-letnie przeżycie biorców przeszczepu płuc4.
Istnieje kilka opcji, aby przeciwdziałać obecnym problemom w transplantacji narządów, w tym wykorzystanie marginalnych dawców5, odzyskiwanie płuc dawcy w systemie perfuzji płuc ex vivo6, oraz ksenotransplantacja przy użyciu edytowanych genów świń7. Te alternatywy mogą poszerzyć pulę narządów dawców; Jednak żaden z nich nie jest w stanie całkowicie rozwiązać problemu niedoboru, immunogenności i niejednorodności funkcjonalnej narządów dawcy.
Jest to dalekie od rzeczywistości, ale sztuczne organy bioinżynieryjne, w których komórki specyficzne dla pacjenta są zintegrowane z bezkomórkowym rusztowaniem organów zwierzęcych, są fascynującym potencjalnym źródłem przeszczepów organów stałych8. Od 2010 roku zgłoszono kilka pionierskich badań, które wykazały potencjalną użyteczność bioinżynieryjnych płuc9,10. W tych badaniach płuca szczurów lub świń zostały pozbawione komórek za pomocą detergentów, komórki zwierzęce lub ludzkie zostały wstrzyknięte z tchawicy lub układu naczyniowego płuc w celu regeneracji tkanki płucnej w bioreaktorze opartym na perfuzji, a niektóre z nich zostały przeszczepione ortotopowo do jamy klatki piersiowej zwierząt11,12,13,14,15. Jednak funkcja i struktura bioinżynieryjnych płuc były przedwczesne, prawdopodobnie z powodu niewystarczającej liczby komórek hodowanych w bioreaktorze lub mniej zintegrowanych połączeń międzykomórkowych.
Jedną przeszkodą w rozwoju badań nad bioinżynierią narządów jest brak platformy eksperymentalnej na małą skalę. Podczas gdy szczury lub świnie są powszechnie używanymi zwierzętami w tej dziedzinie, wymagają >108 komórek płuc na płuco16, co jest bardzo kosztowne dla laboratoriów akademickich. Gdyby myszy były dostępne do badań nad bioinżynierią narządów, moglibyśmy radykalnie obniżyć koszty każdego eksperymentu i przyspieszyć program badawczy. Chociaż istnieją różnice anatomiczne między płucami myszy i człowieka17, podstawowa architektura płuc jest podobna u wszystkich ssaków18. Dlatego wyniki eksperymentów w skali myszy można zastosować do większych zwierząt, po prostu mnożąc liczbę w zależności od wielkości ciała.
Ten protokół ma na celu opisanie szczegółowej procedury eksperymentalnej bioinżynierii płuc przy użyciu bloków płuco-serca myszy i ludzkich komórek pierwotnych19. W tym badaniu przyjęliśmy wcześniej zgłoszony i szeroko stosowany protokół decelularyzacji płuc myszy20,21,22. Wyzwaniem w bioinżynierii płuc jest recelularyzacja pozbawionego komórek naczyń włosowatych naczyń włosowatych20; Dlatego w tym protokole zostaną wykorzystane ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej.

<table><tbody><tr><td>DECELULARYZACJA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2 cala Igła BD PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>305109</td><td>Lub równoważna igła iniekcyjna 27 G</td></tr><tr><td>Cewnik BD Insyte IV 20 GA X 1,8 8IN</td><td>BD</td><td>381237</td><td>Lub odpowiednik cewnika dożylnego 20 G</td></tr><tr><td>Szew jedwabny Blade (4-0)</td><td>Nesco</td><td>GA04SB</td><td>Lub odpowiednik</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik do żyły szyjnej szczura, PU 2Fr 10 cm</td><td>Instech</td><td>C20PU-MJV1301</td><td>Zalecany dla myszy o wadze 30 g i mniejszej.</td></tr><tr><td>Cewnik do żyły szyjnej szczura, PU 3Fr 10 cm</td><td>Instech</td><td>C30PU-RJV1307</td><td>Zalecany dla myszy o wadze powyżej 30 g.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Wtryskiwacze PinPort</td><td>Instech</td><td>PNP3M</td><td></td></tr><tr><td>, 22 G</td><td>Instech</td><td>PNP3F22-50</td><td>Pasuje do C30PU-RJV1307</td></tr><tr><td>PinPorts, 25 G</td><td>Instech</td><td>PNP3F25-50</td><td>Pasuje do C20PU-MJV1301</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka, 5 ml</td><td>Generyczny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>HODOWLA</td><td></td><td></td><td></td>KOMÓRKOWA</tr><tr><td>EGM-2 Podłoże do wzrostu komórek śródbłonka-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC &ndash; Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej</td><td>Lonza</td><td>C2519A</td> BIOREAKTOR NA BAZIE PERFUZJI Igła 20 G Ogólny 3-drogowy kran Ogólny Świdr korkowy Ogólny rozmiar wytaczania, 6-10 mm Głowica <td></td></tr><tr><td>pompy EasyLoad III</td><td>Cole-Parmer</td><td>243934</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>Szkło <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> kanister</td><td>Hario</td><td>SCN-200T</td><td>Średnica wewnętrzna: 80 mm</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne grzewcze</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łącznik przynęty, PVDF, Do miękkiej rurki</td><td>Nordson Medical</td><td>2-9965-01</td><td>Żeński, pasuje do rurki z ID 1.5 mm (L/S 14)</td></tr><tr><td>Złączka do przynęty, PVDF, Do miękkiej rurki</td><td>Nordson Medical</td><td>2-9964-01</td><td>Męski, pasuje do rurki z średnicą wewnętrzną 1.5 mm (L/S 14)</td></tr><tr><td>Złączka do przynęty, PVDF, Do miękkiej rurki</td><td>Nordson Medical</td><td>2-9965-03</td><td>Żeński, pasuje do rurki z średnicą wewnętrzną 3 mm (L/S 16)</td></tr><tr><td>Złączka przynęty, PVDF, do miękkiej rurki</td><td>Nordson Medical</td><td>2-9964-03</td><td>Męska, pasuje do rurki z średnicą wewnętrzna 3 mm (L/S 16)</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Precision Modular Drive ze zdalnym I/O i sterownikiem laboratoryjnym</td><td>Cole-Parmer</td><td>07557-00</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do pompy precyzyjnej Masterflex L/S, PharMed BPT, L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>06508-16</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do pompy Masterflex L/S Pricision, silikon utwardzany platyną, L/S 14</td><td>Cole-Parmer</td><td>96410-14</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Filtr strzykawkowy, 0,22 i mikro; m, polieterosulfon, 33 mm, sterylizowany promieniami gamma</td><td>Millipore</td><td>SLGPR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Butelka z trawą Pyrex 250 ml, zakrętka GL-45</td><td>Corning</td><td>1395-250</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowa septa do GL45 Otwarta górna nakrętka PBT</td><td>Corning</td><td>1395-455S</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowy korek świetlny</td><td>IMG</td><td>07763-18</td><td>Górna średnica: 87 mm, Dolna średnica: 75 mm</td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka, 10 mL, 50 ml</td><td>Ogólny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIRURGIA MYSZY (Izolacja bloku płuco-serce | Przeszczep płuc)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-0 Krawaty nylonowe</td><td>Kono Seisakusho</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>10-0 Krawaty jedwabne</td><td>Kono Seisakusho</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Opaski jedwabne</td><td>Kono Seisakusho</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk tętniczy, zakrzywiony 45 mm, rowkowany</td><td>Natsume seisakusyo</td><td>C-17-45</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte IV Cewnik 24GA</td><td>BD</td><td>381512</td><td>Or odpowiednik cewnika dożylnego 24G</td></tr><tr><td>Kleszcze naczyniowe Bulldog 45mm zakrzywione</td><td>Natsume seisakusyo</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>Winian butorfanolu&nbsp;</td><td>Meiji Seika Pharma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td>Sodium Otsuka Pharmaceutical</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumonta #5/45</td><td>Fine Science Tools</td><td>1251-35</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki sprężynowe w stylu vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15403-08</td><td>Końcówka 45&deg, 0,01 x 0,06 mm</td></tr><tr><td>Zestaw do kauteryzacji Gemini</td><td>Aparat Harvard</td><td>RS-300</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiona końcówka zacisku Halsted-Mosquito, 125 mm</td><td>Centrum badań biologicznych</td><td>16181670</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę Hegar, 150 mm</td><td>B Braun/Aesculap</td><td>BM065R</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór heparyny</td><td>Mochida Seiyaku</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Nippon Zenyaku Kogyo</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokleszcze proste</td><td>B Braun/Aesculap</td><td>BD33R</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Wentylator myszy Sandoz</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aparat Harvard</td><td>Model 687&handel;</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna, klasa kliniczna</td><td>Otsuka Pharmaceutical</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego, 60 x 15 mm</td><td>BD</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Safelet Cath PU Cewnik poliuretanowy o rozmiarze 20 Nipro</td><td></td><td>09-031</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki ze stali nierdzewnej Sakaki zakrzywione 14 cm</td><td>Centrum biobadań</td><td>64152034</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na skalpel</td><td>Centrum badań biologicznych</td><td>16101040</td><td></td></tr><tr><td>System chowania małych zwierząt</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-20</td><td></td></tr><tr><td>Zapasowy skalpel #11</td><td>Muranaka Medical Instruments</td><td>567-001-03</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe, 15 cm</td><td>Centrum Biobadań</td><td>PRI13-3736</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>M525</td><td>Preferowany jest mikroskop chirurgiczny klasy klinicznej z elastycznym systemem ramienia.</td></tr><tr><td>Sugita tytanowy klips do tętniaka zakrzywiony smukły, nr 98</td><td>Mizuho medical</td><td>17-001-98</td><td></td></tr><tr><td>Tytanowy klips Sugita aplikator, 110 mm</td><td>Mizuho medical</td><td>17-013-53</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz elektryczny z regulacją temperatury</td><td>Ogólny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracienki wacik bawełniany</td><td>Ogólny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MANKIET</td><td></td><td></td><td></td>NACZYNIOWY I OSKRZELOWY</tr><tr><td>Grzywna papier ścierny</td><td>Ogólny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wentyl teflonowy angiocewnik Venula o grubości 20</td><td>Top</td><td>1160</td><td></td></tr><tr><td>Venula 22 kaliber Teflonowy angiocewnik</td><td>Top</td><td>1161</td><td></td></tr><tr><td>Venula 24 kaliber Teflonowy angiocewnik</td><td>Top</td><td>1124</td><td></td></tr></tbody></table>

przeszczep bioinżynieryjnego płuca przy użyciu pozbawionych komórek płuc myszy i pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka

Transplantation of Bioengineered Lung Using Decellularized Mouse Lungs and Primary Human Endothelial Cells

Transplantacja płuc jest kluczowym sposobem leczenia dla pacjentów ze schyłkowymi chorobami płuc, takimi jak idiopatyczne zwłóknienie płuc, ale wyzwania, takie jak niedobór dawców i powikłania po przeszczepie, utrzymują się. Bioinżynieryjne płuca, integrujące specyficzne dla pacjenta komórki w pozbawione komórek rusztowania zwierzęce, stanowią obiecującą alternatywę. Pomimo postępów w wykorzystaniu bioinżynieryjnych płuc w modelach zwierzęcych, funkcjonalność i struktura pozostają niedojrzałe. Protokół ten rozwiązuje krytyczną barierę w bioinżynierii narządów: potrzebę opłacalnej platformy eksperymentalnej. Używając modeli mysich zamiast większych zwierząt, takich jak szczury czy świnie, naukowcy mogą znacznie zmniejszyć zasoby wymagane do każdego eksperymentu, przyspieszając postęp badań. 
Protokół przedstawia szczegółową procedurę bioinżynierii płuc przy użyciu bloków płuco-serce myszy i ludzkich komórek pierwotnych, koncentrując się na strategii izolacji bloku płuco-serce myszy, decelularyzacji, ustawieniu bioreaktora, hodowli narządów opartej na perfuzji oraz ortotopowym przeszczepie bioinżynieryjnych płuc. Ta platforma w skali myszy nie tylko zmniejsza koszty eksperymentalne, ale także zapewnia realne ramy do optymalizacji typów i liczby komórek do recelularyzacji, testowania różnych typów komórek przy użyciu metod histologicznych i molekularnych oraz zapewnienia przepływu krwi po przeszczepie. Metoda ta ma potencjał do szerokich zastosowań, w tym do badania interakcji komórkowych w warunkach trójwymiarowej hodowli, interakcji komórka-matryca oraz modelowania nowotworów ex vivo, przyczyniając się w ten sposób do rozwoju w dziedzinie bioinżynierii narządów.

Po zastosowaniu protokołu decelularyzacji płuca myszy są widocznie białe i półprzezroczyste (Rysunek 6A). Komponenty komórkowe powinny zostać całkowicie usunięte, jednak w obserwacji histologicznej struktura pęcherzyków płucnych pozostaje nienaruszona (Rysunek 6B,C). Recelularyzowane płuca myszy z wykorzystaniem 3 × 107 HUVECs w 2-dniowej hodowli w bioreaktorze opartym na perfuzji wykazują jednorodny rozkład HUVECs (<strong class="xfi...

Ten artykuł opisuje, jak stworzyć bioinżynieryjne płuca myszy za pomocą metod decelularyzacji i recelularyzacji. Zawiera również szczegółowe informacje na temat późniejszego ortotopowego przeszczepu płuc.

Przeszczep bioinżynieryjnego płuca przy użyciu pozbawionych komórek płuc myszy i pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor ...

Bioinżynieria organów wielkości człowieka wymaga dużej ilości zasobów, które często przekraczają możliwości laboratoriów akademickich. Obniżenie kosztów rozwoju protokołu iteracyjnego przyspieszy postęp badawczy w tej dziedzinie. Celem tego badania jest dostarczenie ustandaryzowanego protokołu bioinżynierii płuc z wykorzystaniem bloków płuco-serce myszy. Nadal nie wiadomo, jakie komórki są odpowiednie do bioinżynierii narządów i w jaki sposób komórki te powinny być zintegrowane z hodowlą bioreaktora narządowego. Należy porównać wiele typów komórek i warunków w celu ustanowienia skalowalnych i odtwarzalnych protokołów.Myszy są małymi i łatwymi w obsłudze zwierzętami doświadczalnymi. Jednak, mimo że są małe, podstawowa architektura płuc jest podobna u wszystkich ssaków. Optymalizując protokół na tej małej platformie, możemy zwiększyć skalę laserowych modeli zwierząt, po prostu mnożąc zoptymalizowane wyniki w zależności od wielkości zwierząt. Ta platforma bioinżynieryjna płuc wielkości myszy pozwala naukowcom skutecznie testować komórki macierzyste. Te genetycznie zmodyfikowane komórki mogą być cenne lub kosztowne w użyciu w całej inżynierii płuc. Ponadto komórki pochodzące od pacjentów mogą być również wykorzystywane do tworzenia modeli chorób in vitro.Obecne wysiłki obejmują testowanie wielu typów zmodyfikowanych komórek macierzystych i komórek progenitorowych, aby określić wymagany potencjał proliferacyjny i zróżnicowaną zdolność bioinżynierii płuc. Po zidentyfikowaniu odpowiednich komórek badania te zostaną rozszerzone na większy model zwierzęcy, taki jak świnie.[Narrator] Na początek połóż uśpioną mysz w pozycji leżącej na stole operacyjnym i napraw kończyny. Rozpyl 70% etanolu równomiernie na klatkę piersiową i powierzchnię brzucha, aby go wysterylizować. Następnie otwórz jamę brzuszną wzdłuż linii środkowej rozciągającej się do szyi za pomocą nożyczek ze stali nierdzewnej i rozłup mostek. Wyciąć przeponę ze ściany klatki piersiowej. Przetnij brzuszną ścianę klatki piersiowej, aby odsłonić jamy klatki piersiowej i usunąć grasicę. Za pomocą jedwabnego szwu 4/0 legate żyły głównej dolnej i prawej żyły głównej górnej. Przetnij aortę brzuszną nożyczkami ze stali nierdzewnej w celu drenażu. Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności pięciu mililitrów wyposażonej w igłę o rozmiarze 27 wstrzyknij trzy mililitry sterylnego PBS do prawej komory, nakłuwając ścianę komory. Użyj kleszczyków Dumonta, aby zapętlić jedwabny szew 4/0 wokół głównej tętnicy płucnej. Następnie wytnij dwumilimetrowe okienko pod zastawkami tętnicy płucnej, używając nożyczek sprężynowych, aby uzyskać dostęp do ściany prawej komory. Włóż cewnik do tętnicy płucnej przez okienko i zabezpiecz go wstępnie zapętlonym jedwabnym szwem 4/0. Powoli wstrzyknij dwa mililitry PBS przez cewnik do tętnicy płucnej za pomocą pięciomililitrowej strzykawki. Zkaniuluj tchawicę cewnikiem dotchawiczym i zawiąż go na miejscu jedwabnym szwem 4/0. Teraz powoli wstrzyknij dwa mililitry powietrza przez cewnik dotchawiczy za pomocą pustej pięciomililitrowej strzykawki. Przytrzymaj powietrze przez 10 sekund, aby upewnić się, że powietrze nie wycieka z płuc. Usuń blok końcowy serca i płuc. Następnie przenieś wycięty blok płuco-serce na plastikową szalkę Petriego o średnicy 10 centymetrów zawierającą dejonizowaną wodę, w celu decelularyzacji płuc. Inkubuj blok przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji, za pomocą pięciomililitrowej strzykawki, trzykrotnie wstrzyknij dwa mililitry sterylnej dejonizowanej wody przez cewnik dotchawicy. Po każdym wstrzyknięciu należy zrobić przerwę, aby płyn mógł wydostać się z płuc w miarę cofania się. Podobnie wstrzyknij dwa mililitry wody przez cewnik tętnicy płucnej. Wstrzyknąć dwa mililitry 0,1% roztworu Triton X-100 do cewnika dotchawiczego i cewnika do tętnicy płucnej. Przenieś blok płuco-serce na szalkę Petriego i inkubuj statycznie w roztworze Triton X-100 przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia, aby usunąć roztwór Triton X-100 z płuc, wstrzyknij dwa mililitry dejonizowanej wody do cewnika dotchawiczego i cewnika do tętnicy płucnej i powtórz je z dwoma mililitrami 2% roztworu deoksycholanu. Po usunięciu roztworu deoksycholanu z płuc wstrzyknąć dwa mililitry jednego molowego roztworu chlorku sodu do cewnika dotchawiczego i tętnicy płucnej. Inkubować blok płuco-serce przez godzinę. Po usunięciu roztworu chlorku sodu wodą dejonizowaną wstrzyknąć dwa mililitry roztworu roboczego DNazy I do cewnika dotchawiczego i tętnicy płucnej. Inkubować blok płuco-serce przez godzinę. Wstrzyknąć sterylny PBS do cewnika tchawicy i tętnicy płucnej w celu usunięcia roztworu DNazy I. Po decelularyzacji upewnij się, że płuca są białe i przezroczyste na krawędziach. Dodaj 70 mililitrów pożywki do hodowli komórek śródbłonka 2 lub pożywki hodowlanej EGM-2 do szklanego pojemnika i umieść silikonowy korek na górze pojemnika, aby go uszczelnić. Zamontuj silikonowy korek, szklany kanister, nakrętkę GL45 z rurką, szklaną butelkę autoklawowaną o pojemności 250 mililitrów oraz rurkę L/S 14 ze złączkami do przynęt za pomocą trójdrożnych kurków. Włóż igłę o rozmiarze 20 do silikonowej przegrody nakrętki GL45. Napełnij rurki A, B i C pożywką hodowlaną za pomocą 10-mililitrowej strzykawki podłączonej do kurków pierwszego i trzeciego. Przymocuj cewnik do tętnicy płucnej zdekomórkowego bloku płuco-serce do rurki C za pomocą złączki przynęty. Upewnij się, że w cewniku lub rurce nie ma pęcherzyków powietrza. W przypadku wstrzykiwania komórek śródbłonka sterowanego grawitacją, należy umieścić zbiornik komórkowy zawierający ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej lub HUVEC na mieszadle magnetycznym, upewniając się, że zbiornik znajduje się 30 centymetrów nad komorą narządu. Włącz mieszadło magnetyczne z prędkością 120 obr./min. Otwórz kurki pierwszy i drugi, aby umożliwić przepływ zawiesiny komórek do rusztowania bezkomórkowego przez rurkę A, rurkę C i cewnik tętnicy płucnej. W celu perfuzji hodowli narządów należy umieścić komorę narządową w inkubatorze z dwutlenkiem węgla. Podłącz rurkę B do głowicy pompy podłączonej do pompy pulsacyjnej. Zamknij szklane drzwiczki inkubatora. Upewnij się, że rurka jest prawidłowo umieszczona między drzwiami a gumową uszczelką. Inkubuj rusztowanie pozbawione komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny, aby komórki śródbłonka mogły osiąść w rusztowaniu. Uruchom pompę z szybkością sześciu obrotów na minutę, co daje perfuzję medium w wysokości dwóch mililitrów na minutę przy użyciu rurki L/S 14. Obserwuj, jak pozbawione komórek płuco nieznacznie rozszerza się z powodu perfuzji mediów. Następnie zamknij drzwi inkubatora. Aby dokonać wymiany mediów, zatrzymaj napęd pompy. Podłącz sterylną strzykawkę o pojemności 50 mililitrów do kranu trzeciego i wyjmij 50 mililitrów pożywki z komory. Napełnij kolejną sterylną strzykawkę o pojemności 50 mililitrów wstępnie podgrzanym podłożem. Wstrzyknąć roztwór do szklanego kanistra i przenieść pożywkę do komory przez zawór odcinający numer trzy, upewniając się, że zawór odcinający jest prawidłowo przełączony. Uruchom ponownie pompę pulsacyjną. Zbierz zrekulkularyzowany blok płuco-serce po dwóch dniach hodowli narządów perfuzyjnych. Płuca myszy wydawały się białe i półprzezroczyste po decelularyzacji, co wskazuje na usunięcie składników komórkowych, przy jednoczesnym zachowaniu ogólnej struktury płuc. Analiza histologiczna pozbawionych komórek płuc myszy ujawniła nienaruszone struktury pęcherzyków płucnych, bez pozostałych składników komórkowych. Recellularizowane płuca myszy z trzykrotną siłą 10 do mocy siedmiu HUVEC po dwóch dniach hodowli bioreaktora opartego na perfuzji wykazywały jednorodną dystrybucję HUVEC. HUVEC migrowały do obwodowych obszarów pęcherzyków płucnych, tworząc sieć przypominającą naczynia włosowate, jak obserwowano w zrekulkularyzowanych płucach.

transplantation-bioengineered-lung-using-decellularized-mouse-lungs

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowaliśmy zdecelularyzowaną macierz zewnątrzkomórkową płuca oraz nowatorski bioreaktor biomimetyczny, które mogą być wykorzystywane do generowania funkcjonalnej tkanki płucnej. Poprzez zasiewanie komórek do macierzy i ich hodowlę w bioreaktorze, otrzymujemy tkankę wykazującą efektywną wymianę gazową po krótkotrwałym przeszczepieniu in vivo.

Procedura inżynierii płuc

Decelularyzacja całego narządu tworzy naturalne biologiczne rusztowania, które mogą być wykorzystane w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiono opis modelu regeneracji płuc u naczelnych u zwierząt innych niż człowiek, w którym całe płuca są decelularyzowane, a następnie wysiewane dorosłymi komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka w bioreaktorze ułatwiającym krążenie naczyniowe i wentylację płynnych mediów.

Decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego

Aby zrozumieć komórkowe i molekularne mechanizmy leżące u podstaw powstawania nowotworów i rozwoju zwężeń w zastawkach serca z inżynierii tkankowej, opracowano mysi model heterotopowego przeszczepu zastawki serca. Zastawkę płucną serca przeszczepiono biorcy przy użyciu techniki heterotopowego przeszczepiania serca.

Przeszczepienie zastawki płucnej z wykorzystaniem mysiego modelu heterotopowego przeszczepienia serca

Rekapitulacja mikrośrodowiska specyficznego dla danego narządu, która stymuluje miejscową angiogenezę, jest niezbędna do skutecznej regeneracji uszkodzonych tkanek. W niniejszym raporcie przedstawiono nowatorską metodę wszczepiania żeli fibrynowych na powierzchnię płuc żywej myszy w celu zbadania, w jaki sposób mikrośrodowisko specyficzne dla płuc moduluje angiogenezę i regenerację pęcherzyków płucnych u dorosłych myszy.

Implantacja żelu fibrynowego do płuca myszy w celu zbadania angiogenezy specyficznej dla płuc

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

Ten protokół skutecznie kieruje endodermę pochodzącą z embrionalnych komórek macierzystych myszy do dojrzałych komórek nabłonka dróg oddechowych. Ta technika różnicowania wykorzystuje trójwymiarowe, zdecelularizowane rusztowania płuc do kierowania specyfikacją linii płuc w zdefiniowanych, wolnych od surowicy warunkach hodowli.

Generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z ESC przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc

Ten protokół opisuje metodę generowania powtarzalnych, małych tkanek płuc, poprzez ponowne zaludnienie decelularyzowanych, precyzyjnie wyciętych wycinków płuc komórkami nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2, fibroblastami i komórkami śródbłonka.

Zmodyfikowane tkanki płuc przygotowane z bezkomórkowych plastrów płuc

W tym artykule, pierwotne komórki śródbłonka płuc zostały wyizolowane i wyhodowane od nowonarodzonych myszy.

Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji regionalnej decelularyzowanej tkanki płucnej. Protokół ten zapewnia potężne narzędzie do badania złożoności macierzy zewnątrzkomórkowej i interakcji komórka-macierz.

Rozwarstwienie i izolacja specyficznej dla regionu bezkomórkowej tkanki płucnej

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Poznaj protokół bioinżynierii płuc myszy poprzez dekompozycję komórkową i rekompozycję z użyciem ludzkich komórek śródbłonka. Ta metoda umożliwia skalowalne badania nad przeszczepami narządów.

Przeszczep bioinżynieryjnego płuca przy użyciu pozbawionych komórek płuc myszy i pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka

Przeglądaj więcej filmów