Przeszczep bioinżynieryjnego płuca przy użyciu pozbawionych komórek płuc myszy i pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka

Bioinżynieria organów wielkości człowieka wymaga dużej ilości zasobów, które często przekraczają możliwości laboratoriów akademickich. Obniżenie kosztów rozwoju protokołu iteracyjnego przyspieszy postęp badawczy w tej dziedzinie. Celem tego badania jest dostarczenie ustandaryzowanego protokołu bioinżynierii płuc z wykorzystaniem bloków płuco-serce myszy. Nadal nie wiadomo, jakie komórki są odpowiednie do bioinżynierii narządów i w jaki sposób komórki te powinny być zintegrowane z hodowlą bioreaktora narządowego. Należy porównać wiele typów komórek i warunków w celu ustanowienia skalowalnych i odtwarzalnych protokołów.

Myszy są małymi i łatwymi w obsłudze zwierzętami doświadczalnymi. Jednak, mimo że są małe, podstawowa architektura płuc jest podobna u wszystkich ssaków. Optymalizując protokół na tej małej platformie, możemy zwiększyć skalę laserowych modeli zwierząt, po prostu mnożąc zoptymalizowane wyniki w zależności od wielkości zwierząt. Ta platforma bioinżynieryjna płuc wielkości myszy pozwala naukowcom skutecznie testować komórki macierzyste. Te genetycznie zmodyfikowane komórki mogą być cenne lub kosztowne w użyciu w całej inżynierii płuc. Ponadto komórki pochodzące od pacjentów mogą być również wykorzystywane do tworzenia modeli chorób in vitro.

Obecne wysiłki obejmują testowanie wielu typów zmodyfikowanych komórek macierzystych i komórek progenitorowych, aby określić wymagany potencjał proliferacyjny i zróżnicowaną zdolność bioinżynierii płuc. Po zidentyfikowaniu odpowiednich komórek badania te zostaną rozszerzone na większy model zwierzęcy, taki jak świnie.

[Narrator] Na początek połóż uśpioną mysz w pozycji leżącej na stole operacyjnym i napraw kończyny. Rozpyl 70% etanolu równomiernie na klatkę piersiową i powierzchnię brzucha, aby go wysterylizować. Następnie otwórz jamę brzuszną wzdłuż linii środkowej rozciągającej się do szyi za pomocą nożyczek ze stali nierdzewnej i rozłup mostek. Wyciąć przeponę ze ściany klatki piersiowej. Przetnij brzuszną ścianę klatki piersiowej, aby odsłonić jamy klatki piersiowej i usunąć grasicę. Za pomocą jedwabnego szwu 4/0 legate żyły głównej dolnej i prawej żyły głównej górnej. Przetnij aortę brzuszną nożyczkami ze stali nierdzewnej w celu drenażu. Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności pięciu mililitrów wyposażonej w igłę o rozmiarze 27 wstrzyknij trzy mililitry sterylnego PBS do prawej komory, nakłuwając ścianę komory. Użyj kleszczyków Dumonta, aby zapętlić jedwabny szew 4/0 wokół głównej tętnicy płucnej. Następnie wytnij dwumilimetrowe okienko pod zastawkami tętnicy płucnej, używając nożyczek sprężynowych, aby uzyskać dostęp do ściany prawej komory. Włóż cewnik do tętnicy płucnej przez okienko i zabezpiecz go wstępnie zapętlonym jedwabnym szwem 4/0. Powoli wstrzyknij dwa mililitry PBS przez cewnik do tętnicy płucnej za pomocą pięciomililitrowej strzykawki. Zkaniuluj tchawicę cewnikiem dotchawiczym i zawiąż go na miejscu jedwabnym szwem 4/0. Teraz powoli wstrzyknij dwa mililitry powietrza przez cewnik dotchawiczy za pomocą pustej pięciomililitrowej strzykawki. Przytrzymaj powietrze przez 10 sekund, aby upewnić się, że powietrze nie wycieka z płuc. Usuń blok końcowy serca i płuc. Następnie przenieś wycięty blok płuco-serce na plastikową szalkę Petriego o średnicy 10 centymetrów zawierającą dejonizowaną wodę, w celu decelularyzacji płuc. Inkubuj blok przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji, za pomocą pięciomililitrowej strzykawki, trzykrotnie wstrzyknij dwa mililitry sterylnej dejonizowanej wody przez cewnik dotchawicy. Po każdym wstrzyknięciu należy zrobić przerwę, aby płyn mógł wydostać się z płuc w miarę cofania się. Podobnie wstrzyknij dwa mililitry wody przez cewnik tętnicy płucnej. Wstrzyknąć dwa mililitry 0,1% roztworu Triton X-100 do cewnika dotchawiczego i cewnika do tętnicy płucnej. Przenieś blok płuco-serce na szalkę Petriego i inkubuj statycznie w roztworze Triton X-100 przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia, aby usunąć roztwór Triton X-100 z płuc, wstrzyknij dwa mililitry dejonizowanej wody do cewnika dotchawiczego i cewnika do tętnicy płucnej i powtórz je z dwoma mililitrami 2% roztworu deoksycholanu. Po usunięciu roztworu deoksycholanu z płuc wstrzyknąć dwa mililitry jednego molowego roztworu chlorku sodu do cewnika dotchawiczego i tętnicy płucnej. Inkubować blok płuco-serce przez godzinę. Po usunięciu roztworu chlorku sodu wodą dejonizowaną wstrzyknąć dwa mililitry roztworu roboczego DNazy I do cewnika dotchawiczego i tętnicy płucnej. Inkubować blok płuco-serce przez godzinę. Wstrzyknąć sterylny PBS do cewnika tchawicy i tętnicy płucnej w celu usunięcia roztworu DNazy I. Po decelularyzacji upewnij się, że płuca są białe i przezroczyste na krawędziach. Dodaj 70 mililitrów pożywki do hodowli komórek śródbłonka 2 lub pożywki hodowlanej EGM-2 do szklanego pojemnika i umieść silikonowy korek na górze pojemnika, aby go uszczelnić. Zamontuj silikonowy korek, szklany kanister, nakrętkę GL45 z rurką, szklaną butelkę autoklawowaną o pojemności 250 mililitrów oraz rurkę L/S 14 ze złączkami do przynęt za pomocą trójdrożnych kurków. Włóż igłę o rozmiarze 20 do silikonowej przegrody nakrętki GL45. Napełnij rurki A, B i C pożywką hodowlaną za pomocą 10-mililitrowej strzykawki podłączonej do kurków pierwszego i trzeciego. Przymocuj cewnik do tętnicy płucnej zdekomórkowego bloku płuco-serce do rurki C za pomocą złączki przynęty. Upewnij się, że w cewniku lub rurce nie ma pęcherzyków powietrza. W przypadku wstrzykiwania komórek śródbłonka sterowanego grawitacją, należy umieścić zbiornik komórkowy zawierający ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej lub HUVEC na mieszadle magnetycznym, upewniając się, że zbiornik znajduje się 30 centymetrów nad komorą narządu. Włącz mieszadło magnetyczne z prędkością 120 obr./min. Otwórz kurki pierwszy i drugi, aby umożliwić przepływ zawiesiny komórek do rusztowania bezkomórkowego przez rurkę A, rurkę C i cewnik tętnicy płucnej. W celu perfuzji hodowli narządów należy umieścić komorę narządową w inkubatorze z dwutlenkiem węgla. Podłącz rurkę B do głowicy pompy podłączonej do pompy pulsacyjnej. Zamknij szklane drzwiczki inkubatora. Upewnij się, że rurka jest prawidłowo umieszczona między drzwiami a gumową uszczelką. Inkubuj rusztowanie pozbawione komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny, aby komórki śródbłonka mogły osiąść w rusztowaniu. Uruchom pompę z szybkością sześciu obrotów na minutę, co daje perfuzję medium w wysokości dwóch mililitrów na minutę przy użyciu rurki L/S 14. Obserwuj, jak pozbawione komórek płuco nieznacznie rozszerza się z powodu perfuzji mediów. Następnie zamknij drzwi inkubatora. Aby dokonać wymiany mediów, zatrzymaj napęd pompy. Podłącz sterylną strzykawkę o pojemności 50 mililitrów do kranu trzeciego i wyjmij 50 mililitrów pożywki z komory. Napełnij kolejną sterylną strzykawkę o pojemności 50 mililitrów wstępnie podgrzanym podłożem. Wstrzyknąć roztwór do szklanego kanistra i przenieść pożywkę do komory przez zawór odcinający numer trzy, upewniając się, że zawór odcinający jest prawidłowo przełączony. Uruchom ponownie pompę pulsacyjną. Zbierz zrekulkularyzowany blok płuco-serce po dwóch dniach hodowli narządów perfuzyjnych. Płuca myszy wydawały się białe i półprzezroczyste po decelularyzacji, co wskazuje na usunięcie składników komórkowych, przy jednoczesnym zachowaniu ogólnej struktury płuc. Analiza histologiczna pozbawionych komórek płuc myszy ujawniła nienaruszone struktury pęcherzyków płucnych, bez pozostałych składników komórkowych. Recellularizowane płuca myszy z trzykrotną siłą 10 do mocy siedmiu HUVEC po dwóch dniach hodowli bioreaktora opartego na perfuzji wykazywały jednorodną dystrybucję HUVEC. HUVEC migrowały do obwodowych obszarów pęcherzyków płucnych, tworząc sieć przypominającą naczynia włosowate, jak obserwowano w zrekulkularyzowanych płucach.