Przepływ pracy metaproteomiki klinicznej wdrożony w ramach platformy bioinformatycznej Galaxy w celu analizy interakcji gospodarz-mikrobiom leżących u podstaw chorób człowieka
10 stycznia 2025
Metaproteomika kliniczna oferuje wgląd w ludzki mikrobiom i jego wpływ na choroby. Wykorzystaliśmy moc obliczeniową platformy Galaxy do opracowania modułowego przepływu pracy bioinformatycznego, który ułatwia złożoną analizę metaproteomiczną opartą na spektrometrii mas i charakteryzację różnych typów próbek klinicznych istotnych dla badań nad chorobami.
Nasze badania koncentrowały się na wykrywaniu i ilościowym określaniu białek drobnoustrojów oraz zrozumieniu ich roli w klinicznej chorobie. Ta dziedzina badań nazywana jest metaproteomiką kliniczną. W tym badaniu opracowaliśmy bioinformatyczny przepływ pracy, który pozwoli naukowcom zrozumieć, w jaki sposób aktywność bakterii może wpływać na postęp choroby.
Analiza metaproteomiczna próbek klinicznych wiąże się z licznymi wyzwaniami, w tym z obsługą bardzo dużych baz danych sekwencji białek w celu czułej i dokładnej identyfikacji peptydów i białek mikrobiologicznych na podstawie danych ze spektrometrii mas, a także z wykonywaniem adnotacji taksonomicznych i funkcjonalnych ilościowo oznaczonych peptydów i białek w celu umożliwienia biologicznej interpretacji wyników. Przepływ pracy oferuje wiele korzyści, w tym redukcję bazy danych za pomocą naszego przepływu pracy redukcji bazy danych, możliwość wyszukiwania peptydów drobnoustrojów przy użyciu wielu algorytmów wyszukiwania, możliwość weryfikacji peptydów drobnoustrojów wykrytych w danych spektrometrii mas, możliwość ilościowego oznaczania białek drobnoustrojów wraz z białkami gospodarza oraz biologiczną interpretację danych za pomocą analizy statystycznej i wizualnej. Wykorzystaliśmy przepływ pracy metaproteomiki klinicznej do identyfikacji panelu peptydów drobnoustrojów do badań nad progresją choroby mukowiscydozy w celu zbadania stanu koinfekcji podczas fal pandemii COVID-19.
Badania te zostały opublikowane w recenzowanych czasopismach naukowych. Obecnie wykorzystujemy ten przepływ pracy w trwającym badaniu mającym na celu opracowanie predykcyjnego panelu peptydów docelowych dla raka jajnika. Zespół Galaxy P jest zaangażowany w badania multiomiczne i opracowuje kilka zaawansowanych przepływów pracy dla analizy proteogenomiki i metaproteomiki.
Obecnie pracujemy również nad opracowaniem przepływów pracy dla immunopeptydomiki, które umożliwią naukowcom wykrywanie i charakteryzowanie peptydów prezentowanych układowi odpornościowemu, niektóre podczas progresji raka, które są nazywane neoantygenami, a także w przypadku innych chorób, w których mogą to być również peptydy mikrobiologiczne. Na początek uzyskaj listę gatunków, które są związane z chorobą lub stanem będącym przedmiotem zainteresowania. Użyj pliku z listą gatunków zatytułowanego Gatunki.
tabular"jako dane wejściowe dla UniProt. Pobierz proteom w formacie FASTA, aby wygenerować bazę danych sekwencji białek. Uruchom narzędzie do pobierania bazy danych białek, aby wygenerować dwie dodatkowe bazy danych sekwencji białek, ludzką bazę danych Swiss-Prot zawierającą tylko recenzowane wpisy oraz bazę danych białek zanieczyszczających zawierającą wspólne repozytorium białek przypadkowych lub cRAP.
Użyj trzech baz danych białek jako danych wejściowych dla plików scalania FASTA i filtruj unikalne sekwencje, aby wykluczyć duplikaty. Korzystając z dużej bazy danych wygenerowanej i zestawu danych spektrometrii mas jako danych wejściowych, uruchom MetaNovo, aby wygenerować bazę danych o zredukowanych sekwencjach białek, a następnie uruchom pliki scalające FASTA i przefiltruj unikalne sekwencje w bazie danych wygenerowanej przez MetaNovo, ludzkich bazach danych Swiss-Prot i cRAP, aby utworzyć zredukowaną docelową bazę danych zawierającą sekwencje białek mikrobiologicznych, ludzkich i zanieczyszczeń do wykrywania peptydów. Wykonaj Wyszukiwanie GUI", aby wygenerować plik archiwum zawierający dopasowania widma peptydów lub PSM.
Użyj Search GUI "plik archiwum jako dane wejściowe dla Peptide-Shaker", aby wygenerować raporty PSM, peptydów i białek. Uruchom MaxQuant", aby utworzyć pliki grup białkowych i peptydów. Korzystając z narzędzi do manipulacji tekstem, uporządkuj uzyskane dane wyjściowe z Search GUI, Peptide-Shaker" i MaxQuant.
Połącz dwie listy peptydów w jeden zestaw danych o nazwie SGPS-MQ-Peptides.tabular. Pogrupuj połączoną listę peptydów, aby wyeliminować zduplikowane sekwencje peptydów i uzyskać ostateczną listę unikalnych peptydów drobnoustrojów. W celu weryfikacji PepQuery2 wprowadź listę odrębnych peptydów mikrobiologicznych, zestawy danych spektralnych MS, referencyjną bazę danych UniProt dla ludzi z izoformami oraz bazę danych sekwencji białek zanieczyszczeń.
Uruchom Cut"w raportach peptydowych z graficznego interfejsu użytkownika wyszukiwania, Peptide-Shaker"i MaxQuant"aby wyodrębnić sekwencje peptydowe i powiązane wpisy białek. Połącz sekwencje peptydów i wpisy białek z obu programów, aby utworzyć nowy złożony zestaw danych białek peptydowych, a następnie uruchom Query Tabular" na połączonym zestawie danych białek peptydowych i zweryfikowanych peptydach, aby przypisać każdy zweryfikowany peptyd do powiązanego z nim wpisu białka. Grupa, aby zachować unikalne zweryfikowane peptydy i powiązane z nimi identyfikatory UniProt .
Następnie uruchom Query Tabular", aby wyodrębnić identyfikatory UniProt , generując listę oznaczoną Uniprot-ID ze zweryfikowanych Peptides.tabular. Prześlij identyfikatory UniProt do UniProto, aby pobrać powiązane sekwencje białek i zapisać je jako nowy plik UniProt FAPSA. Uruchom pliki scalania FASTA i przefiltruj unikalne sekwencje w nowo wygenerowanej bazie danych UniProt FASTA, ludzkiej bazie danych UniProt z izoformami i bazie danych zanieczyszczeń cRAP, aby utworzyć zweryfikowaną bazę danych do kwantyfikacji peptydów.
Użyj zweryfikowanej bazy danych sekwencji białek i zestawu danych MS jako danych wejściowych dla MaxQuant. Z pliku peptydów MaxQuant wybierz tylko peptydy drobnoustrojowe i uruchom Cut", aby wyodrębnić tylko sekwencje peptydów drobnoustrojowych z pliku wyboru. Zgrupuj plik Cut", aby sporządzić listę ilościowo oznaczonych peptydów mikrobiologicznych.
Użyj pliku list-of-quantified-microbial-peptides jako danych wejściowych dla Unipept do wykonywania adnotacji taksonomicznych i funkcjonalnych. Wyodrębnij wyniki Unipept, w szczególności drzewo taksonomii drobnoustrojów i drzewo białek komisji enzymów mikrobiologicznych. Aby wyświetlić taksonomię drobnoustrojów i drzewa białkowe EC, wybierz zestaw danych i otwórz opcje.
Kliknij Visualize, a następnie Unipept Taxonomy Viewer. W przypadku adnotacji taksonomicznych i funkcjonalnych w formacie tabeli kliknij ikonę oka tabelarycznego zestawu danych o nazwie Unipept_peptinfo. Przewiń, aby przejrzeć każdy peptyd w osobnym wierszu i odpowiadających mu kolumnach informacji.
Przed przeprowadzeniem analizy statystycznej za pomocą MSstatsTMT uruchom polecenie Select"w pliku grup białkowych MaxQuant", aby utworzyć oddzielne zestawy danych dla białek drobnoustrojów i białek ludzkich. Białka te zawierają znaczniki taksonomii, które wskazują na ich źródło. Wyklucz wszelkie białka zanieczyszczające oznaczone znacznikiem con_.
Zachowaj tylko białka drobnoustrojów z tagami, takimi jak _9laco"i białka ludzkie z tagiem _human"w Microbial_Proteins"tabelarycznym i Human_Proteins" tabelarycznym. Na koniec, korzystając z MSstatsTMT, przeprowadź analizę statystyczną z plikiem dowodowym MaxQuant i wybranymi białkami mikrobiologicznymi lub ludzkimi. Kliknij ikonę oka, aby wyświetlić wynikowe wykresy.
Łącznie 2 595 745 sekwencji białek zostało skompilowanych w obszerną bazę danych, która została następnie zredukowana do bardziej ukierunkowanej bazy danych zawierającej 21 289 sekwencji białek w celu skutecznej identyfikacji peptydów. Korzystając z graficznego interfejsu użytkownika wyszukiwania, Peptide-Shaker" i MaxQuant, zidentyfikowano 196 różnych peptydów mikrobiologicznych. W ramach projektu PepQuery2 potwierdzono istnienie 134 peptydów mikrobiologicznych powiązanych z 73 sekwencjami białek, tworząc zweryfikowaną bazę danych do celów kwantyfikacji.
W ramach analizy MaxQuant stworzono plik peptydów zawierający 3 203 peptydy, w tym 155 ilościowo oznaczonych peptydów mikrobiologicznych. Analiza Unipept wykazała, że Lactobacillus jest najliczniejszym rodzajem, a transferazy klasy 2 są najbardziej rozpowszechnioną kategorią enzymów spośród 155 ilościowo oznaczonych peptydów mikrobiologicznych. W ramach analizy MSstatsTMT uzyskano wulkaniczne i porównawcze wykresy ilustrujące białka o zróżnicowanej ekspresji, pokazujące, że trzy białka Lactobacillus były regulowane w dół w przypadkach raka jajnika w porównaniu z łagodnymi przypadkami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na klinicznej metaproteomice, która dostarcza informacji na temat ludzkiego mikrobiomu i jego roli w chorobach. Opracowano przepływ bioinformatyczny (workflow), aby ułatwić analizę białek mikrobiologicznych w próbkach klinicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Kliniczna metaproteomika
- Analiza białek mikrobiologicznych
- Bioinformatyka
Wstęp
- Zrozumienie białek mikrobiologicznych może pomóc w badaniach nad progresją chorób.
- Wyzwania obejmują obsługę dużych baz danych białkowych w celu ich dokładnej identyfikacji.
- Adnotacje taksonomiczne i funkcjonalne są kluczowe dla interpretacji biologicznej.
- Badania te mają znaczenie dla chorób takich jak mukowiscydoza i COVID-19.
Cel badania
- Opracowanie schematu analizy białek mikrobiologicznych w próbkach klinicznych.
- Zrozumienie wpływu aktywności bakteryjnej na progresję choroby.
- Identyfikacja paneli peptydów mikrobiologicznych do badań nad konkretnymi jednostkami chorobowymi.
Zastosowane metody
- Analiza metaproteomiczna oparta na spektrometrii mas.
- Przepływ pracy w zakresie redukcji bazy danych dla wydajnej identyfikacji białek.
- Wiele algorytmów wyszukiwania do detekcji peptydów mikrobiologicznych.
- Analiza statystyczna i wizualna w celu interpretacji danych.
Główne wyniki
- Pomyślna identyfikacja peptydów mikrobiologicznych związanych z mukowiscydozą.
- Wnioski dotyczące stanu koinfekcji podczas fal pandemii COVID-19.
- Wykazane zalety opracowanego przepływu pracy bioinformatycznej.
- Ułatwienie zrozumienia roli mikroorganizmów w rozwoju choroby.
Wnioski
- Przepływ pracy usprawnia analizę białek mikrobiologicznych w badaniach klinicznych.
- Stanowi on podstawę dla przyszłych badań nad wpływem mikroorganizmów na przebieg chorób.
- Kliniczna metaproteomika może prowadzić do lepszego zrozumienia i skuteczniejszego leczenia chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kliniczne przepływy pracy w metaproteomice, które integrują dane spektrometrii mas z zaawansowaną bioinformatyką, są kluczowe dla wyjaśnienia interakcji między gospodarzem a mikrobiomem w przebiegu chorób. Ten rurociąg oparty na platformie Galaxy umożliwia czułą detekcję i kwantyfikację białek mikrobiologicznych w złożonych próbkach klinicznych, bezpośrednio wspierając walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach translacyjnych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną na etapie przejścia od odkryć do badań przedklinicznych, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji portfelowych z uwzględnieniem ryzyka w programach terapeutycznych związanych z mikrobiomem.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie aktywności białek mikrobiologicznych powiązanych z progresją choroby.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez ilościowe oznaczanie białek gospodarza i mikroorganizmów.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki adnotacji taksonomicznej i funkcjonalnej peptydów mikrobiologicznych.
- Zwiększa pewność predykcyjną przy priorytetyzacji celów związanych z mikrobiomem.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane panele peptydowe do dalszych badań przesiewowych oraz analiz biomarkerów.
- Standaryzuje generowanie i weryfikację dopasowań widm peptydowych w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Umożliwia skalowalne, ilościowe przepływy pracy dla wysokoprzepustowej analizy próbek klinicznych.
- Wspiera rzetelną ocenę wkładu drobnoustrojów w fenotypy chorobowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie ilościowego oznaczania białek mikrobialnych z klinicznymi punktami końcowymi istotnymi dla danej jednostki chorobowej.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po przedkliniczną walidację interakcji między gospodarzem a mikrobiomem.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka postęp w rozwijaniu hipotez terapeutycznych celujących w mikrobiom.
- Dostarcza wglądu w mechanizmy niezbędne do opracowania translacyjnych biomarkerów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy schemat postępowania łączy wczesne etapy odkrywania, przesiewania i badań translacyjnych poprzez integrację przetwarzania danych spektrometrii mas, weryfikację peptydów oraz analizy statystycznej w ramach jednolitej platformy Galaxy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w interakcjach między gospodarzem a mikrobiomem.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki dla peptydów i białek na potrzeby opracowywania testów.
- Analityka: Dostarcza statystycznych i wizualnych danych do porównywania ekspresji białek w różnych stanach klinicznych.
- Badania translacyjne: Łączy sygnatury białek mikrobiologicznych ze stanami chorobowymi w celu dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modułowy, dostępny schemat pracy do szerokiego zastosowania w różnych obszarach chorobowych i typach próbek.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad mikrobiomem.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje analizę metaproteomiczną dla zróżnicowanych próbek klinicznych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie portfelem pod kątem kapitałowym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów ukierunkowanych na mikrobiom z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie spektrometrii masowej i bioinformatycznej analizy danych.
- Zależy od dostępu do wysokiej jakości aparatury i infrastruktury obliczeniowej.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w procesie generowania baz danych i weryfikacji peptydów.
- Możliwość adaptacji do różnych typów próbek klinicznych i kontekstów chorobowych.
- Skalowalność może być ograniczona przez rozmiar bazy danych oraz zasoby obliczeniowe.
