Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Opracowujemy zestawy do szybkich i czułych multipleksowych testów immunofluorescencyjnych. Celem jest pomoc naukowcom w profilowaniu różnych typów komórek pojawiających się w tkance FFPE

Immunofluorescencja jest powszechnie przeprowadzana przy użyciu przeciwciał drugorzędowych znakowanych barwnikiem lub peroksydazą. Immunohistochemia ma tendencję do niskiego poziomu. Przeciwciała drugorzędowe znakowane barwnikiem mają niższy sygnał. Testy wzmocnienia sygnału tyramidowego są pracochłonne w optymalizacji i trwają od kilku godzin do wielu dni.

Markery w testach są wstępnie zoptymalizowane i są znacznie szybsze niż inne techniki. Postawienie czterech markerów zajmuje mniej niż osiem godzin, a na każde dodatkowe cztery biomarkery przypada około trzech dodatkowych godzin.

Możliwość szybszego przeprowadzania immunofluorescencji multipleksowej umożliwi szersze zastosowanie proteomiki przestrzennej i zmniejszy barierę w zrozumieniu przestrzennej tekstury tkanki.

[Narrator] Na początek rozmrozić wszystkie odczynniki z zestawu w temperaturze pokojowej. Przechowuj koniugaty przeciwciał, enzym amplifikacyjny, inicjator wymiany i neutralizator wymiany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. Odwiruj rozmrożony rozcieńczalnik przeciwciał. Odpipetować rozcieńczalnik przeciwciał do pojemnika. Krótko odwirować i dodać wszystkie przeciwciała do pojemnika z roztworem barwiącym przeciwciała 1. Dodać dostarczony rozcieńczalnik przeciwciał w rozcieńczeniu od 1 do 100. Następnie za pomocą pipety delikatnie wymieszaj roztwór, unikając wirowania. Po rozmrożeniu należy odwirować mieszany roztwór przed amplifikacją, aby dokładnie wymieszać. Następnie dodaj roztwór do odpowiedniego pojemnika do mieszania. Odwirować bufor amplifikacyjny i pipetę, wymieszać enzym amplifikacyjny. Rozcieńczyć enzym amplifikacyjny w stosunku 1 do 10 w buforze amplifikacyjnym, aby utworzyć bufor amplifikacyjny. Delikatnie mieszać, pipetując, unikając wirowania. Następnie odwirować i odwirować dostarczony roztwór przeciwbarwienia jądrowego i rozcieńczyć od 1 do 100 w ultraczystej wodzie. Następnie rozcieńczyć sondy fluorescencyjne 1 roztwór w stosunku od 1 do 20 w buforze sondy. Włóż pełną różdżkę odczynnika do przyrządu, aby umożliwić pomiar objętości odczynnika. Przejdź do zakładki Ustawienia slajdów u góry oprogramowania do automatycznego barwienia, gdy wszystkie odczynniki są przygotowane. Kliknij przycisk Dodaj badanie i w razie potrzeby wprowadź identyfikator badania, nazwę badania i wszelkie komentarze do badania. W obszarze Objętość dozowania wybierz 150 mikrolitrów i wybierz *Dewax 4 Kroki jako metodę przygotowania. Jeśli nie jest ona dostępna na liście rozwijanej, otwórz menu Ustawienia protokołu, zaznacz preferowane pole wyboru i kliknij przycisk OK. Po utworzeniu badania należy kliknąć przycisk Dodaj slajd znajdujący się po prawej stronie ekranu ustawień slajdu. Wprowadź unikatową nazwę slajdu w obszarze Komentarze do slajdów. Ustaw Typ tkanki na Testuj tkankę w odpowiednim polu. Następnie wybierz 150 mikrolitrów jako objętość dozowania i ustaw tryb barwienia na Pojedynczy w lewym menu rozwijanym i Rutynowy w prawym menu rozwijanym. W obszarze Proces wybierz opcję IHC i ustaw znacznik na roztwór do barwienia przeciwciał. W sekcji Protokoły w oknie Dodaj slajd wybierz Test barwienia 1 do barwienia, *Dewax 4 kroki do przygotowania i *HIER 20 minut z ER2 dla HIERA. Pozostaw protokół enzymatyczny ustawiony na gwiazdkę kreski i kliknij przycisk Dodaj slajd, gdy wszystkie pola zostaną wypełnione. Po dodaniu wszystkich preparatów zamknij okno Dodaj slajd i wydrukuj etykiety slajdów, dołączając każdą z nich do odpowiedniej sekcji tkanki. Załaduj każdy oznaczony slajd na tacę i umieść płytki przykrywkowe na każdej sekcji chusteczek. Włóż tackę na suwaki do przyrządu i wybierz odpowiedni automatyczny barwnik po prawej stronie ekranu oprogramowania. Upewnij się, że wszystkie trzy tacki na szkiełka i wszystkie informacje o odczynnikach, w tym odczynniki luzem i przygotowane, są widoczne. Sprawdź, czy pojemniki na odczynniki luzem są odpowiednio napełnione i czy pojemniki na odpady mają wystarczającą objętość, aby zakończyć cykl. Następnie naciśnij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć barwienie i zapewnić terminowe usunięcie szkiełek z automatycznego barwienia po zakończeniu procedury. Umieścić zabarwione szkiełka w buforze PBS i nałożyć szkiełka nakrywkowe za pomocą podłoża montażowego. Zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub skanera całych preparatów z filtrami kompatybilnymi z barwnikami testowymi. W przypadku testu wymiany należy rozmrozić bufor wymiany w temperaturze pokojowej. Przechowuj neutralizator wymiany i inicjator wymiany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do użycia. Przygotuj dwa pojemniki do miareczkowania odczynników i wyjmij zestaw do wykrywania do użycia podczas protokołu wymiany. Wiruj bufor wymiany. I wymieszaj pipety z inicjatorem wymiany. Przygotuj roztwór wymienny w przeznaczonym do tego pojemniku, mieszając wymagane objętości inicjatora wymiany i bufora wymiany. Wymieszać zawartość tylko przez pipetowanie. Teraz połącz roztwór sond fluorescencyjnych 2 z rozcieńczonym buforem wymiany w odpowiednim pojemniku. Odwirować tylko bufor sondy i sondę fluorescencyjną, a pipetą wymieszać roztwór końcowy. Umieść pełną różdżkę odczynnika ze wszystkimi przygotowanymi odczynnikami na automatycznym barwieniu. Pozwól maszynie wykonać test zanurzenia na wszystkich odczynnikach. Po dodaniu slajdów ustaw znacznik na *Negatywny. A w przypadku Przygotowania, HIER i Enzymu wybierz opcję myślnika z gwiazdką, ponieważ w przypadku protokołu wymiany nie jest potrzebne odparafinowanie ani pobieranie antygenu. Kliknij przycisk Dodaj slajd po zakończeniu. Po dodaniu wszystkich preparatów zamknij okno Dodaj slajd i wydrukuj etykiety slajdów, które zostaną dołączone do każdej odpowiedniej sekcji tkanki. Załaduj każde szkiełko na tacę i umieść płytkę zakrywającą na każdej sekcji chusteczki przed umieszczeniem tacki w automatycznym stainerze. Teraz naciśnij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć bieg. Obrazy rdzenia mikromacierzy tkankowej uchwycone w dwóch rundach barwienia przy użyciu protokołu immunofluorescencji z ośmioma pleksami wykazały wyraźne markery immunologiczne w każdej rundzie, z udaną współrejestracją obrazu łączącą obie rundy w jednolity kompozyt. Obrazowanie całego szkiełka tkanki raka jelita grubego umożliwiło identyfikację fenotypów immunologicznych na podstawie kolokalizacji markerów, w tym limfocytów T regulatorowych, wyczerpanych limfocytów T i makrofagów immunosupresyjnych. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało koekspresję CD3, CD4 i FoxP3 w limfocytach T regulatorowych. PD1 i PDL1 w komórkach nowotworowych i zrębowych. CD3, CD8 i PD1 w wyczerpanych cytotoksycznych limfocytach T. Oraz CD 68 i PDL1 w makrofagach immunosupresyjnych. Porównanie immunohistochemii pojedynczego markera i immunofluorescencji pojedynczej lub multipleksowej potwierdziło zgodność jakościową we wzorcach barwienia we wszystkich markerach. Barwienie odcinków seryjnych w różnych typach tkanek potwierdziło spójne wzorce ekspresji markerów immunologicznych z reprezentatywnymi rdzeniami tkankowymi, wykazując skuteczne barwienie i minimalną zmienność. Skrawki migdałków wybarwione na sześciu seryjnych szkiełkach dla CD8 wykazały wysoką odtwarzalność przy prawie identycznym rozkładzie sygnału na wszystkich obrazach. Kwantyfikacja gęstości komórek markerowo-dodatnich w różnych typach tkanek wykazała najwyższą gęstość w migdałkach i węzłach chłonnych, a najniższą w czerniaku i okrężnicy.