Name: Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj zautomatyzowany protokół multipleksowej immunofluorescencji do badań przestrzennej proteomiki. Ta metoda umożliwia szybkie profilowanie typów komórkowych w tkankach FFPE z wysoką powtarzalnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Ultivue.

<ol><li>McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+research+applications+of+multiplexed+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> J Pathol. 254 (4), 405-417 (2021).</li>
<li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+multiplex+immunohistochemistry%2Fimmunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Comm%22%5BJournal%5D)">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Comm. 40 (4), 135-153 (2020).</li>
<li>Huss, R., Schmid, C., Manesse, M., Thagaard, J., Maerkl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+tumor+heterogeneity+and+diagnostic+profiling+for+advanced+and+immune+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cell+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immunological tumor heterogeneity and diagnostic profiling for advanced and immune therapies.</a> Adv Cell Gene Ther. 4 (3), e113(2021).</li>
<li>Singhal, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaiso+%28ZBTB33%29+subcellular+partitioning+functionally+links+LC3A%2FB%2C+the+tumor+microenvironment%2C+and+breast+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Kaiso (ZBTB33) subcellular partitioning functionally links LC3A/B, the tumor microenvironment, and breast cancer survival.</a> Comm Biol. 4 (1), 1-13 (2021).</li>
<li>Patil, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+plasma+cells+predict+outcomes+to+PD-L1+blockade+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Intratumoral plasma cells predict outcomes to PD-L1 blockade in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Cell. 40 (3), 289-300.e4 (2022).</li>
<li>Hong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+T+cell+therapy+for+MAGE-A4%2B+solid+cancers+in+HLA-A%2A02%2B+patients%3A+a+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Autologous T cell therapy for MAGE-A4+ solid cancers in HLA-A*02+ patients: a phase 1 trial.</a> Nat Med. 29 (1), 104-114 (2023).</li>
<li>Robbins, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-institutional+Assessment+of+Pathologist+Scoring+HER2+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Multi-institutional Assessment of Pathologist Scoring HER2 Immunohistochemistry.</a> Mod Pathol. 36 (1), 100032(2023).</li>
<li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+HER2-Low+a+New+Clinical+Entity+or+Merely+a+Biomarker+for+an+Antibody+Drug+Conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Ther%22%5BJournal%5D)">Is HER2-Low a New Clinical Entity or Merely a Biomarker for an Antibody Drug Conjugate.</a> Oncol Ther. 12 (1), 13-17 (2024).</li>
<li>Fundytus, A., Booth, C. M., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+low+can+you+go%3F+PD-L1+expression+as+a+biomarker+in+trials+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">How low can you go? PD-L1 expression as a biomarker in trials of cancer immunotherapy.</a> Ann Oncol. 32 (7), 833-836 (2021).</li>
<li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Performing+Immunofluorescence+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining.</a> Method Mol Biol. 1897, 299-311 (2019).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Immunofluorescence%3A+A+Powerful+Tool+in+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiplex Immunofluorescence: A Powerful Tool in Cancer Immunotherapy.</a> Int Mol Sci. 24 (4), 3086(2023).</li>
<li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Society+for+Immunotherapy+of+Cancer+statement+on+best+practices+for+multiplex+immunohistochemistry+%28IHC%29+and+immunofluorescence+%28IF%29+staining+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22J+ImmunoTher+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation.</a> J ImmunoTher Cancer. 8 (1), e000155(2020).</li>
<li>Myers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+automated+slide+stainers+for+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Medl+Lab+Obser%22%5BJournal%5D)">A review of automated slide stainers for immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Medl Lab Obser. 40 (1), 41-44 (2008).</li>
<li>Schwarze, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+administration+of+CD1c+%28BDCA-1%29%2B+and+CD141+%28BDCA-3%29%2B+myeloid+dendritic+cells+in+combination+with+talimogene+laherparepvec+in+immune+checkpoint+blockade+refractory+advanced+melanoma+patients%3A+a+phase+I+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+ImmunoTher+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intratumoral administration of CD1c (BDCA-1)+ and CD141 (BDCA-3)+ myeloid dendritic cells in combination with talimogene laherparepvec in immune checkpoint blockade refractory advanced melanoma patients: a phase I clinical trial.</a> J ImmunoTher Cancer. 10 (9), e005141(2022).</li>
<li>Bankhead, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuPath%3A+Open+source+software+for+digital+pathology+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">QuPath: Open source software for digital pathology image analysis.</a> Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).</li>
<li>Koppel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+validation+of+PD-L1+immunohistochemistry+staining+protocols+using+the+antibody+clone+28-8+on+different+staining+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Optimization and validation of PD-L1 immunohistochemistry staining protocols using the antibody clone 28-8 on different staining platforms.</a> Mod Pathol. 31 (11), 1630-1644 (2018).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedural+Requirements+and+Recommendations+for+Multiplex+Immunofluorescence+Tyramide+Signal+Amplification+Assays+to+Support+Translational+Oncology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Procedural Requirements and Recommendations for Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification Assays to Support Translational Oncology Studies.</a> Cancers. 12 (2), 255(2020).</li>
<li>Surace, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Multiplex+Immunofluorescence+Panel+for+Immuno-oncology+Studies+on+Formalin-fixed+Carcinoma+Tissue+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens.</a> J Vis Exp. (143), e58390(2019).</li>
<li>Hinck, L., Näthke, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cell+and+tissue+organization+in+cancer+of+the+breast+and+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in cell and tissue organization in cancer of the breast and colon.</a> Curr Opin Cell Biol. 0, 87-95 (2014).</li>
<li>Alturki, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+Immune+Checkpoint+Inhibitors+in+the+Context+of+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Review of the Immune Checkpoint Inhibitors in the Context of Cancer Treatment.</a> J Clin Med. 12 (13), 4301(2023).</li>
<li>Sun, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+therapy+for+solid+tumours%3A+clinical+dilemmas+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Targeted+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends.</a> Signal Transduct Targeted Ther. 8 (1), 1-26 (2023).</li>
</ol>

Autorzy: K. H., A. Veith, L. D., D. W., G. C., Y. C., J. H. L. i A. Vasaturo są pracownikami firmy Ultivue, która produkuje multipleksowe zestawy immunofluorescencyjne używane w tej pracy.

W niniejszym raporcie opisano protokół wysokoprzepustowego, bardzo czułego barwienia immunofluorescencyjnego multipleksu przy użyciu automatycznego barwienia. Podczas przeprowadzania tego protokołu etapy przygotowania odczynnika są krytyczne i zasługują na uwagę. Konieczne jest upewnienie się, że odczynniki są odpowiednio wymieszane i prawidłowo odmierzone, aby zminimalizować zmienność barwienia między różnymi szkiełkami w tym samym przebiegu lub między różnymi seriami przy użyciu tych samych składników.
Typowe problemy związane z wykonywaniem tego protokołu obejmują niewłaściwe mieszanie odczynników przed załadowaniem oraz możliwość utraty tkanek z powodu niewłaściwej procedury usuwania szkiełek nakrywkowych. Chociaż ten protokół barwienia ma zastosowanie do każdego typu tkanki FFPE, w tym typów raka, niektóre typy tkanek mogą wymagać bardziej ostrożnego obchodzenia się (np. tkanki o wysokiej zawartości tłuszczu). Aby uniknąć utraty tkanki, należy pozwolić, aby szkiełka nasunięte pokrywą nasiąkły wystarczająco długo, aby szkiełko nakrywkowe samo się odczepiło. Nie zmuszaj szkiełka nakrywkowego do odsunięcia lub podważenia szkła.
Ograniczeniem jest to, że podczas gdy wiele z najczęściej stosowanych celów w immunologii onkologicznej jest zwalidowanych i gotowych do użycia, niektóre cele mogą wymagać opracowania testu przed włączeniem do panelu multipleksowego. Chociaż proces ten jest stosunkowo szybki, może to wymagać dodatkowych kilku tygodni, zanim będzie można korzystać z niestandardowego panelu multipleksowego.
Istnieje kilka różnic między tym testem a innymi technologiami immunofluorescencji multipleksowej. W porównaniu z technologiami opartymi na immunofluorescencji bezpośredniej i pośredniej, zademonstrowany tutaj test ma znacznie wyższy poziom amplifikacji, co pozwala na znaczną poprawę stosunku sygnału do szumu, szczególnie w kanałach, które mają tendencję do wykazywania autofluorescencji tkankowej, takich jak kanał FITC. Powoduje to ~30 razy silniejszy sygnał niż immunofluorescencja bezpośrednia i ~ 10 razy silniejszy sygnał niż immunofluorescencja pośrednia, jak określono ilościowo za pomocą analizy intensywności całego slajdu i ręcznej analizy opartej na ROI (ryc. 8). Metoda ta umożliwia znacznie bardziej czułe wykrywanie białek docelowych przy znacznie krótszych czasach ekspozycji i eliminuje potrzebę manipulacji obrazem, w tym odejmowania tła, co grozi usunięciem sygnałów o niskiej intensywności.
W porównaniu z testami mIF opartymi na amplifikacji katalizowanej enzymatycznie test pokazany tutaj ma znacznie lepszą zdolność do przeprowadzania multipleksowania, a także ma prostszy przebieg pracy i ogólnie krótszy czas wykonywania testu (ryc. 1). W tym teście przeciwciała są dodawane do siebie w jednym kroku i jednocześnie amplifikowane, co znacznie upraszcza protokół testu. Co więcej, niektóre technologie oparte na enzymach, takie jak wzmocnienie sygnału tyramidu (TSA), mogą wykazywać interferencję między różnymi przeciwciałami, co nazywa się efektem parasola 12,17,18. Zastosowana tutaj technologia amplifikacji pozwala uniknąć tego problemu, umożliwiając wykrycie wielu kolokalizowanych i koeksprymowanych markerów na tej samej komórce, jak widać na rysunku 4.
Około 90% nowotworów u ludzi powstaje z komórek nabłonkowych19. Dzieje się tak dlatego, że często stanowią one pierwszą linię obrony przed środowiskiem zewnętrznym i szybciej się namnażają, co prowadzi do szybszej akumulacji potencjalnie onkogennych mutacji. W tym przypadku stan zapalny odgrywa kluczową rolę w nowotworzeniu nowotworzenia, progresji i rozprzestrzenianiu się. W ciągu ostatniej dekady wiele terapii ukierunkowanych na inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych i komórki odpornościowe stało się potężnym arsenałem przeciwko wielu typom nowotworów 5,20,21. Jednak znaczna część pacjentów nadal nie reaguje na leczenie. Jest prawdopodobne, że mikrośrodowisko guza (TME) i lokalny krajobraz immunologiczny odgrywają kluczową rolę. Profilowanie sygnatur molekularnych TME związanych z różnicową odpowiedzią na lek u wielu pacjentów może być możliwe lepsze zdefiniowanie biomarkerów terapeutycznych. Raport ten pokazuje, że technologia mIF może być stosowana do równoległego profilowania wielu biomarkerów białkowych, w tym markerów o niskiej ekspresji, na setkach całych preparatów próbek lub mikromacierzy nowotworowych.

Wysoko multipleksowa immunofluorescencja (mIF) to zaawansowana technika, która rewolucjonizuje dziedzinę analizy tkanek, umożliwiając jednoczesną wizualizację wielu białkowych biomarkerów w obrębie jednego przekroju tkanki1,2. Możliwość ta zapewnia bezprecedensowy poziom szczegółowości i rozdzielczości przestrzennej, co jest często kluczowe dla zrozumienia interakcji między typami komórek o złożonej morfologii w mikrośrodowisku tkankowym w wielu skalach przestrzennych3. Technika ta jest szczególnie cenna w badaniach onkologicznych, gdzie może być wykorzystywana do kolokalizacji biomarkerów nowotworowych, białkowych celów terapeutycznych, lokalnego stanu układu odpornościowego i punktów kontrolnych, interakcji między różnymi typami komórek, a nawet podkomórkowych wzorców kolokalizacji związanych z metabolizmem leków w tkance4,5,6.
Pomimo swojego potencjału, większość technologii mIF wciąż mierzy się ze znacznymi wyzwaniami, w szczególności w zakresie równoważenia czułości i przepustowości z możliwościami multipleksowania. Ograniczenie to jest szczególnie krytyczne w przypadku wykrywania biomarkerów klinicznych, które mogą wykazywać bardzo niską ekspresję, takich jak HER2 oraz PD-L17,8,9. Aby zrozumieć przyczynę tego stanu rzeczy, niezbędne jest zapoznanie się z innymi modalnościami mIF. Metody tradycyjne utorowały drogę dla bardziej zaawansowanych platform mIF, jednak wiążą się one z własnym zestawem zalet i ograniczeń.
Bezpośrednia immunofluorescencja (DIF) wykorzystuje przeciwciała bezpośrednio sprzężone z fluoroforami lub z oligonukleotydem zdolnym do przyciągania fluoroforów10. Metoda ta jest łatwa do zastosowania w analizach multipleksowych, lecz cechuje się niższą czułością oraz trudnością w odróżnieniu sygnału od tła tkankowego lub artefaktów barwienia.
Pośrednia immunofluorescencja (IIF) wykorzystuje przeciwciało wtórne, które wiąże się z przeciwciałem pierwotnym. Zapewnia to silniejszy sygnał w porównaniu z DIF opartą na przeciwciałach pierwotnych. W połączeniu z ulepszonymi konstrukcjami komór przepływowych, sekwencyjna IIF pozwala na wykrycie do 40 biomarkerów w jednym badaniu2,11. Metody te wciąż cechują się jednak stosunkowo niską czułością w porównaniu ze strategiami wzmacniania sygnału opartymi na enzymach, takimi jak te stosowane w technikach immunohistochemicznych (IHC).
Immunofluorescencja oparta na katalizie enzymatycznej jest najczęściej spotykana w metodach IHC wykorzystujących peroksydazę chrzanową (HRP) do osadzania barwników chromogennych (DAB) lub fluorescencyjnych (np. wzmocnienie sygnału tyramidą (TSA)). Ponieważ testy te opierają się na tym samym enzymie katalitycznym, ich czułość detekcji jest podobna, co sprawia, że wielospektralne testy mIF oparte na TSA są odpowiednie do zastosowań klinicznych2,12. Zaletą wzmocnienia sygnału opartego na DNA jest wysoki stopień możliwego multipleksowania przy zachowaniu doskonałego wzmocnienia sygnału i modularności. W przeciwieństwie do nich, metody oparte na HRP są mniej modularne i trudniejsze do optymalizacji, co wymaga dodatkowych cykli opracowywania i testowania paneli.
Immunofluorescencja z użyciem przeciwciał z kodem kreskowym DNA 
Przedstawiony tutaj test mIF wykorzystuje polimerazę DNA do jednoczesnej amplifikacji przeciwciał z kodem kreskowym DNA, po czym następują cykle barwienia i odbarwiania sond raportujących z użyciem czterech fluorescencyjnych oligonukleotydów w każdej rundzie obrazowania (Rycina 1).
<img alt="Wiązanie i amplifikacja przeciwciał, schemat przedstawiający wymianę sygnału w eksperymencie obrazowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ilustracja graficzna protokołu analizy z zastosowaniem multipleksowej immunofluorescencji. Przeciwciała sprzężone z kodami kreskowymi są dodawane w jednym kroku, a kody kreskowe są amplifikowane jednocześnie. W każdym cyklu dodawane są grupy czterech sond fluorescencyjnych, co pozwala na jednoczesną wizualizację czterech markerów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Jednorazowe dodanie przeciwciał i jednostopniowa amplifikacja znacznie upraszczają protokół badania. Proces ten jest wspierany przez zautomatyzowane systemy barwienia i skanowania o wysokiej przepustowości, które zapewniają powtarzalne wyniki między poszczególnymi preparatami i seriami dla dużej liczby próbek wykorzystywanych w badaniach klinicznych13.
Jedną z głównych zalet tej technologii jest zdolność do zachowania wysokiej czułości przy jednoczesnym umożliwieniu szerokiej multipleksacji2. Przepływ pracy zapewnia również utrzymanie wysokiej przepustowości obrazowania, co rozwiązuje jeden z głównych problemów wysoce multipleksowanych technologii mIF (np. &gt; 8 biomarkerów) w badaniach klinicznych. Jest to szczególnie istotne w badaniach klinicznych, gdzie subtelne różnice w niskiej ekspresji celów terapeutycznych (np. niskie HER2) u poszczególnych pacjentów mogą dostarczyć kluczowych informacji na temat odpowiedzi na leczenie.
Oprócz tych kluczowych cech, test ten zapewnia również możliwość konfiguracji panelu, wysokoprzepustowe możliwości obrazowania całych preparatów oraz rozdzielczość optyczną niezbędną do badania procesów i przedziałów subkomórkowych, a także wypustek komórkowych związanych z makrofagami i komórkami dendrytycznymi. Możliwość badania złożonych fenotypów komórkowych w wielu skalach przestrzennych stanowi krytyczną zaletę obrazowania optycznego w porównaniu z metodami opartymi na obrazowaniu cytometrii masowej (IMC)2.
W niniejszej pracy przedstawiono protokół testu mIF 8-pleks z wykorzystaniem automatycznego barwiarki i skanera całych preparatów. Test ten obejmuje panel ośmiu przeciwciał pierwszorzędowych: CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 oraz pan-Cytokeratyny14. Panel ten umożliwi immunoprofilowanie tkanki nowotworowej oraz identyfikację komórek znajdujących się w guzie lub w środowisku zrębu. Protokół ten wykorzystuje automatyczną barwiarkę do wstępnego barwienia i rund wymiany sond; proces barwienia i obrazowania można ukończyć w ciągu 2 dni. Przedstawiono również metody walidacji testu mIF oraz przeprowadzania analizy uzyskanych obrazów.

<table><tbody><tr><td>Klon anty-CD3</td><td>Ultivue</td><td></td><td>BC33 (BioCare). Część ULT50801 klonu</td></tr><tr><td>anty-CD4</td><td>Ultivue</td><td></td><td>SP35 (Abcam). Część klonu</td></tr><tr><td>anty-CD68</td><td>Ultivue</td><td></td><td>KP1 (BioCare) ULT50801 bazie danych anty-CD68. Część ULT50801 klonu</td></tr><tr><td>anty-CD8</td><td>Ultivue</td><td></td><td>C8/144B (BioCare). Część klonów ULT50801</td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin + Anti-SOX10</td><td>Ultivue</td><td></td><td>AE1/AE3 (Bethyl Labs) i BC34 (BioCare). Część ULT50801, dostarczana w postaci mieszaniny</td></tr><tr><td>Anti-FOXP3</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone 236A/E7 (Thermo). Część klonu</td></tr><tr><td>anty-PD1</td> Ultivue CAL20 (Abcam) ULT50801 <td>Ultivue</td><td></td><td>. Część ULT50801 klonu</td></tr><tr><td>anty-PDL1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>73-10 (Abcam). Część</td></tr><tr><td>mikroskopu ULT50801 Axioscan.Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>nazywa mikroskop fluorescencyjny w tekście</td></tr><tr><td>Roztwór do odwoskowywania Bond</td><td>Leica AR9222</td> Roztwór do <td></td> odzyskiwania epitopów Bond Leica AR9222 <td></td></tr><tr><td>Otwarte</td> pojemniki <td>Leica</td><td>AR9640</td><td></td></tr><tr><td>, 30 ml</td><td></td><td></td> Zestaw do wykrywania badań Leica OP309700 <td></td></tr><tr><td>Bond</td><td>Leica</td><td>DS9455</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do miareczkowania</td><td></td> Bond Zestaw do miareczkowania <td>Leica</td> OPT9049 <td></td></tr> Bond <tr><td>Uniwersalne płytki nakrywkowe</td><td>Leica</td><td>OPT9719</td> Bond Leica S21.4611 <td></td></tr><tr><td>Bond Wash Solution 10x Koncentrat</td><td>Leica</td><td>AR9590</td><td></td></tr><tr><td>BondRX Autostainer</td><td>Leica</td><td></td><td>nazywany "autostainerem" w tekście</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Oprogramowanie BondRX <td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td></td><td>w wersji 6.0 lub nowszej</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, grubość #1.5</td><td>Etanol Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>, 200 proof</td><td>Bloki tkankowe VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>FFPE</td> Typy tkanek <td>BioIVT</td><td></td><td>różnią się między sobą</td></tr><tr><td>Test OmniVUE 8-plex (CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, pan-Cytokeratin/SOX10)</td><td>Ultivue</td><td>ULT50801</td><td>zawiera wszystkie inne składniki Ultivue</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Boston BioProducts</td><td>C-9911F</td><td>(pH 7,4 z 2,7 mM KCl i 137 mM NaCl)</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo</td><td>P10144</td><td>nazywany "podłożem montażowym" w tekście</td></tr><tr><td>UltiAnalyzer.AI</td><td>Ultivue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltiStacker.AI</td><td>Ultivue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultivue Bufor wzmacniający Ultivue</td><td>Ultivue</td><td></td><td>część ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Ultivue</td><td></td><td>część</td></tr><tr><td>ULT50801 bufora wymiany</td><td>Ultivue Ultivue</td><td></td><td>część</td></tr><tr><td>inicjatora wymiany Ultivue część ULT50801 inicjatora wymiany</td><td>Ultivue</td><td></td><td>część neutralizatora wymiany ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue</td><td></td><td></td> część <td>ULT50801</td></tr><tr><td>Sondy fluorescencyjne Ultivue 1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>część ULT50801</td></tr><tr><td>Sondy fluorescencyjne Ultivue 2</td><td>Część</td><td></td><td>ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Pre-Amplification Mix</td><td>Ultivue</td><td></td><td>część</td></tr><tr><td>ULT50801 Ultivue Probe Buffer</td><td>Ultivue</td><td></td><td>część ULT50801</td></tr><tr><td>Woda ultraczysta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assays for Translational Research

Multiplex immunofluorescence (mIF) to zaawansowana technika, która pozwala na szczegółową, przestrzennie rozdzielczą analizę próbek tkanek poprzez wizualizację wielu biomarkerów białkowych w jednej sekcji. Jednak większość technologii mIF napotyka znaczne kompromisy między czułością a przepustowością podczas multipleksowania, co stanowi krytyczne ograniczenie dla niezawodnego wykrywania biomarkerów o niskiej liczebności w wielu sekcjach tkanki. Nowe podejście do mIF wykorzystuje unikalne kody kreskowe DNA połączone z przeciwciałami, które są amplifikowane przez równoległy mechanizm amplifikacji pojedynczej cząsteczki. Metoda ta pozwala osiągnąć jakość barwienia wysoce porównywalną z immunohistochemią klasy klinicznej (IHC), zapewniając jednocześnie wysokie możliwości multipleksowania i wysokoprzepustowe obrazowanie na całym szkiełku. Test ten polega na amplifikacji koktajlu przeciwciał oznaczonych kodem kreskowym DNA na tkance, a następnie sekwencyjnych rundach etapów wykrywania w celu wizualizacji czterech oligonukleotydów znakowanych fluorescencyjnie na cykl. Proces ten umożliwia zatem wykrycie ośmiu lub więcej biomarkerów na próbkę tkanki. Kluczowe etapy tej metody obejmują zautomatyzowane przygotowanie tkanek, zastosowanie pierwszorzędowych przeciwciał sprzężonych z kodami kreskowymi DNA, wzmocnienie sygnału oraz iteracyjne cykle wykrywania, obrazowania i usuwania sygnału. Po akwizycji obrazu następuje rejestracja obrazu i analiza pojedynczych komórek przy użyciu platformy do analizy danych obrazów przestrzennych wspomaganej sztuczną inteligencją. W tym badaniu protokół zastosowano do utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) wielotkankowych mikromacierzy (TMA), w tym migdałków, czerniaka, okrężnicy i rdzeni węzłów chłonnych w trzech egzemplarzach. Zaawansowane technologie mIF zapewniają lepszy wgląd w odpowiedź guza, mikrośrodowisko guza i krajobraz immunologiczny. Pokonując nieodłączne kompromisy między czułością, możliwościami multipleksowania i przepustowością obrazowania, naukowcy mogą teraz dążyć do zrozumienia heterogeniczności trudnych sygnatur molekularnych i biomarkerów odpowiedzi terapeutycznych.

Zgodnie z powyższym protokołem, tkankę FFPE barwi się w kierunku wielu celów; uzyskano wysokiej jakości obrazy wszystkich markerów w grupach po cztery (Rycina 3A,B). Oprogramowanie do korejestracji obrazów umożliwia łączenie i korejestrację obrazów z tej samej preparatu, co przedstawiono na Rycynie 3C. Podobne wyniki pokazano na Rycynie 4 dla preparatu tkanki z raka jelita grubego (CRC).
Powodzenie protokołu należy określić poprzez ocenę oczekiwanego wzoru barwienia. W przedstawionym przykładzie CRC każdy z barwionych celów jest ekspresjonowany w oczekiwanym przedziale podkomórkowym, np. jądrowo FoxP3, błonowo CD3, cytoplazmatycznie CD68 (Rysunek 4B-D). Każdy z celów funkcjonalnych jest ekspresjonowany na odpowiednim typie komórek, co demonstruje przykład ko-lokalizacji PD1 i CD3 lub PDL-1 i CD68, wykazujące odpowiednio wyczerpane limfocyty T oraz makrofagi immunosupresyjne. Ocena dobrego stosunku sygnału do tła, umożliwiająca skuteczne odróżnienie prawdziwego sygnału dodatniego od potencjalnego szumu tła, jest zazwyczaj przeprowadzana jakościowo przez patologów lub ekspertów w zakresie analizy obrazu, którzy potwierdzają jakość barwienia, umożliwiając tym samym pomyślną analizę obrazu. Aby dodatkowo potwierdzić jakość i wydajność barwienia, można zastosować porównanie ze złotym standardem IHC (chromogenny DAB) na seriach skrawków (patrz przykład na Rysunku 5), a także wykorzystać próbkę tkanki kontrolnej dodatniej, takiej jak ludzkie migdałki, co w przypadku większości celów immunologicznych może być przydatne do potwierdzenia powodzenia serii barwień. Należy zauważyć, że nowotwory mogą wykazywać niższą ekspresję celów niż ludzkie migdałki16.
Po jakościowym potwierdzeniu wyników można przeprowadzić analizę ilościową. W niniejszej pracy polega ona przede wszystkim na obliczeniu gęstości komórek różnych fenotypów (liczba komórek/mm2) wykazujących ekspresję określonego celu lub celów, a także na obliczeniu średnich poziomów intensywności celów funkcjonalnych, które mogą wykazywać szeroki zakres dynamiczny ekspresji. Przy ocenie precyzji testów mIF, skrawki seryjne barwione tymi samymi markerami powinny wykazywać porównywalne sygnały pomiędzy preparatami, co można zaobserwować jakościowo na Rysunku 6. Przykładowe ilościowe wyniki gęstości pojedynczych markerów w różnych typach tkanek przedstawiono na Rysunku 7. Analiza obrazów pozwala na identyfikację komórek pozytywnych, a następnie obliczenie odpowiadającej im gęstości komórek pozytywnych dla każdego markera, a także średniej intensywności sygnału na jedną komórkę pozytywną. Umożliwia to obliczenie współczynnika zmienności (CV) dla każdego markera w celu oceny precyzji testu multipleksowego (Tabela 4).
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna tkanki; barwienie wielokolorowe; analiza markerów komórkowych; skala 1mm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Obrazy rdzenia matrycy tkankowej (TMA) uzyskane z kolejnych rund barwienia w protokole immunofluorescencji 8-plex. (A) Obraz uzyskany z pierwszej rundy obrazowania, przedstawiający markery CD8, PD1, PD-L1 oraz CD68. Po zastosowaniu protokołu wymiany, (B) przedstawia drugą rundę obrazowania na tym samym preparacie dla drugiej grupy markerów CD3, CD4, FoxP3 oraz CK/SOX10, a (C) pokazuje obraz współrejestrowany, łączący obrazy (A) i (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Immunohistochemia, markery CD3, CD4, CD8, PD-1, PD-L1; analiza obrazu mikroskopowego, barwienie tkanek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne barwienie tkanki raka jelita grubego (CRC) z zastosowaniem 8-pleksowej immunofluorescencji. Na rycinie przedstawiono fenotypy komórkowe, które można zidentyfikować poprzez kolokalizację wielu celów w tej samej komórce. (góra) Obraz całego preparatu tkanki CRC. (dół) Szczegółowe widoki obszarów tkanki z zaznaczeniem (A) komórek T-reg (CD3+/CD4+/FOXP3+), (B) komórek wykazujących ekspresję PD-1 i PD-L1 w obrębie guza i zrębu, (C) wyczerpanych cytotoksycznych limfocytów T (CD3+/CD8+/PD-1), (D) komórek nowotworowych unikających odpowiedzi immunologicznej (PD-L1+/CK+) oraz makrofagów immunosupresyjnych (CD68+/PDL1+). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat wielokrotnej immunohistochemii przedstawiający wyniki barwienia DAB, ISP monopleks i ISP multipleks." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Jakościowe porównanie barwienia immunohistochemicznego (IHC) z immunofluorescencyjnym (IF). Przekroje seryjne barwione metodą immunohistochemiczną z pojedynczym markerem (DAB, górny rząd), immunofluorescencją z pojedynczym markerem (ISP monopleks) oraz widok pojedynczego kanału z wielokrotnej immunofluorescencji (ISP multipleks), wykazujący jakościową zgodność między różnymi metodami barwienia. Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie histologiczne; analiza przekrojów tkanek migdałka, czerniaka, węzła chłonnego i jelita grubego, wyniki mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Barwienie seryjnych przekrojów. (A) Schemat przedstawiający układ wielotkankowej macierzy tkankowej (TMA). (B) Reprezentatywne obrazy 8-pleksowe rdzeni tkanek każdego rodzaju w TMA. (C) Reprezentatywne obrazy CD8 w rdzeniu migdałka na sześciu seryjnych przekrojach TMA barwionych w jednej serii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres pudełkowy analizy ekspresji genów w zależności od typu tkanki, przedstawiający zmienność poziomu ekspresji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Ilościowe określenie gęstości pojedynczego markera dla każdego typu tkanki uwzględnionego w TMA. Gęstości dla poszczególnych tkanek stanowią średnie gęstości z trzech reprezentatywnych rdzeni każdego typu tkanki na slajdzie TMA. Oś y przedstawia gęstości pojedynczego markera w różnych typach tkanek na osi x, w jednostkach dodatnich komórek/mm2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza immunofluorescencyjna: markery CK i PDL1; zawiera wykresy średniej intensywności sygnału (AT488, Cy5)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Analiza obszarów zainteresowania (ROI) względnego sygnału fluorescencyjnego, porównująca wzmocnioną metodę ISP mIF opisaną w niniejszym protokole z pośrednią metodą IF. (A) Reprezentatywny preparat barwiony na CK (lewo) lub PD-L1 (prawo) z zaznaczonymi pięcioma obszarami ROI. (B) Reprezentatywne obrazy ROI dla CK (góra) i PD-L1 (dół). Średnia intensywność sygnału uzyskana za pomocą wzmocnionej mIF (fioletowy) i pośredniej IF (niebieski) dla (C) CK i (D) PD-L1 w pięciu obszarach ROI, z których każdy ma wymiary 100 µm x 100 µm i zawiera około 200 komórek. Wartości na osi Y przedstawiają arbitralne jednostki fluorescencji, a słupki błędów oznaczają odchylenia standardowe (n=3). (E) Względną intensywność sygnału uzyskaną za pomocą wzmocnionej ISP mIF (fioletowy) i pośredniej IF (niebieski) obliczono jako stosunek średniego sygnału wzmocnionej mIF do średniego sygnału pośredniej IF we wszystkich ROI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 4: Obliczony współczynnik zmienności (CV). CV gęstości komórek pozytywnych oraz średniej intensywności sygnału dla obrazów migdałka ukazano na Rysunku 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/Table04_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Multiplex immunofluorescence (mIF) is an advanced technique that allows for detailed, spatially resolved analysis of tissue samples by visualizing ...

Opracowujemy zestawy do szybkich i czułych multipleksowych testów immunofluorescencyjnych. Celem jest pomoc naukowcom w profilowaniu różnych typów komórek pojawiających się w tkance FFPEImmunofluorescencja jest powszechnie przeprowadzana przy użyciu przeciwciał drugorzędowych znakowanych barwnikiem lub peroksydazą. Immunohistochemia ma tendencję do niskiego poziomu. Przeciwciała drugorzędowe znakowane barwnikiem mają niższy sygnał. Testy wzmocnienia sygnału tyramidowego są pracochłonne w optymalizacji i trwają od kilku godzin do wielu dni.Markery w testach są wstępnie zoptymalizowane i są znacznie szybsze niż inne techniki. Postawienie czterech markerów zajmuje mniej niż osiem godzin, a na każde dodatkowe cztery biomarkery przypada około trzech dodatkowych godzin.Możliwość szybszego przeprowadzania immunofluorescencji multipleksowej umożliwi szersze zastosowanie proteomiki przestrzennej i zmniejszy barierę w zrozumieniu przestrzennej tekstury tkanki.[Narrator] Na początek rozmrozić wszystkie odczynniki z zestawu w temperaturze pokojowej. Przechowuj koniugaty przeciwciał, enzym amplifikacyjny, inicjator wymiany i neutralizator wymiany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. Odwiruj rozmrożony rozcieńczalnik przeciwciał. Odpipetować rozcieńczalnik przeciwciał do pojemnika. Krótko odwirować i dodać wszystkie przeciwciała do pojemnika z roztworem barwiącym przeciwciała 1. Dodać dostarczony rozcieńczalnik przeciwciał w rozcieńczeniu od 1 do 100. Następnie za pomocą pipety delikatnie wymieszaj roztwór, unikając wirowania. Po rozmrożeniu należy odwirować mieszany roztwór przed amplifikacją, aby dokładnie wymieszać. Następnie dodaj roztwór do odpowiedniego pojemnika do mieszania. Odwirować bufor amplifikacyjny i pipetę, wymieszać enzym amplifikacyjny. Rozcieńczyć enzym amplifikacyjny w stosunku 1 do 10 w buforze amplifikacyjnym, aby utworzyć bufor amplifikacyjny. Delikatnie mieszać, pipetując, unikając wirowania. Następnie odwirować i odwirować dostarczony roztwór przeciwbarwienia jądrowego i rozcieńczyć od 1 do 100 w ultraczystej wodzie. Następnie rozcieńczyć sondy fluorescencyjne 1 roztwór w stosunku od 1 do 20 w buforze sondy. Włóż pełną różdżkę odczynnika do przyrządu, aby umożliwić pomiar objętości odczynnika. Przejdź do zakładki Ustawienia slajdów u góry oprogramowania do automatycznego barwienia, gdy wszystkie odczynniki są przygotowane. Kliknij przycisk Dodaj badanie i w razie potrzeby wprowadź identyfikator badania, nazwę badania i wszelkie komentarze do badania. W obszarze Objętość dozowania wybierz 150 mikrolitrów i wybierz *Dewax 4 Kroki jako metodę przygotowania. Jeśli nie jest ona dostępna na liście rozwijanej, otwórz menu Ustawienia protokołu, zaznacz preferowane pole wyboru i kliknij przycisk OK. Po utworzeniu badania należy kliknąć przycisk Dodaj slajd znajdujący się po prawej stronie ekranu ustawień slajdu. Wprowadź unikatową nazwę slajdu w obszarze Komentarze do slajdów. Ustaw Typ tkanki na Testuj tkankę w odpowiednim polu. Następnie wybierz 150 mikrolitrów jako objętość dozowania i ustaw tryb barwienia na Pojedynczy w lewym menu rozwijanym i Rutynowy w prawym menu rozwijanym. W obszarze Proces wybierz opcję IHC i ustaw znacznik na roztwór do barwienia przeciwciał. W sekcji Protokoły w oknie Dodaj slajd wybierz Test barwienia 1 do barwienia, *Dewax 4 kroki do przygotowania i *HIER 20 minut z ER2 dla HIERA. Pozostaw protokół enzymatyczny ustawiony na gwiazdkę kreski i kliknij przycisk Dodaj slajd, gdy wszystkie pola zostaną wypełnione. Po dodaniu wszystkich preparatów zamknij okno Dodaj slajd i wydrukuj etykiety slajdów, dołączając każdą z nich do odpowiedniej sekcji tkanki. Załaduj każdy oznaczony slajd na tacę i umieść płytki przykrywkowe na każdej sekcji chusteczek. Włóż tackę na suwaki do przyrządu i wybierz odpowiedni automatyczny barwnik po prawej stronie ekranu oprogramowania. Upewnij się, że wszystkie trzy tacki na szkiełka i wszystkie informacje o odczynnikach, w tym odczynniki luzem i przygotowane, są widoczne. Sprawdź, czy pojemniki na odczynniki luzem są odpowiednio napełnione i czy pojemniki na odpady mają wystarczającą objętość, aby zakończyć cykl. Następnie naciśnij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć barwienie i zapewnić terminowe usunięcie szkiełek z automatycznego barwienia po zakończeniu procedury. Umieścić zabarwione szkiełka w buforze PBS i nałożyć szkiełka nakrywkowe za pomocą podłoża montażowego. Zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub skanera całych preparatów z filtrami kompatybilnymi z barwnikami testowymi. W przypadku testu wymiany należy rozmrozić bufor wymiany w temperaturze pokojowej. Przechowuj neutralizator wymiany i inicjator wymiany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do użycia. Przygotuj dwa pojemniki do miareczkowania odczynników i wyjmij zestaw do wykrywania do użycia podczas protokołu wymiany. Wiruj bufor wymiany. I wymieszaj pipety z inicjatorem wymiany. Przygotuj roztwór wymienny w przeznaczonym do tego pojemniku, mieszając wymagane objętości inicjatora wymiany i bufora wymiany. Wymieszać zawartość tylko przez pipetowanie. Teraz połącz roztwór sond fluorescencyjnych 2 z rozcieńczonym buforem wymiany w odpowiednim pojemniku. Odwirować tylko bufor sondy i sondę fluorescencyjną, a pipetą wymieszać roztwór końcowy. Umieść pełną różdżkę odczynnika ze wszystkimi przygotowanymi odczynnikami na automatycznym barwieniu. Pozwól maszynie wykonać test zanurzenia na wszystkich odczynnikach. Po dodaniu slajdów ustaw znacznik na *Negatywny. A w przypadku Przygotowania, HIER i Enzymu wybierz opcję myślnika z gwiazdką, ponieważ w przypadku protokołu wymiany nie jest potrzebne odparafinowanie ani pobieranie antygenu. Kliknij przycisk Dodaj slajd po zakończeniu. Po dodaniu wszystkich preparatów zamknij okno Dodaj slajd i wydrukuj etykiety slajdów, które zostaną dołączone do każdej odpowiedniej sekcji tkanki. Załaduj każde szkiełko na tacę i umieść płytkę zakrywającą na każdej sekcji chusteczki przed umieszczeniem tacki w automatycznym stainerze. Teraz naciśnij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć bieg. Obrazy rdzenia mikromacierzy tkankowej uchwycone w dwóch rundach barwienia przy użyciu protokołu immunofluorescencji z ośmioma pleksami wykazały wyraźne markery immunologiczne w każdej rundzie, z udaną współrejestracją obrazu łączącą obie rundy w jednolity kompozyt. Obrazowanie całego szkiełka tkanki raka jelita grubego umożliwiło identyfikację fenotypów immunologicznych na podstawie kolokalizacji markerów, w tym limfocytów T regulatorowych, wyczerpanych limfocytów T i makrofagów immunosupresyjnych. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało koekspresję CD3, CD4 i FoxP3 w limfocytach T regulatorowych. PD1 i PDL1 w komórkach nowotworowych i zrębowych. CD3, CD8 i PD1 w wyczerpanych cytotoksycznych limfocytach T. Oraz CD 68 i PDL1 w makrofagach immunosupresyjnych. Porównanie immunohistochemii pojedynczego markera i immunofluorescencji pojedynczej lub multipleksowej potwierdziło zgodność jakościową we wzorcach barwienia we wszystkich markerach. Barwienie odcinków seryjnych w różnych typach tkanek potwierdziło spójne wzorce ekspresji markerów immunologicznych z reprezentatywnymi rdzeniami tkankowymi, wykazując skuteczne barwienie i minimalną zmienność. Skrawki migdałków wybarwione na sześciu seryjnych szkiełkach dla CD8 wykazały wysoką odtwarzalność przy prawie identycznym rozkładzie sygnału na wszystkich obrazach. Kwantyfikacja gęstości komórek markerowo-dodatnich w różnych typach tkanek wykazała najwyższą gęstość w migdałkach i węzłach chłonnych, a najniższą w czerniaku i okrężnicy.

high-throughput-automated-multiplex-immunofluorescence-assays-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Wykorzystując technologię mikrosfer xMAP firmy Luminex Corporation, opracowaliśmy wielowiązkowy fluorometryczny test immunoenzymatyczny (MFIA) do nadzoru serologicznego różnych gatunków zwierząt laboratoryjnych. MFIA to zawiesinowa macierz mikrosfer, w której antygen, kontrola tkankowa lub immunoglobuliny są kowalencyjnie powiązane z kolorowo kodowanymi mikrosferami polistyrenowymi. Omówiono metodę testową MFIA oraz różne zagadnienia związane z rozwiązywaniem problemów.

Metodyka przeprowadzania i rozwiązywanie problemów w multipleksowym fluorometrycznym immunoprzebiegu

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Szczegółowy protokół dla sześciomarkerowego multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego jest zoptymalizowany i wykonany, przy użyciu automatycznego barwnika dla bardziej spójnych wyników i krótszego czasu zabiegu. Podejście to może być bezpośrednio zaadaptowane przez dowolne laboratorium do badań immunoonkologicznych.

Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Tutaj opisujemy protokół barwienia immunohistochemicznego multipleksu fluorescencyjnego i obrazowania dla jednoczesnej lokalizacji wielu antygenów związanych z rakiem w chłoniaku. Protokół ten można rozszerzyć o analizę kolokalizacji biomarkerów we wszystkich sekcjach tkanki.

Multipleksowane fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne, obrazowanie i analiza w próbkach histologicznych chłoniaka

Multiplex fluorescencyjna immunohistochemia to nowa technologia, która umożliwia wizualizację wielu typów komórek w nienaruszonej, utrwalonej formaliną, zatopionej parafinie tkance (FFPE). Przedstawiono wytyczne dotyczące zapewnienia udanego 7-kolorowego multipleksu wraz z instrukcjami dotyczącymi optymalizacji przeciwciał i odczynników, przygotowaniem preparatów, projektem i wskazówkami dotyczącymi unikania typowych problemów.

Optymalizacja, projektowanie i unikanie pułapek w manualnej multipleksowej immunohistochemii fluorescencyjnej

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Zautomatyzowane testy wykorzystujące wielodołkowe mikropłytki są korzystnym podejściem do identyfikacji regulatorów szlaku, umożliwiając ocenę wielu warunków w jednym eksperymencie. W tym przypadku dostosowaliśmy dobrze znany protokół obrazowania i kwantyfikacji makropinosomów do 96-dołkowego formatu mikropłytek i zapewniamy kompleksowy zarys automatyzacji przy użyciu wielomodowego czytnika płytek.

Zautomatyzowane obrazowanie i analiza w celu ilościowego oznaczania makropinosomów znakowanych fluorescencyjnie

W tym artykule opisany jest protokół ręcznego wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA) multipleksowego immunofluorescencji (mIF) połączonego z analizą obrazu i analizą przestrzenną. Protokół ten może być stosowany z sekcjami zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie do barwienia od dwóch do sześciu antygenów na szkiełko, w zależności od skanera do szkiełek dostępnego w laboratorium.

Multipleksowa immunofluorescencja połączona z przestrzenną analizą obrazu w celu klinicznej i biologicznej oceny mikrośrodowiska guza

Zastosowanie taniej, wszechstronnej techniki fotonapromieniania manualną metodą IBEX pozwala na optymalne obrazowanie tkanki ludzkiej ze znaczną natywną autofluorescencją. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób uzyskać multipleksowane obrazy całych preparatów z archiwalnych próbek klinicznych przy użyciu odwróconego mikroskopu, powszechnie dostępnych odczynników i oprogramowania typu open source do wyrównywania i przetwarzania obrazu.

Zoptymalizowany przepływ pracy dla iteracyjnego wybielania rozszerza obrazowanie multipleksowe wysoce autofluorescencyjnych próbek klinicznych

Multipleksowa immunofluorescencja umożliwia sekwencyjne oznaczyć wiele markerów przeciwciał w obrębie pojedynczej sekcji tkanki, aby wspierać przestrzenną analizę architektury tkanki i populacji komórek. Tutaj przedstawiono przepływ pracy dla wielokrotnego wykrywania markerów związanych z starzeniem się, strukturalnych i immunologicznych, łącznie z manualną i zautomatyzowaną przygotowaniem szkieł i iteracyjnym obrazowaniem oraz analizą pojedynczych komórek za pomocą oprogramowania do cyfrowej...

Wielobarwne badanie immunofluorescencyjne do przestrzennej oceny markerów starzenia in vivo

Poznaj zautomatyzowany protokół multipleksowej immunofluorescencji do badań przestrzennej proteomiki. Ta metoda umożliwia szybkie profilowanie typów komórkowych w tkankach FFPE z wysoką powtarzalnością.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Przeglądaj więcej filmów