Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego
July 11th, 2025
Niniejszy protokół opisuje opłacalną metodę oczyszczania, namnażania i charakteryzowania wysoce jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) od myszy. Takie podejście ułatwia pozyskiwanie dużych ilości BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, wspierając modele mysie i posuwając naprzód badania przedkliniczne.
Nasze badania zapewniają tanią metodę oczyszczania i namnażania jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego myszy. Pomaga to naukowcom uzyskać wystarczającą ilość wysokiej jakości komórek o silnych zdolnościach wzrostu i różnicowania. Kluczowym wyzwaniem w badaniach nad komórkami macierzystymi szpiku kostnego jest opracowanie prostego i skutecznego protokołu izolowania mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego. Ta metoda pozwala mezenchymalnym komórkom macierzystym szpiku kostnego rosnąć bocznie, unikając zakłóceń. Wykorzystuje trzecie pasażowanie, unika dodatkowych efektów wzrostu i utrzymuje komórki krwiotwórcze w pobliżu, aby wspierać zdrowie i funkcję komórek macierzystych.
[Instruktor] Na początek namocz uśpioną mysz w 75% etanolu przez pięć minut. Za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych wykonaj około centymetrowe nacięcie na kończynie tylnej, w pobliżu ścięgna Achillesa. Następnie wykonaj okrągłe nacięcie wokół tylnej kończyny, aby odsłonić dystalną kość piszczelową. Oderwij skórę od miejsca nacięcia w górę w kierunku biodra, aby usunąć skórę z obu tylnych kończyn. Przeciąć wzdłuż kości biodrowej, aby odłączyć głowę kości udowej od kości biodrowej. Za pomocą sterylnego skalpela usuń jak najwięcej ścięgien i mięśni z kości piszczelowej i strzałkowej, aby ułatwić późniejsze zaczerwienienie. Umieść oczyszczone kości z powrotem w naczyniu zawierającym PBS z 2% penicyliną i streptomycyną przed umieszczeniem ich w sterylnym kapturze. Weź strzykawkę o pojemności 50 mililitrów i przymocuj igłę dołączoną do strzykawki. Napełnij strzykawkę 20 mililitrami pożywki alpha MEM i zastąp igłę tą, która jest dołączona do strzykawki o pojemności jednego mililitra. W sterylnym kapturze użyj nożyczek, aby odciąć oba końce oddzielonej kości udowej lub piszczelowej. Teraz włóż igłę do kości na przeciętej krawędzi i przepłucz szpik kostny do 100-milimetrowego naczynia do hodowli komórek zawierającego kompletną pożywkę alfa MEM. Kontynuuj płukanie, aż kość stanie się widocznie blada, co wskazuje na udane pobranie szpiku. Pipetuj w górę i w dół 40 razy za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety, aby rozproszyć dowolne agregaty komórek. Teraz przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki wirówkowej, aby usunąć zanieczyszczenia, fragmenty tkanek i nierozproszone grudki. Dostosuj całkowitą objętość do 15 mililitrów za pomocą kompletnej pożywki alpha MEM i przenieś przefiltrowaną zawiesinę komórek do 100-milimetrowego naczynia hodowlanego. Trzymaj naczynie obiema rękami i delikatnie obracaj je 15 razy ruchem ósemkowym, aby równomiernie rozprowadzić komórki na naczyniu. Na koniec umieść naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i kulturze przez pięć dni. Rysunek ten ilustruje progresję morfologiczną komórek zrębu szpiku kostnego od początkowej ekstrakcji do trzeciego pasażu w hodowli. Świeżo wyekstrahowane komórki szpiku kostnego wydawały się w przeważającej mierze jednojądrzaste z rozproszonymi kropelkami tłuszczu widocznymi na całym polu. W piątym dniu hodowli zaczęły pojawiać się komórki w kształcie wrzecionowatego kształtu, które osiągnęły około 60% do 80% konfluencji, kontynuując wzrost gęstości do siódmego dnia. Od pierwszego do trzeciego przejścia komórki zrębu szpiku kostnego utrzymywały morfologię wrzecionowatą lub wrzecionowatą, tworzyły przezroczystą monowarstwę z połączonymi koloniami i nie wykazywały oznak apoptozy, takich jak ziarnistość cytoplazmatyczna lub fragmentacja jądrowa. Cytometria przepływowa potwierdziła, że CD29, CD44 i Sca-1 wykazywały wysoką ekspresję w komórkach zrębu szpiku kostnego. Ekspresja markerów CD31 i CD45 linii śródbłonka i układu krwiotwórczego była znikoma. Kwantyfikacja markerów dodatkowo potwierdziła wysokie poziomy ekspresji CD29, CD44 i Sca-1 w porównaniu z CD31 i CD45.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia opłacalną metodę oczyszczania i rozmnażania wysoce jednorodnych komórek mezenchymalnych szpiku kostnego (BMSCs) od myszy. Protokół ten nie tylko upraszcza proces izolacji, ale także poprawia zdolności proliferacyjne i różnicowania uzyskanych BMSCs, posuwając naprzód badania przedkliniczne na modelach mysich.
Kluczowe komponenty badania
Obszar badań
- Biologia komórki
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Modele przedkliniczne
Tło
- Komórki mezenchymalne szpiku kostnego odgrywają kluczową rolę w medycynie regeneracyjnej.
- Jednorodne BMSCs są niezbędne dla wiarygodnych wyników eksperymentów.
- Potrzebne są opłacalne protokoły, aby ułatwić szerszy dostęp do badań.
Stosowane metody
- Techniki ekstrakcji i hodowli szpiku kostnego.
- Model myszy do uzyskania BMSCs.
- Cytometria przepływowa do charakteryzacji komórek.
Główne wyniki
- Protokół dał BMSCs o silnym potencjale wzrostu i różnicowania.
- BMSCs utrzymywały jednolitą morfologię wrzecionowatą lub wrzecionową przez kolejne przeszczepy.
- Cytometria przepływowa potwierdziła wysokie występowanie markerów komórek macierzystych, CD29, CD44 i Sca-1.
Wnioski
- To badanie z powodzeniem pokazuje solidną metodę izolacji BMSC, która wspiera dalsze badania.
- Wyniki są istotne dla poprawy powtarzalności i efektywności zastosowań komórek macierzystych w biologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable purification and expansion of homogeneous mouse bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) is critical for preclinical model development and translational research. This protocol enables consistent generation of high-quality BMSCs with validated phenotypes, supporting robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Standardized BMSC workflows reduce biological variability, enhancing predictive confidence across R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables reproducible isolation of BMSCs for hypothesis-driven pathway interrogation.
- Supports functional target validation by providing homogeneous, well-characterized cell populations.
- Reduces mechanistic ambiguity in disease-relevant in vitro models.
- Facilitates portfolio triage by ensuring consistent biological inputs for screening.
Screening & Assay Development
- Provides standardized BMSC preparations for downstream assay development.
- Improves assay reproducibility and quantitative output reliability through phenotypic validation.
- Enables scalable expansion of BMSCs for high-throughput screening platforms.
- Supports robust compound evaluation by minimizing cell population heterogeneity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant preclinical models by supplying validated stem cell populations.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation with consistent cell quality.
- De-risks translational studies by confirming differentiation and proliferation potential.
- Supports biomarker alignment through flow cytometry-based phenotyping.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, providing a foundation for lead identification and translational research.
- Discovery Biology: Enables rigorous hypothesis testing and pathway clarification using homogeneous BMSCs.
- Screening: Delivers assay-ready, phenotypically validated cells for reproducible screening workflows.
- Analytics: Utilizes flow cytometry to generate quantitative marker expression data for condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies with validated, multipotent stem cell populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol for repeated use across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces biological risk in early-stage research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of BMSC workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by providing reliable preclinical model inputs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique and flow cytometry analysis.
- Needs access to cell culture infrastructure and analytical instrumentation.
- Demands cross-team standardization for consistent cell preparation and phenotyping.
- Adaptable to various mouse strains but may require optimization for other species.
- Yield and homogeneity depend on precise adherence to protocol steps.
