Name: Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania i ekspansji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego myszy z zastosowaniem cytometrii przepływowej. Protokół zapewnia wysoką jednorodność i potencjał różnicowania komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez granty z Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Chin (2020YFE0201600) oraz Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82174408 i 82374477).

<ol><li>Chu, D. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+progress+of+isolation%2C+culture%2C+storage%2C+and+clinical+application+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells.</a> Int J Mol Sci. 21 (3), 708(2020).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Transl%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> J Orthop Transl. 3 (1), 26-33 (2015).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+apoptotic+BMSCs+ameliorate+osteoporosis+via+transporting+regenerative+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from apoptotic BMSCs ameliorate osteoporosis via transporting regenerative signals.</a> Theranostics. 14 (9), 3583-3602 (2024).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice.</a> J Vis Exp. (131), e56750(2018).</li>
<li>Chu, D. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+stem+cells+for+therapy%3A+An+update+on+the+progress+of+isolation%2C+culture%2C+storage%2C+and+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue stem cells for therapy: An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application.</a> J Clin Med. 8 (7), 917(2019).</li>
<li>Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+fibrotic+diseases%E2%80%94the+two+sides+of+the+same+coin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in fibrotic diseases—the two sides of the same coin.</a> Acta Pharmacol Sin. 44 (2), 268-287 (2023).</li>
<li>Carbone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cervical+dislocation+as+a+humane+euthanasia+method+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> J Vis Exp. (77), e50586(2013).</li>
<li>Grossner, T., Haberkorn, U., Hofmann, J., Gotterbarm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+basal+cell+culture+media+upon+the+osteogenic+response+of+hMSCs+evaluated+by+99mTc-HDP+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of different basal cell culture media upon the osteogenic response of hMSCs evaluated by 99mTc-HDP labeling.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6288(2022).</li>
<li>Janda, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surrogate+Wnt+agonists+that+phenocopy+canonical+Wnt+and+%CE%B2-catenin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surrogate Wnt agonists that phenocopy canonical Wnt and β-catenin signalling.</a> Nature. 545 (7653), 234-237 (2017).</li>
<li>Bernar, A., Gebetsberger, J. V., Bauer, M., Streif, W., Schirmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+Alizarin+Red+S+assay+by+enhancing+mineralization+of+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimization of the Alizarin Red S assay by enhancing mineralization of osteoblasts.</a> Int J Mol Sci. 24 (1), 723(2022).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+osteogenic+differentiation+of+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+mice+inhibited+by+cyclophosphamide+with+psoralen%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Tissue+Eng+Res%22%5BJournal%5D)">Restoration of osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in mice inhibited by cyclophosphamide with psoralen.</a> Chin J Tissue Eng Res. 29 (1), 16-23 (2025).</li>
<li>Papaccio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Cancer+cells%2C+cancer+stem+cells%2C+and+mesenchymal+stem+cells%3A+Influence+in+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Concise review: Cancer cells, cancer stem cells, and mesenchymal stem cells: Influence in cancer development.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2115-2125 (2017).</li>
<li>Kolf, C. M., Cho, E., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells.+Biology+of+adult+mesenchymal+stem+cells%3A+Regulation+of+niche%2C+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: Regulation of niche, self-renewal and differentiation.</a> Arthritis Res Ther. 9 (1), 204(2007).</li>
<li>Soleimani, M., Nadri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).</li>
<li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+protocol+for+long-term+culture+of+murine+bone+marrow+stromal+%28mesenchymal%29+stem+cells+that+retained+their+in+vitro+and+in+vivo+stemness+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal (mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture.</a> Biol Proced Online. 21 (1), 3(2019).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+gene+expression+signatures+associated+with+bone+marrow+stromal+cell+subpopulations+and+time+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals gene expression signatures associated with bone marrow stromal cell subpopulations and time in culture.</a> J Transl Med. 17 (1), 23(2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów w związku z tym badaniem.

Terapia komórkami macierzystymi cieszy się dużym zainteresowaniem ze względu na jej potencjał do zrewolucjonizowania medycyny regeneracyjnej. Badania przedkliniczne dostarczyły istotnych dowodów potwierdzających kliniczne zastosowanie komórek macierzystych, w szczególności BMSC13. Jednak wyzwania, takie jak niska wydajność komórek, zanieczyszczenie i powolny wzrost, utrudniają ich zastosowanie kliniczne. W związku z tym istnieje pilna potrzeba badań koncentrujących się na standaryzacji procesów pr...

Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BMSC) są znane ze swoich właściwości multipotencjalnych i są szeroko stosowane w leczeniu różnych chorób ze względu na ich właściwości samoodnawialne, różnicujące i immunomodulujące 1,2. BMSC są łatwo dostępne, zdolne do rozległej ekspansji, wykazują właściwości immunosupresyjne i nie wywołują natychmiastowych reakcji immunologicznych3, co czyni je atrakcyjnymi do zastosowań w inżynierii tkankowej i skutecznymi nośnikami w terapii komórkowej.
W szpiku kostnym głównymi mieszkańcami są dwie główne populacje komórek macierzystych i ich potomstwo, krwiotwórcze komórki macierzyste i BMSC4. Tradycyjnie, BMSC uzyskuje się poprzez celowaną aspirację szpiku kostnego i identyfikuje się jako komórki przylegające do tworzywa sztucznego in vitro. Jednak metoda ta jest niewystarczająca do odróżnienia BMSC od innych subpopulacji szpiku kostnego, w tym komórek śródbłonka, perycytów, leukocytów i hematopoetycznych komórek macierzystych5. Dlatego potrzebny jest łatwy i skuteczny protokół izolacji BMSC.
Obecne prace szczegółowo opisują separację i oczyszczanie BMSC poprzez ich fizyczne przyleganie do plastikowych płytek do hodowli komórkowych. Eksperymenty z cytometrią przepływową przeprowadzono na BMSC trzeciego pasażu przy użyciu markerów powierzchniowych CD29, CD44 i Sca-1, zgodnie z zaleceniami komitetu Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej i Genowej (ISCT) Mezenchymalnych komórek zrębowych (MSC)6. Zgodnie z kryteriami ISCT, mysie MSCs charakteryzują się dodatnim wynikiem dla CD29, CD44 i antygenu komórek macierzystych 1 (Sca-1) oraz ujemnym dla markera komórek krwiotwórczych CD45 i markera komórek śródbłonka CD31. Ponadto BMSC powinny być multipotencjalne, wykazując trójliniowe różnicowanie w osteoblasty, chondrocyty i adipocyty. W tym eksperymencie osteogeneza została wywołana w wyekstrahowanych BMSC, z barwieniem ALP wykonanym w dniu 7 i testem czerwieni alizarynowej S w dniu 21 w celu oceny różnicowania. Indukowano również dyferencjowanie adipogenne wyizolowanych i oczyszczonych BMSC, przy czym barwienie czerwienią olejową wykonano w 21 dniu w celu oceny adipogenezy.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml (igła strzykawki 22G)</td><td>UPRZEJMA GRUPA(KDL)</td><td>60017031</td><td></td></tr><tr><td>1-etapowy NBT/BCIP&nbsp;</td><td>Pierce Biotechnology, Inc.</td><td>34042</td><td>Barwienie fosfatazą alkaliczną</td></tr><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>Wexis powiedział:</td><td>5200250</td><td>Utrwalanie komórek</td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Wybór laboratoryjny</td><td>11110</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Wybór laboratoryjny</td><td>11310</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>40 &mu; m Sitko komórkowe</td><td>Cornig powiedział:</td><td>352340</td><td>Filtracja w celu usunięcia aglomeratów</td></tr><tr><td>Strzykawka 50 ml</td><td>UPRZEJMA GRUPA(KDL)</td><td>60017040</td><td></td></tr><tr><td>75% etanol&nbsp;</td><td>Szanghaj NianYue Biotechnology Co., Ltd</td><td>31009001</td><td>Zdezynfekuj skórę myszy</td></tr><tr><td>Alizaryna Czerwień S</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Ciągnik hamulcowy A5533</td><td>Wykrywanie złogów wapnia i zwapniałych guzków</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne APC CD44 (klon: IM7)</td><td>eBionauka</td><td>17-0441-82</td><td>Cytometria przepływowa&nbsp;</td></tr><tr><td>Kontrola izotypu APC Rat IgG2b kappa (klon: eB149/10H5)</td><td>eBionauka</td><td>17-4031-82</td><td>Cytometria przepływowa&nbsp;</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Japonia Firma Hiryama</td><td>HVE-50 (wersja angielska)</td><td>Sterylizacja narzędzi chirurgicznych</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo Fisher Technology (Chiny) Co., Ltd.</td><td>300583057</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Przepływometria Cytoflex</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>A00-1-1102</td><td>Cytometria przepływowa&nbsp;</td></tr><tr><td>deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Zobacz materiał D4902</td><td>Różnicowanie osteogenne BMSC</td></tr><tr><td>Naczynie (100mm)</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Talerz (60mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>Umieszczenie próbki podczas przeszczepu&nbsp;</td></tr><tr><td>Waciki dezynfekujące</td><td>Szanghaj Honglong Industrial Co., Ltd.</td><td>20230627</td><td>Zdezynfekuj skórę myszy</td></tr><tr><td>Jednorazowe sterylne rękawiczki</td><td>Szanghaj Honglong Industrial Co., Ltd</td><td>YT21131</td><td>Sterylna operacja</td></tr><tr><td>Podwójny lew Napromieniowana dieta gryzoni</td><td>Suzhou Shuangshi Eksperymentalna technologia pasz dla zwierząt Co., Ltd.</td><td>GB 14924.3</td><td>Pasza</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Shanghai Biosun Sci& Tech Co., Sp. z o.o.</td><td>Zobacz materiał BS-0002-500</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>FITC Chomik Anty-Szczur CD29 (klon: Ha2/5)</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>555003</td><td>Cytometria przepływowa&nbsp;</td></tr><tr><td>FITC Chomik IgM, &lambda; 1 Kontrola izotypu (klon: G235-1)</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>553960</td><td>Cytometria przepływowa&nbsp;</td></tr><tr><td>żelatyna (0,1%)</td><td>OriCell (OriCell)</td><td>GLT-11301 powiedział:</td><td>zwiększają zdolność adhezyjną komórek</td></tr><tr><td>Klatka na myszy IVC</td><td>Suzhou Monkey King Animal Sprzęt eksperymentalny Technology Co., Ltd.</td><td>HH-MMB-2</td><td>Bariera dla zwierząt</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Numer katalogowy A8960</td><td>Różnicowanie osteogenne BMSC</td></tr><tr><td>Znakowanie pióra</td><td>Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.&nbsp;</td><td>YYST5 powiedział:</td><td>Zaznacz informacje komórkowe na szalce Petriego</td></tr><tr><td>Modyfikacja MEM Alpha (1x)</td><td>Szanghaj NianYue Biotechnology Co., Ltd</td><td>SH30265</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Zestaw do różnicowania adipogennego komórek macierzystych szpiku kostnego myszy</td><td>Cyagen</td><td>MUXMX-90031 powiedział:</td><td>Różnicowanie adipogenne BMSC&nbsp;</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti2 Mikroskop odwrócony Synstem</td><td>Japonia Nikon Korporatin</td><td>Ti2-U</td><td>Obserwuj komórki i rób zdjęcia</td></tr><tr><td>Nożyczki okulistyczne&nbsp;</td><td>Szanghaj NianYue Biotechnology Co., Ltd</td><td>Y00030 JZ</td><td>Przetnij skórę</td></tr><tr><td>Pęseta okulistyczna</td><td>Szanghaj NianYue Biotechnology Co., Ltd</td><td>BS-ZER-S-100 Ostrze biologiczne</td><td>Uzyskaj tkankę kostną myszy.</td></tr><tr><td>PIPETA PASTEURA</td><td>Szanghaj NianYue Biotechnology Co., Ltd</td><td>Zobacz materiał BS-XG-03M</td><td>Odessać pożywkę hodowlaną</td></tr><tr><td>PE Rat Anti-Mouse CD31 (klon: Ha2/5)</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>553373</td><td>Cytometria przepływowa&nbsp;</td></tr><tr><td>PE Szczur IgG2a, &kappa; Kontrola izotypu (klon: R35-95)</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>553930</td><td>Cytometria przepływowa&nbsp;</td></tr><tr><td>PE-cyjanininy7 Ly-6A/E (Sca-1) Przeciwciało monoklonalne (klon: D7)</td><td>eBionauka</td><td>25-5981-82</td><td>Cytometria przepływowa&nbsp;</td></tr><tr><td>PE-cyjaninina 7 Szczur IgG2a kappa Kontrola izotypu (klon: eBR2a)</td><td>eBionauka</td><td>25-4321-82</td><td>Cytometria przepływowa&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Szanghaj NianYue Biotechnology Co., Ltd</td><td>2585636</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 (klon: Ha2/5)</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>561869</td><td>Cytometria przepływowa&nbsp;</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Szczur IgG2b, &kappa; Kontrola izotypu (klon: A95-1)</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>550764</td><td>Cytometria przepływowa&nbsp;</td></tr><tr><td>Skalpele</td><td>Fabryka narzędzi chirurgicznych w Szanghaju Urządzenia medyczne? Grupa?Co., Sp. z o.o.&nbsp;</td><td>J11010-10# JZ</td><td>Odizoluj tylne kończyny i tułów myszy oraz usuń obce tkanki z kości</td></tr><tr><td>Sterylny kaptur</td><td>Thermo Fisher Technology (Chiny) Co., Ltd.</td><td>ECO0.9 (klasa ECO0.9)</td><td>Stół operacyjny chirurgiczny</td></tr><tr><td>sterylne obłożenia chirurgiczne</td><td>Henan Huayu Sprzęt medyczny Co., Ltd.</td><td>20160900</td><td>Zapewnij sterylne miejsce operacji</td></tr><tr><td>Probówka (50 ml)</td><td>Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.&nbsp;</td><td>BLD-BL2002500</td><td>Przechowywać przefiltrowany roztwór komórkowy</td></tr><tr><td>trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>25200056</td><td>trawić przylegające komórki</td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosforan</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Zobacz materiał G5422</td><td>Różnicowanie osteogenne BMSC</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego

Purification, Expansion, and Flow Cytometry-Based Phenotyping of Mouse Derived Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) to populacja komórek macierzystych, które mogą samoodnawiać się i różnicować w wiele linii komórkowych. Wśród nich MSCs znajdujące się w szpiku kostnym, znane jako mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BMSC), odgrywają kluczową rolę w osteogenezie, wspomaganiu układu krwiotwórczego, naprowadzaniu/migracji i immunosupresji. BMSC są szeroko stosowane w badaniach biologii komórki i inżynierii tkankowej ze względu na ich potencjał w komórkowych strategiach terapeutycznych, a także ich łatwą dostępność, stabilność genetyczną i niską immunogenność. Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) i BMSC współistnieją w szpiku kostnym, ale mają odrębne komórki progenitorowe. Podczas ekstrakcji komórek ze szpiku kostnego zwykle uzyskuje się wiele typów komórek, co może prowadzić do niejednorodności populacji komórek, potencjalnie powodując stronniczość i nie spełniając wysokich standardów eksperymentalnych. Dlatego tak ważne jest opracowanie skutecznych technik poprawy jednorodności i wydajności BMSC in vitro. W badaniu przedstawiono szczegółowy protokół oczyszczania, ekspandowania i fenotypowania opartego na cytometrii przepływowej BMSC uzyskanych od myszy BALB/c. Jednorodność i fenotyp komórek macierzystych BMSC trzeciego pasażu scharakteryzowano za pomocą cytometrii przepływowej, wykazując dodatniość dla CD29, CD44 i Sca-1, ujemność dla CD45 i CD31 oraz potwierdzając ich zdolność do różnicowania osteogennego i adipogennego. Ten ekonomiczny protokół zapewnia łatwą i wydajną metodę uzyskania wystarczającej liczby jednorodnych BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, co jest niezbędne do postępu badań na modelach mysich i szeroko zakrojonych badań przedklinicznych.

Myszie BMSCs zostały wyizolowane i hodowane przez około 2 tygodnie w celu uzyskania BMSCs w trzecim pasażu (P3) (Rycina 3). Jak pokazano na Rycini 3A, komórki świeżo wyekstrahowane z szpiku kostnego pozostały jednojądrowe z widocznymi kropelkami tłuszczu. W naczyniu hodowlanym pojawiły się komórki wrzecionowate, które osiągnęły 60%-80% konfluencji w 5tym dniu hodowli (Rycina 3B,C</...

Niniejszy protokół opisuje opłacalną metodę oczyszczania, namnażania i charakteryzowania wysoce jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) od myszy. Takie podejście ułatwia pozyskiwanie dużych ilości BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, wspierając modele mysie i posuwając naprzód badania przedkliniczne.

Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of stem cells that can self-renew and differentiate into multiple cell lineages. Among them, MSCs found in ...

Nasze badania zapewniają tanią metodę oczyszczania i namnażania jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego myszy. Pomaga to naukowcom uzyskać wystarczającą ilość wysokiej jakości komórek o silnych zdolnościach wzrostu i różnicowania. Kluczowym wyzwaniem w badaniach nad komórkami macierzystymi szpiku kostnego jest opracowanie prostego i skutecznego protokołu izolowania mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego. Ta metoda pozwala mezenchymalnym komórkom macierzystym szpiku kostnego rosnąć bocznie, unikając zakłóceń. Wykorzystuje trzecie pasażowanie, unika dodatkowych efektów wzrostu i utrzymuje komórki krwiotwórcze w pobliżu, aby wspierać zdrowie i funkcję komórek macierzystych.[Instruktor] Na początek namocz uśpioną mysz w 75% etanolu przez pięć minut. Za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych wykonaj około centymetrowe nacięcie na kończynie tylnej, w pobliżu ścięgna Achillesa. Następnie wykonaj okrągłe nacięcie wokół tylnej kończyny, aby odsłonić dystalną kość piszczelową. Oderwij skórę od miejsca nacięcia w górę w kierunku biodra, aby usunąć skórę z obu tylnych kończyn. Przeciąć wzdłuż kości biodrowej, aby odłączyć głowę kości udowej od kości biodrowej. Za pomocą sterylnego skalpela usuń jak najwięcej ścięgien i mięśni z kości piszczelowej i strzałkowej, aby ułatwić późniejsze zaczerwienienie. Umieść oczyszczone kości z powrotem w naczyniu zawierającym PBS z 2% penicyliną i streptomycyną przed umieszczeniem ich w sterylnym kapturze. Weź strzykawkę o pojemności 50 mililitrów i przymocuj igłę dołączoną do strzykawki. Napełnij strzykawkę 20 mililitrami pożywki alpha MEM i zastąp igłę tą, która jest dołączona do strzykawki o pojemności jednego mililitra. W sterylnym kapturze użyj nożyczek, aby odciąć oba końce oddzielonej kości udowej lub piszczelowej. Teraz włóż igłę do kości na przeciętej krawędzi i przepłucz szpik kostny do 100-milimetrowego naczynia do hodowli komórek zawierającego kompletną pożywkę alfa MEM. Kontynuuj płukanie, aż kość stanie się widocznie blada, co wskazuje na udane pobranie szpiku. Pipetuj w górę i w dół 40 razy za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety, aby rozproszyć dowolne agregaty komórek. Teraz przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki wirówkowej, aby usunąć zanieczyszczenia, fragmenty tkanek i nierozproszone grudki. Dostosuj całkowitą objętość do 15 mililitrów za pomocą kompletnej pożywki alpha MEM i przenieś przefiltrowaną zawiesinę komórek do 100-milimetrowego naczynia hodowlanego. Trzymaj naczynie obiema rękami i delikatnie obracaj je 15 razy ruchem ósemkowym, aby równomiernie rozprowadzić komórki na naczyniu. Na koniec umieść naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i kulturze przez pięć dni. Rysunek ten ilustruje progresję morfologiczną komórek zrębu szpiku kostnego od początkowej ekstrakcji do trzeciego pasażu w hodowli. Świeżo wyekstrahowane komórki szpiku kostnego wydawały się w przeważającej mierze jednojądrzaste z rozproszonymi kropelkami tłuszczu widocznymi na całym polu. W piątym dniu hodowli zaczęły pojawiać się komórki w kształcie wrzecionowatego kształtu, które osiągnęły około 60% do 80% konfluencji, kontynuując wzrost gęstości do siódmego dnia. Od pierwszego do trzeciego przejścia komórki zrębu szpiku kostnego utrzymywały morfologię wrzecionowatą lub wrzecionowatą, tworzyły przezroczystą monowarstwę z połączonymi koloniami i nie wykazywały oznak apoptozy, takich jak ziarnistość cytoplazmatyczna lub fragmentacja jądrowa. Cytometria przepływowa potwierdziła, że CD29, CD44 i Sca-1 wykazywały wysoką ekspresję w komórkach zrębu szpiku kostnego. Ekspresja markerów CD31 i CD45 linii śródbłonka i układu krwiotwórczego była znikoma. Kwantyfikacja markerów dodatkowo potwierdziła wysokie poziomy ekspresji CD29, CD44 i Sca-1 w porównaniu z CD31 i CD45.

purification-expansion-flow-cytometry-based-phenotyping-mouse-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Opisujemy protokół izolacji i oczyszczania neutrofili ze szpiku kostnego myszy poprzez wirowanie w gradiacji gęstości oraz znakowanie neutrofili za pomocą barwników CellTracker. Jest to prosta, szybka, powtarzalna i ekonomiczna metoda uzyskiwania dużej liczby neutrofili do dalszych badań funkcjonalnych lub eksperymentów adoptywnych w zakresie transferu i śledzenia.

Izolacja, oczyszczanie i znakowanie neutrofili szpiku kostnego myszy do badań funkcjonalnych i eksperymentów z transferem adoptywnym

Przedstawiamy protokół wykrywania jednoczesnej ekspresji markerów komórek macierzystych białaczki na pierwotnych komórkach ostrej białaczki szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje przodków i przypuszczalną populację LSC o rosnącym stopniu dojrzałości. Potwierdziliśmy obecność tych populacji w odpowiadających im ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów.

Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji

Diagnoza MDS jest trudna ze względu na brak kryteriów morfologicznych lub cytogenetyki bez informacji. MFC może pomóc udoskonalić proces diagnostyczny MDS. Aby analiza MFC stała się przydatna w praktyce klinicznej, musi opierać się na parametrach o wystarczającej swoistości i czułości, a dane powinny być powtarzalne dla różnych operatorów.

Cytometria przepływowa sterowana bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Ksenobiotyczne pompy wypływowe są bardzo aktywne w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) i powodują ekstruzję TMRM, barwnika fluorescencyjnego o potencjale błony mitochondrialnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół do dokładnego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w HSPC za pomocą TMRM w obecności Werapamilu, inhibitora pompy wypływowej.

Poprawa dokładności cytometrycznej oceny potencjału błony mitochondrialnej w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych poprzez hamowanie pomp wypływowych

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Ten protokół opisuje zastosowanie aktywowanego fluorescencją sortowania komórek ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu metody sortowania pojedynczych komórek. W szczególności zastosowanie sortowania pojedynczych komórek może osiągnąć 99% czystość komórek immunofenotypowanych z niejednorodnej populacji w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrycznej cytometrii przepływowej.

Sortowanie jednokomórkowe immunofenotypowanych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

Poznaj metodę oczyszczania i ekspansji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego myszy z zastosowaniem cytometrii przepływowej. Protokół zapewnia wysoką jednorodność i potencjał różnicowania komórek.

Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego (Wideo) | JoVE Journal

Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego

Przeglądaj więcej filmów