Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego
11 lipca 2025
Niniejszy protokół opisuje opłacalną metodę oczyszczania, namnażania i charakteryzowania wysoce jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) od myszy. Takie podejście ułatwia pozyskiwanie dużych ilości BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, wspierając modele mysie i posuwając naprzód badania przedkliniczne.
Nasze badania zapewniają tanią metodę oczyszczania i namnażania jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego myszy. Pomaga to naukowcom uzyskać wystarczającą ilość wysokiej jakości komórek o silnych zdolnościach wzrostu i różnicowania. Kluczowym wyzwaniem w badaniach nad komórkami macierzystymi szpiku kostnego jest opracowanie prostego i skutecznego protokołu izolowania mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego. Ta metoda pozwala mezenchymalnym komórkom macierzystym szpiku kostnego rosnąć bocznie, unikając zakłóceń. Wykorzystuje trzecie pasażowanie, unika dodatkowych efektów wzrostu i utrzymuje komórki krwiotwórcze w pobliżu, aby wspierać zdrowie i funkcję komórek macierzystych.
[Instruktor] Na początek namocz uśpioną mysz w 75% etanolu przez pięć minut. Za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych wykonaj około centymetrowe nacięcie na kończynie tylnej, w pobliżu ścięgna Achillesa. Następnie wykonaj okrągłe nacięcie wokół tylnej kończyny, aby odsłonić dystalną kość piszczelową. Oderwij skórę od miejsca nacięcia w górę w kierunku biodra, aby usunąć skórę z obu tylnych kończyn. Przeciąć wzdłuż kości biodrowej, aby odłączyć głowę kości udowej od kości biodrowej. Za pomocą sterylnego skalpela usuń jak najwięcej ścięgien i mięśni z kości piszczelowej i strzałkowej, aby ułatwić późniejsze zaczerwienienie. Umieść oczyszczone kości z powrotem w naczyniu zawierającym PBS z 2% penicyliną i streptomycyną przed umieszczeniem ich w sterylnym kapturze. Weź strzykawkę o pojemności 50 mililitrów i przymocuj igłę dołączoną do strzykawki. Napełnij strzykawkę 20 mililitrami pożywki alpha MEM i zastąp igłę tą, która jest dołączona do strzykawki o pojemności jednego mililitra. W sterylnym kapturze użyj nożyczek, aby odciąć oba końce oddzielonej kości udowej lub piszczelowej. Teraz włóż igłę do kości na przeciętej krawędzi i przepłucz szpik kostny do 100-milimetrowego naczynia do hodowli komórek zawierającego kompletną pożywkę alfa MEM. Kontynuuj płukanie, aż kość stanie się widocznie blada, co wskazuje na udane pobranie szpiku. Pipetuj w górę i w dół 40 razy za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety, aby rozproszyć dowolne agregaty komórek. Teraz przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki wirówkowej, aby usunąć zanieczyszczenia, fragmenty tkanek i nierozproszone grudki. Dostosuj całkowitą objętość do 15 mililitrów za pomocą kompletnej pożywki alpha MEM i przenieś przefiltrowaną zawiesinę komórek do 100-milimetrowego naczynia hodowlanego. Trzymaj naczynie obiema rękami i delikatnie obracaj je 15 razy ruchem ósemkowym, aby równomiernie rozprowadzić komórki na naczyniu. Na koniec umieść naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i kulturze przez pięć dni. Rysunek ten ilustruje progresję morfologiczną komórek zrębu szpiku kostnego od początkowej ekstrakcji do trzeciego pasażu w hodowli. Świeżo wyekstrahowane komórki szpiku kostnego wydawały się w przeważającej mierze jednojądrzaste z rozproszonymi kropelkami tłuszczu widocznymi na całym polu. W piątym dniu hodowli zaczęły pojawiać się komórki w kształcie wrzecionowatego kształtu, które osiągnęły około 60% do 80% konfluencji, kontynuując wzrost gęstości do siódmego dnia. Od pierwszego do trzeciego przejścia komórki zrębu szpiku kostnego utrzymywały morfologię wrzecionowatą lub wrzecionowatą, tworzyły przezroczystą monowarstwę z połączonymi koloniami i nie wykazywały oznak apoptozy, takich jak ziarnistość cytoplazmatyczna lub fragmentacja jądrowa. Cytometria przepływowa potwierdziła, że CD29, CD44 i Sca-1 wykazywały wysoką ekspresję w komórkach zrębu szpiku kostnego. Ekspresja markerów CD31 i CD45 linii śródbłonka i układu krwiotwórczego była znikoma. Kwantyfikacja markerów dodatkowo potwierdziła wysokie poziomy ekspresji CD29, CD44 i Sca-1 w porównaniu z CD31 i CD45.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia kosztowo efektywną metodę oczyszczania i namnażania wysoce homogennych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSCs) myszy. Protokół ten nie tylko upraszcza proces izolacji, ale także zwiększa zdolności do proliferacji i różnicowania uzyskanych BMSCs, co usprawnia badania przedkliniczne z wykorzystaniem modeli mysich.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia komórki
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Modele przedkliniczne
Wstęp
- Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego odgrywają kluczową rolę w medycynie regeneracyjnej.
- Homogenne BMSCs są niezbędne dla uzyskania wiarygodnych wyników eksperymentalnych.
- Konieczne są kost efektywne protokoły, aby ułatwić szerszy dostęp do badań.
Zastosowane metody
- Techniki ekstrakcji i hodowli szpiku kostnego.
- Model mysi do pozyskiwania BMSCs.
- Cytometria przepływowa w charakterystyce komórek.
Główne wyniki
- Protokół pozwolił na uzyskanie BMSCs o wysokim potencjale wzrostu i różnicowania.
- BMSCs zachowały spójną morfologię wrzecionowatą w kolejnych pasażach.
- Cytometria przepływowa potwierdziła wysoką ekspresję markerów komórek macierzystych: CD29, CD44 oraz Sca-1.
Wnioski
- Niniejsze badanie z powodzeniem demonstruje niezawodną metodę izolacji BMSC, która stanowi wsparcie dla dalszych badań.
- Wyniki te mają znaczenie dla zwiększenia powtarzalności i efektywności zastosowań komórek macierzystych w biologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodne oczyszczanie i namnażanie homogennych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego myszy (BMSCs) ma kluczowe znaczenie dla rozwoju modeli przedklinicznych i badań translacyjnych. Niniejszy protokół umożliwia spójne generowanie wysokiej jakości BMSCs o zwalidowanych fenotypach, co wspiera rzetelną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w fazie wczesnego odkrywania. Standaryzowane przepływy pracy z użyciem BMSCs redukują zmienność biologiczną, zwiększając pewność prognostyczną w ramach portfeli badawczo-rozwojowych (R&D).
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia odtwarzalną izolację BMSCs w celu badania szlaków sygnałowych w oparciu o postawione hipotezy.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez dostarczanie homogenicznych, dobrze scharakteryzowanych populacji komórek.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modelach in vitro istotnych dla przebiegu chorób.
- Ułatwia selekcję projektów z portfolio poprzez zapewnienie spójnych wkładów biologicznych do przesiewania.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane preparaty BMSC do późniejszej optymalizacji testów.
- Poprawia powtarzalność testów i niezawodność wyników ilościowych dzięki walidacji fenotypowej.
- Umożliwia skalowalną ekspansję BMSC dla platform wysokoprzepustowych przesiewów.
- Wspiera rzetelną ocenę związków poprzez minimalizację heterogeniczności populacji komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia zgodność z istotnymi dla choroby modelami przedklinicznymi poprzez dostarczanie zwalidowanych populacji komórek macierzystych.
- Gwarantuje ciągłość od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej dzięki spójnej jakości komórek.
- Minimalizuje ryzyko w badaniach translacyjnych poprzez potwierdzenie potencjału różnicowania i proliferacji.
- Wspiera dopasowanie biomarkerów dzięki fenotypowaniu opartemu na cytometrii przepływowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół integruje etap wczesnego odkrywania z rozwojem modeli przedklinicznych, stanowiąc podstawę do identyfikacji związków wiodących oraz prowadzenia badań translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia rygorystyczne testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych z wykorzystaniem homogenicznych BMSCs.
- Przesiewanie: Dostarcza komórek zwalidowanych fenotypowo, gotowych do analizy, co zapewnia powtarzalność procesów przesiewowych.
- Analityka: Wykorzystuje cytometrię przepływową do generowania ilościowych danych o ekspresji markerów w celu porównania różnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z badaniami przedklinicznymi dzięki zwalidowanym, multipotencjalnym populacjom komórek macierzystych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowany, skalowalny protokół do powtarzalnego stosowania w programach badawczo-rozwojowych (R&D).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje ryzyko biologiczne w badaniach na wczesnym etapie.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów BMSC.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne kapitałowo rozwijanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki dostarczeniu wiarygodnych danych z modeli przedklinicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie technik sterylnych oraz analizy cytometrii przepływowej.
- Wymaga dostępu do infrastruktury hodowli komórkowych oraz aparatury analitycznej.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójnego przygotowania i fenotypowania komórek.
- Metoda jest możliwa do zastosowania u różnych szczepów myszy, jednak może wymagać optymalizacji dla innych gatunków.
- Wydajność i homogenność zależą od precyzyjnego przestrzegania poszczególnych kroków protokołu.
