Ocena sygnalizacji śmierci komórki za pomocą immunofluorescencji w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

Udar niedokrwienny mózgu jest główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności na całym świecie. Nasza praca koncentruje się na celach lekowych stosowanych w leczeniu udaru mózgu. Interesuje nas kilka pojawiających się celów, takich jak RUNX1 i katepsyny. Aby ocenić te cele, opracowaliśmy szczurzy model udaru niedokrwiennego poprzez zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej.

Modelujemy udar niedokrwienny u szczurów, wprowadzając włókno w celu zamknięcia tętnicy środkowej mózgu. Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu jest najczęściej stosowanym modelem gryzoni do przedklinicznych badań udaru mózgu w połączeniu z innymi technikami, takimi jak TTC, immunofluorescencja i barwienie TUNEL. Możemy badać patofizjologię udaru mózgu w zintegrowanym podejściu. Istnieją pewne wyzwania techniczne związane z immunofluorescencją, takie jak specyficzność przeciwciał minimalizująca tło fluorescencji i optymalizacja stosunku sygnału do szumu poprzez wykorzystanie właściwości znaczników fluorescencyjnych i specyficznych przeciwciał. Immunofluorescencja pozwala nam zrozumieć skomplikowany krajobraz architektury komórkowej i interakcji molekularnych z modelem zamykania tętnicy środkowej mózgu.

Pewna ilość tkanki mózgowej jest potencjalnie możliwa do uratowania przy odpowiednim oknie czasowym udaru. Nasze wyniki pokazują, że ekspresja katepsyny B jest aktywowana w liczbie mózgów szczurów po niedrożności tętnicy środkowej mózgu. Towarzyszy mu zwiększona apoptoza. Dalsze badania nad mechanizmem leżącym u podstaw sygnalizacji śmierci komórki mogą przynieść nowy cel dla leku.

W naszym przyszłym badaniu będziemy nadal badać potencjalne cele molekularne w szlakach zapalnych i sygnalizacji śmierci komórki. Mamy nadzieję, że niektóre z tych celów odkrytych w badaniach eksperymentalnych będą mogły zostać przełożone na terapię kliniczną, poprawiając w ten sposób przeżywalność i jakość życia pacjentów po udarze.

[Narrator] Na początek umieść znieczulonego szczura w pozycji leżącej na plecach i utrzymuj temperaturę jego ciała na poziomie 36,5 °C za pomocą regulowanej maty grzewczej i sondy monitorującej temperaturę doodbytniczą. Ogol skórę na szyi i zdezynfekuj ją za pomocą roztworu dezynfekującego jodoforu. Następnie wykonaj 2-centymetrowe nacięcie w linii środkowej szyi i cofnij tkanki miękkie, aby odsłonić naczynia szyjne. Za pomocą kleszczy wyizoluj prawą tętnicę szyjną wspólną lub CCA, tętnicę szyjną zewnętrzną, ECA i tętnicę szyjną wewnętrzną, ICA. Podwiązać proksymalne prawe CCA za pomocą szwów. Następnie zaciśnij odpowiednie ICA i ECA w ich punkcie początkowym za pomocą mikroklipsa. Włóż nylonową żyłkę pokrytą okrągłą silikonową końcówką do światła CCA przez małe nacięcie i zawiąż węzeł w CCA, aby zapobiec krwawieniu i przemieszczaniu się żyłki. Otwórz prawy mikroklips ICA i włóż żyłkę do prawej środkowej tętnicy mózgowej lub MCA przez kikut ICA, aż silikonowa końcówka zatka początek MCA. Odetnij odsłoniętą część nylonowej żyłki i zamknij nacięcie szyjki w linii środkowej. Po dwóch godzinach niedrożności MCA otwórz nacięcie szyi i rozwiąż węzeł w CCA. Następnie wyjmij nylonową żyłkę, aby ponownie stopić MCA. Po operacji obserwuj szczura podczas rekonwalescencji po znieczuleniu w podgrzewanej klatce z matą grzewczą o regulowanej temperaturze. Korzystając ze Skali Długiej Oceny Behawioralnej Zaya, oceń funkcję neurologiczną dwie godziny po niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO) i 22 godziny po reperfuzji. Po odizolowaniu całego mózgu od szczura modelowego MCAO, zamrozić mózg w temperaturze -20 °C na 20 minut. Pokrój zamrożony mózg na sześć plasterków koronalnych z zachowaniem odległości 2 mm między plasterkami. Plastry barwić 2% TTC przez 15 minut w temperaturze 37 °C w ciemności. Następnie utrwal plastry mózgu 4% paraformaldehydem przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Sfotografuj poplamione plasterki za pomocą aparatu cyfrowego ustawionego w trybie automatycznym dla obiektów z bliska. Przenieś obrazy do komputera i użyj oprogramowania ImageJ, aby zmierzyć rozmiar zawału. Oblicz rozmiar zawału jako stosunek sumy obszaru zawału we wszystkich sześciu wycinkach do sumy całkowitej powierzchni mózgu w tych samych wycinkach. W grupie MCAO zaobserwowano istotne obszary zawału w porównaniu z brakiem zawału w grupie pozorowanej. W celu analizy immunofluorescencyjnej utrwal nienaruszony mózg szczura modelowego MCAO w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny. Następnie odwodnić mózg w serii gradientów roztworu sacharozy w stężeniach 10%, 15% i 30%, w stężeniach 10%, 15% i 30%, kontynuując, aż tkanka opadnie. Osadź odwodniony mózg w związku o optymalnej temperaturze cięcia i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza. Snap zamrozić mózg w ciekłym azocie. Na kriostacie przeciąć mózg na grubość 5 μm. Po wyrównaniu zamrożonych skrawków mózgu w temperaturze pokojowej, umyj je trzykrotnie sterylnym PBS przez 5 minut każda. Narysuj tkankę pisakiem immunohistochemicznym przed inkubacją z 20 μg na ml proteinazy K i 0,3% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po umyciu skrawków PBS nanieść 3% BSA na zarysowaną tkankę i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę w celu zablokowania. Zastąpić roztwór blokujący odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym i inkubować skrawki przez noc w ciemności w temperaturze 4 °C. Następnego dnia przemyj skrawki trzy razy sterylnym PBS zawierającym 0,1% Tween-20 przez 5 minut każda. Dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe sprzężone z wymaganym fluoroforem i inkubować skrawki w wilgotnej komorze przez godzinę, chroniąc je przed światłem. Po umyciu skrawków PBS zawierającym Tween-20 należy je zabarwić medium montażowym zawierającym DAPPI i przykryć szkiełkami nakrywkowymi. W mikroskopie fluorescencyjnym ustaw długość fali wzbudzenia na 488 nm, długość fali emisji na 520 nm, a czas ekspozycji na 500 ms, aby uchwycić barwione obrazy wycinków mózgu. Immunoreaktywność katepsyny B była istotnie zwiększona w niedokrwiennym rdzeniu grupy MCAO w porównaniu z grupą pozorowaną. Immunoreaktywność katepsyny B była istotnie podwyższona w korze półcienia w grupie MCAO w porównaniu z grupą pozorowaną. Nie zaobserwowano istotnej różnicy w immunoreaktywności katepsyny B między rdzeniem niedokrwiennym a korą półcieniową. Na początek odwodnij plastry mózgu utrwalone paraformaldehydem od szczura modelowego MCAO, zwiększając stężenie etanolu przez 35 do 50 minut każdy. Następnie potraktuj wycinki mózgu przezroczystym środkiem biologicznym 1 z olejkiem terpentynowym przez 35 do 50 minut, a następnie środkiem oczyszczającym 2 przez 35 do 50 minut, aż tkanka stanie się całkowicie przezroczysta. Teraz zanurz plastry mózgu w pożywkach 1, 2, 3 i 4 sekwencyjnie po 60 minut każdy. Umieść plastry mózgu w kasecie do zatapiania, szczelnie je zamknij i przechowuj w chłodni w celu zestalenia. Za pomocą mikrotomu przyciąć blok tkanki na głębokość 10 μm, a następnie pokroić na plasterki na głębokość 5 μm. Pozostawić skrawki tkanki na powierzchni w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C przez 30 sekund, a następnie przenieść je na szkiełka. Po wysuszeniu należy odparafinować skrawki mózgu w środku czyszczącym przez dwa cykle po 10 minut każdy. Następnie nawodnij sekcje mózgu w zmniejszających się stężeniach etanolu. Teraz przepłucz sekcję trzy razy w PBS przez pięć minut każdy. Po usunięciu nadmiaru wilgoci dodać 100 μl proteinazy K do każdej sekcji i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Po przepłukaniu PBS nanieść 100 μl końcowego buforu równoważącego deoksynukleotydylotransferazę do każdej próbki i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 10-30 minut. Usunąć bufor za pomocą bibuły chłonnej i dodać 50 μl roztworu roboczego do etykietowania z zestawu testowego TUNEL. Następnie nanieść roztwór roboczy DAPPI na skrawki i inkubować w ciemności przez pięć minut, aby przeciwdziałać barwieniu jąder. Przepłukać próbki w PBS cztery razy przez 5 minut każda. Usuń nadmiar płynu i uszczelnij szkiełko środkiem montażowym zapobiegającym blaknięciu. Zeskanuj wybarwione szkiełko za pomocą systemu obrazowania multispektralnego Vectra Polaris. Barwienie TUNEL wykazało znaczny wzrost apoptozy, z większą liczbą komórek TUNEL-dodatnich w korze półcieniowej grupy MCAO w porównaniu z grupą pozorowaną.