Name: Ocena sygnalizacji śmierci komórki za pomocą immunofluorescencji w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Poznaj ocenę sygnalizacji śmierci komórki za pomocą immunofluorescencji w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego z zastosowaniem techniki MCAO. Ta metoda pozwala badać ekspresję kathepsyny B i apoptozę w mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Simiao Wu był wspierany przez Departament Nauki i Technologii Prowincji Syczuan (2024YFHZ0330) oraz Szpital Zachodniochiński Uniwersytetu Syczuan. Weihong Był wspierany przez Departament Nauki i Technologii prowincji Syczuan (2023YFS0297) oraz Uniwersytet Syczuański. Dziękujemy Yi Zhangowi i Yue Li z Głównego Ośrodka Badawczego Szpitala Zachodniochińskiego Uniwersytetu Syczuańskiego za ich wsparcie techniczne w zakresie obrazowania i analizy TUNEL.

Ten protokół i opisane tutaj eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Medycznej Uniwersytetu Syczuańskiego. Opieka nad zwierzętami i ich wykorzystywanie były zgodne z lokalnymi i międzynarodowymi kryteriami etycznymi.
UWAGA: W tym badaniu wykorzystano dorosłe samce szczurów rasy Sprague-Dawley o wadze 250-280 g. Szczury były trzymane w standardowych warunkach środowiskowych (temperatura 20-22 °C, 12 godzin cyklu światła/ciemności), karmione standardową dietą dla szczurów i wodą o wysokiej czystości. Zabieg chirurgiczny został przeprowadzony w sterylnych warunkach.
1. Model szczura MCAO
<ol>
	<li>Wywołać znieczulenie początkowe za pomocą 4% izofluranu z tlenem w dawce 1 l/min. Monitorować głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia stopy. Podczas znieczulenia należy podać maść do oka, aby zapobiec wysuszeniu. Wstrzyknąć szczurowi 1 ml soli fizjologicznej podskórnie w celu uzupełnienia objętości oraz 5 mg/kg karprofenu i 0,1 mg/kg buprenorfiny w celu znieczulenia przedoperacyjnego. Izofluran należy początkowo zmniejszać do 3,5%, a następnie stopniowo do 2% przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	<li>Umieść szczura w pozycji leżącej na plecach i utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 36,5 ± 0,1 °C na regulowanej macie grzewczej z sondą monitorującą temperaturę doodbytniczą. Ogol i zdezynfekuj skórę szyi roztworem dezynfekującym jodofor.</li>
	<li>Wykonaj 2-centymetrowe nacięcie w linii środkowej szyi i cofnij tkanki miękkie, aby odsłonić naczynia szyjne. Użyj kleszczy, aby wyizolować prawą tętnicę szyjną wspólną (CCA), tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) i tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA).</li>
	<li>Użyj szwów, aby podwiązać proksymalne prawe CCA i zacisnąć prawe ICA i ECA za pomocą mikroklipsa na ich początku.</li>
	<li>Włóż nylonową żyłkę pokrytą okrągłą silikonową końcówką do światła CCA przez małe nacięcie i zawiąż węzeł w CCA, aby zapobiec krwawieniu i przemieszczaniu się nylonowej żyłki.</li>
	<li>Otwórz prawy mikroklips ICA i włóż nylonową żyłkę do prawej środkowej tętnicy mózgowej (MCA) przez kikut ICA, aż silikonowa końcówka zatka początek MCA (~18-20 mm).</li>
	<li>Odetnij odsłoniętą część nylonowej żyłki i zamknij nacięcie linii środkowej szyi.</li>
	<li>Po 2 godzinach okluzji MCA otwórz nacięcie szyi i rozwiąż węzeł w CCA. Następnie wyjmij nylonową żyłkę, aby ponownie stopić MCA. Podwiązać dystalną prawą CCA i zamknąć nacięcie szyi szwami ciągłymi lub przerywanymi.</li>
	<li>Po operacji buprenorfinę podaje się we wstrzyknięciu podskórnym co 8 godzin, w dawce 0,03 mg/kg. Obserwuj szczury przez cały okres rekonwalescencji po znieczuleniu w ogrzewanej klatce z matą grzewczą o regulowanej temperaturze. Aby zachęcić do jedzenia, umieść w klatce szalkę Petriego z puree z paszy. Trzymaj jednego szczura w klatce po operacji.</li>
	<li>Poddać szczury pozorowane tej samej procedurze bez wprowadzania żyłki. 
	UWAGA: W sumie 9 zwierząt jest używanych w każdej grupie do pomiaru wielkości zawału (n = 3), analizy immunofluorescencyjnej (n = 3) i wykrywania apoptozy (n = 3).</li>
	<li>Oceń funkcje neurologiczne po 2 godzinach od MCAO i 22 godziny po reperfuzji za pomocą skali oceny behawioralnej Zea-Longa ze skalą 0-5 punktów14. Wyklucz stawki z wynikiem 0 lub 4.</li>
</ol>
2. Pomiar wielkości zawału (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Złóż szczury w ofierze w głębokim znieczuleniu (4% izofluranu) za pomocą gilotyny i ostrożnie odizoluj cały mózg od czaszki.</li>
	<li>Zamrozić mózg w temperaturze -20 °C na 20 minut i pokroić zamrożony mózg na sześć plasterków koronalnych z zachowaniem odległości 2 mm między plasterkami. Plamić plastry mózgu 2% TTC przez 15 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.</li>
	<li>Utrwal plastry mózgu 4% paraformaldehydem przez 24 godziny w temperaturze pokojowej (RT). Sfotografuj poplamione plasterki aparatem cyfrowym, z ustawieniem trybu automatycznego dla obiektów z bliska.</li>
	<li>Przenieś zdjęcia do komputera i zmierz rozmiar zawału za pomocą ImageJ. Przedstaw rozmiar zawału jako stosunek sumy obszaru zawału w 6 plasterkach do sumy całego obszaru mózgu w tych samych wycinkach. Wyraż dane jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM).</li>
</ol>
3. Analiza immunofluorescencyjna kriosekcji mózgu (Rysunek 2)
<ol>
	<li>Wywołać znieczulenie za pomocą 4% izofluranu i 1 l/min tlenu. Naciąć skórę i tkankę podskórną, aby odsłonić serce.</li>
	<li>Usuń osierdzie i wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku. Przelej 200 ml soli fizjologicznej przez lewą komorę, a następnie 200 ml 4% paraformaldehydu.</li>
	<li>Otwórz czaszkę i usuń nienaruszony mózg.</li>
	<li>Utrwal mózg w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez ponad 24 godziny. Następnie odwodnić go w serii gradientów roztworu sacharozy o stężeniach 10%, 15% i 30%, aż tkanka opadnie, około 6-8 godzin dla każdego stężenia.</li>
	<li>Osadź mózg w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i usuń pęcherzyki powietrza, jeśli takie istnieją. Następnie zamroź mózg w ciekłym azocie i przechowuj go w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Podzielić mózg na sekcje za pomocą kriostatu o grubości 5 μm. Podczas przekroju upewnić się, że temperatura w komorze utrzymuje się w zakresie od -18 °C do -20 °C. Oznacz miejsce cięcia w oparciu o miejsce modelu i warunki eksperymentalne. Przechowuj sekcje w zamrażarce.</li>
	<li>Pozwól, aby zamrożone skrawki zrównoważyły się w temperaturze pokojowej przez ~ 30 minut, aby przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne. Następnie namocz skrawki sterylnym PBS 3x przez 5 minut każda.</li>
	<li>Obrysuj tkankę pisakiem immunohistochemicznym. Inkubować z 20 μg/ml proteinazy K (bez RNazy) i 0,3% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Namocz skrawki sterylnym PBS 3x przez 5 minut każda. Nałożyć 3% BSA na zarysowaną tkankę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w celu zablokowania.</li>
	<li>Po zablokowaniu usunąć roztwór, dodać odpowiednie przeciwciało pierwszorzędowe (rekombinowane przeciwciało monoklonalne katepsyny-B królika, 1:200) i inkubować skrawki przez noc w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć skrawki sterylnym PBS zawierającym 0,1% Tween-20 3x przez 5 minut każda.</li>
	<li>Dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe (kozie przeciwciało anty-szczurze IgG [H+L] [sprzężone z FITC], 1:200) z wymaganym fluoroforem i inkubować skrawki w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, chroniąc je przed światłem.</li>
	<li>Po wtórnej inkubacji przeciwciał przemyć skrawki sterylnym PBS zawierającym 0,1% Tween-20 3x przez 5 min każda. Zabejcuj sekcje medium montażowym zawierającym DAPI i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z następującymi ustawieniami: długość fali wzbudzenia 488 nm, długość fali emisji 520 nm i czas naświetlania 500 ms. Przechowuj skrawki w ciemności w temperaturze 4 °C w celu długotrwałej konserwacji.</li>
</ol>
4. Wykrywanie apoptozy za pomocą barwienia TUNEL (Rysunek 3)
UWAGA: Komercyjny zestaw testowy TUNEL jest używany do barwienia TUNEL. Ten zestaw TUNEL zawiera roztwór roboczy buforu DNazy I, bufor równoważący deoksynukleotydylotransferazę (TdT), roztwór roboczy do znakowania i roztwór roboczy DAPI.
<ol>
	<li>Perfuzja i izolacja mózgu przy użyciu tej samej procedury, co powyżej (kroki 3.2-3.3). Zanurz mózg w 4% paraformaldehydzie na 3-4 godziny w celu utrwalenia.</li>
	<li>Pokrój mózg na plastry koronalne o grubości około 2 mm, zaczynając od końca rostralnego do końca ogonowego, i zanurz w 4% paraformaldehydzie na dodatkowe 12 godzin. Po utrwaleniu umyj plastry mózgu pod bieżącą wodą przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zanurz plastry mózgu w roztworach etanolu o stężeniach 50%, 70%, 80%, 90%, 95% i 100% kolejno na 35-50 minut każdy w celu odwodnienia.</li>
	<li>Traktuj wycinki mózgu przezroczystym czynnikiem biologicznym I typu TO przez 35-50 minut, a następnie środkiem czyszczącym II przez 35-50 minut, aż tkanka stanie się całkowicie przezroczysta.</li>
	<li>Zanurz plastry mózgu kolejno w pożywce do zatapiania I na 60 minut, w pożywce II na 60 minut, na 60 minut, a na 60 minut.</li>
	<li>Umieść plastry mózgu w kasecie do osadzania. Zamknij kasetę, wyraźnie ją oznacz i umieść w chłodni w celu zestalenia.</li>
	<li>Ustaw mikrotom na początkową grubość 10 μm, aby przyciąć blok tkanki. Następnie dostosuj grubość do 5 μm do krojenia.</li>
	<li>Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 45 °C, unieść skrawki tkanek na powierzchni wody i podnieść je na szkiełka. Po około 30 s wyjmij szkiełka, wysusz je w temperaturze pokojowej i przechowuj w suszarce.</li>
	<li>Odparafinować zmagazynowane fragmenty mózgu, zanurzając je w środku czyszczącym na 2 cykle po 10 minut każdy.</li>
	<li>Aby nawodnić sekcje, namocz je w bezwodnym etanolu na 5 minut, powtarzając 3 razy. Przenieś sekcje do 90% etanolu na 3 min. Następnie namocz skrawki w 80% etanolu przez 3 minuty. Na koniec zanurz sekcje w 70% etanolu na 3 minuty.</li>
	<li>Przepłukać próbki w PBS 3x przez 5 minut każda. Delikatnie usuń nadmiar wilgoci za pomocą bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Do każdej próbki należy podać 100 μl 1x roztworu roboczego proteinazy K i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Po przepuszczalności płukać próbki w PBS 3x przez 5 minut każda.</li>
	<li>Przygotować próbki do kontroli dodatniej.
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl 1x roztwór roboczy buforu DNazy I (zestaw do oznaczania TUNEL) do permeabilizowanej próbki i pozostawić do zrównoważenia w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Ostrożnie usunąć nadmiar płynu z próbki za pomocą bibuły chłonnej.</li>
		<li>Dodać 100 μl rozcieńczonego roztworu roboczego DNazy I (200 U/ml) do próbki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10-30 min. Przepłukać próbki w PBS 3x przez 5 min każda.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować próbki do kontroli ujemnej.
	<ol>
		<li>Nałożyć 100 μl 1x roztworu roboczego buforu DNazy I na przefiltrowaną próbkę i równoważyć w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Inkubować ujemną próbkę kontrolną z buforem DNazy I w temperaturze 37 °C przez 10-30 minut, upewniając się, że nie dodano enzymu DNazy I. Przepłukać próbki w PBS 3x przez 5 minut każda.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do każdej próbki nanieść 100 μl końcowego buforu równoważącego deoksynukleotydylotransferazę (TdT) (zestaw do oznaczania TUNEL) i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 10-30 minut. Następnie usuń bufor równowagi TdT za pomocą papieru chłonnego.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 50 μl roztworu roboczego do znakowania (zestaw do oznaczania TUNEL), a następnie inkubować je w temperaturze 37 °C w wilgotnej, ciemnej komorze przez 60 minut. Jeśli intensywność sygnału jest niska, rozważ wydłużenie czasu reakcji znakowania DNA. Następnie przepłukać próbki w PBS 3x przez 5 minut każda.</li>
	<li>Po osuszeniu nadmiaru wilgoci nanieść roztwór roboczy DAPI (zestaw do oznaczania TUNEL) i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 5 minut, aby przeciwdziałać barwieniu jąder. Następnie przepłukać próbki w PBS 4x przez 5 minut każda. Usuń nadmiar płynu papierem chłonnym i uszczelnij szkiełka za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu.</li>
	<li>Zeskanuj zabarwione szkiełka za pomocą systemu obrazowania multispektralnego Vectra Polaris i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania systemowego.</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Przedstaw wyniki eksperymentu jako środki ± SEM i przeanalizuj dane za pomocą testu t Studenta dla porównań dwóch grup za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 10 (GraphPad Software, San Diego, CA).</li>
	<li>Ustaw wartość p mniejszą niż 0,05 jako różnicę statystyczną.</li>
</ol>

Immunofluorescence Staining to Study Cell Death in Rat MCAO Stroke Models

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niedrożność tętnicy mózgowej prowadzi do pozbawienia tlenu i składników odżywczych, a następnie do aktywacji reaktywnych form tlenu, wewnątrzkomórkowego przeciążenia wapniem, uwalniania glutaminianu i indukcji reakcji zapalnych15. Ta seria zdarzeń powoduje śmierć komórki i nieodwracalne uszkodzenie tkanek w mózgu po zawale. Półcień można potencjalnie uratować poprzez interwencję medyczną w odpowiednim oknie terapeutycznym16. Jedynym zatwierdzonym sposobem leczenia udaru nie...

Udar mózgu jest główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności na całym świecie1. Wysoka śmiertelność i zachorowalność na udar mózgu powodują ogromne obciążenie publicznej opieki zdrowotnej i poważne konsekwencje społeczno-gospodarcze. Chociaż częstość występowania i umieralność z powodu udaru mózgu pozostają stabilne, liczba pacjentów z udarem mózgu i zgonów związanych z udarem rośnie z biegiem dziesięcioleci2,3. Udary można sklasyfikować jako niedokrwienne lub krwotoczne. Większość przypadków udarów to udary niedokrwienne spowodowane niedrożnością głównej tętnicy mózgowej4. Do tej pory tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) jest jedynym zatwierdzonym przez FDA lekiem na udar niedokrwienny, ale jego zastosowanie jest mocno ograniczone przez wąskie okno terapeutyczne, powikłania i przeciwwskazania5,6,7. W związku z tym pilne jest opracowanie nowych opcji leczenia z szerszym oknem terapeutycznym w celu złagodzenia skutków udaru.
Eksperymentalne modele zwierzęce są użytecznymi narzędziami do badania patofizjologii udaru niedokrwiennego. U większości pacjentów udar niedokrwienny mózgu jest spowodowany zablokowaniem środkowej tętnicy mózgowej (MCA)8. W związku z tym opracowano modele niedrożności tętnic środkowych mózgu (MCAO) gryzoni, które przypominają zawał mózgu u ludzi. Chociaż istnieje kilka podejść MCAO, które są stosowane w badaniach na małych zwierzętach, najczęściej stosowaną metodą jest model szwu śródświetlnego, który polega na wprowadzeniu nylonowego włókna do środkowej tętnicy mózgowej z tętnic szyjnych zewnętrznych lub wewnętrznych, co powoduje przejściowe lub trwałe zamknięcie przepływu krwi4,9. Model ten prowadzi do dużej objętości zawału mózgu i umożliwia badanie sygnalizacji śmierci komórki w tkance mózgowej zawału za pomocą technik immunofluorescencyjnych.
Obszar otaczający rdzeń po zawale, określany jako półcień, jest celem potencjalnych terapii udarowych10,11. Ponieważ przepływ krwi w półcieniu jest częściowo utrzymany, uszkodzone neurony i komórki nieneuronalne w tym obszarze można uratować poprzez hamowanie aktywacji sygnalizacji śmierci komórki. Celowanie w szlaki śmierci komórkowej może być obiecującą strategią neuroprotekcji po udarze12. Dlatego ocena sygnalizacji śmierci komórki ma kluczowe znaczenie dla eksperymentalnych badań nad udarem. Ostatnio wykazano, że katepsyna-B, proteaza lizosomalna, odgrywa rolę w pośredniczeniu w programowanej śmierci komórki po udarze mózgu i zyskała znaczną uwagę w dziedzinie neurologicznej13. Katepsyna-B stanowi potencjalny cel dla neuroprotekcji, który zasługuje na dalsze badania.
Ten artykuł pokazuje, jak wywołać MCAO za pomocą metody szwu śródświetlnego u szczurów. Pokazujemy również, jak wykonać barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazaliowego (TTC) w celu określenia wielkości zawału i wykrycia komórek apoptotycznych za pomocą barwienia końcowym deoksynukleotydylotransferazą dUTP (TUNEL).

<table><tbody><tr><td>Akoya Vectra Polaris</td><td>Akoya Biosciences</td><td>N/A</td><td>System obrazowania wielospektralnego Vectra Polaris&nbsp;</td></tr><tr><td>Bezwodny etanol</td><td>Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co.</td><td></td><td></td>Nie</tr> dotyczy <tr><td>Buprenorfiny</td><td>Szpital w Chinach Zachodnich</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Karprofen</td><td>Szpital w Chinach Zachodnich</td><td>Nie</td><td></td></tr> dotyczy <tr><td>Przeciwciało katepsyny-B</td><td>Abcam Ab214428</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>LEICA&nbsp;</td><td>LEICA CM 1950</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>OLYMPUS</td><td>TG-7</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rat IgG (H+L) (sprzężony z FITC)</td><td>Elabscience</td><td>&nbsp; E-AB-1021</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Solarbio</td><td>SL038</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie GraphPad Prism 10</td><td>Nie dotyczy</td><td>https://www.graphpad-prism.cn/?c=i&a=prismdownload_cn</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Nie dotyczy</td><td>https://imagej.net/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>długopis immunohistochemiczny</td><td>Biosharp</td><td>http://www.biosharp.cn/index/product/details/language/en/product_id/2828.html</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie InForm</td><td>Oprogramowanie systemowe Akoya Biosciences</td><td>w wersji 2.6.0</td><td>dla systemu obrazowania wielospektralnego&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór dezynfekujący Jodophor</td><td>Huatian Technology Industry Co.</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD Life Science Co.</td><td>https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/</td><td></td></tr> <tr><td>Podłoże montażowe zawierające monofilament nylonowy DAPI</td><td>Solarbio</td><td>S2110</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RWD Life Science Co.</td><td>https://www.rwdstco.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Optymalna temperatura skrawania (OCT)</td><td>Epredia</td><td>N/A</td> Paraformaldehyd Biosharp N/A <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy fosforanu (PBS)</td><td>Solarbio</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Prism GraphPad&nbsp;</td><td>Wersja 10</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza</td><td>K Tiangen</td><td>RT403-02</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Kelun Co.</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>szczurów Sprague-Dawley</td><td>Huafukang Co.</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Sacharozy</td><td>BioFroxx</td><td>1245GR500</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>RWD Life Science Co.</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysty czynnik biologiczny&nbsp; &nbsp;</td><td>Beijing Solarbio Nauka & Tecnology Co., Sp. z o.o.</td><td>http://www.solarbio.net/</td><td></td></tr> <tr><td>Roztwór chlorku trifenylotetrazolu (TTC)</td><td>Solarbio</td><td>G3005</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioFroxx</td><td>1139ML100</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw TUNEL</td><td>Elabscience</td><td>&nbsp; E-CK-A321</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena sygnalizacji śmierci komórki za pomocą immunofluorescencji w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

Evaluating Cell Death Signaling by Immunofluorescence in a Rat Model of Ischemic Stroke

Udar mózgu jest główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności na całym świecie. Większość przypadków udaru ma charakter niedokrwienny i wynika z niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCA). Obecne podejścia farmakologiczne w leczeniu udaru niedokrwiennego są ograniczone; Dlatego pilnie potrzebne są nowatorskie terapie zapewniające skuteczną neuroochronę przed uszkodzeniem niedokrwiennym po udarze. W tkance mózgowej po udarze niedokrwiennym obszar półcienia niedokrwiennego jest możliwy do uratowania, ale istnieje ryzyko progresji do nieodwracalnego uszkodzenia. Obszar półcienia otaczający rdzeń po zawale jest koncepcyjnym celem neuroprotekcji. Ponieważ przepływ krwi jest częściowo utrzymany w obszarze półcienia, komórki neuronalne i nieneuronalne w tym obszarze przejściowo przeżywają po udarze, a te komórki, które są nadal żywe, mogą zostać uratowane przez odpowiednie interwencje medyczne. Zrozumienie patofizjologii półcienia jest ważne w rozwoju terapii neuroprotekcyjnych, ponieważ szlaki śmierci komórkowej aktywowane w niedokrwiennym półcieniu mogą wskazywać na cele terapeutyczne, takie jak RUNX1 i katepsyny. Te cele białkowe funkcjonujące jako mediatory zaprogramowanej śmierci komórki mogą być dalej wykorzystywane w badaniach translacyjnych. O umiarkowanych rozmiarach i podobieństwie do ludzkiego mózgu, szczurzy model okluzji MCA in vivo (MCAO) naśladuje ludzki udar niedokrwienny i oferuje odpowiednie narzędzie do badania patologii półcienia, badania sygnalizacji śmierci komórki i oceny skutków potencjalnych celów w kontekście MCAO. Tutaj opisujemy, jak indukować MCAO u szczurów i jak wykonywać barwienie immunofluorescencyjne w celu wykrycia sygnalizacji śmierci komórki w mózgu szczura po MCAO.

Szczury poddano 120-minutowemu niedokrwieniu podczas MCAO, po którym nastąpiła 22-godzinna reperfuzja. Śmiertelność podczas operacji MCAO była minimalna i wynosiła około 25% w okresie reperfuzji. W grupie MCAO zaobserwowano znaczne uszkodzenie mózgu, podczas gdy w mózgowiu grupy Sham nie stwierdzono ognisk zawału (24,87 ± 1,21% vs. 0% sumy obszaru zawału w stosunku do całkowitego obszaru mózgu; MCAO [n = 3] vs. Sham [n = 3], P &lt; 0.001; Rycina 1A,B). W grupie MCAO...

Modele in vivo szczurów są niezbędnymi narzędziami do badania mechanizmów patologicznych i celów terapeutycznych dla udaru niedokrwiennego. W niniejszej pracy opisano wykonywanie barwienia immunofluorescencyjnego w wycinkach mózgu z zawałem po zamknięciu tętnicy środkowej mózgu (MCAO) u szczurów.

Ocena sygnalizacji śmierci komórki za pomocą immunofluorescencji w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

Stroke is a leading cause of death and disability worldwide. Most cases of stroke are ischemic and result from the occlusion of the middle cerebral artery ...

Udar niedokrwienny mózgu jest główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności na całym świecie. Nasza praca koncentruje się na celach lekowych stosowanych w leczeniu udaru mózgu. Interesuje nas kilka pojawiających się celów, takich jak RUNX1 i katepsyny. Aby ocenić te cele, opracowaliśmy szczurzy model udaru niedokrwiennego poprzez zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej.Modelujemy udar niedokrwienny u szczurów, wprowadzając włókno w celu zamknięcia tętnicy środkowej mózgu. Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu jest najczęściej stosowanym modelem gryzoni do przedklinicznych badań udaru mózgu w połączeniu z innymi technikami, takimi jak TTC, immunofluorescencja i barwienie TUNEL. Możemy badać patofizjologię udaru mózgu w zintegrowanym podejściu. Istnieją pewne wyzwania techniczne związane z immunofluorescencją, takie jak specyficzność przeciwciał minimalizująca tło fluorescencji i optymalizacja stosunku sygnału do szumu poprzez wykorzystanie właściwości znaczników fluorescencyjnych i specyficznych przeciwciał. Immunofluorescencja pozwala nam zrozumieć skomplikowany krajobraz architektury komórkowej i interakcji molekularnych z modelem zamykania tętnicy środkowej mózgu.Pewna ilość tkanki mózgowej jest potencjalnie możliwa do uratowania przy odpowiednim oknie czasowym udaru. Nasze wyniki pokazują, że ekspresja katepsyny B jest aktywowana w liczbie mózgów szczurów po niedrożności tętnicy środkowej mózgu. Towarzyszy mu zwiększona apoptoza. Dalsze badania nad mechanizmem leżącym u podstaw sygnalizacji śmierci komórki mogą przynieść nowy cel dla leku.W naszym przyszłym badaniu będziemy nadal badać potencjalne cele molekularne w szlakach zapalnych i sygnalizacji śmierci komórki. Mamy nadzieję, że niektóre z tych celów odkrytych w badaniach eksperymentalnych będą mogły zostać przełożone na terapię kliniczną, poprawiając w ten sposób przeżywalność i jakość życia pacjentów po udarze.[Narrator] Na początek umieść znieczulonego szczura w pozycji leżącej na plecach i utrzymuj temperaturę jego ciała na poziomie 36,5 °C za pomocą regulowanej maty grzewczej i sondy monitorującej temperaturę doodbytniczą. Ogol skórę na szyi i zdezynfekuj ją za pomocą roztworu dezynfekującego jodoforu. Następnie wykonaj 2-centymetrowe nacięcie w linii środkowej szyi i cofnij tkanki miękkie, aby odsłonić naczynia szyjne. Za pomocą kleszczy wyizoluj prawą tętnicę szyjną wspólną lub CCA, tętnicę szyjną zewnętrzną, ECA i tętnicę szyjną wewnętrzną, ICA. Podwiązać proksymalne prawe CCA za pomocą szwów. Następnie zaciśnij odpowiednie ICA i ECA w ich punkcie początkowym za pomocą mikroklipsa. Włóż nylonową żyłkę pokrytą okrągłą silikonową końcówką do światła CCA przez małe nacięcie i zawiąż węzeł w CCA, aby zapobiec krwawieniu i przemieszczaniu się żyłki. Otwórz prawy mikroklips ICA i włóż żyłkę do prawej środkowej tętnicy mózgowej lub MCA przez kikut ICA, aż silikonowa końcówka zatka początek MCA. Odetnij odsłoniętą część nylonowej żyłki i zamknij nacięcie szyjki w linii środkowej. Po dwóch godzinach niedrożności MCA otwórz nacięcie szyi i rozwiąż węzeł w CCA. Następnie wyjmij nylonową żyłkę, aby ponownie stopić MCA. Po operacji obserwuj szczura podczas rekonwalescencji po znieczuleniu w podgrzewanej klatce z matą grzewczą o regulowanej temperaturze. Korzystając ze Skali Długiej Oceny Behawioralnej Zaya, oceń funkcję neurologiczną dwie godziny po niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO) i 22 godziny po reperfuzji. Po odizolowaniu całego mózgu od szczura modelowego MCAO, zamrozić mózg w temperaturze -20 °C na 20 minut. Pokrój zamrożony mózg na sześć plasterków koronalnych z zachowaniem odległości 2 mm między plasterkami. Plastry barwić 2% TTC przez 15 minut w temperaturze 37 °C w ciemności. Następnie utrwal plastry mózgu 4% paraformaldehydem przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Sfotografuj poplamione plasterki za pomocą aparatu cyfrowego ustawionego w trybie automatycznym dla obiektów z bliska. Przenieś obrazy do komputera i użyj oprogramowania ImageJ, aby zmierzyć rozmiar zawału. Oblicz rozmiar zawału jako stosunek sumy obszaru zawału we wszystkich sześciu wycinkach do sumy całkowitej powierzchni mózgu w tych samych wycinkach. W grupie MCAO zaobserwowano istotne obszary zawału w porównaniu z brakiem zawału w grupie pozorowanej. W celu analizy immunofluorescencyjnej utrwal nienaruszony mózg szczura modelowego MCAO w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny. Następnie odwodnić mózg w serii gradientów roztworu sacharozy w stężeniach 10%, 15% i 30%, w stężeniach 10%, 15% i 30%, kontynuując, aż tkanka opadnie. Osadź odwodniony mózg w związku o optymalnej temperaturze cięcia i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza. Snap zamrozić mózg w ciekłym azocie. Na kriostacie przeciąć mózg na grubość 5 μm. Po wyrównaniu zamrożonych skrawków mózgu w temperaturze pokojowej, umyj je trzykrotnie sterylnym PBS przez 5 minut każda. Narysuj tkankę pisakiem immunohistochemicznym przed inkubacją z 20 μg na ml proteinazy K i 0,3% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po umyciu skrawków PBS nanieść 3% BSA na zarysowaną tkankę i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę w celu zablokowania. Zastąpić roztwór blokujący odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym i inkubować skrawki przez noc w ciemności w temperaturze 4 °C. Następnego dnia przemyj skrawki trzy razy sterylnym PBS zawierającym 0,1% Tween-20 przez 5 minut każda. Dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe sprzężone z wymaganym fluoroforem i inkubować skrawki w wilgotnej komorze przez godzinę, chroniąc je przed światłem. Po umyciu skrawków PBS zawierającym Tween-20 należy je zabarwić medium montażowym zawierającym DAPPI i przykryć szkiełkami nakrywkowymi. W mikroskopie fluorescencyjnym ustaw długość fali wzbudzenia na 488 nm, długość fali emisji na 520 nm, a czas ekspozycji na 500 ms, aby uchwycić barwione obrazy wycinków mózgu. Immunoreaktywność katepsyny B była istotnie zwiększona w niedokrwiennym rdzeniu grupy MCAO w porównaniu z grupą pozorowaną. Immunoreaktywność katepsyny B była istotnie podwyższona w korze półcienia w grupie MCAO w porównaniu z grupą pozorowaną. Nie zaobserwowano istotnej różnicy w immunoreaktywności katepsyny B między rdzeniem niedokrwiennym a korą półcieniową. Na początek odwodnij plastry mózgu utrwalone paraformaldehydem od szczura modelowego MCAO, zwiększając stężenie etanolu przez 35 do 50 minut każdy. Następnie potraktuj wycinki mózgu przezroczystym środkiem biologicznym 1 z olejkiem terpentynowym przez 35 do 50 minut, a następnie środkiem oczyszczającym 2 przez 35 do 50 minut, aż tkanka stanie się całkowicie przezroczysta. Teraz zanurz plastry mózgu w pożywkach 1, 2, 3 i 4 sekwencyjnie po 60 minut każdy. Umieść plastry mózgu w kasecie do zatapiania, szczelnie je zamknij i przechowuj w chłodni w celu zestalenia. Za pomocą mikrotomu przyciąć blok tkanki na głębokość 10 μm, a następnie pokroić na plasterki na głębokość 5 μm. Pozostawić skrawki tkanki na powierzchni w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C przez 30 sekund, a następnie przenieść je na szkiełka. Po wysuszeniu należy odparafinować skrawki mózgu w środku czyszczącym przez dwa cykle po 10 minut każdy. Następnie nawodnij sekcje mózgu w zmniejszających się stężeniach etanolu. Teraz przepłucz sekcję trzy razy w PBS przez pięć minut każdy. Po usunięciu nadmiaru wilgoci dodać 100 μl proteinazy K do każdej sekcji i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Po przepłukaniu PBS nanieść 100 μl końcowego buforu równoważącego deoksynukleotydylotransferazę do każdej próbki i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 10-30 minut. Usunąć bufor za pomocą bibuły chłonnej i dodać 50 μl roztworu roboczego do etykietowania z zestawu testowego TUNEL. Następnie nanieść roztwór roboczy DAPPI na skrawki i inkubować w ciemności przez pięć minut, aby przeciwdziałać barwieniu jąder. Przepłukać próbki w PBS cztery razy przez 5 minut każda. Usuń nadmiar płynu i uszczelnij szkiełko środkiem montażowym zapobiegającym blaknięciu. Zeskanuj wybarwione szkiełko za pomocą systemu obrazowania multispektralnego Vectra Polaris. Barwienie TUNEL wykazało znaczny wzrost apoptozy, z większą liczbą komórek TUNEL-dodatnich w korze półcieniowej grupy MCAO w porównaniu z grupą pozorowaną.

evaluating-cell-death-signaling-immunofluorescence-rat-model-ischemic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Chirurgiczne wywołanie niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u szczura jest powszechnie stosowanym modelem w badaniach nad udarem. W niniejszej pracy demonstrujemy indukcję ogniskowego niedokrwienia mózgu poprzez zamknięcie tętnicy środkowej mózgu. Przedstawiono również wizualizację powstałego zawału za pomocą barwienia histologicznego oraz obrazowania rezonansem magnetycznym.

Model ogniskowego niedokrwienia mózgu poprzez endowaskularną okluzję tętnicy środkowej mózgu u szczura za pomocą szwu

Kilka zwierzęcych modeli niedokrwienia mózgu zostało opracowanych w celu symulacji ludzkiego stanu udaru. Protokół ten opisuje model niedrożności środkowej tętnicy mózgowej indukowanej endoteliną-1 (ET-1) (MCAO) dla udaru niedokrwiennego u szczurów.  Ponadto omówiono ważne względy, zalety i wady tego modelu.

Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu indukowany endoteliną-1 dla udaru niedokrwiennego z laserową kontrolą przepływu dopplerowskiego u szczura

Obustronna niedrożność tętnicy szyjnej w połączeniu z niedociśnieniem ogólnoustrojowym powoduje globalne niedokrwienie mózgu u szczura, powodując uszkodzenie hipokampa z powtarzalnym nasileniem. Zwierzęta są upośledzone z przewidywalnymi wzorcami uszkodzeń mózgu, szybko wracają do zdrowia, a wskaźniki śmiertelności są stosunkowo niskie.

Okluzja / niedociśnienie 2-naczyniowe: szczurzy model globalnego niedokrwienia mózgu

Wykazano, że monitorowanie perfuzji mózgowej poprawia dokładność modeli udaru niedokrwiennego. Trudności techniczne często ograniczają wykorzystanie tego niezbędnego narzędzia do badań naczyń mózgowych. W tym filmie pokazano zoptymalizowany system do uzyskania jedno- lub wielomiejscowego monitorowania hemodynamicznego podczas śródświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu u szczurów.

Zoptymalizowany system do monitorowania perfuzji mózgowej w modelu udaru szczura wewnątrzświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Prezentujemy nową technikę fluorescencji do selektywnego znakowania in situ aktywnych komórek fagocytarnych, które usuwają zwłoki komórek po udarze. Podejście to jest ważne dla oceny reakcji mózgu na niedokrwienie, ponieważ tylko niewielka część fagocytów obecnych w niedokrwionym mózgu uczestniczy w usuwaniu śmierci komórki.

Ocena klirensu fagocytarnego śmierci komórki w eksperymentalnym udarze za pomocą ligawalnych sond fluorescencyjnych

Uszkodzenia mózgu wynikające z niedokrwienia mózgu mogą być nieinwazyjnie obrazowane i badane u szczurów za pomocą przedklinicznej pozytonowej tomografii emisyjnej połączonej z wstrzykiwaną sondą radioaktywną, 18F-fluorodeoksyglukozą. Co więcej, wykorzystanie nowoczesnych narzędzi programowych, które zawierają szablony mózgu dotyczące ilości zainteresowania (VOI), znacznie zwiększa ilość informacji uzyskanych z tych badań.

Nieinwazyjne obrazowanie i analiza niedokrwienia mózgu u żywych szczurów przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej z 18F-FDG

Zgłaszana jest metoda dostarczania nerwowych komórek macierzystych, przystosowanych do wstrzykiwania roztworów lub zawiesin, przez wspólną tętnicę szyjną (mysz) lub tętnicę szyjną zewnętrzną (szczur) po udarze niedokrwiennym. Wstrzyknięte komórki są szeroko rozmieszczone w miąższu mózgu i można je wykryć do 30 dni po porodzie.

Dotętnicze dostarczanie nerwowych komórek macierzystych do mózgu szczura i myszy: zastosowanie do niedokrwienia mózgu

W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym za pomocą analizy cytometrii przepływowej w modelu mini-udaru. Metoda ta umożliwia szczegółowe badanie interakcji neuroimmunologicznych i może być zaadaptowana do badania innych chorób neurodegeneracyjnych, pogłębiając naszą wiedzę na temat odpowiedzi immunologicznych w patologii udaru.

Izolacja i cytometryczna ocena interakcji neuroimmunologicznych w mysim modelu mini-udaru

Reagowanie na sygnały powiązane z pokarmem lub lekiem nasila się w czasie okresu abstynencji, co może wiązać się ze zwiększoną podatnością na zachowania nawrotowe. W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy procedurę oceny tej „inkubacji głodu” (ang. incubation of craving) u szczurów, które podawały sobie samodzielnie sacharozę.

Ogólna metoda oceny inkubacji głodu sacharozy u szczurów

Pierwotne odłączone embrionalne kultury neuronów hipokampa są przydatne do badania mechanizmów sygnalizacyjnych związanych ze śmiercią neuronów. Określenie płci zarodków przed izolacją i dysocjacją hipokampa pozwala na przygotowanie oddzielnych kultur męskich i żeńskich, co umożliwia badaczowi zidentyfikowanie i zbadanie sygnalizacji komórkowej specyficznej dla płci.

Stratyfikowane kultura neuronów według płci w celu zbadania szlaków śmierci komórek niedokrwiennych

Poznaj ocenę sygnalizacji śmierci komórki za pomocą immunofluorescencji w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego z zastosowaniem techniki MCAO. Ta metoda pozwala badać ekspresję kathepsyny B i apoptozę w mózgu.

Ocena sygnalizacji śmierci komórki za pomocą immunofluorescencji w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

Przeglądaj więcej filmów