Obrazowanie heterogenicznych fenotypów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej

Badania naszego laboratorium koncentrują się na tym, dlaczego antybiotyki zawodzą. W szczególności interesuje nas kilka komórek zwanych trwałymi w populacjach bakterii, które rzekomo mają zostać zabite przez antybiotyk, ale mogą przetrwać leczenie antybiotykami. Uważa się, że te uporczywe substancje powodują nawrót infekcji po zakończeniu leczenia antybiotykami.

Jesteśmy zainteresowani badaniem ekspresji genów i metabolizmu tych osób, aby lepiej zrozumieć ich strategie przetrwania. Obecnym wyzwaniem dla pola persister jest zrównoważenie przepustowości z czułością pojedynczej komórki. Musimy dopasować zdolność pojedynczej komórki do podziału po leczeniu, co zakwalifikuje ją jako trwałą komórkę, z pewnym mierzalnym fenotypem, który może pomóc nam zrozumieć wewnętrzne funkcjonowanie komórki.

Być może będziemy musieli to zrobić, aby tysiące komórek złapały choćby jednego uporczywego czynnika. Nasz protokół został opracowany tak, aby był łatwy do wdrożenia w porównaniu z nieprecyzyjnymi metodami kanapkowymi z agarem lub wytwarzaniem urządzeń mikroprzepływowych, co może być wyzwaniem technicznym. Odkryliśmy, że nasz protokół zapewnia powtarzalne i stabilne obrazowanie w czasie przy użyciu minimalnej ilości materiałów, co oznacza, że jest zarówno opłacalny, jak i minimalnie marnotrawny przy gromadzeniu wysokiej jakości danych.

Nasze przyszłe badania będą wykorzystywać kombinację metod omicznych i jednokomórkowych, aby zbadać, w jaki sposób patogeny reagują na leczenie różnymi klasami antybiotyków i wracają do zdrowia po ich zakończeniu. Naszym ostatecznym celem jest wykorzystanie tej wiedzy do opracowania nowych strategii poprawy leczenia zakażeń klinicznych. Na początek umieść sterylną 30-milimetrową szkiełko nakrywkowe na dnie podstawy ze stali nierdzewnej wymiennego naczynia do szkiełek nakrywkowych.

Delikatnie wkręć wkładkę poliwęglanową w podstawę, upewniając się, że szkiełko nakrywkowe tworzy podstawę komory i uszczelnij ją na miejscu, ściskając dołączony silikonowy O-ring. Umieść niestandardową przegrodę wydrukowaną w 3D na 30-milimetrowym szkiełku nakrywkowym, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu komórek modalnych. Przygotuj 1,5% agarozy w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, używając wybranego podłoża i delikatnie zamieszaj, aby wymieszać.

Poluzuj nakrętkę stożkowej rurki i umieść ją w szklanej zlewce lub uchwycie nadającym się do kuchenki mikrofalowej. Podgrzej mieszaninę agarozy w kuchence mikrofalowej na wysokich obrotach, zatrzymując się co trzy do czterech sekund, aby zawirować i wymieszać, aby zapobiec bulgotaniu. Po minucie sprawdź, czy w mieszaninie pozostała niestopiona agaroza.

Jeśli jest jednolicie klarowna, pozwól agarozie na chwilę ostygnąć do około 60 stopni Celsjusza. Dodaj odpowiednie antybiotyki lub matryce i delikatnie zamieszaj, aby wymieszać, unikając tworzenia się pęcherzyków. Odpipetować dwa mililitry agarozy do komory za pomocą 30-milimetrowego szkiełka nakrywkowego.

Delikatnie połóż sterylny 25-milimetrowy szkiełko nakrywkowe na agarozie w górnym otworze komory. Pozostaw podkładkę do zestalenia się na jedną do dwóch godzin. Po zestaleniu się podkładki należy użyć markera permanentnego z cienką końcówką, aby zaznaczyć położenie i tożsamość każdej próbki na 25-milimetrowym szkiełku nakrywkowym.

Odwróć komorę tak, aby pierścień podstawy ze stali nierdzewnej był skierowany do góry i ostrożnie przytrzymaj wkładkę poliwęglanową pod spodem podczas odkręcania podstawy. Odłóż podstawę ze stali nierdzewnej na bok. Zsuń 30-milimetrową szkiełko nakrywkowe z podkładki agarozowej i wyrzuć ją.

Rozcieńczyć hodowle komórek Pseudomonas aeruginosa lub Staphylococcus aureus w PBS do rzadkiej gęstości odpowiedniej do wizualizacji pojedynczych komórek. Energicznie pipetuj w górę i w dół, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Zaznacz pięć mikrolitrów rozcieńczonych zawiesin komórkowych w zaznaczonych miejscach na podkładce agarozowej.

Po wyschnięciu plam umieść nową sterylną 30-milimetrową szkiełko osłonowe na podkładce. Następnie przytrzymaj wkładkę z poliwęglanu jedną ręką i powoli nawlecz podstawę ze stali nierdzewnej na szkiełko nakrywkowe. Po uszczelnieniu komory sprawdź, czy agaroza styka się z powierzchnią 30-milimetrowego szkiełka nakrywkowego.

Za pomocą końca pęsety delikatnie dociśnij 25-milimetrowy szkiełko nakrywkowe, aż agaroza dotknie 30-milimetrowego szkiełka nakrywkowego równomiernie na swojej powierzchni. Na początek przygotuj mikroskop i komorę obrazowania do kontroli środowiska, ustawiając temperaturę w inkubatorze i inkubatorze z dużą komorą na 37 stopni Celsjusza. Następnie włącz nawilżacz komorowy.

Umieścić jeden preparat z podkładki agarozowej w inkubatorze ze stopniem i zamknąć komorę, aby umożliwić równowagę. Przygotuj oprogramowanie MetaMorph do akwizycji obrazu, konfigurując wbudowany algorytm autofokusa tak, aby używał kanału fazowego podczas akwizycji wielowymiarowej. Na karcie Etap ustaw wiele pozycji etapu dla każdej próbki, kierując się polami widzenia o równomiernie rozłożonej gęstości komórek.

Następnie w zakładce Time-Lapse skonfiguruj czas trwania i częstotliwość pozyskiwania obrazu. W zakładce Wavelengths (Długości fal) ustaw żądane kanały do akwizycji i dostosuj czasy ekspozycji w oparciu o intensywność sygnału próbki. Gdy podkładka agarozowa rozgrzeje się w komorze, umieść pokrywę nawilżającą na inkubatorze stage top.

Następnie w mikroskopie przełącz się z trybu kontrastu fazowego na tryb kontrastu interferencji różnicowej. Wyreguluj kondensor i przysłonę przysłony, aby uzyskać odpowiednie oświetlenie Kohlera. Po zakończeniu regulacji przełącz się z powrotem w tryb kontrastu fazowego.

Przejdź do każdej pozycji stage, dostosuj ostrość i zresetuj pozycję stage do nowej płaszczyzny ogniskowej. Kliknij przycisk Nabierz, aby rozpocząć wielowymiarową akwizycję. Po akwizycji, aby skompilować obrazy, otwórz MetaMorph i użyj aplikacji Review Multidimensional Data, aby wybrać żądane kanały lub długości fal i uwzględnić wszystkie punkty czasowe dla każdej pozycji etapu.

Kliknij Załaduj obrazy i zapisz każdą kompilację z odpowiednią nazwą kanału jako plik TIFF. Przeprowadzono obrazowanie poklatkowe komórek Staphylococcus aureus, wykazując barwienie jodkiem propidyny w miarę postępu antybiotykoterapii, co wskazywało na uszkodzenie błony. Obrazowanie Pseudomonas aeruginosa podczas antybiotykoterapii wykazało komórki, które ulegają tworzeniu sferoplastów, filamentacji i kondensacji cytoplazmatycznej, czemu towarzyszy barwienie jodkiem propidyny.

Udane przygotowanie padów agarozowych i warunki obrazowania umożliwiły obserwację Staphylococcus aureus powracającego do zdrowia po antybiotykoterapii i Pseudomonas aeruginosa powracającego do zdrowia po leczeniu antybiotykami w celu utworzenia dużych klastrów pochodzących z pojedynczych komórek.