Name: Obrazowanie heterogenicznych fenotypów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj protokół obrazowania komórek persystentnych Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej. Ta metoda pozwala wizualizować strategie przetrwania bakterii podczas antybiotykoterapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Pani Susan Staurovsky z UConn Health Center for Cell Analysis and Modeling Microscopy Facility za pomoc w przeprowadzaniu eksperymentów mikroskopowych. Dziękujemy dr Mona Wu Orr i Warsztatom Genetyki i Metabolizmu Podstaw Gronkowca za ich protokoły i porady dotyczące klonowania odpowiednio u P. aeruginosa i S. aureus. Prace te były wspierane przez fundusze z National Institutes of Health (NIH; DP2GM146456-01 i 1R01AI167886-01A1 do W.W.K.M., 1F30DE032598-01A1 do P.J.H. i 1F31DK136259-01A1 do T.J.L.). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu naszych eksperymentów ani w przygotowaniu tego manuskryptu.

Visualizing Antibiotic Persistence in Bacterial Pathogens

<ol><li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+between+resistance%2C+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nat Rev Microbiol. 14, 320-330 (2016).</li>
<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitions+and+guidelines+for+research+on+antibiotic+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence.</a> Nat Rev Microbiol. 17 (7), 441-448 (2019).</li>
<li>Conlon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+chronic+and+relapsing+infections%3A+evidence+of+a+role+for+persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus chronic and relapsing infections: evidence of a role for persister cells.</a> Bioessays. 36 (10), 991-996 (2014).</li>
<li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+strains+producing+high+levels+of+persister+cells+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis.</a> J Bacteriol. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li>
<li>Verstraete, L., Van den Bergh, B., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+and+evolution+of+antibiotic+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ecology and evolution of antibiotic persistence.</a> Trends Microbiol. 30 (5), 466-479 (2021).</li>
<li>Sett, A., Dubey, V., Bhowmik, S., Pathania, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+bacterial+persistence%3A+Mechanisms+and+strategies+for+effective+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Decoding bacterial persistence: Mechanisms and strategies for effective eradication.</a> ACS Infect Dis. 10 (8), 2525-2539 (2024).</li>
<li>Mempin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+extracellular+ATP+by+bacteria+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Release of extracellular ATP by bacteria during growth.</a> BMC Microbiol. 13, 301(2013).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells%2C+dormancy+and+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (1), 48-56 (2006).</li>
<li>Fauvart, M., De Groote, V. N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+persister+cells+in+chronic+infections%3A+clinical+relevance+and+perspectives+on+anti-persister+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of persister cells in chronic infections: clinical relevance and perspectives on anti-persister therapies.</a> J Med Microbiol. 60 (pt 6), 699-709 (2011).</li>
<li>Van den Bergh, B., Fauvart, M., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation%2C+physiology%2C+ecology%2C+evolution+and+clinical+importance+of+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Formation, physiology, ecology, evolution and clinical importance of bacterial persisters.</a> FEMS Microbiol Rev. 41, 219-251 (2017).</li>
<li>Levin, B. R., Rozen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-inherited+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Non-inherited antibiotic resistance.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (7), 556-562 (2006).</li>
<li>Davis, K. M., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+heterogeneity+within+bacterial+populations+via+single+cell+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Defining heterogeneity within bacterial populations via single cell approaches.</a> Bioessays. 38 (8), 782-790 (2016).</li>
<li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277(2021).</li>
<li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+automated+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy.</a> J Vis Exp. 53, e3145(2011).</li>
<li>Hare, P. J., Gonzalez, J. R., Quelle, R. M., Wu, Y. I., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+transcriptional+activities+underlie+stationary-phase+Pseudomonas+aeruginosa+sensitivity+to+levofloxacin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Metabolic and transcriptional activities underlie stationary-phase Pseudomonas aeruginosa sensitivity to levofloxacin.</a> Microbiol Spectr. 12 (1), e0356723(2024).</li>
<li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).</li>
<li>Pang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((agr-Dependent+interactions+of+Staphylococcus+aureus+USA300+with+human+polymorphonuclear+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">agr-Dependent interactions of Staphylococcus aureus USA300 with human polymorphonuclear neutrophils.</a> J Innate Immun. 2 (6), 546-559 (2010).</li>
<li>Bose, J. L., Fey, P. D., Bayles, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+tools+to+enhance+the+study+of+gene+function+and+regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic tools to enhance the study of gene function and regulation in Staphylococcus aureus.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (7), 2218(2013).</li>
<li>Schenk, S., Laddaga, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+electroporation+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus.</a> FEMS Microbiol Lett. 73, 133-138 (1992).</li>
<li>Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrosser%2C+MR+%22The+Genetic+Manipulation+of+Staphylococci.+Methods+Molecular+Biology%22">The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology</a>. , Humana Press. New York, NY. (2016).</li>
<li>Krausz, K. L., Bose, J. L. Bacteriophage Transduction in Staphylococcus aureus: Broth-Based Method. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKrausz%2C+KL+%22The+Genetic+Manipulation+of+Staphylococci.+Methods+Molecular+Biology%22">The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology</a>. , Humana Press. New York, NY. (2016).</li>
<li>Olson, M. E. Bacteriophage Transduction in Staphylococcus aureus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOlson%2C+ME+%22The+Genetic+Manipulation+of+Staphylococci.+Methods+Molecular+Biology%22">The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology</a>. , Humana Press. New York, NY. (2016).</li>
<li>Fey, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+resource+for+rapid+and+comprehensive+phenotype+screening+of+nonessential+Staphylococcus+aureus+genes%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">A genetic resource for rapid and comprehensive phenotype screening of nonessential Staphylococcus aureus genes.</a> mBio. 4 (1), e00537-e00612 (2013).</li>
<li>Coe, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-strain+Tn-Seq+reveals+common+daptomycin+resistance+determinants+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Multi-strain Tn-Seq reveals common daptomycin resistance determinants in Staphylococcus aureus.</a> PLoS Pathog. 15 (11), e1007862(2019).</li>
<li>Figurski, D. H., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+an+origin-containing+derivative+of+plasmid+RK2+dependent+on+a+plasmid+function+provided+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (4), 1648(1979).</li>
<li>Shee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+proteins+detect+spontaneous+DNA+breakage+in+human+and+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Engineered proteins detect spontaneous DNA breakage in human and bacterial cells.</a> eLife. 2, e01222(2013).</li>
<li>Kowalska-Krochmal, B., Dudek-Wicher, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+inhibitory+concentration+of+antibiotics%3A+methods%2C+interpretation%2C+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">The minimum inhibitory concentration of antibiotics: methods, interpretation, clinical relevance.</a> Pathogens. 10 (2), 165(2021).</li>
<li>Robinson, J. L., Jaslove, J. M., Murawski, A. M., Fazen, C. H., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+network+analysis+reveals+that+nitric+oxide+reductase+prevents+metabolic+cycling+of+nitric+oxide+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">An integrated network analysis reveals that nitric oxide reductase prevents metabolic cycling of nitric oxide by Pseudomonas aeruginosa.</a> Metab Eng. 41, 67-81 (2017).</li>
<li>Wolff, J. A., MacGregor, C. H., Eisenberg, R. C., Phibbs, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+catabolite+repression+control+mutants+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of catabolite repression control mutants of Pseudomonas aeruginosa PAO.</a> J Bacteriol. 173 (15), 4700-4706 (1991).</li>
<li>Batchelder, J. I., Taylor, A. J., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+augment+oxidative+stress+to+sensitize+antibiotic-tolerant+Staphylococcus+aureus+to+fluoroquinolones%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Metabolites augment oxidative stress to sensitize antibiotic-tolerant Staphylococcus aureus to fluoroquinolones.</a> mBio. , e0271424(2024).</li>
<li>Power, A. D., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar+and+agarose+used+for+Staphylococcus+aureus+biofilm+cultivation+impact+fluoroquinolone+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Agar and agarose used for Staphylococcus aureus biofilm cultivation impact fluoroquinolone tolerance.</a> J Appl Microbiol. 135 (8), lxae191(2024).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nat Commun. 8, 14836(2017).</li>
<li>Ducret, A., Quardokus, E., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicrobeJ%2C+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nat Microbiol. 1 (7), 16077(2016).</li>
<li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oufti%3A+an+integrated+software+package+for+high-accuracy%2C+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Mol Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
<li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-cell+chemostat%3A+an+agarose-based%2C+microfluidic+device+for+high-throughput%2C+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Odkryliśmy, że sukces eksperymentu z mikroskopią poklatkową zależy od jakości płatków agarozowych i ich stabilności w trakcie obrazowania. Zamknięte w komorze ze stali nierdzewnej podkładki agarozowe są stosunkowo łatwe do przygotowania, co skutkuje konsekwentnie płaskimi próbkami, które można stabilnie obrazować przez dziesiątki godzin. Umożliwia to obrazowanie dziesiątek tysięcy komórek w jednym eksperymencie i zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia rzadkich wariantów fenotypowych, takich jak komórki trwałe, w populacji.
Ta metoda przygotowania padów agarozowych stanowi łatwą do wdrożenia alternatywę dla wcześniej opublikowanych metod. Nasz protokół nie wymaga technicznej precyzji wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych ani zręcznych manipulacji metodami "kanapkowymi" agarozy, co ułatwia osiągnięcie spójnych przygotowań od biegu do biegu 14,16,36. Ponadto system jest ekonomiczny. Komora ze stali nierdzewnej jest sterylizowalna i wielokrotnego użytku (w przeciwieństwie do jednorazowych komór plastikowych), a konfiguracja nie wymaga specjalistycznego sprzętu16,37. Komorę można łatwo dopasować do różnych systemów mikroskopowych za pomocą dostępnych na rynku wkładek stolikowych. Dodatkowo, ponieważ bakterie są unieruchomione na granicy faz agarozy ze szkłem pokrywającym, odnieśliśmy sukces w śledzeniu wysoce ruchliwych bakterii, takich jak P. aeruginosa, jednocześnie pozwalając na zmiany morfologiczne (Figura 4, Dodatkowe wideo 4). Inne techniki obrazowania pojedynczych komórek, takie jak "maszyna matka", ograniczają komórki do kanałów, które uniemożliwiają obserwację zmian morfologicznych innych niż filamentacja36.
Aby odnieść sukces z tym protokołem, należy pamiętać o kilku krytycznych krokach i parametrach. Do przygotowania padu ważne jest, aby dokładnie podgrzać i stopić agarozę, ponieważ wszelkie pozostałe kryształy agarozy spowodują dyfrakcję światła i wpłyną na jakość obrazu. Podobnie należy zadbać o to, aby pipetować agarozę do komory bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Aby zapewnić, że grubość padów agarozowych pozostaje stała i aby ograniczyć dryft próbki, ważne jest, aby przed rozpoczęciem obrazowania umożliwić elektrodę zrównoważenie - zwykle przez 15 minut - w wilgotnej obudowie o kontrolowanej temperaturze. Innym czynnikiem, który może powodować słabą jakość obrazu, jest kontrola wilgotności: niska wilgotność spowoduje odwodnienie i kurczenie się podkładki agarozowej, podczas gdy wysoka wilgotność (lub niewłaściwe ogrzanie próbki w komorze) może spowodować kondensację ciepłego powietrza na próbce i zniekształcenie obrazowania. Przykład nieoptymalnego obrazowania poklatkowego z powodu kondensacji można znaleźć w filmie uzupełniającym 8.
Ograniczeniem obecnej konfiguracji jest to, że pożywki hodowlane nie mogą być wymieniane, co uniemożliwia ciągłe śledzenie poszczególnych bakterii przed, w trakcie i po antybiotykoterapii. Przewidujemy, że sprzężenie podkładki agarozowej z komórkami przepływowymi lub urządzeniami mikroprzepływowymi, które umożliwiają wymianę pożywek hodowlanych, może umożliwić śledzenie populacji podczas zmian żywieniowych lub środowiskowych. Kolejnym parametrem obecnej konstrukcji, który można poprawić, jest napowietrzanie próbek. Uszczelka typu O-ring, przykręcana górna konstrukcja wymiennej czaszy szkiełka nakrywkowego umożliwia lepsze napowietrzanie próbki w porównaniu z konfiguracjami, które wymagają użycia uszczelniacza na bazie wosku lub smaru do uszczelnienia padów16. Jednak napowietrzanie w szczelnie zamkniętej komorze może być nadal ograniczone i może nie sprzyjać wzrostowi obligatoryjnych tlenowców, choć pozostaje to do przetestowania.
Protokół przygotowania próbki do obrazowania poklatkowego, który przedstawiamy w tym artykule, umożliwia śledzenie tysięcy bakterii w trakcie ich reakcji na antybiotykoterapię lub powrotu do zdrowia po antybiotykoterapii. Metoda ta jest również wysoce uogólniona i ma wiele potencjalnych zastosowań poza biologią przetrwałych. Na przykład układ podkładki agarozowej i rozdzielacza pozwala na wysiewanie przestrzennie oddzielonych próbek komórek, a jednocześnie umożliwia komunikację komórka-komórka poprzez dyfuzję przez podkładkę agarozową. Obecnie badamy potencjał tej konfiguracji do testowania, w jaki sposób wymiana wydzielanych produktów wpływa na wzrost komórek w społecznościach wielogatunkowych. Przewidujemy, że protokół ten zapewni niską barierę wejścia do mikroskopii poklatkowej dla nowego badacza i nieograniczone możliwości dla doświadczonego mikrobiologa.

Patogeny bakteryjne mogą unikać działania antybiotyków poprzez dwa podstawowe mechanizmy: oporność na antybiotyki, która obejmuje zmiany genetyczne, oraz tolerancję fenotypową, która obejmuje zmiany niegenetyczne. Oporność na antybiotyki jest genetycznie zakodowanym zjawiskiem, które nadaje danej komórce bakteryjnej zdolność nie tylko do przetrwania, ale także do replikacji w obecności antybiotyku1. Tolerancja fenotypowa, która może obejmować bakterie tolerujące antybiotyki lub oporne na antybiotyki, występuje, gdy komórki wytrzymują bakteriobójcze leczenie antybiotykami, nie uzyskując zdolności do replikacji w obecności hamującego stężenia antybiotyku1,2. To, co odróżnia tolerancję od wytrwałości, to fakt, że tolerancja odnosi się do zdolności całej populacji do przeżycia leczenia, podczas gdy wytrwałość odnosi się do podzbioru izogenicznej, ale fenotypowo heterogenicznej populacji, która przeżywa leczenie antybiotykami. Kiedy hodowla klonalna jest traktowana antybiotykami bakteriobójczymi, a osoby, które przeżyły, które pozostają w kulturze, są wykreślane w czasie w skali logarytmiczno-liniowej, krzywa dwufazowa jest zwykle wykrywana, gdy obecne są osoby trwałe. Na tych krzywych pierwsza faza pokazuje, że większość populacji jest zabijana stosunkowo szybko, a druga faza wskazuje, że trwała frakcja antybiotyku jest zabijana w wolniejszym tempie lub wcale1,2.
Utrzymywanie się antybiotyków stanowi poważne obciążenie dla globalnych systemów opieki zdrowotnej. Na przykład uważa się, że utrzymujące się Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa, na których skupia się ten artykuł, powodują infekcje oporne na antybiotyki, w tym nawracające infekcje dróg oddechowych u pacjentów z mukowiscydozą i przewlekłymi infekcjami ran3,4. Dlatego kluczowe znaczenie ma dalsze wyjaśnienie biologii komórek trwałych i programów fenotypowych. Chociaż poczyniono postępy w zrozumieniu, w jaki sposób przetrwały organizmy powstają i reanimują, nadal istnieją krytyczne luki w wiedzy dotyczącej koordynacji przeprogramowania metabolicznego i zdarzeń molekularnych w poszczególnych komórkach, które leżą u podstaw trwałości5,6,7,8.
Skuteczne badanie wytrwałości okazało się wyzwaniem technicznym. Ponieważ trwałość jest obserwowalna tylko w niewielkim podzbiorze populacji bakterii, techniki pobierania próbek z dużych populacji bakterii często nie są w stanie uchwycić istotnych informacji biologicznych1,2,8,9,10. Ponadto, ponieważ zmiany fenotypowe, które leżą u podstaw trwałości, są przejściowe i nie są dziedziczne, śledzenie losu komórek trwałych może być złożone1,8,9,10,11. Gdy bakterie trwałe wznowią wzrost, mogą się dzielić i dać początek zarówno trwałym, jak i nietrwałym, co uniemożliwia wzbogacenie populacji czystych przetrwałych przez hodowlę. Wyzwania te podkreślają zapotrzebowanie na techniki, które mogą spełniać następujące kryteria: 1) zdolność do przechwytywania informacji biologicznych o żywych, pojedynczych komórkach oraz 2) zdolność do stosowania w połączeniu z barwnikami fluorescencyjnymi, sondami, czujnikami i reporterami, które umożliwiają badanie fenotypów pojedynczych komórek w heterogenicznych populacjach w czasie.
Ostatnie osiągnięcia w technologiach jednokomórkowych umożliwiły skuteczne badanie niejednorodności bakterii i pokonanie tych przeszkód w badaniu trwałości12,13. Niektóre z tych technik obejmują mikroskopię fluorescencyjną, cytometrię przepływową/sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, mikrofluidykę i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki12,13. W tym miejscu opisujemy protokoły wyjaśniające fizjologię przetrwałości pojedynczej komórki za pomocą epifluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej transkrypcyjnych lub translacyjnych szczepów reporterowych. Mikroskopia fluorescencyjna jest potężną techniką, która spełnia kryteria badania fenotypów trwałych, a mianowicie zdolność do określenia, które pojedyncze komórki w dużej populacji rozmnażają się po usunięciu antybiotyku, a zatem można je zdefiniować jako trwałe. Wraz z wprowadzeniem technologii zautomatyzowanych kamer i komór inkubacyjnych, wychwytywanie żywych komórek bakteryjnych jest szeroko dostępne w całej dziedzinie mikrobiologii. Co najważniejsze, mikroskopia poklatkowa oferuje możliwość wizualizacji pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym, w ciągu godzin, a nawet dni, co umożliwia śledzenie bakterii przed, w trakcie i po antybiotykoterapii14,15,16. Wnioski z tych badań, wykorzystujące mikroskopię poklatkową, mają ogromny potencjał, aby uzyskać wgląd w złożone mechanizmy biologii przetrwałych.

<table><tbody><tr><td>BaSiC</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/marrlab/BaSiC</td><td></td></tr><tr><td>Certyfikowana biologia molekularna Agaroza</td><td>Biorad</td><td>1613101</td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td></tr><tr><td>Wymienne naczynie ze szkła nakrywkowego</td><td>Bioptechs</td><td>190310-35</td><td>ICD 35 mm do przygotowania wacików agarozowych; w zestawie szkiełka</td></tr> <tr><td>nakrywkowe 30 mm (#1,5)Silnik świetlny LED Lumencor Spectra 7 Silnik świetlny</td> LED <td>Lumencor</td><td>https://lumencor.com/products/spectra-light-engine</td><td>Spectra 7</td></tr><tr><td>Urządzenia molekularne</td><td>MetaMorph</td><td>Wersja Premier 7.10.5</td><td></td></tr><tr><td>Kamera pco.edge 4.2 bi sCMOS</td><td>Kamera Excelitas</td><td>https://www.excelitas.com/product/pcoedge-42-bi-usb-scmos-camera</td><td>sCMOS</td></tr><tr><td>Komora inkubacyjna na żywo PeCon peCon</td><td></td><td>https://www.pecon.biz/</td><td></td></tr> <tr><td>Thomas Scientific Okrągłe szkło nakrywkowe, grubość #1.5, 25 mm, opakowanie 100 szt</td>. <td>Fisher Scientific</td><td>NC1272770</td><td>25 mm (#1.5) szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss Axiovert 200M</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/widefield-microscopes/axiovert-for-materials.html</td><td>Mikroskop odwrócony z obiektywem Plan-Apochromat 63x/1,40 Oil Ph3 M27, silnikiem światła LED Lumencor Spectra 7 i kamerą pco.edge 4.2 bi sCMOS (rozmiar piksela 6,5 mm)</td></tr></tbody></table>

obrazowanie heterogenicznych fenotypów pseudomonas aeruginosa i staphylococcus aureus za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej

Time-Lapse Epifluorescence Microscopy Imaging of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Heterogeneous Phenotypes

Trwałość antybiotyku to zjawisko, w którym niewielka liczba komórek bakteryjnych w genetycznie podatnej populacji przeżywa antybiotykoterapię, która zabija inne genetycznie identyczne komórki. Bakterie trwałe mogą wznowić replikację po zakończeniu leczenia antybiotykami i powszechnie uważa się, że leżą one u podstaw niepowodzenia klinicznego leczenia. Niedawne prace wykorzystujące moc poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej, w której bakterie są znakowane fluorescencyjnymi reporterami transkrypcyjnymi, reporterami translacyjnymi i/lub barwnikami dla różnych cech komórkowych, poszerzyły naszą wiedzę na temat Escherichia coli uporczywość wykraczająca poza to, czego można się dowiedzieć z testów przeżycia antybiotyków na poziomie populacji. Takie podejścia jednokomórkowe, a nie masowe testy populacji, są niezbędne do nakreślenia mechanizmów tworzenia się przetrwałych, odpowiedzi na uszkodzenia i przeżycia. Jednak metody badania przetrwałości innych ważnych gatunków chorobotwórczych na tym poziomie szczegółowości pozostają ograniczone.
To badanie dostarcza elastycznego podejścia do obrazowania poklatkowego Pseudomonas aeruginosa (pałeczki Gram-ujemnej) i Staphylococcus aureus (gram-dodatniego ziarniaka) podczas antybiotykoterapii i rekonwalescencji. Omawiamy podejścia genetyki molekularnej do wprowadzania reporterów fluorescencyjnych do tych bakterii. Za pomocą tych reporterów, a także barwników, możemy śledzić zmiany fenotypowe, cechy morfologiczne i losy poszczególnych komórek w odpowiedzi na leczenie antybiotykami. Dodatkowo jesteśmy w stanie obserwować fenotypy poszczególnych osób utrzymujących się w trakcie reanimacji po leczeniu. Ogólnie rzecz biorąc, praca ta służy jako źródło informacji dla osób zainteresowanych śledzeniem przeżycia i ekspresji genów poszczególnych komórek leczonych antybiotykami, w tym osób utrzymujących się, zarówno w trakcie, jak i po leczeniu, w klinicznie ważnych patogenach.

Pomyślne wprowadzenie plazmidów reporterowych do P. aeruginosa i S. aureus jest sygnalizowane wzrostem na odpowiednich antybiotykach selekcyjnych i może zostać potwierdzone za pomocą kolonijnego PCR i/lub sekwencjonowania. Zmodyfikowane szczepy należy zweryfikować jako reportery fenotypowe, poddając je warunkom, w których wiadomo, że badany gen ulega indukcji; powstałą fluorescencję można zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, spektrofotometrii lub mikroskopii epifluorescencyjnej (Rycina 1).
Aby ułatwić dobór dawki(ek) antybiotyku do wykorzystania w kolejnych eksperymentach, należy przeprowadzić testy zależne od stężenia antybiotyku w celu oznaczenia komórek przetrwalnikowych (persisterów) dla badanych szczepów P. aeruginosa lub S. aureus. Testy zależne od stężenia zazwyczaj dają w wyniku krzywą dwufazową z gwałtownym początkowym spadkiem przy niższych stężeniach antybiotyku oraz plateau lub mniejszym nachyleniem przy wyższych stężeniach. Jednakże dla niektórych par antybiotyk-gatunek wyraźna krzywa dwufazowa może nie wystąpić. Na przykład krzywa dla S. aureus i delafloxacyny jest wyraźnie dwufazowa (Rycina 3A), ale krzywa dla P. aeruginosa i lewofloksacyny już nie (Rycina 3B)15. W takim przypadku wybralibyśmy stężenie wynoszące co najmniej 10x MIC (np. 5 µg/mL, co stanowi około 15x MIC dla P. aeruginosa)15. Ponieważ jednak stężenie 15x MIC lewofloksacyny skutkuje przeżyciem tylko ~0,001% P. aeruginosa, stosujemy leczenie lewofloksacyną w stężeniu 1 µg/mL, jeśli chcemy zaobserwować persistery podczas obrazowania komórek podczas ich regeneracji na podkładkach z agarozy wolnej od antybiotyku (Supplementary Video 6); w przeciwnym razie liczba pól widzenia potrzebnych do obrazowania wielu persisterów staje się zbyt duża.
Na początku obrazowania idealnie przygotowana próbka i podkładka agarozowa powinny być płaskie w całym polu widzenia, wolne od dużych zanieczyszczeń, zmarszczek lub pęcherzyków powietrza, a pojedyncze komórki powinny być rozmieszczone równomiernie. Uzyskanie dobrze rozproszonych pojedynczych komórek może wymagać optymalizacji rozcieńczenia lub resuspensji próbki. W przypadku S. aureus komórki mają tendencję do tworzenia małych skupisk i muszą zostać dokładnie wymieszane w wirówce przed naniesieniem na podkładkę agarozową (Rysunek 4 i Rysunek 5). W przypadku P. aeruginosa komórki w zawiesinie mogą tworzyć agregaty zamknięte w lepkawej macierzy zewnątrzkomórkowej; konieczne jest dokładne pipetowanie tych próbek i rozbicie agregatów w celu obrazowania pojedynczych komórek. 
Po zakończeniu eksperymentu obrazowania, pomyślnie wykonany time-lapse obrazów będzie ostry, stabilnie oświetlony i z minimalnym dryftem w płaszczyźnie x-y przez cały czas trwania eksperymentu. Supplementary Video 7 przedstawia optymalną akwizycję obrazu: t to kanał fazowy z Supplementary Video 4 przed korekcją cieniowania lub dryftu. Utrata ostrości może wystąpić, jeśli kondensacja (wynikająca z nadmiernego nawilżenia lub niewystarczającego ogrzewania próbki) spowoduje powstanie kropli wody na górnym szkiełku nakrywkowym 25 mm, co zniekształci światło i przesunie płaszczyznę ogniskową poza maksymalny zakres wyszukiwania algorytmu autofocus (Supplementary Video 8). Zmienność oświetlenia zazwyczaj wskazuje na niewystarczającą ilość oleju imersyjnego w momencie obrazowania. Jeśli stolik porusza się zbyt szybko, olej na obiektywie może zostać w tyle i wciąż nadążać w momencie akwizycji obrazów. Można temu zapobiec, dostosowując ustawienia akwizycji w celu spowolnienia prędkości ruchu lub dodając pauzę między ruchem do następnej pozycji a akwizycją obrazu. Znaczny dryft próbki będzie wyglądać jak wiele komórek przesuwających się smugami przez pole widzenia, podczas gdy niektóre pozostaną w miejscu (Supplementary Video 9). Zazwyczaj dzieje się to w późniejszej fazie eksperymentów, ponieważ podkładka z agarozy uległa odwodnieniu z powodu niewystarczającej kontroli wilgotności. Przygotowanie podkładki z agarozy przedstawione w niniejszej pracy zostało zaprojektowane w celu zwiększenia stabilności próbki, jednak właściwe ogrzewanie/nawilżanie próbki i jej otoczenia jest niezbędne do optymalnej akwizycji obrazu.
<img alt="Mikroskopia komórek persystujących; poziomy ekspresji genów, skupisko fluorescencyjne w czasie; schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Szczepy z reporterem fluorescencyjnym obrazują ekspresję badanego genu. (A) S. aureus został poddany transdukcji transkrypcyjnym reporterem GFP dla badanego genu zgodnie z Protokołem 1. Szczep reporterowy traktowano przez 24 h antybiotykiem, przemyto PBS, a następnie naniesiono na podkładkę agarozową przygotowaną z CA-MHB z dodatkiem jodku propidyny (1.6 µM) i chloramfenikolu (10 µg/mL w celu utrzymania plazmidu reporterowego) do obrazowania w fazie regeneracji (Supplementary Video 1). (B) P. aeruginosa został poddany transformacji plazmidem zawierającym translacyjny reporter sprzężony z mScarlet dla badanego białka26. Szczep reporterowy traktowano przez 5 h antybiotykiem, przemyto PBS, a następnie naniesiono na podkładkę agarozową przygotowaną z BSM z dodatkiem Tet (75 µg/mL; w celu utrzymania plazmidu reporterowego) do obrazowania w fazie regeneracji (Supplementary Video 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wzrost bakterii na płytkach agarowych, seria rozcieńczeń, obserwacja kolonii, przygotowanie eksperymentu mikrobiologicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Namnażanie i pozyskiwanie bakteriofagów. (A) Sześć płytek przedstawia sześć różnych ilości rozcieńczonego zapasu fagów na trawnikach S. aureus RN4220. Czerwone obramowania wskazują trzy płytki, które zostaną wykorzystane do pozyskania fagów: od płytki z największym przejaśnieniem (pogrubiona czerwona obwódka; 1 x109 PFU/mL) do dwóch kolejnych rozcieńczeń (1 x108 oraz 1 x 107 PFU/mL). Czarne strzałki wskazują poszczególne plaki. (B) Aby pozyskać fagi z płytek, należy zebrać warstwę miękkiego agaru (lewo), przenieść zawiesinę na kolejną płytkę z rozcieńczeniem (środek), a po połączeniu miękkiego agaru ze wszystkich trzech płytek, przelać go do probówki stożkowej w celu wirowania (prawo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres frakcji przeżycia w funkcji stężenia antybiotyku, S. aureus, P. aeruginosa, analiza skuteczności leku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3Reprezentatywne testy persystencji zależne od stężenia. Zależną od stężenia persistencję fluorochinolonów oceniano w fazie stacjonarnej (A) S. aureus (przeciwko delaflooksacynie) i (B) P. aeruginosa (przeciwko lewofloksacyną). W kolejnych eksperymentach wykorzystano 5 µg/mL delafloxacyna (czerwone koło), ponieważ S. aureus zabijanie osiągnęło plateau przy tym stężeniu. Dawka wynosząca co najmniej 1 µg/mL lewofloksacyna (czerwone koło) zostanie wykorzystana w kolejnych eksperymentach z P. aeruginosaNależy zauważyć, że proces zabijania bakterii nie osiąga plateau dla P. aeruginosaistnieje jednak wciąż mniej stroma „druga faza” krzywej dwufazowej, która wskazuje na obecność trwałej subpopulacji. Panel 3B został zaadaptowany za zgodą Hare et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia poklatkowa S. aureus i P. aeruginosa pokazująca zmiany w komórkach PI+ w czasie. Dołączono schematy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Obrazowanie fenotypów bakteryjnych podczas leczenia antybiotykami. Komórki S. aureus (A) i P. aeruginosa (B) w fazie stacjonarnej naniesiono na podkładki agarowe zawierające antybiotyki z grupy fluorochinolonów i monitorowano w trakcie leczenia: 5 µg/mL delafloxacyny dla S. aureus (Wideo uzupełniające 3) i 5 µg/mL lewofloksacyny dla P. aeruginosa (Wideo uzupełniające 4)15. Do podkładek dodano jodek propidyny (PI; 16 µM dla P. aeruginosa, 1.6 µM dla S. aureus), aby oznakować martwe lub obumierające komórki. Komórki S. aureus pozostają w większości nienaruszone i żywe w obecności FQ, podczas gdy większość komórek P. aeruginosa ulega drastycznym zmianom morfologicznym, w tym tworzeniu okrągłych sferoplastów, przed liza i śmiercią. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia poklatkowa wzrostu Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa, proliferacja bakterii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Śledzenie persisterów podczas regeneracji. (A) populacje S. aureus i (B) P. aeruginosa zostały wysiane na podkładki agarozowe zawierające świeżą pożywkę po potraktowaniu fluorochinolonami (5 µg/mL delafloxacyny dla S. aureus i 1 µg/mL lewofloksacyny dla P. aeruginosa), a następnie monitorowano ich regenerację po leczeniu (Supplementary Video 5 oraz Supplementary Video 6). Widoczne persistery są zaznaczone zielonymi strzałkami na dwóch pierwszych klatkach w każdym panelu; pozostały one nienaruszone i żywotne podczas leczenia antybiotykiem. Po początkowym okresie adaptacyjnym persistery zaczęły się dzielić, dając początek nowemu potomstwu (zaznaczonemu zielonymi okręgami). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces przygotowania szkiełka nakrywki i wysiewania komórek, schemat zestawu i komponenty do badania mikroskopowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Przygotowanie próbki do badania mikroskopowego. (A) Schemat przepływu pracy podczas przygotowania próbki z użyciem wymiennego naczynia ze szkiełkiem nakrywką („komory”). (B) Zdjęcie rozmontowanej komory i jej poszczególnych komponentów. (C) Zdjęcie w pełni zmontowanej komory. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wideo uzupełniające 1: S. aureus komórka przetrwalnikowa Plik wideo zawierający obrazy w Rycina 1AW skrócie, S. aureus zawierające reporter transkrypcyjny GFP dla genu zainteresowania, poddano 24-godzinnej inkubacji z antybiotykiem, przemyto PBS, a następnie wysiano na podkładkę agarową przygotowaną z CA-MHB z dodatkiem jodku propidyny (1.6 µM) oraz chloramfenikolem (10 µg/mL) do obrazowania podczas rekonwalescencji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS1_S-aureus_persister_video.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Wideo uzupełniające 2: P. aeruginosa komórka persystująca Plik wideo zawierający obrazy w Rycina 1BW skrócie, P. aeruginosa noszącą reporter translacyjny sprzężony z mScarlet dla białka docelowego, poddano 5-godzinnej inkubacji z antybiotykiem, przemyto buforem PBS, a następnie wysiano na podkładkę agarozową przygotowaną z pożywki BSM z dodatkiem Tet (75 µg/mL) do obrazowania podczas rekonwalescencji26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS2_Paeru-fluorescent-persister.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Wideo uzupełniające 3: S. aureus podczas leczenia antybiotykiem. Kulturę S. aureus w fazie stacjonarnej, wyhodowaną w bogatym, chemicznie zdefiniowanym medium, naniesiono na podkładki agarozowe przygotowane z bezkomórkowego medium kondycjonowanego z tej kultury z dodatkiem jodku propidyny (1.6 μM) i delafloxacyny (5 μg/mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS3_S-aureus_treatment.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Wideo uzupełniające 4: P. aeruginosa podczas leczenia antybiotykami. Kultura w fazie stacjonarnej P. aeruginosa wyhodowane w pożywce BSM zasiano na podkładki agarowe wykonane z bezkomórkowego medium warunkującego z hodowli P. aeruginosa hodowane równolegle w pożywce BSM; podkładka agarozowa zawierała również jodek propidyny (16 µM) oraz lewofloksacynę (5 µg/mL). Materiał wideo został opracowany za zgodą Hare i in.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS4_P-aeruginosa_treatment.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Wideo uzupełniające 5: S. aureus podczas rekonwalescencji po antybiotykoterapii. S. aureus hodowano do fazy stacjonarnej w bogatym, chemicznie zdefiniowanym medium. Kultury w fazie stacjonarnej traktowano delafloxaciną w stężeniu 5 µg/mL w probówkach przez 24 h, przemyto PBS, a następnie naniesiono na bezzantybiotykiowe podłoża agarowe CA-MHB zawierające jodek propidyny (1.6 µM) w celu obrazowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS5_S-aureus_recovery.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Wideo uzupełniające 6: P. aeruginosa podczas regeneracji po antybiotyku. Kulturę P. aeruginosa w fazie stacjonarnej, hodowaną w pożywce BSM, traktowano w probówkach lewofloksacyną w stężeniu 1 µg/mL przez 7 h, przemyto PBS, a następnie naniesiono na podkładki z agarozy BSM bez antybiotyku zawierające jodek propidyny (16 µM) w celu obrazowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS6_P-aeruginosa_recovery.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Wideo uzupełniające 7: Przykład optymalnego pozyskiwania obrazu. To wideo przedstawia kanał fazowy z Wideo uzupełniającego 4 przed przetwarzaniem obrazu jako przykład optymalnego pozyskiwania obrazów w trybie time-lapse. Należy zwrócić uwagę na minimalny dryft, stabilne oświetlenie oraz utrzymanie ostrości przez cały czas trwania eksperymentu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS7_uncorrected-Paeru.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Wideo uzupełniające 8: Przykład suboptimalnej akwizycji obrazu z powodu kondensacji. To wideo przedstawia fragment eksperymentu, w którym na akwizycję obrazu wpłynął słaby fokus, prawdopodobnie z powodu kondensacji pary wodnej w komorze wynikającej z niewłaściwego ogrzewania próbki i/lub nadmiernego nawilżenia środowiska obrazowania. Obrazowaną próbką były bakterie P. aeruginosa traktowane lewofloksacyną podczas regeneracji po antybiotyku na podkładce agarowej BSM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS8_Suboptimal_Imaging_Condensation.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Wideo uzupełniające 9: Przykład nieoptymalnego pozyskiwania obrazu z powodu dryftu. To wideo przedstawia fragment eksperymentu, w którym na pozyskiwanie obrazu wpłynął dryft próbki, prawdopodobnie spowodowany odwodnieniem oraz kurczeniem się lub odklejaniem podkładki agarozowej od szkiełka nakrywnego. Obrazowaną próbką były bakterie P. aeruginosa na podkładce agarozowej zawierającej lewofloksacynę i jodek propidyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS9_Suboptimal_Drift.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Plik uzupełniający 1: 25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

W tym manuskrypcie udostępniamy kompleksowy protokół oceny przeżywalności antybiotyków dla Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, przekształcając plazmidy w P. aeruginosa i S. aureus w celu stworzenia szczepów reporterowych i wizualizacji wariantów fenotypowych, takich jak uporczywe, za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej.

Obrazowanie heterogenicznych fenotypów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej

Antibiotic persistence is a phenomenon in which a small number of bacterial cells in a genetically susceptible population survive antibiotic treatment ...

Badania naszego laboratorium koncentrują się na tym, dlaczego antybiotyki zawodzą. W szczególności interesuje nas kilka komórek zwanych trwałymi w populacjach bakterii, które rzekomo mają zostać zabite przez antybiotyk, ale mogą przetrwać leczenie antybiotykami. Uważa się, że te uporczywe substancje powodują nawrót infekcji po zakończeniu leczenia antybiotykami.Jesteśmy zainteresowani badaniem ekspresji genów i metabolizmu tych osób, aby lepiej zrozumieć ich strategie przetrwania. Obecnym wyzwaniem dla pola persister jest zrównoważenie przepustowości z czułością pojedynczej komórki. Musimy dopasować zdolność pojedynczej komórki do podziału po leczeniu, co zakwalifikuje ją jako trwałą komórkę, z pewnym mierzalnym fenotypem, który może pomóc nam zrozumieć wewnętrzne funkcjonowanie komórki.Być może będziemy musieli to zrobić, aby tysiące komórek złapały choćby jednego uporczywego czynnika. Nasz protokół został opracowany tak, aby był łatwy do wdrożenia w porównaniu z nieprecyzyjnymi metodami kanapkowymi z agarem lub wytwarzaniem urządzeń mikroprzepływowych, co może być wyzwaniem technicznym. Odkryliśmy, że nasz protokół zapewnia powtarzalne i stabilne obrazowanie w czasie przy użyciu minimalnej ilości materiałów, co oznacza, że jest zarówno opłacalny, jak i minimalnie marnotrawny przy gromadzeniu wysokiej jakości danych.Nasze przyszłe badania będą wykorzystywać kombinację metod omicznych i jednokomórkowych, aby zbadać, w jaki sposób patogeny reagują na leczenie różnymi klasami antybiotyków i wracają do zdrowia po ich zakończeniu. Naszym ostatecznym celem jest wykorzystanie tej wiedzy do opracowania nowych strategii poprawy leczenia zakażeń klinicznych. Na początek umieść sterylną 30-milimetrową szkiełko nakrywkowe na dnie podstawy ze stali nierdzewnej wymiennego naczynia do szkiełek nakrywkowych.Delikatnie wkręć wkładkę poliwęglanową w podstawę, upewniając się, że szkiełko nakrywkowe tworzy podstawę komory i uszczelnij ją na miejscu, ściskając dołączony silikonowy O-ring. Umieść niestandardową przegrodę wydrukowaną w 3D na 30-milimetrowym szkiełku nakrywkowym, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu komórek modalnych. Przygotuj 1,5% agarozy w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, używając wybranego podłoża i delikatnie zamieszaj, aby wymieszać.Poluzuj nakrętkę stożkowej rurki i umieść ją w szklanej zlewce lub uchwycie nadającym się do kuchenki mikrofalowej. Podgrzej mieszaninę agarozy w kuchence mikrofalowej na wysokich obrotach, zatrzymując się co trzy do czterech sekund, aby zawirować i wymieszać, aby zapobiec bulgotaniu. Po minucie sprawdź, czy w mieszaninie pozostała niestopiona agaroza.Jeśli jest jednolicie klarowna, pozwól agarozie na chwilę ostygnąć do około 60 stopni Celsjusza. Dodaj odpowiednie antybiotyki lub matryce i delikatnie zamieszaj, aby wymieszać, unikając tworzenia się pęcherzyków. Odpipetować dwa mililitry agarozy do komory za pomocą 30-milimetrowego szkiełka nakrywkowego.Delikatnie połóż sterylny 25-milimetrowy szkiełko nakrywkowe na agarozie w górnym otworze komory. Pozostaw podkładkę do zestalenia się na jedną do dwóch godzin. Po zestaleniu się podkładki należy użyć markera permanentnego z cienką końcówką, aby zaznaczyć położenie i tożsamość każdej próbki na 25-milimetrowym szkiełku nakrywkowym.Odwróć komorę tak, aby pierścień podstawy ze stali nierdzewnej był skierowany do góry i ostrożnie przytrzymaj wkładkę poliwęglanową pod spodem podczas odkręcania podstawy. Odłóż podstawę ze stali nierdzewnej na bok. Zsuń 30-milimetrową szkiełko nakrywkowe z podkładki agarozowej i wyrzuć ją.Rozcieńczyć hodowle komórek Pseudomonas aeruginosa lub Staphylococcus aureus w PBS do rzadkiej gęstości odpowiedniej do wizualizacji pojedynczych komórek. Energicznie pipetuj w górę i w dół, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Zaznacz pięć mikrolitrów rozcieńczonych zawiesin komórkowych w zaznaczonych miejscach na podkładce agarozowej.Po wyschnięciu plam umieść nową sterylną 30-milimetrową szkiełko osłonowe na podkładce. Następnie przytrzymaj wkładkę z poliwęglanu jedną ręką i powoli nawlecz podstawę ze stali nierdzewnej na szkiełko nakrywkowe. Po uszczelnieniu komory sprawdź, czy agaroza styka się z powierzchnią 30-milimetrowego szkiełka nakrywkowego.Za pomocą końca pęsety delikatnie dociśnij 25-milimetrowy szkiełko nakrywkowe, aż agaroza dotknie 30-milimetrowego szkiełka nakrywkowego równomiernie na swojej powierzchni. Na początek przygotuj mikroskop i komorę obrazowania do kontroli środowiska, ustawiając temperaturę w inkubatorze i inkubatorze z dużą komorą na 37 stopni Celsjusza. Następnie włącz nawilżacz komorowy.Umieścić jeden preparat z podkładki agarozowej w inkubatorze ze stopniem i zamknąć komorę, aby umożliwić równowagę. Przygotuj oprogramowanie MetaMorph do akwizycji obrazu, konfigurując wbudowany algorytm autofokusa tak, aby używał kanału fazowego podczas akwizycji wielowymiarowej. Na karcie Etap ustaw wiele pozycji etapu dla każdej próbki, kierując się polami widzenia o równomiernie rozłożonej gęstości komórek.Następnie w zakładce Time-Lapse skonfiguruj czas trwania i częstotliwość pozyskiwania obrazu. W zakładce Wavelengths (Długości fal) ustaw żądane kanały do akwizycji i dostosuj czasy ekspozycji w oparciu o intensywność sygnału próbki. Gdy podkładka agarozowa rozgrzeje się w komorze, umieść pokrywę nawilżającą na inkubatorze stage top.Następnie w mikroskopie przełącz się z trybu kontrastu fazowego na tryb kontrastu interferencji różnicowej. Wyreguluj kondensor i przysłonę przysłony, aby uzyskać odpowiednie oświetlenie Kohlera. Po zakończeniu regulacji przełącz się z powrotem w tryb kontrastu fazowego.Przejdź do każdej pozycji stage, dostosuj ostrość i zresetuj pozycję stage do nowej płaszczyzny ogniskowej. Kliknij przycisk Nabierz, aby rozpocząć wielowymiarową akwizycję. Po akwizycji, aby skompilować obrazy, otwórz MetaMorph i użyj aplikacji Review Multidimensional Data, aby wybrać żądane kanały lub długości fal i uwzględnić wszystkie punkty czasowe dla każdej pozycji etapu.Kliknij Załaduj obrazy i zapisz każdą kompilację z odpowiednią nazwą kanału jako plik TIFF. Przeprowadzono obrazowanie poklatkowe komórek Staphylococcus aureus, wykazując barwienie jodkiem propidyny w miarę postępu antybiotykoterapii, co wskazywało na uszkodzenie błony. Obrazowanie Pseudomonas aeruginosa podczas antybiotykoterapii wykazało komórki, które ulegają tworzeniu sferoplastów, filamentacji i kondensacji cytoplazmatycznej, czemu towarzyszy barwienie jodkiem propidyny.Udane przygotowanie padów agarozowych i warunki obrazowania umożliwiły obserwację Staphylococcus aureus powracającego do zdrowia po antybiotykoterapii i Pseudomonas aeruginosa powracającego do zdrowia po leczeniu antybiotykami w celu utworzenia dużych klastrów pochodzących z pojedynczych komórek.

time-lapse-epifluorescence-microscopy-imaging-pseudomonas-aeruginosa

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół opisujący zastosowanie systemu komórek przepływowych do hodowli i analizy biofilmów mikrobiologicznych w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM).

Biofilm Pseudomonas aeruginosa i Saccharomyces cerevisiae w komórkach przepływowych

Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę monitorowania zachowania pojedynczych komórek różnych bakterii w czasie, z wykorzystaniem zautomatyzowanej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Ponadto przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy uzyskanych obrazów mikroskopowych.

Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Źródło: Chetrit, D. i in. Zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz tomografii krioelektronowej w celu wyróżnienia cech przestrzenno-skroniowych systemu sekrecji kropkowej/icm Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).Ten film pokazuje przygotowanie i obrazowanie bakterii patogennych znakowanych fluorescencjonie. Agarozowe podkładki są najpierw przygotowywane i umieszczane w ramie klejącej. Na podkład aplikowana jest zawiesina genetycznie modyfikowanych bakterii ekspresujących...

Przygotowanie próbek i obrazowanie bakterii znakowanych fluorescencją

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa in Sputum Samples from Cystic Fibrosis Patients

Ten film demonstruje technikę in vitro do badania wpływu leczenia przeciwbakteryjnego na agregaty Pseudomonas aeruginosa (Pa). Znakowane fluorescencyjnie komórki Pa są hodowane jako agregaty, naśladując wzorzec wzrostu podczas infekcji. Po poddaniu skupiskom subletalnym stężeniem antybiotyku kolistyny, ocena interakcji bakteria-antybiotyk w czasie rzeczywistym jest przeprowadzana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Technika in vitro do badania leczenia przeciwdrobnoustrojowego na agregatach bakteryjnych

Prezentujemy metody badania wpływu PSM i innych toksyn wydzielanych przez Staphylococcus aureus na neutrofile za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej.

Badanie oddziaływań Staphylococcus aureus z neutrofilami za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii poklatkowej

Opisujemy techniki utrwalania, zatapiania parafiny i cienkiego cięcia biofilmów kolonii mikroorganizmów. W przygotowanych próbkach za pomocą mikroskopii można uwidocznić podstrukturę biofilmu i wzorce ekspresji reporterowej.

Osadzanie parafiny i cienkie cięcie biofilmów kolonii drobnoustrojów do analizy mikroskopowej

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

Syntetyczne podłoże do mukowiscydozy (SCFM2) może być używane w połączeniu zarówno z konfokalną laserową mikroskopią skaningową, jak i aktywowanym fluorescencją sortowaniem komórek, aby obserwować agregaty bakteryjne w wysokiej rozdzielczości. W tym artykule szczegółowo opisano metody oceny zagregowanych populacji podczas leczenia przeciwdrobnoustrojowego jako platformę dla przyszłych badań.

Narzędzia do oceny w czasie rzeczywistym modelu zakażenia Pseudomonas aeruginosa

Trwałość antybiotyku opisuje zdolność małych subpopulacji we wrażliwej populacji izogenicznej do przejściowego tolerowania wysokich dawek antybiotyków bakteriobójczych. Niniejszy protokół łączy podejścia do scharakteryzowania fenotypu trwałości antybiotyku na poziomie molekularnym i komórkowym po wystawieniu Escherichia coli na działanie śmiertelnych dawek ofloksacyny.

Analiza populacyjna i jednokomórkowa trwałości antybiotyków w Escherichia coli

Poznaj protokół obrazowania komórek persystentnych Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej. Ta metoda pozwala wizualizować strategie przetrwania bakterii podczas antybiotykoterapii.

Obrazowanie heterogenicznych fenotypów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie heterogenicznych fenotypów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów