Podejścia biologii strukturalnej i chemii analitycznej do charakteryzowania enzymów metabolicznych glikozydu C w mikrobiocie jelitowej człowieka

Podejścia z zakresu biologii strukturalnej i chemii analitycznej do charakteryzowania enzymów metabolicznych glikozydów C w mikrobiocie jelitowej człowieka. Protokół. Po pierwsze, produkcja i oczyszczanie białek. Budowa wektora wyrażenia.

Uzyskaj sekwencję klastra genów GenBank LC422372.1 z NCBI. Sklonuj geny do zmodyfikowanego wektora pET-28a. Przekształć plazmidy w kompetentne komórki E. coli BL21 DE3.

Następnie hoduj bakterie w pożywce LB z 50 mikrogramami na mililitr kanamycyny w temperaturze 37 stopni. Dodaj 0,2 milimola IPTG do pożywki, gdy gęstość bakteryjna OD600 osiągnie 0,6. Hoduj bakterie w temperaturze 16 stopni przez 16 godzin.

Odwirować kulturę bakteryjną w temperaturze 4 000 g w czterech stopniach. Odrzucić supernatant i zachować osad bakteryjny. Zawiesić osad bakteryjny w buforze A. Oczyszczanie białka.

Dodać jeden milimol PMSF do zawiesiny bakteryjnej. Lizuj zawiesinę bakterii za pomocą ultradźwiękowego wyłącznika komórek. Odwirować lizat bakteryjny pod ciśnieniem 48 000 g przez 40 minut w temperaturze czterech stopni.

Oczyścić białko w supernatancie za pomocą kolumny NTA do chromatografii powinowactwa do niklu. Eluować związane białko za pomocą buforu B w gradiacji. Zbierz próbki o wysokiej absorpcji UV 280 nanometrów i przezroczystych prążkach białkowych z SDS-PAGE w następnym kroku.

Dializować próbki w stosunku do buforu C. Oczyść dializowane białko za pomocą kolumny chromatografii jonowymiennej. Zwiąż białko docelowe z kolumną za pomocą buforu C. Umuj związane białko za pomocą składnika buforu D. Oczyść białko za pomocą kolumny wykluczającej wielkość z buforem E. Zbierz próbki białka do następnego kroku.

Skoncentrować próbki białka do 20 miligramów na mililitr, podwielokrotnienie, szybko zamrozić ciekłym azotem. Przechowuj go w temperaturze 80 stopni do wykorzystania w przyszłości. Zmierz stężenie białka za pomocą QuickDrop z promieniowaniem UV 280 nanometrów.

Dichroizm kołowy, CD, zbieranie danych o widmie. Rozcieńczyć białka do 0,2 miligrama na mililitr w jednorazowym buforze PBS, pH 7,4. Ustaw prędkość skanowania instrumentu na 50 nanometrów na minutę, a szerokość pasma spektralnego na jeden nanometr.

Zbieraj dane spektralne CD w zakresie długości fal od 200 do 260 nanometrów. Odejmij tło PBS i weź średnią wartość z trzech pomiarów. Po drugie, krystalografia białek i oznaczenie strukturalne.

Wzrost i optymalizacja kryształów białek. Przeprowadzić wstępne badanie przesiewowe krystalizacji metodą sitting-drop przy użyciu zestawów do krystalizacji białek na 48-dołkowych płytkach krystalicznych. Ustaw gradienty strącania i stężenia białka, aby zoptymalizować krystalizację białek za pomocą metody wiszącej kropli.

Przenieś kryształy do roztworu do namaczania zawierającego bufor zbiornikowy i związki docelowe w temperaturze 16 stopni przez 30 minut po całkowitym wzroście. Przenieś kryształy do roztworu krioprotektantu zawierającego bufor krystalizacyjny uzupełniony 25% glicerolem i natychmiast przechowuj w ciekłym azocie w celu zebrania danych. Gromadzenie danych i ustrukturyzowane oznaczanie kryształów białek.

Zbierz pełny zestaw danych dyfrakcji rentgenowskiej na liniach badawczych SSRF NFPS przy użyciu fal padających o długości 0,978 angstremów. Początkowo przetwarzaj dane dyfrakcji krystalicznej za pomocą programu do przetwarzania danych krystalograficznych. Przeprowadź fazowanie za pomocą programu do automatycznego przetwarzania danych.

Korzystaj z oprogramowania do określania struktury krystalicznej w celu automatycznego udoskonalania i optymalizacji modelu struktury. Po trzecie, monitorowanie aktywności reakcji i wyznaczanie parametrów kinetycznych. Monitorowanie aktywności DgpA/B/C za pomocą HPLC.

Zmontuj układ reakcji rozszczepienia glikozydu C w buforze PBS, pH 7,4, zawierającym 20 mikromoli na mililitr DgpA / B / C, jeden milimol na litr jonu manganu, jeden milimol na litr NAD, 10 milimoli na litr DTT i 0,1 milimoli na litr substratu, pueraryny, daidzyny, genistyny. Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze 37 stopni przez osiem godzin. Dodaj trzykrotność ilości metanolu do układu reakcyjnego, aby zakończyć reakcję.

Odwirować roztwór reakcyjny o stężeniu 16 000 g przez 15 minut w celu usunięcia osadu. Przefiltrować supernatant za pomocą membrany filtracyjnej o średnicy 0,22 mikrometra. Wykonaj analizę HPLC z elucją gradientową przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę, długościach fal detekcji UV 265 nanometrów i objętości iniekcji 10 mikrolitrów.

Monitorowanie aktywności DgpA za pomocą indofenolu 2,6-dichlorofenolu, DCPIP, test. Inkubuj 0,8 milimola na litr DCPIP, 50 mikromoli na litr białka i 10 milimoli na litr substratu w jednorazowym buforze PBS, pH 7,4. Po 20 godzinach reakcji zapisać zmianę absorbancji DCPIP przy 600 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek.

Określenie szybkości inhibicji glukozy w reakcji rozszczepienia wiązań C-glikozydowych pueraryny. Przeprowadzić reakcję w jednorazowym buforze PBS o pH 7,4 przy różnych stężeniach glukozy do układu reakcyjnego, jak opisano w sekcji 3.1. Wykonuj reakcję w 37 stopniach przez 12 godzin.

Wykonaj analizę ilościową wygenerowanych produktów za pomocą HPLC. Wyznaczanie parametrów kinetycznych. Stężenie pueraryny ustala się od 0,01 do czterech milimoli na litr, a daidzyny i genistyny od 0,01 do dwóch milimoli na litr w reakcji rozszczepienia glikozydu C-glikozydowego DgpA/B/C.

Przeprowadzać reakcję w temperaturze 37 stopni przez osiem godzin zgodnie z metodą opisaną w ppkt 3.1. Wyprowadź parametry kinetyczne Km i kcat, dopasowując obliczoną szybkość reakcji i stężenie substratu do modelu Michaelise'a-Mentena w Prism. Po czwarte, przygotowanie i wykrywanie produktu pośredniego reakcji.

Przygotowanie produktu pośredniego reakcji. Do przeprowadzenia reakcji zgodnie z metodami opisanymi w sekcji 3.1 należy użyć daidzyny i genistyny jako substratów przy użyciu układu reakcyjnego o objętości 90 mililitrów. Oczyścić produkt pośredni za pomocą preparatywnej HPLC z kolumną do preparatywnej chromatografii cieczowej.

Oczyszczone produkty pośrednie wysuszyć za pomocą próżniowego koncentratora odśrodkowego do wykorzystania w przyszłości. Charakterystyka produktu pośredniego reakcji z LC-MS. Rozpuścić część oczyszczonych produktów pośrednich z reakcji daidzyny i genistyny w metanolu, aby przygotować roztwory każdego związku w stężeniu 50 mikrogramów na mililitr.

Odwirować przy 13 500 gach przez 10 minut i zebrać usternatanty do analizy LC-MS/MS. Użyj tego samego programu elucji gradientowej, co w analizie HPLC do analizy LC-MS z objętością wtrysku wynoszącą pięć mikrolitrów. Charakterystyka produktu pośredniego reakcji za pomocą NMR.

Rozpuścić część oczyszczonych produktów pośrednich z reakcji daidzyny w sześcioraku deuterowanym dimetylosulfotlenkiem dimetylu do spektroskopii NMR protonów i węgla 13. Nagraj widma NMR na instrumencie NMR w częstotliwości 400 megaherców dla protonu. Zapisz widma NMR na instrumencie NMR w częstotliwości 175 megaherców dla węgla 13.

Reprezentatywne wyniki. Ogólnie rzecz biorąc, zaprojektowaliśmy połączone podejście eksperymentalne, które obejmuje produkcję i oczyszczanie białek, eksperymenty z krystalizacją, testy aktywności oraz identyfikację struktur produktów reakcji na rysunku pierwszym. W szczególności uzyskaliśmy białka o wysokiej czystości za pomocą trzyetapowej chromatografii oczyszczającej, chromatografii jonowymiennej i chromatografii filtracji żelowej na rysunku drugim.

W eksperymentach krystalizacji określiliśmy struktury krystaliczne DgpA i kompleksu DgpB/C z rozdzielczościami odpowiednio 2,7 angstremów i 2,1 angstremów na rysunku 3A do D. Ponadto odkryliśmy, że DgpA przyjmuje się w automatycznie hamowanym potwierdzeniu w postaci heksamerycznej na figurach 3B i C, co zostało zwalidowane za pomocą testu redukcji DCPIP na rysunku 3F. Następnie odkryliśmy, że glukoza tworzy sieć wiązań wodorowych z kluczowymi aminokwasami w kieszeni rozpoznawania substratu DgpA na rysunku 3E. Na tej podstawie zaprojektowaliśmy mutanty i oceniliśmy ich aktywność rozszczepienia substratu za pomocą parametrów kinetycznych na rysunku 3J.

Co ciekawe, podczas rozszczepienia flawonoidów O-glikozydowych i DgpA/B/C, zaobserwowaliśmy tworzenie się związków pośrednich na figurach 4A i B. Te produkty pośrednie zostały zidentyfikowane jako flawonoidy C-glikozydowe poprzez analizę NMR i LC-MS na figurze 4C do H, co wskazuje, że DgpA/B/C może przekształcać O-glikozydy w C-glikozydy. Jesteśmy pionierami w integracji chemii i biotechnologii w celu zbadania struktury i cech funkcjonalnych enzymów metabolizmu glikozydów C, wykazując, że jest to rozsądne i praktyczne rozwiązanie. Takie podejście wypełnia luki w metodologiach badawczych w tej dziedzinie i może być łatwo zastosowane do innych genów o różnych funkcjach metabolicznych.

W związku z tym stanowi on również nowy model referencyjny dla przyszłych badań nad cechami strukturalnymi i funkcjonalnymi innych funkcjonalnych białek jelitowych.