Obrazowanie na żywo recyklingu pęcherzyków synaptycznych w złączu nerwowo-mięśniowym wypreparowanych larw danio pręgowanego

Badamy molekularny i komórkowy mechanizm przekaźnictwa synaptycznego na przykładzie połączenia nerwowo-męskiego larw danio pręgowanego jako systemu modelowego. Jesteśmy zainteresowani wyjaśnieniem regulacyjnego moderacji synapsy w odpowiedzi na różne stany fizjologiczne i patologiczne. Protokół ten pozwala nam na wizualizację nowej transmisji indukowanej potencjałem czynnościowym w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw danio pręgowanego z lepszą czułością.

Możemy monitorować funkcję synaptyczną wywołaną umiarkowaną stymulacją, która nie była wcześniej testowana. Ten protokół obrazowania można wykonać pod konwencjonalnym mikroskopem epifluorescencyjnym i niekoniecznie wymaga konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Innymi słowy, metoda ta zapewnia opłacalną platformę do obrazowania funkcji nerwowo-mięśniowych w porównaniu z innymi konfiguracjami eksperymentalnymi.

Aby przygotować 200 mililitrów roztworu zewnątrzkomórkowego, wymieszaj 6,4 mililitra 3,5 molowego chlorku sodu, 0,4 mililitra jednego molowego chlorku potasu, 1 mililitr jednego molowego HEPES, 0,4 mililitra jednego molowego chlorku wapnia, 0,2 mililitra jednego molowego chlorku magnezu i 360 miligramów glukozy. Następnie dodaj ultraczystą wodę, aby zwiększyć całkowitą objętość do 200 mililitrów. Dodać 20 mikrolitrów 15-milimolowego roztworu podstawowego D-tubokuraryny, aby przygotować 100 mililitrów roztworu zewnątrzkomórkowego z 3 mikromolową D-tubokuraryną.

Aby przygotować 25 mililitrów roztworu zewnątrzkomórkowego zawierającego 0,02% trikainy, dodaj 0,5 mililitra 1% roztworu podstawowego tricainy do 25 mililitrów roztworu. Za pomocą ściągacza do mikropipet pociągnij kapilary ze szkła theta, aż średnica końcówki będzie mieścić się w zakresie od 3 do 10 mikrometrów. Napełnij pipetę roztworem zewnątrzkomórkowym.

Włóż cienki drut platynowy do każdego otworu kapilary i przytrzymaj szklaną elektrodę pipety theta na uchwycie pipety mikromanipulatora z napędem. Następnie podłącz tył każdego przewodu do izolatora bodźców. Na 25 mililitrów roztworu zewnątrzkomórkowego zawierającego 0,02% trikainy na szklaną szalkę Petriego przenieś larwy danio pręgowanego na szalkę Petriego w celu rozwarstwienia.

Użyj dwóch cienkich kleszczyków, aby obrać skórę larw. Użyj pierwszych kleszczy, aby przytrzymać larwy na miejscu i uszczypnij skórę po grzbietowej stronie pęcherza pławnego innymi kleszczami. Następnie za pomocą skalpela usuń pęcherz pławny, narządy wewnętrzne i głowę.

Użyj szklanej pipety Pasteura z polerowaną ogniowo końcówką, aby przenieść wypreparowaną próbkę danio pręgowanego do komory obrazowania. Mechanicznie przymocuj próbkę za pomocą nylonowej nici przyklejonej do platynowego drutu w kształcie litery C, aby ustawić ją pod kątem w przybliżeniu równoległym do elektrody stymulującej. Perfuzjować próbkę za pomocą systemu przepływu grawitacyjnego z szybkością 1 mililitra na minutę z roztworem zewnątrzkomórkowym zawierającym 3 mikromolowe D-tubokurarynę.

Następnie włóż elektrodę stymulacyjnej do rdzenia kręgowego. Ostrożnie umieść końcówkę elektrody w pobliżu neuronów ruchowych rdzenia, zidentyfikowanych jako neurony TagRFP-dodatnie zlokalizowane po brzusznej stronie rdzenia kręgowego. Przesuń elektrodę pod kątem od sąsiedniego segmentu do pozycji docelowej.

Aby rozpocząć na komputerze, wybierz region obrazowania na podstawie obrazu fluorescencji TagRFP na żywo. Upewnij się, że wybrany region zawiera wiele bulionów i wyklucza te znajdujące się w pobliżu granicy segmentu ciała. Przełącz jednostkę filtra fluorescencyjnego GFP fluorescencji na obrazowanie.

Następnie dostosuj intensywność źródła światła, aby uzyskać jasny obraz w trybie poklatkowym 1 Hz bez nasycenia. Wprowadź czas ekspozycji do 100 w polu milisekund ekspozycji w oknie mikromenedżera. Skonfiguruj oprogramowanie do akwizycji obrazu i cyfrowe urządzenie wejściowe i wyjściowe, aby zsynchronizować akwizycję obrazu ze stymulacją elektryczną.

Następnie określ częstotliwość stymulacji, liczbę potencjałów czynnościowych i opóźnienie czasowe między rozpoczęciem akwizycji obrazu a dostarczeniem stymulacji w skrypcie Arduino. Na podstawie tych ustawień oblicz całkowitą liczbę obrazów wymaganych do akwizycji i wprowadź tę wartość w polu liczby w oknie akwizycji wielowymiarowej w MicroManagerze. Ustaw 1-sekundowy interwał w polu interwału dla obrazowania poklatkowego 1 Hz.

W przypadku stymulacji elektrycznej skonfiguruj izolator bodźca tak, aby dostarczał 1-milisekundowe impulsy stałego napięcia o napięciu 70 miliwoltów. Wykonaj polecenie digitizera, aby rozpocząć akwizycję obrazu. Monitoruj proces, aby sprawdzić, czy nie ma niedopuszczalnego dryfu obrazu oraz czy można zaobserwować fluor i reakcje.

Zmodyfikuj intensywność stymulacji, taką jak częstotliwość w liczbie impulsów, lub dostosuj temperaturę w zależności od celu eksperymentu. Obrazy poklatkowe można zapisać jako stos szeregów czasowych TIFF. Do analizy wybrano synapsy o dużym wzroście sygnału, chociaż wszystkie butony wykazały wykrywalne zmiany w stanie potencjału czynnościowego 20 Hz 100, Zaobserwowano silne odpowiedzi fluoru po stymulacji elektrycznej o wysokiej częstotliwości ze zmianami fluorescencji wskazującymi na egzocytozę podczas stymulacji i późniejszy rozpad, odzwierciedlający endocytozę i ponowne zakwaszenie pęcherzyków synaptycznych.

Stałe czasowe zaniku fluorescencji zmieniały się w zależności od bodźca, intensywności i temperatury, przy czym potencjały czynnościowe 20 Hz 25 pokazywały się po 16,6 sekundy, 20 Hz 100 Potencjały czynnościowe po 56,8 sekundy i 50 Hz 500 Potencjały czynnościowe po 62,7 sekundy.